Name: Sondy mocujące do pomiaru naprężenia do ilościowego określania mechaniki integryny i adhezji za pośrednictwem czynnika wzrostu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj metodę pomiaru naprężenia integryn za pomocą platformy czujników TGT w liniach komórkowych Cos-7. Technika ta umożliwia ilościową analizę wpływu EGFR na mechanikę komórkową i adhezję.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować członkom laboratorium Mattheyses za owocne dyskusje i krytykę. Potwierdzamy finansowanie dla A.L.M. z NSF CAREER 1832100 i NIH R01GM131099.

<ol><li>Lim, C. -G., Jang, J., Kim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+machinery+for+sensing+mechanical+force%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular machinery for sensing mechanical force.</a> BMB Reports. 51 (12), 623-629 (2018).</li>
<li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28Micro%29managing+the+mechanical+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">(Micro)managing the mechanical microenvironment.</a> Integrative Biology. 3 (10), 959-971 (2011).</li>
<li>Vogel, V., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+matter+in+health+and+disease.+From+Cancer+to+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces matter in health and disease. From Cancer to Tissue Engineering.</a> Nanotechnology. , 233-303 (2010).</li>
<li>Wang, J. H. C., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+rules+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Sports+Science%2C+Medicine+and+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Mechanics rules cell biology.</a> BMC Sports Science, Medicine and Rehabilitation. 2 (1), 16(2010).</li>
<li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+principles%2C+practices%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).</li>
<li>Streuli, C. H., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+co-operation+between+integrins+and+other+receptor+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Signal co-operation between integrins and other receptor systems.</a> Biochemical Journal. 418 (3), 491-506 (2009).</li>
<li>Chiasson-MacKenzie, C., McClatchey, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR-induced+cytoskeletal+changes+drive+complex+cell+behaviors%3A+The+tip+of+the+iceberg%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">EGFR-induced cytoskeletal changes drive complex cell behaviors: The tip of the iceberg.</a> Science Signaling. 11 (515), (2018).</li>
<li>Kechagia, J. Z., Ivaska, J., Roca-Cusachs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+as+biomechanical+sensors+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins as biomechanical sensors of the microenvironment.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 457-473 (2019).</li>
<li>De Luca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+EGFR+signaling+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The role of the EGFR signaling in tumor microenvironment.</a> Journal of Cellular Physiology. 214 (3), 559-567 (2008).</li>
<li>Javadi, S., Zhiani, M., Mousavi, M. A., Fathi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+Epidermal+Growth+Factor+Receptors+%28EGFR%29+and+integrins+in+resistance+to+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitors+%28TKIs%29+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between Epidermal Growth Factor Receptors (EGFR) and integrins in resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in solid tumors.</a> European Journal of Cell Biology. 99 (4), 151083(2020).</li>
<li>Eliceiri, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+and+growth+factor+receptor+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Integrin and growth factor receptor crosstalk.</a> Circulation Research. 89 (12), 1104-1110 (2001).</li>
<li>Dan, L., Jian, D., Na, L., Xiaozhong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+EGFR+and+integrin+affects+invasion+and+proliferation+of+gastric+cancer+cell+line%2C+SGC7901%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between EGFR and integrin affects invasion and proliferation of gastric cancer cell line, SGC7901.</a> OncoTargets and Therapy. 5, 271-277 (2012).</li>
<li>Giancotti, F. G., Tarone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+control+of+cell+fate+through+joint+integrin%2Freceptor+protein+kinase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews%3A+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Positional control of cell fate through joint integrin/receptor protein kinase signaling.</a> Annual Reviews: Cell and Developmental Biology. 19, 173-206 (2003).</li>
<li>Ricono, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+cross-talk+between+epidermal+growth+factor+receptor+and+integrin+alphavbeta5+promotes+carcinoma+cell+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Specific cross-talk between epidermal growth factor receptor and integrin alphavbeta5 promotes carcinoma cell invasion and metastasis.</a> Cancer Research. 69 (4), 1383-1391 (2009).</li>
<li>Polacheck, W. J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell-generated+forces%3A+a+guide+to+the+available+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools.</a> Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).</li>
<li>Hang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosensors+for+single+cell+mechanical+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Nanosensors for single cell mechanical interrogation.</a> Biosensors and Bioelectronics. 179, 113086(2021).</li>
<li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li>
