Mikrodysekcja warstwowa płatków zastawki trójdzielnej do dwuosiowej charakterystyki mechanicznej i kwantyfikacji mikrostrukturalnej
February 10th, 2022
Ten protokół opisuje dwuosiową charakterystykę mechaniczną, spolaryzowaną obrazowanie przestrzennej domeny częstotliwości opartej na obrazowaniu kolagenu oraz mikrodysekcję płatków zastawki trójdzielnej. Przedstawiona metoda wyjaśnia, w jaki sposób warstwy ulotek przyczyniają się do holistycznych zachowań ulotek.
Metoda ta może wyizolować wkład warstw tkankowych w ogólne zachowanie tkanki, dostarczając nowych informacji na temat mikrostruktury tkanki. Nasze ramy do mikrodysekcji i badań pozwalają nam bezpośrednio porównać właściwości mechaniczne i mikrostrukturalne płatków zastawek serca z ich własnymi warstwami kompozytowymi. Mikrodysekcja może być trudna do opanowania, dlatego zdecydowanie zaleca się ćwiczenie jak najwięcej przed rozpoczęciem badania.
Najpierw zbierz wymagane materiały, tablicę woskową, wodę DI, pipetę, skalpel, mikronożyczki, cienkie kleszcze, zakrzywione kleszcze, grube kleszcze i szpilki. Odłącz tkankę od testera dwuosiowego i zmierz jej grubość za pomocą laserowego czujnika przemieszczenia. Umieść chusteczkę na tablicy woskowej.
Zbadaj stronę brzuszną tkanki pod kątem dużych przyczepów struny. Zrób zdjęcie w celach informacyjnych. Rozłóż tkankę płasko na desce woskowej przedsionkami skierowanymi do góry.
Aby przymocować tkankę do deski, umieść po jednej szpilce odchylonej od tkanki w każdym rogu, tak aby lekko naciągnęła tkankę. Upewnij się, że kołki znajdują się poza otworami utworzonymi przez zęby podczas montażu tkanki, a tkanka jest kwadratowa i nie przesuwa się podczas mikrodysekcji warstwy. W razie potrzeby umieść szpilki wzdłuż boku tkanki podczas preparowania, aby bardziej rozciągnąć tkankę.
Usuń znaczniki odniesienia szklanych koralików. Umieść wodę demineralizowaną na powierzchni tkanki za pomocą pipety tak, aby całkowicie pokryła tkankę w sposób przypominający pęcherzyki. Aby wykonać początkowy róg, wybierz róg przypiętego próbki, unikając dużych wstawek strunowych w delikatnych obszarach.
Następnie przeciąć warstwę A/S, lekko przeciągając skalpelem po powierzchni tkanki wzdłuż otworów montażowych w celu przeprowadzenia testów mechanicznych. Krawędzie cięcia zaczynają się rozsuwać, odsłaniając warstwę F/V pod spodem. , cienkimi kleszczami mocno przetrzyj wzdłuż nacięcia, aby jeszcze bardziej rozdzielić jego krawędzie.
Jeśli nacięcie w warstwie A/S nie zacznie się rozsuwać, delikatnie prześledź to samo cięcie ponownie skalpelem. Wykonaj drugie cięcie prostopadłe do pierwszego cięcia. Jeśli dwa nacięcia nie są połączone, przeciągnij cienką pęsetę pod małym obszarem tkanki oddzielającej dwa nacięcia.
Następnie ostrożnie użyj nożyczek, aby przeciąć tkankę. Pocieraj wzdłuż nacięć rogu cienkimi kleszkami, aż tkanka oddzieli się od warstwy F/V. Gdy tylko mały kawałek tkanki zostanie oddzielony, chwyć go dużą pęsetą i delikatnie pociągnij, aby jeszcze bardziej oddzielić warstwy kompozytu.
