Name: Izolacja wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 z błony śluzowej nosa myszy w celu wykrycia ekspresji CD226 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek ILC2 z błony śluzowej nosa myszy w celu wykrycia ekspresji CD226. Technika ta umożliwia badanie roli ILC2 w chorobach nosa za pomocą cytometrii przepływowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.Z. był wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81871258) oraz fundusze dostarczone przez Czwarty Wojskowy Uniwersytet Medyczny (No.2020rcfczr). Y.Z. był wspierany przez Program Badań Podstawowych Nauk Przyrodniczych Shaanxi (nr 2021JM-081).

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie procedury i protokoły zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Badań Naukowych IV Wojskowego Uniwersytetu Medycznego (nr 20211008).
1. Ustanowienie mysiego modelu AR
<ol>
	<li>Trzymanie samców i samic myszy typu dzikiego (WT) C57BL/6 w wieku 8-12 tygodni w określonych warunkach wolnych od patogenów i zapewnienie standardowej karmy laboratoryjnej i wody.</li>
	<li>Zemulguj 50 μg albuminy jaja kurzego (OVA) w 0,2 ml sterylnego PBS zawierającego 2 mg wodorotlenku glinu na czystej ławce, aby zachować sterylność. W dniach 0, 7 i 14 należy wstrzyknąć dootrzewnowo samicom lub samcom myszy po 50 μg zemulgowanego OVA.</li>
	<li>W dniach 21, 22, 23, 24 i 25 wkraplać donosowo myszom 50 μg OVA rozpuszczonych w 30 μl sterylnego PBS (15 μl na nozdrze) w znieczuleniu wziewnym (2-3% izofluranu o szybkości przepływu tlenu lub 0,5 l / min).</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji 24 godziny po ostatnim wyzwaniu (dzień 26).</li>
</ol>
2. Izolacja komórek jednojądrzastych (MNC) z błony śluzowej nosa
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy w głębokim znieczuleniu. Namocz myszy głową do góry w 75% etanolu przez 5 minut i unikaj przedostania się etanolu do zewnętrznego nozdrza. Połóż brzuch w dół na stole operacyjnym</li>.
	<li>Odetnij przednie zęby. W linii środkowej głowy wykonaj nacięcie i rozetnij skórę nożyczkami.</li>
	<li>Zdejmij dolną szczękę, odetnij cały nos wzdłuż końca podniebienia i umieść tkankę na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 5 ml lodowatego PBS. Za pomocą nożyczek i kleszczy usuń mięso i mięśnie przylegające do kości.</li>
	<li>Przenieś nos myszy na nową szalkę Petriego o średnicy 60 mm zawierającą 5 ml lodowatego PBS. Umyj kości dwukrotnie 5 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Przenieś nos do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wystarczająco rozbić i przenieść nos do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml wstępnie podgrzanego buforu do trawienia (pożywka RPMI 1640 uzupełniona 1 mg/ml kolagenazy IV i 10 U/ml DNazy I).</li>
	<li>Zamocuj pokrywę i umieść rurkę pionowo w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C, z ciągłym mieszaniem przy 120-150 obr./min przez 40 min. 
	UWAGA: Podgrzej bufor trawienny do 37 °C, aby osiągnąć najwyższą aktywność enzymu.</li>
	<li>Dodaj 5 ml lodowatej pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), aby zatrzymać proces trawienia.</li>
	<li>Przefiltruj przez sitko o średnicy 70 μm, aby usunąć fragmenty stałe.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut, a następnie delikatnie wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w lodowato zimnym podłożu RPMI 1640 i wirować przy 500 x g przez 5 minut. Delikatnie wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 4 ml pożywki o gradiencie gęstości 40% (160 μl 10x PBS + 1,44 ml roztworu podstawowego pożywki gradientowej gęstości + 2,4 ml pożywki RPMI 1640).</li>
	<li>Delikatnie włóż pipetę Pasteura do dna probówki i powoli dodaj 2,5 ml pożywki o gradiencie gęstości 80% (200 μl 10x PBS + 1,8 ml roztworu podstawowego pożywki o gradientzie gęstości + 0,5 ml pożywki RPMI 1640).</li>
	<li>Ustawić przyspieszenie i opóźnienie wirówki na niższym poziomie niż trzeci bieg i wirować przy 400 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Usuń górną warstwę zanieczyszczeń przed opróżnieniem komórek na granicy faz, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia. Ostrożnie opróżnij warstwę komórek jednojądrzastych (MNC) na granicy faz pożywki o gradiencie gęstości 40%/80% do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml lodowatego PBS za pomocą pipety. Dwukrotnie umyj komórki lodowatym PBS.</li>
</ol>
3. Barwienie powierzchni do analizy FCM
<ol>
	<li>Zebrać komórki i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w buforze do barwienia (PBS uzupełniony 2% FBS i 0,1% NaN3) i wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas przygotowywania buforu do barwienia. NaN3 jest bardzo toksyczny i może powodować uszkodzenie narządów w przypadku połknięcia, wdychania lub kontaktu ze skórą. Unikaj również uwolnienia do środowiska.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 80 μl roztworu blokującego (przeciwciało anty-CD16/32 (1:100) rozcieńczone w buforze barwiącym) na probówkę. Inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Nie przemywając, dodać 20 μl odpowiedniego rozcieńczenia koktajlu przeciwciał barwiących powierzchnię (tabela 1).</li>
	<li>Dodać 1 μl (na test) barwnika 520 (FVD) do utrwalania żywotności tuż przed dodaniem koktajlu przeciwciał do próbek. Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 min. Ustaw pasujące przeciwciała izotypowe i fluorescencję minus jeden (FMO) jako kontrole ujemne.</li>
	<li>Przemyć komórki w 500 μl buforu barwiącego, odwirowując przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu barwiącego. Dodać 50 μl wirowych bezwzględnych kulek do liczenia do wybarwionych komórek i zamieszać. Poddaj je analizie cytometrii przepływowej (FCM). 
	UWAGA: Dane FCM uzyskano za pomocą analizatora komórek spektralnych i przeanalizowano za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej (FCM).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

