Name: Amplifikacja Escherichia coli w chipie mikroprzepływowym Continuous-Flow-PCR i jego wykrywanie za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Poznaj metodę amplifikacji Escherichia coli w mikroprzepływowym systemie CF-PCR z detekcją produktów przez elektroforezę kapilarną. Protokół umożliwia szybką analizę kwasów nukleinowych w warunkach laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Komisję Nauki i Technologii Gminy Szanghaj, Chiny (nr 19ZR1477500 i nr 18441900400). Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony Uniwersytetu w Szanghaju dla Nauki i Technologii (No.2017KJFZ049).

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników i sprzętu użytego w tym protokole.
1. Produkcja chipa mikroprzepływowego CF-PCR
<ol>
	<li>Podgrzej wafel silikonowy w temperaturze 200 °C przez 25 minut, aby usunąć wilgoć.</li>
	<li>Dozować 1 ml fotorezystu SU-8-2075 na cal płytki. Wirować na płytce krzemowej za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 500 obr./min przez 5-10 s z przyspieszeniem 100 obr./min, a następnie z prędkością 2 000 obr./min przez 30 s z przyspieszeniem 500 obr./min/s.</li>
	<li>Miękki wafel silikonowy pieczemy w temperaturze 65 °C przez 3 minuty, a następnie w temperaturze 95 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Ustaw 150 - 215 mJ/cm² jako energię ekspozycji dla maszyny fotolitograficznej i wygraweruj zaprojektowany wzór na fotorezyście za pomocą maski fotolitograficznej. Umieść wafel silikonowy i maskę gotowe do ekspozycji.</li>
	<li>Po naświetleniu piecz wafel krzemowy w temperaturze 65 °C przez 2 minuty, a następnie w temperaturze 95 °C przez 7 minut.</li>
	<li>Zanurz płytkę krzemową w roztworze wywoływacza, aby usunąć nadmiar fotorezystu i wyjmij go, gdy widoczne są mikrokanały (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Użyj izopropanolu, aby spłukać pozostały roztwór wywoływacza.</li>
	<li>Wymieszać prepolimer polidimetylosiloksanu (PDMS) i utwardzacz w stosunku 10:1. Wlać zmieszany roztwór PDMS do formy repliki i zestalić go w temperaturze 80 °C przez 60 minut.</li>
	<li>Po aktywacji przymocuj chip mikroprzepływowy PDMS do szkiełka za pomocą myjki plazmowej i zestal je w temperaturze 80 °C przez 30 minut tak szybko, jak to możliwe (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Wymiary zewnętrzne chipa to 80,0 mm × 30,0 mm × 0,4 mm. W chipie mikroprzepływowym znajduje się 40 kanałów serpentynowych (100 μm × 1,46 mm × 100 μm, szerokość × długość × głębokość).</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu do PCR
<ol>
	<li>Całkowicie rozmrozić odczynniki przed konfiguracją. Użyj mieszalnika wirowego i wirówki, aby upewnić się, że odczynniki są dobrze wymieszane.</li>
	<li>Przygotuj probówkę wirówkową, dodając następujące składniki w następującej kolejności: 33,75 μl wody, 1,0 μl matrycy DNA, 0,5 μl startera, 5,0 μl buforu, 4,0 μl mieszaniny dNTP, 1,5 μl Tween 20, 3,5 μL PVP i na koniec 0,25 μl polimerazy DNA. 
	UWAGA: W tym przypadku użytą matrycą DNA jest E. coli. Startery dla E. coli i składniki roztworu PCR są wymienione odpowiednio w Tabeli 1 i Tabeli 2.</li>
	<li>Wymieszaj roztwór, wirując.</li>
</ol>
3. Budowa systemu CF-PCR
<ol>
	<li>Przygotuj dwie grzałki ceramiczne o dodatnim współczynniku temperaturowym (PTC), dwa przekaźniki półprzewodnikowe, dwa regulatory temperatury PID, dwa czujniki temperatury i przewód zasilający. 
	UWAGA: Rozmiar grzałek ceramicznych PTC zależy od wielkości chipa mikroprzepływowego; długość powinna być większa niż długość chipa - długość-szerokość-wysokość zastosowanych tutaj grzałek ceramicznych PTC wynosi 10 cm x 2 cm x 0,4 cm.</li>
	<li>Podłącz grzałkę do przekaźnika półprzewodnikowego.</li>
	<li>Podłącz przekaźnik półprzewodnikowy do regulatora temperatury PID.</li>
	<li>Przymocuj sondę czujnika temperatury do dolnej części dwóch grzałek i podłącz zacisk do regulatora temperatury PID.</li>