Kontynuuj obieranie tkanki, chwytając ją większą pęsetą, aby zapobiec niepożądanemu rozdarciu i rozdarciu warstwy kompozytu A/S, i pocieraj szew, aż dotrze do końca dwóch nacięć wykonanych w rogu. Jeśli pierwszy zakręt ma poważne problemy z separacją, wypróbuj inny róg jako punkt wyjścia. Następnie, aby wykonać drugi róg, przedłuż dwa nacięcia wykonane dla pierwszego rogu, umieszczając końcówkę skalpela na dole każdego cięcia i lekko przeciągając ją wzdłuż powierzchni tkanki, tak aby przedłużenia cięte łączyły się z oryginalnymi nacięciami i nadal podążały za otworami zębów lub szwów.
Kontynuuj wydłużanie nacięć i odklejanie wierzchniej warstwy kompozytu A/S z powrotem, jednocześnie pocierając szew, aż jedna strona będzie gotowa. Zauważ, że tkanka zostanie całkowicie oddzielona wzdłuż jednego cięcia. Następnie utwórz drugi róg prostopadły do końca całkowicie oderwanej strony.
Wydłuż pozostałe cięcia, unikając wstawiania dużych akordów. Należy wykluczyć wtrącenia struny z obszaru separacji A/S tylko wtedy, gdy to wykluczenie pozwoli na uzyskanie próbki A/S wystarczająco dużej do charakterystyki doświadczalnej. Kontynuuj oddzielanie warstw A/S i F/V, stosując techniki pocierania i ciągnięcia zastosowane w pierwszym zakręcie.
Natychmiast przerwij oddzielanie tkanki, jeśli utworzy się rozdarcie lub. Aby zapobiec złapaniu pęsety, umieść nożyczki w dowolnym otworze, który się utworzy i odetnij tkankę od środka. Jeśli wada utworzy się wzdłuż szwu separacji, zacznij oddzielać tkankę wzdłuż innej krawędzi.
Poszukaj połączeń międzywarstwowych, które mogą pojawić się podczas oddzielania tkanki i zapobiegaj dalszemu oddzielaniu tkanek. Zwróć uwagę, że są to cienkie, ale mocne pasma, które należy ostrożnie przyciąć nożyczkami. Unikaj tworzenia w warstwie A/S lub cięcia w dół w warstwie F/V.
Kontynuuj ten proces, aż zostanie oddzielona największa możliwa próbka warstwy A/S. Zaznacz orientację próbki za pomocą pisaka chirurgicznego. Na koniec przeciąć nożyczkami wzdłuż szwu oddzielającego pozostałą krawędź tkanki.
Umieść oddzieloną warstwę kompozytu A/S płasko na macie do cięcia. W razie potrzeby użyj skalpela, aby wyprostować krawędzie tkanki i stworzyć kwadratowy kształt tkanki odpowiedni do dwuosiowych testów mechanicznych. Umieść warstwę A/S w wodzie DI, aż będzie gotowa do testu.
Zaznacz orientację warstwy F/V, która pozostaje na płycie woskowej. Wytnij jak największy kwadrat z obszaru, z którego usunięto warstwę A/S. Następnie umieść go w wodzie DI.
Analiza histologiczna nienaruszonego płatka i dwóch wyciętych warstw zweryfikowała, czy tkanka została prawidłowo oddzielona wzdłuż granicy między gąbczastym a zwłóknieniem. Mikrofotografie histologiczne wykorzystano do określenia grubości warstwy tkankowej i frakcji masowych składników za pomocą oprogramowania ImageJ. Testy mechaniczne kontrolowane przemieszczeniem i przetwarzanie końcowe dały dane dotyczące napięcia błony w funkcji rozciągania przedniego płatka zastawki trójdzielnej, tylnego płatka zastawki trójdzielnej i płatka przegrody zastawki trójdzielnej, opisujące nieliniowe zachowanie mechaniczne tkanki.
Dane z obrazowania w spolaryzowanej dziedzinie częstotliwości przestrzennej dostarczyły kolorowych map orientacji włókien kolagenowych i stopnia anizotropii optycznej. W szczególności te mapy kolorów zapewniły kompleksowe zrozumienie architektury włókien kolagenowych w całej próbce tkanki. Ważne jest, aby pamiętać, że warstwa kompozytowa kurczy się po oddzieleniu od przypiętej tkanki.