ILC2 są ściśle związane ze stanem zapalnym typu 2 i zaburzeniami zapalnymi, jak wykazano w coraz większej liczbie badań. Zarówno modele mysie, jak i obserwacja człowieka przyczyniają się do lepszego zrozumienia jego funkcji w górnych drogach oddechowych. W patofizjologii astmy ILC2 są aktywowane przez limfopoetynę zrębu grasicy, IL-25 i IL-33, które są głównie wytwarzane przez komórki nabłonkowe. Następnie, odzwierciedlając komórki Th2, ILC2 wytwarzają IL-4, IL-5 i IL-13 w celu zaostrzenia stanu zapalnego typu 2<sup clas...

Wrodzone komórki limfoidalne grupy 2 (ILC2s) zostały po raz pierwszy odkryte w tkankach jamy otrzewnej myszy, a następnie wykazano, że są obecne we krwi i innych tkankach obwodowych, takich jak płuca, skóra i jama nosowa1,2,3. Jako komórki rezydujące w tkankach, ILC2 są głównie utrzymywane i namnażane lokalnie i działają jako pierwsi strażnicy reagujący na egzogenne szkodliwe bodźce poprzez wytwarzanie licznych cytokin typu 2 i indukowanie odporności typu 24,5,6. ILC2 mogą również wywierać swoje działanie poprzez transport w kierunku zainfekowanych tkanek7,8.
Podobnie jak w przypadku komórek T-helper 2 (Th2), skomplikowane sieci regulacyjne ILC2 zapewniają ich znaczący udział w postępie różnych chorób zapalnych typu 2, w tym chorób alergicznych dróg oddechowych8,9. W astmie alarminy pochodzące z komórek nabłonkowych mogą aktywować ILC2, które dodatkowo sprzyjają zapaleniu płuc poprzez wydzielanie interleukiny (IL)-4, IL-5 i IL-1310. Badania kliniczne wykazały również, że poziomy ILC2 były znacznie podwyższone w plwocinie i krwi pacjentów z ciężką astmą, co sugeruje związek ILC2 z ciężkością astmy i ich funkcją jako predyktora progresji astmy11.
Alergiczny nieżyt nosa (AR) jest powszechną przewlekłą chorobą zapalną, która dotyka miliony ludzi rocznie, a skuteczne metody leczenia tej choroby są ograniczone12,13. ILC2 odgrywają kluczową rolę w patofizjologii AR, zarówno w fazie uczuleni, jak i w fazie generowania objawów i stanu zapalnego14. U pacjentów z AR zgłaszano, że poziomy ILC2 we krwi obwodowej są podwyższone zarówno miejscowo, jak i ogólnoustrojowo15. Jednak pewne efekty i mechanizmy leżące u podstaw ILC2 na patofizjologię i progresję AR nadal wymagają dalszych badań.
CD226 - transbłonowa glikoproteina, która służy jako cząsteczka kostymulacyjna - ulega ekspresji głównie na komórkach NK (natural killer), limfocytach T i innych monocytach zapalnych16,17. Interakcja CD226 i jego ligandów (CD155 i/lub CD112) lub konkurenta (TIGIT) pozwala mu uczestniczyć w biologicznych funkcjach różnych komórek odpornościowych18. Wiązanie ligandów na komórkach prezentujących antygen z CD226 na limfocytach cytotoksycznych (CTL) sprzyja aktywacji obu komórek jednocześnie, podczas gdy aktywacja CTL może być dodatkowo tłumiona przez TIGIT (immunoreceptor limfocytów T z domenami Ig i ITIM), konkurenta CD22619,20. Badanie ex vivo na ludziach wykazało, że CD226 i CD155 na limfocytach T regulują równowagę między Th1 / Th17 i Th2 poprzez różnicową modulację podzbiorów Th21. CD226 może również pośredniczyć w adhezji płytek krwi i zabijaniu guza NK22,23. Tymczasem CD226 jest dobrze przebadany pod kątem patogenezy różnych chorób zakaźnych, chorób autoimmunologicznych i nowotworów18,24,25. Obecnie CD226 stał się nowym jasnym punktem w immunoterapii. Badania wykazały, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą odwrócić ekspresję CD226 na komórkach NK, aby przywrócić ich aktywność cytotoksyczną i interweniować w postęp raka płuc26. Niedawne badanie ujawniło podklaster płodowych ILC grupy 3 w jelitach płodowych charakteryzujących się wysoką ekspresją CD226 przez sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki27, co wskazuje, że CD226 może odgrywać role we wrodzonej odporności za pośrednictwem komórek limfoidalnych.