	<li>Podłącz szeregowo dwa przekaźniki półprzewodnikowe i podłącz przewód zasilający.</li>
	<li>Wydrukuj w 3D szczelinę dla dwóch grzejników i utrzymuj grzejniki w tej samej płaszczyźnie (patrz plik uzupełniający 1 dla plików STL wymaganych do drukowania 3D). 
	UWAGA: Pozostaw 12-milimetrową szczelinę powietrzną między dwoma grzejnikami.</li>
	<li>Umieść chip mikroprzepływowy na dwóch grzejnikach.</li>
	<li>Przygotuj pompę strzykawkową i strzykawkę, zamocuj strzykawkę na pompie strzykawkowej, połącz silikonową rurkę (średnica wewnętrzna 0,8 mm [ID]) ze strzykawką i podłącz stalową igłę (0,7 mm ID) do górnej części rurki silikonowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Włóż stalową igłę do wlotu chipa mikroprzepływowego.</li>
	<li>Umieść końcówkę pipety na wylocie chipa, aby zebrać produkty PCR.</li>
</ol>
4. Budowa systemu CE
<ol>
	<li>Użyj zasilacza wysokonapięciowego, aby wytworzyć pole elektryczne pola pulsacyjnego; zwróć uwagę na elektrody dodatnie i ujemne.</li>
	<li>Użyj lampy rtęciowej jako źródła światła i przefiltruj długość fali wzbudzenia z lampy rtęciowej przez filtr.</li>
	<li>Umieść kapilar na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Zbierz emisję fluorescencji za pomocą obiektywu, a następnie wykryj ją za pomocą fotopowielacza R928 (PMT). Obserwuj mikroskop i kapilarę. Włącz światło w ciemnym pomieszczeniu; Światło wzbudzenia jest zbierane przez obiektyw.</li>
	<li>Użyj samodzielnie opracowanego oprogramowania LABVIEW, aby sterować zasilaniem i zakończyć akwizycję danych (opisaną w krokach 6.3-6.6). Patrz https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi. 
	UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone w ciemnym pomieszczeniu, a schemat systemu CE jest pokazany w <silna klasa="xfig">Rysunek 4.</li>
</ol>
5. Uruchom rozwiązanie PCR
<ol>
	<li>Ustawić temperaturę grzałek systemu CF-PCR na 65 °C i 95 °C.</li>
	<li>Umieść chip mikroprzepływowy na dwóch blokach grzewczych.</li>
	<li>Włożyć końcówkę silikonowej probówki do probówki wirówkowej zawierającej 50 μl roztworu do PCR (od kroku 2.3). Pociągnąć za tłok strzykawki, aby powoli pobrać roztwór. Zamocować strzykawkę na pompie strzykawkowej. Włóż stalową igłę do wlotu chipa mikroprzepływowego.</li>
	<li>Ustaw natężenie przepływu pompy na 10 μl/min i naciśnij przycisk start, aby wepchnąć roztwór do mikrokanału na wlocie mikrochipa.</li>
	<li>Zbierz produkty PCR na wylocie chipa mikroprzepływowego. 
	UWAGA: Przepłucz kanał ultraczystą wodą przed i po PCR, aby usunąć zanieczyszczenia.</li>
</ol>
6. Wykrywanie produktów PCR przez ten system CE zbudowany we własnym zakresie
<ol>
	<li>Przygotuj kapilarnę o długości całkowitej 8 cm i długości efektywnej 6 cm.</li>
	<li>Przygotować bufor separacyjny, mieszając 100 μl 1% hydroksyetylocelulozy (HEC, w/v), 2 μl 100x SYBR Green I i 98 μl ultraczystej wody, aby otrzymać 0,5% HEC (w/v) zawierającego 1x SYBR Green I.</li>
	<li>Napełnić kapilarę przygotowanym buforem separacyjnym za pomocą pompy próżniowej.</li>
	<li>Wprowadź napięcie wtrysku (800 V) i czas wtrysku (2,0 s) w interfejsie oprogramowania, kliknij przycisk start i poczekaj, aż produkty PCR zostaną elektrodynamicznie wprowadzone do kapilary przy napięciu 100 V/cm (2,0 s). 
	UWAGA: Na tym etapie produkty PCR umieszcza się na elektrodzie ujemnej, a bufor umieszcza się na elektrodzie dodatniej.</li>
	<li>Wprowadź napięcie stałe (800 V) do interfejsu oprogramowania, kliknij przycisk start i uruchom elektroforezę przy natężeniu pola elektrycznego 100 V/cm. 
	UWAGA: Na tym etapie zarówno elektrody dodatnie, jak i ujemne są umieszczane z buforem.</li>
	<li>Kliknij przycisk stop po oddzieleniu wszystkich fragmentów DNA w kapilarze.</li>
	<li>Przepłukuj kapilarę wysterylizowaną wodą przez 1 minutę po każdym uruchomieniu.</li>
</ol>