<li>Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+traction+forces+by+micropillar+arrays%3A+contribution+of+substrate+warping+to+pillar+deflection%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Probing cellular traction forces by micropillar arrays: contribution of substrate warping to pillar deflection.</a> Nano Letters. 10 (5), 1823-1830 (2010).</li>
<li>Ma, V. P. -Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Nanotechnology+as+an+Emerging+Tool+to+Study+Mechanotransduction+in+Living+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">DNA Nanotechnology as an Emerging Tool to Study Mechanotransduction in Living Systems.</a> Small. 15 (26), 1900961(2019).</li>
<li>Kim, Y., Kim, K. A., Kim, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+DNA+force+sensors+to+study+the+molecular+level+forces+required+to+activate+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Korean+Physical+Society%22%5BJournal%5D)">Double-stranded DNA force sensors to study the molecular level forces required to activate signaling pathways.</a> Journal of the Korean Physical Society. 78 (5), 386-392 (2021).</li>
<li>Rao, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+activation+attenuates+the+mechanical+threshold+for+integrin+tension+and+focal+adhesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">EGFR activation attenuates the mechanical threshold for integrin tension and focal adhesion formation.</a> Journal of Cell Sciences. 133 (13), (2020).</li>
<li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167(2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 325-330 (2018).</li>
<li>Ma, V. P. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+induced+catalytic+amplification+reaction+for+readout+of+receptor-mediated+cellular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Mechanically induced catalytic amplification reaction for readout of receptor-mediated cellular forces.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5488-5492 (2016).</li>
<li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+single+molecular+forces+required+to+activate+integrin+and+notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling.</a> Science. 340 (6135), 991-994 (2013).</li>
<li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+regulated+conformational+change+of+integrin+%CE%B1V%CE%B23%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Force regulated conformational change of integrin αVβ3.</a> Matrix Biology. 60-61, 70-85 (2017).</li>
<li>Kantlehner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+coating+with+cyclic+RGD+peptides+stimulates+osteoblast+adhesion+and+proliferation+as+well+as+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Surface coating with cyclic RGD peptides stimulates osteoblast adhesion and proliferation as well as bone formation.</a> ChemBioChem. 1 (2), 107-114 (2000).</li>
<li>Kapp, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+evaluation+of+the+activity+and+selectivity+profile+of+ligands+for+RGD-binding+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comprehensive evaluation of the activity and selectivity profile of ligands for RGD-binding integrins.</a> Scientific Reports. 7, 39805(2017).</li>
<li>Kok, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+functional+evaluation+of+RGD-modified+proteins+as+alpha%28v%29beta%283%29+integrin+directed+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as alpha(v)beta(3) integrin directed therapeutics.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 128-135 (2002).</li>
<li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502(2017).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li>
<li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li>
<li>Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+tension-classifications%2C+interpretations+and+limitations+of+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001(2019).</li>
<li>Luca, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-Jagged+complex+structure+implicates+a+catch+bond+in+tuning+ligand+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Notch-Jagged complex structure implicates a catch bond in tuning ligand sensitivity.</a> Science. 355 (6331), 1320-1324 (2017).</li>
<li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li>
<li>Brockman, J. M., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+proofreading%3A+a+general+mechanism+to+enhance+the+fidelity+of+information+transfer+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Mechanical proofreading: a general mechanism to enhance the fidelity of information transfer between cells.</a> Frontiers in Physics. 7, 14(2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Dzięki szczegółowej procedurze krok po kroku opisanej powyżej, można przygotować powierzchnie TGT w celu ilościowego określenia morfologii komórek i napięcia integryny generowanego przez przylegające komórki podczas przyłączania i rozprzestrzeniania się komórek po leczeniu EGF. Prosta konstrukcja sondy, synteza i przygotowanie powierzchni wraz z prostą konfiguracją eksperymentalną zapewniły stabilną platformę do badania interakcji EGFR i integryn. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki potwierdzają, że zależna od ligandu aktywacja EGFR zwiększa rozprzestrzenianie się komórek, dostraja właściwości przenoszące siłę receptorów integryny oraz wspomaga organizację i dojrzewanie adhezji ogniskowej. Wyniki uzyskane za pomocą sond TGT potwierdzają nadrzędną hipotezę, że czynniki wzrostu, takie jak EGFR, działają jako "mechano-organizatorzy", zwiększając ilość i organizację przestrzenną napięcia integryny oraz regulując orientację i mechanikę zrostów ogniskowych.