Nasza wiedza na temat ILC2 w zapaleniu dróg oddechowych opiera się głównie na badaniach nad astmą; jednak niewiele wiadomo o ich funkcjach w odporności błony śluzowej nosa. W związku z tym ustanowiono protokół izolacji i identyfikacji ILC2 z błony śluzowej nosa. Badanie koncentruje się na ekspresji CD226 na ILC2 w tkankach nosa i jego zmienności między myszami zdrowymi i AR. Może to dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw regulacji lokalnej odporności za pośrednictwem ILC2 i posłużyć jako podstawa do opracowania nowych podejść do leczenia AR.

<table><tbody><tr><td>Wodorotlenek glinu</td><td>Meilun technologia biologiczna</td><td>21645-51-2</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>11-0112-82</td><td>Stosowany w przeciwciałie</td></tr><tr><td>koktajl CD11c</td><td>BioLegend</td><td>117306</td><td>Stosowany w przeciwciałie</td></tr><tr><td>CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>Klon: 93; Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>CD226</td><td>BioLegend</td><td>128812</td><td>Stosowany w koktajlu przeciwciała</td></tr><tr><td>CD3e</td><td>BioLegend</td><td>100306</td><td>Stosowany w koktajlu przeciwciała</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103128</td><td>Stosowany w przeciwciałie</td></tr><tr><td>CD45R</td><td>eBioscience</td><td>11-0452-82</td><td>Stosowany w przeciwciałie Coctail</td></tr><tr><td>CD90.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>553014</td><td>Stosowany w przeciwciałach koktajl</td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>DIYIBio DY40128</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CountBright absolutne koraliki do liczenia</td><td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td>absolutne koraliki do liczenia</td></tr><tr><td>Dnase <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/63525/63525eq01v2.jpg" style="margin: auto; "></td><td>Beyotime</td><td>D7076</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Utrwalany barwnik żywotności eFluor 520 (FITC)</td><td>eBioscience</td><td>65-0867-14</td><td>FVD</td></tr><tr><td>HBSS, wapń, magnez</td><td>Servicebio</td><td>G4204-500</td><td></td></tr><tr><td>KLRG1</td><td>eBioscience</td><td>17-5893-81</td><td>Stosowany w koktajlu przeciwciała</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>SIGMA</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>NovoExpress</td> Oprogramowanie do <td>analizy cytometrii przepływowej (FCM)</td><td>AgilentTechnologies</td><td>wersja 1.5.0</td></tr><tr><td>OVA</td><td>SIGMA</td><td>9006-59-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Servicebio</td><td>G4202-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>Servicebio</td><td>G4207-500</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Yeasen</td><td>40501ES60</td><td>gęstość pożywka gradientowa</td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRV</td><td></td></tr><tr><td>Analizator komórek spektralnych</td><td>SONY</td><td>SA3800</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 z błony śluzowej nosa myszy w celu wykrycia ekspresji cd226