<ol><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-in-one+microfluidic+device+for+on-site+diagnosis+of+pathogens+based+on+an+integrated+continuous+flow+PCR+and+electrophoresis+biochip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip.</a> Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).</li>
<li>Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-flow+thermal+gradient+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Continuous-flow thermal gradient PCR.</a> Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+portable+continuous+flow+PCR+microfluidic+chip+for+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication.</a> Biomedical Microdevices. 22 (1), 5(2019).</li>
<li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+characterization+of+a+PDMS-glass+hybrid+continuous-flow+PCR+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip.</a> Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).</li>
<li>Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchip-based+PCR+device+using+flexible+printed+circuit+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).</li>
<li>Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Capillary Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).</li>
<li>Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+intact+antibody+drug+conjugate+variants+using+microfluidic+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).</li>
<li>Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+for+epinephrine+in+dental+anesthetic+solutions+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis.</a> Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).</li>
<li>Maeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+using+TaqMan+and+SYBR+Green+for+Actinobacillus+actinomycetemcomitans%2C+Porphyromonas+gingivalis%2C+Prevotella+intermedia%2C+tetQgene+and+total+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).</li>
<li>Hajba, L., Guttman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+column+coatings+for+capillary+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).</li>
<li>Kleparnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+combination+of+capillary+electrophoresis+with+mass+spectrometry%3A+methodology+and+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory.</a> Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Zarówno PCR, jak i CE to dwie popularne biotechnologie w analizie kwasów nukleinowych. W artykule opisano amplifikację E. coli i wykrywanie produktów PCR przy użyciu systemów CF-PCR i CE, oba zbudowane we własnym zakresie. Docelowy gen E. coli został pomyślnie amplifikowany w ciągu 10 minut ze względu na wysokie szybkości wymiany ciepła. Fragmenty DNA mniejsze niż 1500 pz oddzielono w ciągu 8 minut (ryc. 5). Ogromną zaletą tych dwóch technik jest to, że mogą one znacznie za...

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to technika biologii molekularnej używana do amplifikacji określonych fragmentów DNA, a tym samym do amplifikacji śladowych ilości DNA setki milionów razy. Jest szeroko stosowany w diagnostyce klinicznej, badaniach medycznych, bezpieczeństwie żywności, identyfikacji sądowej i innych dziedzinach. Proces PCR składa się głównie z trzech etapów: denaturacji w temperaturze 90-95 °C, wyżarzania w temperaturze 50-60 °C i przedłużania w temperaturze 72-77 °C. Cykle termiczne są ważną częścią procesu PCR; jednak tradycyjny termocykler PCR jest nie tylko nieporęczny, ale także niewydajny, wymaga około 40 minut na wykonanie 25 cykli. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zbudowano system PCR O CIĄGŁYM PRZEPŁYWIE (CF-PCR), oparty na chipie mikroprzepływowym. CF-PCR może znacznie zaoszczędzić czas, wprowadzając roztwór PCR do mikrokanalików umieszczonych na grzejnikach w różnych temperaturach1,2,3,4,5.
Ponieważ elektroforeza kapilarna (CE) ma wiele zalet, takich jak wysoka rozdzielczość, duża szybkość i doskonała odtwarzalność6,7,8,9,10,11, stał się popularnym narzędziem w laboratorium do analizy kwasów nukleinowych i białek. Jednak większość laboratoriów, zwłaszcza laboratoriów w krajach rozwijających się, nie może sobie pozwolić na tę technologię ze względu na wysoką cenę instrumentu CE. W tym artykule przedstawiliśmy protokoły wytwarzania chipa mikroprzepływowego CF-PCR i budowania wszechstronnego systemu CE w laboratorium. Demonstrujemy również proces amplifikacji E. coli przez ten system CF-PCR oraz wykrywanie produktów PCR przez system CE. Postępując zgodnie z procedurami opisanymi w tym protokole, użytkownicy powinni być w stanie wytworzyć chipy mikroprzepływowe, przygotować roztwory PCR, zbudować system CF-PCR do amplifikacji kwasów nukleinowych i skonfigurować prosty system CE, nawet przy ograniczonych zasobach, do separacji fragmentów DNA.