Po nałożeniu na powierzchnię TGT komórki lądują, przyłączają się i rozprzestrzeniają, gdy receptory integryny (αVβ3) wyczuwają i wiążą się z ligandem cRGDfK. W ten sposób sondy TGT mogą zostać mechanicznie rozerwane, generując fluorescencję w miejscu zaangażowania ligandów. Odczyt jest skumulowaną "historią sił" komórki oddziałującej z powierzchnią. Istnieje kilka typowych problemów z powierzchniami TGT, które mogą występować podczas tych eksperymentów. Wysoka fluorescencja tła powierzchni (rysunek 6A,B), niejednolity wygląd powierzchni, niezdolność komórek do generowania sygnału napięcia (rysunek 6C,D) i niepowodzenie komórek w rozprzestrzenianiu się (rysunek 6E,F) mogą być spowodowane wadami technicznymi sondy TGT lub syntezy powierzchniowej. Rozwiązania tych typowych problemów przedstawiono w tabeli 1.
Prosta konstrukcja sond TGT zapewnia biologom komórkowym potężne narzędzie do badania określonych wyników sygnalizacji integryny czynnika wzrostu w izolacji, bez zakłóceń ze strony innych receptorów na powierzchni komórki, dostarczając tylko określone ligandy i stymulacje. Dodatkowo sondy TGT pozwalają na badanie progu napięcia podkreślającego poszczególne receptory integrynowe podczas adhezji komórek przy czułości pN. Alternatywne podejścia nie uwzględniają sił wywieranych przez poszczególne receptory z wysoką rozdzielczością przestrzenną w ustalonych próbkach31. Mikroskopia sił trakcyjnych jest czuła tylko na siły nN, o rząd wielkości wyższe niż siły przyłożone przez poszczególne receptory integryny15, a sondy napięcia molekularnego mierzą siły pN, ale ponieważ są odwracalne, nie wytrzymują solidnie fiksacji. Z tych powodów sondy TGT są atrakcyjnym narzędziem do badania mechaniki oddziaływań czynnik wzrostu-integryna.
Istnieje kilka niuansów technicznych związanych z sondami TGT, które należy wziąć pod uwagę przed zaprojektowaniem eksperymentu. Obraz napięcia jest migawką w czasie, reprezentującą historię siły, a nie wskaźnikiem zaangażowania receptor-ligand w dowolnym punkcie czasowym. Ponieważ generowanie sygnału zależy od separacji sondy, fluorescencja TGT wynika z otwartych sond, które nie są pod aktywnym napięciem spowodowanym zaangażowaniem receptor-ligand. Oznacza to, że odczyt naprężenia całki uzyskany na powierzchni TGT ma charakter historyczny i kumulatywny, reprezentujący miejsca, w których występowały siły większe niż Ttol; lokalizacje obecnych sił receptor-ligand mniejszych niż Ttol nie są podane19,32. Ponieważ pęknięcie TGT powoduje zakończenie zaangażowania receptor-ligand, rozprzestrzenianie się komórek jest spowodowane interakcjami integryna-ligand, które doświadczają sił niższych niż Ttol. Użytkownik musi zatem zachować ostrożność podczas definiowania czasu po poszyciu, aby oszacować wyniki mechaniczne związane z adhezjami na bazie integryn. Na koniec należy rozważyć znaczenie Ttol. Zastosowane tutaj sondy TGT mają Ttol 56 pN, gdzie Ttol jest stałą siłą potrzebną do rozerwania 50% sond przy zastosowaniu przez 2 s. Biorąc pod uwagę skomplikowane systemy biologiczne, TGT prawdopodobnie doświadczają niejednorodnej i zróżnicowanej gradacji sił z różnymi zależnościami czasowymi. Jeśli TGT zostaną rozerwane przez siły większe niż Ttol, fluorescencja byłaby niedoszacowaniem całkowitego napięcia. Alternatywnie, siły poniżej Ttol przyłożone przez dłuższy czas mogą spowodować pęknięcie podobnej liczby sond, co wysokie siły progowe przyłożone przez krótszy czas. Oba te scenariusze mogą skutkować takim samym odczytem intensywności fluorescencji, co utrudnia określenie dokładnej wielkości lub dynamiki naprężenia przy użyciu sond TGT33,34.