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

Dzięki licznym badaniom na temat wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 (ILC2) opublikowanym na przestrzeni lat, ILC2 są powszechnie znane z udziału w regulacji różnych procesów patologicznych, w tym odporności przeciw robakom, naprawie tkanek, termogenezie i chorobom autoimmunologicznym, takim jak astma i alergiczny nieżyt nosa (AR). ILC2 na stałe znajdują się w tkankach obwodowych, takich jak skóra, jelita, płuca i jama nosowa; Istnieją jednak ograniczone informacje na temat ich dokładnych funkcji w odporności błony śluzowej nosa. CD226 jest aktywującą cząsteczką kostymulacyjną, ulegającą głównie ekspresji na komórkach NK (natural killer), limfocytach T i monocytach zapalnych. Nie wiadomo jednak, czy ILC2 wyrażają CD226 lub odgrywają rolę w patogenezie chorób związanych z ILC2s. Tutaj opracowaliśmy metodę izolowania i identyfikowania ILC2 z błony śluzowej nosa i wykryliśmy ekspresję CD226 na ILC2 uzyskanych od zdrowych myszy i myszy AR. W niniejszym artykule opisujemy ten protokół izolacji i identyfikacji ILC2 z mysiej błony śluzowej nosa, który pomoże zbadać wewnętrzny patologiczny mechanizm zaburzeń immunologicznych w chorobach błony śluzowej nosa.

W celu zbadania roli komórek ILC2 w AR opracowano mysi model indukowany OVA. Konstrukcja mysiego modelu AR opierała się na wcześniejszych badaniach z niewielkimi modyfikacjami28,29,30,31. Nagrano 10-minutowy film, aby zmierzyć częstotliwość kichania i drapania nosa po ostatniej stymulacji donosowej. Objawy alergiczne myszy z indukowanym OVA AR przedstawiono na Rysunku 1</st...

Wrodzone komórki limfoidalne grupy 2 (ILC2), zaangażowane w zapalenie typu 2, głównie uczestniczą w odpowiedzi na infekcję robakami pasożytniczymi, choroby alergiczne, homeostazę metaboliczną i naprawę tkanek. W tym badaniu przedstawiono procedurę izolacji ILC2 z mysiej błony śluzowej nosa i wykrywania ekspresji CD226.

Izolacja wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 z błony śluzowej nosa myszy w celu wykrycia ekspresji CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

