Amplifikacja Escherichia coli w chipie mikroprzepływowym Continuous-Flow-PCR i jego wykrywanie za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej

Protokół ten opisuje, jak zbudować system łańcuchowy polimerazy o ciągłym przepływie w oparciu o chip mikroprzepływowy oraz jak zbudować system elektroforezy kapilarnej w laboratorium. Przedstawia prosty sposób analizy kwasów nukleinowych w laboratorium. Reakcja łańcuchowa polimerazy jest tradycyjną metodą stosowaną do amplifikacji genu docelowego.

Jednak tradycyjny PCR jest bardzo czasochłonny ze względu na wydajność zmienności w niskiej temperaturze. W niniejszej pracy zaproponowano system PCR o ciągłym przepływie oparty na chipie mikroprzepływowym. Czas amplifikacji można znacznie skrócić, wprowadzając roztwór PCR do mikrokanalika umieszczonego na grzejnikach ustawionych na różne temperatury.

Ponieważ CE ma wiele zalet, takich jak wysoka rozdzielczość, duża prędkość i doskonała odtwarzalność, stał się popularnym narzędziem w laboratorium do analizy kwasów nukleinowych i białek. Jednak większość laboratoriów, zwłaszcza laboratoriów w krajach rozwijających się, nie może sobie pozwolić na tę technologię ze względu na wysoką cenę instrumentu CE. W tym artykule przedstawiliśmy protokoły wytwarzania chipa mikroprzepływowego CF-PCR i budowania wszechstronnego systemu CE w laboratorium.

Przedstawiono również proces amplifikacji Escherichia coli przez system CF-PCR oraz detekcję produktów PCR przez system CE. Postępując zgodnie z procedurami opisanymi w tym protokole, użytkownicy powinni być w stanie wytworzyć chipy mikroprzepływowe, przygotować roztwór PCR, zbudować system CF-PCR do amplifikacji kwasów nukleinowych i skonfigurować prosty system CE, nawet przy ograniczonych zasobach, do separacji fragmentów DNA. Podgrzej wafel krzemowy w temperaturze 200 stopni Celsjusza przez 25 minut, aby usunąć wilgoć.

Dozuj jeden mililitr fotorezystu SU-8 2075 na cal płytki. Wiruj na płytce krzemowej za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 500 obr./min przez 5 do 10 sekund z przyspieszeniem 100 obr./min na sekundę, a następnie z prędkością 2 000 obr./min przez 30 sekund z przyspieszeniem 500 obr./min na sekundę. Piecz na miękko w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez trzy minuty i 95 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Ustaw od 150 do 215 milidżuli na centymetr kwadratowy jako energię ekspozycji dla maszyny fotolitograficznej i wygraweruj zaprojektowany wzór na fotorezyście za pomocą maski fotolitograficznej. Umieść wafel silikonowy i maskę gotowe do naświetlenia. Po ekspozycji piecz wafel w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwie minuty i 95 stopni Celsjusza przez siedem minut.

Zanurz płytkę krzemową w roztworze wywoływacza, aby usunąć nadmiar fotorezystu i wyjmij ją, gdy widać mikrokanały. Następnie użyj izopropanolu, aby spłukać pozostały roztwór wywoływacza. Wymieszać prepolimer polidimetylosiloksanu i utwardzacz w stosunku 10 do 1.

Wlej zmieszany roztwór PDMS do formy repliki i zestalaj go w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 60 minut. Przyklej chip mikroprzepływowy PDMS do szkiełka po aktywacji za pomocą myjki plazmowej i zestal je w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 minut tak szybko, jak to możliwe. Użyj mieszalnika wirowego i wirówki, aby upewnić się, że odczynniki są dobrze wymieszane.

Przygotuj probówkę wirówkową. Najpierw dodaj wodę do probówki wirówkowej. Następnie dodaj matrycę DNA, starter, bufor, mieszaninę dNTP, Tween 20, PVP, a na koniec dodaj polimerazę DNA.

Na koniec wymieszaj roztwór przez wir. Przygotuj dwie grzałki ceramiczne PTC, dwa przekaźniki półprzewodnikowe, dwa regulatory temperatury, dwa czujniki temperatury i przewód zasilający. Podłącz grzałkę do przekaźnika półprzewodnikowego.

Podłącz przekaźnik półprzewodnikowy do regulatora temperatury PID. Następnie przymocuj sondę czujnika temperatury do dolnej części dwóch grzałek i podłącz terminal do regulatora temperatury PID. Na koniec połącz szeregowo dwa przekaźniki półprzewodnikowe i podłącz przewód zasilający.

Wydrukuj w 3D szczelinę dla dwóch grzejników i utrzymuj grzejniki w tej samej płaszczyźnie. Umieść chip mikroprzepływowy na dwóch grzejnikach. Przygotować pompę strzykawkową i strzykawkę, a następnie zamocować strzykawkę na pompie strzykawkowej.