<table><tbody><tr><td>100 pz drabinka DNA</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>3422A</td><td></td></tr><tr><td>10x Szybki bufor I</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR070A</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Pekin Solarbio Nauka &amp; Technologia Co., Sp. z o.o.</td>Rozwiązanie deweloperskie <td>T1051</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Alfa Aesar, USA</td><td>L15459</td><td></td></tr><tr><td>mieszanina dNTP (2,5 μ M)</td> <td>Takara Bio Inc.</td><td>RR070A</td><td></td></tr><tr><td>EC-F</td><td>Sangon Biotech, Szanghaj, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EC-R</td><td>Sangon Biotech, Szanghaj, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEC, 1300K</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>9004-62-0</td><td></td></tr><tr><td>izopropanol</td><td>Aladdin, Szanghaj, Chiny</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td></td><td>mikroskop Olympus, Japonia</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>fotolitografia&amp; nbsp;</td><td>SUSS MicroTec, Niemcy</td> Lampa fotopowielacza <td>MJB4</td><td></td></tr><tr><td> </td><td>Hamamatsu Photonics, Japonia</td><td>R928</td><td></td></tr><tr><td>fotorezystor</td><td>MicroChem, USA</td><td>SU-8 2075</td><td></td></tr><tr><td>Regulatory temperatury PID </td><td>Szanghaj, Chiny</td> Myjka plazmowa <td>XH-W2023</td><td></td></tr><tr><td> </td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr><tr><td>poliwinylopirolidon (PVP)</td><td>Aladyn, Szanghaj, Chiny</td><td></td> Pompa P110608 <td></td></tr><tr><td></td><td>Aparatura Harvarda</td><td>PHD2000</td><td></td></tr><tr><td>rurki silikonowe </td><td>BIO-RAD,USA</td><td></td><td></td></tr> 7318210 <tr><td>przekaźniki półprzewodnikowe</td><td>KZLTD, Chiny</td><td>KS1-25LA</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA SpeedSTAR HS&amp;NBSP;</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR070A stalowa</td><td></td></tr><tr><td>igła</td><td>zhongxinqiheng, Suzhou, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR ZIELONY <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/63523/63523eq01.jpg" style="margines: auto; "></td><td>Solarbio, Pekin, Chiny</td><td>Czujniki temperatury SY1020</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EasyShining Technology, Chengdu, Chiny</td> Szablon <td>TCM-M207</td><td></td></tr><tr><td>(E. coli)</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>AK601</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Aladdin, Szanghaj, Chiny</td><td>T104863</td><td></td></tr><tr><td>zasilacz napięciowy </td><td>Medina, Nowy Jork, Stany Zjednoczone</td><td>Trek Model 610E</td><td></td></tr></tbody></table>

amplifikacja escherichia coli w chipie mikroprzepływowym continuous-flow-pcr i jego wykrywanie za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej

Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to tradycyjna metoda stosowana do amplifikacji docelowego genu, który odegrał ważną rolę w diagnostyce biomolekularnej. Jednak tradycyjny PCR jest bardzo czasochłonny ze względu na wydajność zmienności w niskiej temperaturze. W niniejszej pracy zaproponowano system PCR Z CIĄGŁYM PRZEPŁYWEM (CF-PCR) oparty na chipie mikroprzepływowym. Czas amplifikacji można znacznie skrócić, wprowadzając roztwór PCR do mikrokanalika umieszczonego na grzejnikach ustawionych na różne temperatury. Ponadto, ponieważ elektroforeza kapilarna (CE) jest idealnym sposobem różnicowania dodatnich i fałszywie dodatnich produktów PCR, zbudowano system CE, aby osiągnąć skuteczną separację fragmentów DNA. W artykule opisano proces amplifikacji Escherichia coli (E. coli) przez zbudowany we własnym zakresie system CF-PCR oraz detekcję produktów PCR przez CE. Wyniki pokazują, że docelowy gen E. coli został pomyślnie amplifikowany w ciągu 10 minut, co wskazuje, że te dwa systemy mogą być wykorzystywane do szybkiej amplifikacji i wykrywania kwasów nukleinowych.

Rycina 5 przedstawia elektroferogram produktów PCR oraz markerów DNA. Ślad (Rycina 5A) to wynik CE produktu amplifikowanego metodą CF-PCR, ślad (Rycina 5B) to wynik CE produktu amplifikowanego za pomocą termocyklera, a ślad (Rycina 5C) to wynik CE drabinki DNA 100 bp. W pierwszej kolejności przeprowadzono amplifikację genu docelowego E. coli w systemie CF-PCR; przejście roztworu PCR od wlotu do...

Ten protokół opisuje, jak zbudować system łańcucha polimerazy o ciągłym przepływie oparty na mikroprzepływowym chipie i jak zbudować system elektroforezy kapilarnej w laboratorium. Przedstawiono w nim prostą metodę analizy kwasów nukleinowych w laboratorium.

Amplifikacja Escherichia coli w chipie mikroprzepływowym Continuous-Flow-PCR i jego wykrywanie za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej

Polymerase chain reaction (PCR) is a traditional method employed for the amplification of a target gene that has played an important role in biomolecular ...