Protokół ten został opracowany w celu wyizolowania i zidentyfikowania wrodzonych komórek limfoidalnych grupy drugiej z mysiej błony śluzowej nosa oraz zbadania pewnych skutków i mechanizmów leżących u podstaw ILC dwa w chorobach nosa. Technika ta umożliwia naukowcom wyizolowanie ILC 2 z miejscowego międzybłonka i uwidocznienie ekspresji antygenu powierzchniowego za pomocą cytometrii przepływowej. Nasza technika nie obejmuje skomplikowanych operacji.Jednak jedną ważną rzeczą jest próba całkowitego usunięcia mięsa przylegającego do małych kości, aby uniknąć wpływu innych pobliskich tkanek Przed rozpoczęciem eksperymentu należy umieścić sześć dzikich myszy typu C57 czarnych samców i samic w wieku od 8 do 12 tygodni w określonych warunkach wolnych od patogenów, pod warunkiem zaopatrzenia w standardową karmę laboratoryjną i wodę. Aby ustalić model alergicznego nieżytu nosa, emulguj 50 mikrogramów albuminy jaja kurzego w 0,2 mililitra sterylnego PBS zawierającego dwa miligramy wodorotlenku glinu i wstrzyknij dootrzewnowo 50 mikrogramów zemulgowanej albuminy jaja kurzego każdej myszy przez zero, siedem i 14 dni. W dniach 21, 22, 23, 24 i 25 donosowo wkraplaj myszom 50 mikrogramów albuminy jaja kurzego rozpuszczonej w 30 mikrolitrach sterylnego PBS, a następnie poddaj myszy eutanazji 24 godziny po ostatnim prowokacji.Namocz głowę uśpionej myszy w 75% etanolu na pięć minut i unikaj przedostania się etanolu do zewnętrznego nozdrza. Połóż brzuch w dół na stole operacyjnym. Odetnij cztery zęby, a na linii środkowej głowy wykonaj nacięcie i rozetnij skórę nożyczkami.Następnie usuń dolną szczękę, odetnij cały nos wzdłuż końca podniebienia i umieść tkankę na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej pięć litrów lodowatego PBS. Za pomocą nożyczek i kleszczy usuń mięso i mięśnie przylegające do kości. Następnie przenieś nos myszy na nową 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą pięć mililitrów lodowatego PBS i umyj kości.Po drugim płukaniu przenieś nos do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Wystarczająco rozbić tkankę i przenieść ją do 15-mililitrowej probówki zawierającej dwa mililitry wstępnie podgrzanego buforu trawiennego. Zamocuj pokrywkę i umieść rurkę pionowo w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 120 do 150 obr./min na 40 minut.Następnie dodaj pięć mililitrów lodowatej pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, aby zatrzymać trawienie. Następnie przefiltruj zawartość przez sitko o średnicy 70 mikronów, aby usunąć fragmenty stałe. Po odwirowaniu filtratu o sile 500 G przez pięć minut, delikatnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w lodowatym podłożu RPMI 1640.Aby powtórzyć wirowanie, jak pokazano wcześniej, ponownie zawieś osad komórkowy w czterech mililitrach pożywki o gradiencie gęstości 40%. Następnie delikatnie włóż pipetę Pasteura do dna tuby, aby dodać 2,5 mililitra pożywki o gradiencie o gęstości 80%. Odwirować probówkę o sile 400 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej z szybkością przyspieszania i zwalniania niższą niż na trzecim biegu.Przed opróżnieniem komórek na granicy faz należy usunąć wierzchnią warstwę zanieczyszczeń, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia. Następnie za pomocą pipety odsączyć warstwę komórek jednojądrzastych na granicy faz gradientu gęstości 40% na 80% do 15-mililitrowej probówki zawierającej dwa mililitry lodowatego lodu. Umyj komórki dwukrotnie lodowatym PBS.Zebrać komórki i odwirować je przez pięć minut w temperaturze 500 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zawiesić osad komórkowy w buforze barwiącym i ponownie odwirować przez pięć minut w temperaturze 500 G. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić i inkubować komórki w roztworze blokującym o objętości 80 mikrolitrów przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.Dodać jeden mikrolitr dającego się utrwalić barwnika żywotności 520 tuż przed dodaniem do próbki 20 mikrolitrów koktajlu przeciwciał barwiących powierzchnię o odpowiednim rozcieńczeniu. Ustaw również pasujące przeciwciała izotypowe i fluorescencję minus jeden jako kontrole ujemne. Następnie umyj komórki w 500 mikrolitrach buforu barwiącego, wirując w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 200 mikrolitrach buforu barwiącego. Na koniec dodaj 50 mikrolitrów wirowych bezwzględnych kulek do liczenia do wybarwionych komórek. Wymieszaj je i poddaj analizie cytometrii przepływowej.Mysi model indukowany komórkami jajowymi opracowany w celu zbadania roli wrodzonych komórek limfoidalnych grupy drugiej wykazał, że częstotliwość pocierania nosa i kichania u myszy z alergicznym nieżytem nosa była znacznie wyższa niż w grupie kontrolnej. W błonie śluzowej nosa zdrowych myszy kontrolnych zidentyfikowano około 2 do 3% komórek ujemnych linii i komórek CD 45 dodatnich. Bezwzględna liczba wrodzonych komórek limfoidalnych grupy drugiej wahała się od 2 000 do 4 000.Analiza cytometrii przepływowej wykazała niezwykły wzrost całkowitej liczby wrodzonych komórek limfoidalnych grupy drugiej w błonie śluzowej nosa alergicznego nieżytu nosa w porównaniu ze zdrowymi myszami kontrolnymi. Wyższą ekspresję CD 226 wykryto w grupie drugiej wrodzonych komórek limfoidalnych u myszy z alergicznym nieżytem nosa niż u myszy kontrolnych. Ponadto średnia intensywność fluorescencji CD 226 była znacznie podwyższona u myszy AR.Należy pamiętać o krokach usuwania mięsa przylegającego do kości nosowej, ustawiania szybkości przyspieszania i zwalniania podczas wirowania pożywki i opróżniania komórek jednojądrzastych. Zidentyfikowane dwójki ILC mogą być podstawą do charakterystyki cytometrii przepływowej posortowanej do hodowli komórkowej lub stymulowanej in vitro, co pomogłoby w zbadaniu specyficznego ryzyka dwójek ILC w tkance nosowej. Ta procedura izolowania i charakteryzowania limfocytów, szczególnie we wrodzonych komórkach limfatycznych w błonie śluzowej nosa, sprawia, że protokół ten jest wstępnym odniesieniem dla naukowców badających lokalne środowisko immunologiczne nosa.