Zbierz jak największą próbkę, aby upewnić się, że jest wystarczająca ilość tkanki do kolejnych badań.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę charakteryzacji mechanicznej dwuosiowej i kwantyfikacji kolagenu blaszek zastawki trójdzielnej. Daje wgląd w to, jak warstwy blaszek wpływają na ogólne zachowanie blaszek.
Kluczowe Składowe Badania
Dział Nauka
- Neuroscience
- Biologia układu krążenia
- Mechanika tkanek
Tło
- Zrozumienie mechaniki zastawki serca jest kluczowe dla zdrowia układu krążenia.
- Techniki mikrodissekcji mogą ujawnić wkład warstw tkankowych.
- Kwantyfikacja kolagenu pomaga w ocenie właściwości tkanki.
- Badania mechaniczne dostarczają informacji na temat zachowania się tkanki.
Cel Badania
- Izolacja wkładu warstw tkankowych w ogólne zachowanie.
- Porównanie właściwości mechanicznych i mikrostrukturalnych blaszek zastawki serca.
- Wzbogacenie zrozumienia mikrostruktury zastawki serca.
Wykorzystane Metody
- Biaxialne badania mechaniczne blaszek zastawki trójdzielnej.
- Polaryzowana obrazowanie dziedzinowej częstotliwości przestrzennej do kwantyfikacji kolagenu.
- Mikrodissekcja warstw tkankowych w celu szczegółowej analizy.
- Wykorzystanie specyficznych narzędzi, takich jak skalpel i pinceta do dissectacji.
Główne Wyniki
- Wkład poszczególnych warstw tkankowych został pomyślnie zmierzony.
- Właściwości mechaniczne znacząco różniły się w warstwach.
- Kwantyfikacja kolagenu dostarczyła informacji na temat struktury tkanki.
- Metodologia pozwala na bezpośrednie porównanie warstw kompozytowych.
Wnioski
- Badanie wzbogaca zrozumienie mechaniki zastawki serca.
- Techniki mikrodissekcji wymagają praktyki, aby osiągnąć biegłość.
- Uzyskane informacje mogą wpłynąć na przyszłe badania w dziedzinie układu krążenia.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Layer-specific mechanical and microstructural quantification of tricuspid valve leaflets addresses a critical gap in understanding tissue-level determinants of valve function and failure. This protocol enables direct comparison of intact and dissected leaflet layers, supporting predictive modeling and mechanistic de-risking in early cardiovascular device and therapeutic development. The approach enhances portfolio decision-making by providing high-resolution data for computational model validation and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of tissue-layer contributions to overall valve mechanics for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by quantifying layer-specific biomechanical and microstructural properties.
- Provides data to refine computational models, increasing predictive confidence in target selection.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated tissue samples for reproducible mechanical and imaging assays.
- Standardizes measurement of membrane tension and collagen architecture across tissue layers.
- Enables quantitative outputs for downstream screening of biomaterials or device-tissue interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microstructural and biomechanical data with disease-relevant tissue models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of valve repair or replacement strategies by clarifying tissue mechanics.
- Provides a framework for biomarker discovery linked to tissue integrity and function.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-fidelity tissue data for model development, assay validation, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the role of specific leaflet layers in valve function and pathology.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative mechanical and microstructural readouts for assay development.
- Analytics: Provides membrane tension-stretch curves and collagen orientation maps for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by aligning tissue mechanics with disease states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for tissue characterization across cardiovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue-based research.
- Operational Value: Standardizes tissue dissection and testing for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage risk in device or therapeutic development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated tissue mechanics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and tissue handling for reproducible results.
- Needs access to biaxial mechanical testers, imaging systems, and histological analysis tools.
- Demands cross-team standardization of dissection and measurement protocols.
- May require adaptation for different valve types or species-specific tissues.
- Sample size and tissue integrity can limit downstream testing and analysis.