Protokół ten opisuje, jak zbudować system łańcuchowy polimerazy o ciągłym przepływie w oparciu o chip mikroprzepływowy oraz jak zbudować system elektroforezy kapilarnej w laboratorium. Przedstawia prosty sposób analizy kwasów nukleinowych w laboratorium. Reakcja łańcuchowa polimerazy jest tradycyjną metodą stosowaną do amplifikacji genu docelowego.Jednak tradycyjny PCR jest bardzo czasochłonny ze względu na wydajność zmienności w niskiej temperaturze. W niniejszej pracy zaproponowano system PCR o ciągłym przepływie oparty na chipie mikroprzepływowym. Czas amplifikacji można znacznie skrócić, wprowadzając roztwór PCR do mikrokanalika umieszczonego na grzejnikach ustawionych na różne temperatury.Ponieważ CE ma wiele zalet, takich jak wysoka rozdzielczość, duża prędkość i doskonała odtwarzalność, stał się popularnym narzędziem w laboratorium do analizy kwasów nukleinowych i białek. Jednak większość laboratoriów, zwłaszcza laboratoriów w krajach rozwijających się, nie może sobie pozwolić na tę technologię ze względu na wysoką cenę instrumentu CE. W tym artykule przedstawiliśmy protokoły wytwarzania chipa mikroprzepływowego CF-PCR i budowania wszechstronnego systemu CE w laboratorium.Przedstawiono również proces amplifikacji Escherichia coli przez system CF-PCR oraz detekcję produktów PCR przez system CE. Postępując zgodnie z procedurami opisanymi w tym protokole, użytkownicy powinni być w stanie wytworzyć chipy mikroprzepływowe, przygotować roztwór PCR, zbudować system CF-PCR do amplifikacji kwasów nukleinowych i skonfigurować prosty system CE, nawet przy ograniczonych zasobach, do separacji fragmentów DNA. Podgrzej wafel krzemowy w temperaturze 200 stopni Celsjusza przez 25 minut, aby usunąć wilgoć.Dozuj jeden mililitr fotorezystu SU-8 2075 na cal płytki. Wiruj na płytce krzemowej za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 500 obr./min przez 5 do 10 sekund z przyspieszeniem 100 obr./min na sekundę, a następnie z prędkością 2 000 obr./min przez 30 sekund z przyspieszeniem 500 obr./min na sekundę. Piecz na miękko w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez trzy minuty i 95 stopni Celsjusza przez 15 minut.Ustaw od 150 do 215 milidżuli na centymetr kwadratowy jako energię ekspozycji dla maszyny fotolitograficznej i wygraweruj zaprojektowany wzór na fotorezyście za pomocą maski fotolitograficznej. Umieść wafel silikonowy i maskę gotowe do naświetlenia. Po ekspozycji piecz wafel w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwie minuty i 95 stopni Celsjusza przez siedem minut.Zanurz płytkę krzemową w roztworze wywoływacza, aby usunąć nadmiar fotorezystu i wyjmij ją, gdy widać mikrokanały. Następnie użyj izopropanolu, aby spłukać pozostały roztwór wywoływacza. Wymieszać prepolimer polidimetylosiloksanu i utwardzacz w stosunku 10 do 1.Wlej zmieszany roztwór PDMS do formy repliki i zestalaj go w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 60 minut. Przyklej chip mikroprzepływowy PDMS do szkiełka po aktywacji za pomocą myjki plazmowej i zestal je w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 minut tak szybko, jak to możliwe. Użyj mieszalnika wirowego i wirówki, aby upewnić się, że odczynniki są dobrze wymieszane.Przygotuj probówkę wirówkową. Najpierw dodaj wodę do probówki wirówkowej. Następnie dodaj matrycę DNA, starter, bufor, mieszaninę dNTP, Tween 20, PVP, a na koniec dodaj polimerazę DNA.Na koniec wymieszaj roztwór przez wir. Przygotuj dwie grzałki ceramiczne PTC, dwa przekaźniki półprzewodnikowe, dwa regulatory temperatury, dwa czujniki temperatury i przewód zasilający. Podłącz grzałkę do przekaźnika półprzewodnikowego.Podłącz przekaźnik półprzewodnikowy do regulatora temperatury PID. Następnie przymocuj sondę czujnika temperatury do dolnej części dwóch grzałek i podłącz terminal do regulatora temperatury PID. Na koniec połącz szeregowo dwa przekaźniki półprzewodnikowe i podłącz przewód zasilający.Wydrukuj w 3D szczelinę dla dwóch grzejników i utrzymuj grzejniki w tej samej płaszczyźnie. Umieść chip mikroprzepływowy na dwóch grzejnikach. Przygotować pompę strzykawkową i