isolation-group-2-innate-lymphoid-cells-from-mouse-nasal-mucosa-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja limfocytów przy użyciu zestawu Miltenyi MACs jest niezawodną metodą oczyszczania komórek z homogenatów całych tkanek limfatycznych. Komórki oczyszczone za pomocą systemu Miltenyi charakteryzują się zazwyczaj czystością ≥ 96%. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki niezbędne do izolacji komórek T CD4+, wykorzystując jeden z wielu zestawów oferowanych przez firmę Miltenyi.

Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

Opisano metody badania udziału tkanki chłonnej związanej z nosogardłem (NALT) w nosowych i systemicznych odpowiedziach immunologicznych myszy na szczepionki podawane donosowo. Przedstawiamy procedurę chirurgiczną służącą do stworzenia modelu mysiego zależnego od NALT oraz hodowle ex vivo wyizolowanej tkanki NALT.

Badanie roli tkanki limforetykularnej związanej z nosogardzielą (NALT) w odpowiedziach myszy na szczepionki

Opisano wydajną metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne oraz separację w gradiencie Percoll w celu zapewnienia efektywnej izolacji. Technikę tę można również dostosować do zastosowania u innych...

Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

Rośnie zainteresowanie zrozumieniem funkcji immunologicznych określonych subpopulacji komórek w łatach Peyera (PP), głównych miejscach indukcyjnych tkanek limfatycznych związanych z jelitami.  W tym miejscu przedstawiamy równoległe protokoły przygotowania preparatów pojedynczych komórek PP do analizy cytometrii przepływowej i kriosekcji PP do barwienia immunologicznego.

Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera

Izolacja komórek zrębu węzłów chłonnych to wieloetapowa procedura obejmująca trawienie enzymatyczne i mechaniczną dezagregację w celu uzyskania fibroblastycznych komórek siatkowatych, limfatycznych i komórek śródbłonka krwi. W opisanej procedurze krótkie trawienie jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Opisujemy tutaj protokół izolacji komórek szpikowych ze skóry myszy i drenowania węzłów chłonnych po śródskórnym wstrzyknięciu sporozoitów Plasmodium. Cytometria przepływowa pobranych komórek zapewnia wiarygodny test charakteryzujący reakcję zapalną skóry i węzłów chłonnych drenujących na pasożyta.

Izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

W obecnym protokole wyjaśniamy, jak łatwo przetwarzać i hodować jednojądrzaste komórki migdałków od zdrowych ludzi poddawanych częściowej chirurgicznej operacji wycięcia migdałków, aby badać wrodzone reakcje immunologiczne po aktywacji, naśladując infekcję wirusową w tkankach błony śluzowej.

Izolacja jednojądrzastych komórek migdałków w celu zbadania ex vivo wrodzonych odpowiedzi immunologicznych w tkance limfatycznej błony śluzowej człowieka

Tutaj prezentujemy protokół do izolacji i identyfikacji ludzkich komórek niszy rąbkowej.

Izolacja i identyfikacja komórek niszy rąbka ramiennego

Poznaj metodę izolacji komórek ILC2 z błony śluzowej nosa myszy w celu wykrycia ekspresji CD226. Technika ta umożliwia badanie roli ILC2 w chorobach nosa za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 z błony śluzowej nosa myszy w celu wykrycia ekspresji CD226

Przeglądaj więcej filmów