Połącz silikonową rurkę ze strzykawką i podłącz stalową igłę do górnej części silikonowej rurki. Włóż stalową igłę do wlotu chipa mikroprzepływowego. Umieść końcówkę pipety na wylocie chipa, aby zebrać produkty PCR.

Użyj zasilacza wysokonapięciowego, aby wytworzyć pole elektryczne pola impulsowego. Słuchaj, to jest zasilacz wysokiego napięcia. Są to elektrody dodatnie i ujemne.

Użyj lampy rtęciowej jako źródła światła i przefiltruj długość fali wzbudzenia z lampy rtęciowej przez filtr. Umieść kapilar na stoliku mikroskopu. Zbierz emisję fluorescencji za pomocą obiektywu, a następnie wykryj ją za pomocą fotopowielacza.

To jest nasz mikroskop i to jest nasza kapilara. Teraz włączamy światło w ciemnych warunkach pokojowych. Światło wzbudzenia jest zbierane przez obiektyw.

Użyj opracowanego przez siebie oprogramowania LABVIEW, aby sterować zasilaniem i zakończyć akwizycję danych. Ustaw temperaturę grzałek systemu CF-PCR na 65 stopni Celsjusza i 95 stopni Celsjusza. Umieść chip mikroprzepływowy na dwóch blokach grzewczych.

Włóż końcówkę silikonowej probówki do probówki wirówkowej zawierającej 50 mikrolitrów roztworu PCR. Pociągnąć za tłok strzykawki, aby powoli pobrać roztwór. Zamocować strzykawkę na pompie strzykawkowej.

Włóż stalową igłę do wlotu chipa mikroprzepływowego. Ustaw natężenie przepływu pompy na 10 mikrolitrów na minutę i naciśnij przycisk start, aby wepchnąć roztwór do mikrokanału na wlocie mikrochipa. Zebrać produkty PCR na wylocie chipa mikroprzepływowego.

Przygotuj kapilarnę o długości całkowitej 8 centymetrów i długości efektywnej 6 centymetrów. Przygotuj bufor separacyjny, mieszając 100 mikrolitrów 1% HEC, dwa mikrolitry 100x SYBR Green i 98 mikrolitrów ultraczystej wody, aby uzyskać 0,5% HEC zawierające 1x SYBR Green. Napełnij kapilarę przygotowanym buforem separacyjnym za pomocą pompy próżniowej.

Wprowadź napięcie wtrysku i czas wtrysku w interfejsie oprogramowania, kliknij przycisk start i poczekaj, aż produkty PCR zostaną elektrodynamicznie wprowadzone do kapilary. Wprowadź napięcie DC do interfejsu oprogramowania, kliknij przycisk start i uruchom elektroforezę przy napięciu 100 woltów na centymetr natężenia pola elektrycznego. Kliknij przycisk stop po oddzieleniu wszystkich fragmentów DNA w kapilarze.

Przepłucz kapilarę wysterylizowaną wodą przez jedną minutę po każdym uruchomieniu. To zdjęcie przedstawia elektroferogram produktów PCR i markerów DNA. Najpierw amplifikowaliśmy docelowy gen Escherichia coli w systemie CF-PCR, a roztwór PCR potrzebował około 10 minut i 30 sekund od wlotu do wylotu chipa.

Wielkość docelowego amplikonu Escherichia coli wynosiła 544 pz. Następnie przeanalizowaliśmy amplifikowane produkty PCR w systemie elektroforezy kapilarnej. Ponadto w tych samych warunkach eksperymentalnych przeprowadziliśmy również elektroforezę kapilarną drabinki DNA o długości 100 pz.

Wielkość produktu PCR można ocenić na podstawie elektroferogramu drabiny DNA. Każdy eksperyment został przeprowadzony trzy razy w celu zapewnienia odtwarzalności. Dane na tym zdjęciu pokazują, że pik odpowiadający produktom PCR Escherichia coli zaobserwowano po separacji, a czas migracji produktów PCR w chipie mikroprzepływowym był zgodny z czasem w termocyklerze.

Zarówno PCR, jak i CE to dwie popularne biotechnologie w analizie kwasów nukleinowych. W artykule opisano amplifikację Escherichia coli i wykrywanie produktów PCR za pomocą systemów CF-PCR i CE, oba zbudowane we własnym zakresie. Docelowy gen Escherichia coli został pomyślnie amplifikowany w ciągu 10 minut, a fragmenty DNA mniejsze niż 1500 pz zostały oddzielone w ciągu ośmiu minut.

Ponadto system CF-PCR oparty na chipie mikroprzepływowym i system CE wprowadzony w tej pracy są łatwe do wytworzenia i mogą oferować prosty sposób analizy kwasów nukleinowych w laboratorium. Może wzmacniać i wykrywać tylko jedną próbkę na raz, co ogranicza jego szerokie zastosowanie. W związku z tym prace nad zintegrowanym mikroprzepływowym układem chipowym CF-PCR i CE do wysokowydajnego wykrywania patogenów są nadal w toku.