strzykawkę, a następnie zamocować strzykawkę na pompie strzykawkowej.Połącz silikonową rurkę ze strzykawką i podłącz stalową igłę do górnej części silikonowej rurki. Włóż stalową igłę do wlotu chipa mikroprzepływowego. Umieść końcówkę pipety na wylocie chipa, aby zebrać produkty PCR.Użyj zasilacza wysokonapięciowego, aby wytworzyć pole elektryczne pola impulsowego. Słuchaj, to jest zasilacz wysokiego napięcia. Są to elektrody dodatnie i ujemne.Użyj lampy rtęciowej jako źródła światła i przefiltruj długość fali wzbudzenia z lampy rtęciowej przez filtr. Umieść kapilar na stoliku mikroskopu. Zbierz emisję fluorescencji za pomocą obiektywu, a następnie wykryj ją za pomocą fotopowielacza.To jest nasz mikroskop i to jest nasza kapilara. Teraz włączamy światło w ciemnych warunkach pokojowych. Światło wzbudzenia jest zbierane przez obiektyw.Użyj opracowanego przez siebie oprogramowania LABVIEW, aby sterować zasilaniem i zakończyć akwizycję danych. Ustaw temperaturę grzałek systemu CF-PCR na 65 stopni Celsjusza i 95 stopni Celsjusza. Umieść chip mikroprzepływowy na dwóch blokach grzewczych.Włóż końcówkę silikonowej probówki do probówki wirówkowej zawierającej 50 mikrolitrów roztworu PCR. Pociągnąć za tłok strzykawki, aby powoli pobrać roztwór. Zamocować strzykawkę na pompie strzykawkowej.Włóż stalową igłę do wlotu chipa mikroprzepływowego. Ustaw natężenie przepływu pompy na 10 mikrolitrów na minutę i naciśnij przycisk start, aby wepchnąć roztwór do mikrokanału na wlocie mikrochipa. Zebrać produkty PCR na wylocie chipa mikroprzepływowego.Przygotuj kapilarnę o długości całkowitej 8 centymetrów i długości efektywnej 6 centymetrów. Przygotuj bufor separacyjny, mieszając 100 mikrolitrów 1% HEC, dwa mikrolitry 100x SYBR Green i 98 mikrolitrów ultraczystej wody, aby uzyskać 0,5% HEC zawierające 1x SYBR Green. Napełnij kapilarę przygotowanym buforem separacyjnym za pomocą pompy próżniowej.Wprowadź napięcie wtrysku i czas wtrysku w interfejsie oprogramowania, kliknij przycisk start i poczekaj, aż produkty PCR zostaną elektrodynamicznie wprowadzone do kapilary. Wprowadź napięcie DC do interfejsu oprogramowania, kliknij przycisk start i uruchom elektroforezę przy napięciu 100 woltów na centymetr natężenia pola elektrycznego. Kliknij przycisk stop po oddzieleniu wszystkich fragmentów DNA w kapilarze.Przepłucz kapilarę wysterylizowaną wodą przez jedną minutę po każdym uruchomieniu. To zdjęcie przedstawia elektroferogram produktów PCR i markerów DNA. Najpierw amplifikowaliśmy docelowy gen Escherichia coli w systemie CF-PCR, a roztwór PCR potrzebował około 10 minut i 30 sekund od wlotu do wylotu chipa.Wielkość docelowego amplikonu Escherichia coli wynosiła 544 pz. Następnie przeanalizowaliśmy amplifikowane produkty PCR w systemie elektroforezy kapilarnej. Ponadto w tych samych warunkach eksperymentalnych przeprowadziliśmy również elektroforezę kapilarną drabinki DNA o długości 100 pz.Wielkość produktu PCR można ocenić na podstawie elektroferogramu drabiny DNA. Każdy eksperyment został przeprowadzony trzy razy w celu zapewnienia odtwarzalności. Dane na tym zdjęciu pokazują, że pik odpowiadający produktom PCR Escherichia coli zaobserwowano po separacji, a czas migracji produktów PCR w chipie mikroprzepływowym był zgodny z czasem w termocyklerze.Zarówno PCR, jak i CE to dwie popularne biotechnologie w analizie kwasów nukleinowych. W artykule opisano amplifikację Escherichia coli i wykrywanie produktów PCR za pomocą systemów CF-PCR i CE, oba zbudowane we własnym zakresie. Docelowy gen Escherichia coli został pomyślnie amplifikowany w ciągu 10 minut, a fragmenty DNA mniejsze niż 1500 pz zostały oddzielone w ciągu ośmiu minut.Ponadto system CF-PCR oparty na chipie mikroprzepływowym i system CE wprowadzony w tej pracy są łatwe do wytworzenia i mogą oferować prosty sposób analizy kwasów nukleinowych w laboratorium. Może wzmacniać i wykrywać tylko jedną próbkę na raz, co ogranicza jego szerokie zastosowanie. W związku z tym prace nad zintegrowanym mikroprzepływowym układem chipowym CF-PCR i CE do wysokowydajnego wykrywania patogenów są nadal w toku.

amplification-escherichia-coli-continuous-flow-pcr-microfluidic-chip

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Pioli, R., et al., Modeling of microorganisms and microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje metodę wychwytywania pojedynczych, znakowanych fluorescencyjnie komórek Escherichia coli (E. coli) w pułapkach mikroprzepływowych przy użyciu bezwęglowej zawiesiny i kontrolowanego przepływu, a następnie dodawania składników odżywczych w celu wyzwalania wzrostu i obrazowania fluorescencyjnego mikrokolonii.

Wzorce mikroprzepływowe i śledzenie wzrostu bakterii jednokomórkowych na podstawie fluorescencji

Zacznij od skażonej próbki wody, która prawdopodobnie zawiera kałowe coliformy, w tym E. coli.Wykonaj seryjne rozcieńczanie w wodzie destylowanej, aby zmniejszyć mętność i obciążenie mikroorganizmami.Wymieszaj pożądaną próbkę z nośnikiem odżywczym i załaduj ją do mikrofluidu.Użyj filtracji próżniowej, aby wychwytywać bakterie na membranie w serpentynowym kanale chipa.Dodaj pożywkę do górnej komory i inkubuj, aby wspomóc regenerację bakterii.Zastąpić podłoże roztworem fagów specyficznych dla E.

Badanie mikrofluidyczne oparte na fagach do wykrywania żywotnej E. coli w próbkach wody

Ten film opisuje technikę elektroforezy kapilarnej do analizy fluorescencyjnie znakowanych amplikonów PCR uzyskanych z różnych próbek na podstawie ich wielkości. Generuje wzór migracyjny, który określa długości par zasad fragmentów za pomocą znakowanego barwnika fluorescencyjnego w każdym fragmencie.

Elektroforeza kapilarna: technika analizy znakowanych fluorescencyjnie amplikonów reakcji łańcuchowej polimerazy

Ten film opisuje technikę mikroprzepływowej elektroforezy kapilarnej do rozdzielania amplikonów PCR na podstawie ich wielkości. Ta technika pomaga w wymiarowaniu fragmentów przy użyciu barwników fluorescencyjnych i standardowych markerów wielkości molekularnej.

Mikroprzepływowa elektroforeza kapilarna do wymiarowania fragmentów produktów PCR: technika separacji elektroforetycznej oparta na mikroprocesorach w celu oddzielenia fragmentów DNA na podstawie wielkości

Zintegrowany mikroprzepływowy układ termoplastyczny został opracowany do użytku jako diagnostyka molekularna. Chip wykonuje ekstrakcję kwasów nukleinowych, odwrotną transkryptazę i PCR. Opisano metody wytwarzania i uruchamiania chipa.

Wytwarzanie chipów mikroprzepływowych i metoda wykrywania grypy

Test qPCR został opracowany do wykrywania Escherichia coli O157:H7 z unikalnym markerem genetycznym, Z3276. qPCR połączono z leczeniem monoazydkiem propidyny (PMA) w celu wykrywania żywych komórek. Protokół ten został zmodyfikowany i dostosowany do formatu płytki 96-dołkowej w celu łatwej i spójnej obsługi wielu...

Wykrywanie żywych komórek Escherichia coli O157:H7 metodą PMA-qPCR

Prezentujemy mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do wykrywania hybrydyzacji DNA. Po funkcjonalizacji sondy ssDNA bada się swoistość, czułość i granicę wykrywalności za pomocą komplementarnych i niekomplementarnych celów ssDNA. Wyniki ilustrują wpływ zdarzeń hybrydyzacji DNA na układ elektrochemiczny, przy granicy wykrywalności wynoszącej 3,8 nM.

Mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji DNA

Ten protokół opisuje produkcję małej, gotowej do użycia kasety, która może być zastosowana do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście. W tym podejściu wykorzystano matrycę kapilarną do multipleksu i wysoce skutecznego wykrywania celów GMO.

Wizualna detekcja wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym

Cyfrowy mikrofluidyk oparty na elektrozwilżaniu to technika, która wykorzystuje sterowaną napięciem zmianę pozornego kąta zwilżania kropli o objętości mikrolitra, aby ułatwić jej manipulację. Połączenie tego z funkcjonalizowanymi kulkami magnetycznymi umożliwia integrację wielu operacji laboratoryjnych w celu przygotowania próbki i identyfikacji patogenów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

Różne patogeny bakteryjne mogą powodować infekcje dróg oddechowych i prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, jeśli nie zostaną dokładnie wykryte i szybko leczone. Szybkie i dokładne wykrywanie tych patogenów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli zapewnia skuteczne zarządzanie i kontrolę infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

Poznaj metodę amplifikacji Escherichia coli w mikroprzepływowym systemie CF-PCR z detekcją produktów przez elektroforezę kapilarną. Protokół umożliwia szybką analizę kwasów nukleinowych w warunkach laboratoryjnych.

Amplifikacja Escherichia coli w chipie mikroprzepływowym Continuous-Flow-PCR i jego wykrywanie za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej (Wideo) | JoVE Journal

Amplifikacja Escherichia coli w chipie mikroprzepływowym Continuous-Flow-PCR i jego wykrywanie za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej

Przeglądaj więcej filmów