Ogólnie rzecz biorąc, oceny napięcia integryny ze stymulacją czynnikiem wzrostu powinny być dokonywane ostrożnie, projektując eksperymenty z kontrolami wewnętrznymi, porównując profile rozprzestrzeniania się na innych powierzchniach pokrytych matrycą, dokonując równoległych ocen fluorescencji TGT w komórkach w obecności lub bez stymulacji czynnika wzrostu oraz stosując TGT o różnym Ttol. TGT umożliwiają ilościowe określenie roli sygnalizacji czynnika wzrostu w regulacji mechaniki receptorów integrynowych, dynamiki adhezji ogniskowej i rozprzestrzeniania się komórek. Protokół ten może być używany jako szablon dla wielu eksperymentów opartych na TGT przy użyciu sond o różnymT tol, różnych ligandach, różnych typach komórek lub różnych warunkach stymulacji. Dowolne białka będące przedmiotem zainteresowania mogą być znakowane po utrwaleniu i można zastosować dowolny rodzaj ilościowej analizy obrazu. W związku z tym przedstawiamy szablon dla wielu eksperymentów TGT.
Zastosowanie sond TGT nie ogranicza się do badania integryn, ale można je rozszerzyć na różnorodny zestaw receptorów błony komórkowej w różnych typach komórek poprzez modyfikację ligandu. Sondy TGT wykorzystano do zbadania roli sił w regulacji różnych kaskad sygnalizacji receptorów, w tym do identyfikacji mechanicznej roli mechaniki receptora Notch w rozwoju embrionalnym i neurogenezie35, sił pośredniczących w identyfikacji i internalizacji antygenów przez receptory komórek B36 oraz zdolności mechanicznej korekty receptorów powierzchniowych komórek T do wykrywania zmian sił w celu zwiększenia siły i swoistości transferu sygnału37. Łącznie odkrycia te podkreślają ogromny potencjał sond TGT w różnych warunkach eksperymentalnych.

Komórki mają wrodzoną zdolność do wyczuwania, generowania i reagowania na siły mechaniczne, co prowadzi do zmian w fenotypie komórkowym i przebudowy lokalnego mikrośrodowiska1,2. Siły odgrywają kluczową rolę w regulacji wielu aspektów zachowania komórek, w tym adhezji, migracji, proliferacji, różnicowania i gojenia się ran3,4. Aberracje w dwukierunkowej wymianie mechanicznej między komórką a mikrośrodowiskiem mogą prowadzić do stanów chorobowych, w tym raka5. Liczne receptory błonowe są zaangażowane w utrzymanie homeostazy macierzy komórkowej; spośród nich integryny i receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) wykazują silną synergię6,7. Klasycznie integryny ustanawiają mechaniczne połączenie między mikrośrodowiskiem a wewnątrzkomórkowym cytoszkieletem, podczas gdy EGFR reguluje wzrost, proliferację i przeżycie komórek8,9. EGFR jest wysoce zbadanym celem terapeutycznym, skoncentrowanym na regulacji zewnętrznej ułatwiającej sygnalizację wewnątrzkomórkową. Przesłuch EGFR-integryna został ustalony genetycznie i biochemicznie w celu regulacji postępu wielu chorób, w tym raka10,11. Podczas gdy badania wskazują na istnienie wzajemnych oddziaływań EGFR-integryna, wyniki przypisuje się szlakom sygnałowym z dala od błony komórkowej7,12,13,14. Wpływ EGFR lub innych czynników wzrostu na mechanikę komórek pozostaje w dużej mierze niezbadany, częściowo z powodu braku narzędzi do pomiaru sił komórkowych i wyników sygnalizacji. Wyzwanie polega na zidentyfikowaniu odpowiednich narzędzi do badania komunikacji między tymi równoległymi paradygmatami sygnalizacji i ilościowego określenia ich konkretnego wkładu w mechanikę komórki.
Opracowano kilka podejść do pomiaru sił generowanych przez receptory adhezyjne komórek, a czytelnik jest kierowany do szczegółowych recenzji tych technik15,16. Krótko mówiąc, mikroskopia sił trakcyjnych i detekcja matryc mikrofilarów opierają się na deformacji podłoża w celu wywnioskowania sił nanoniutonów (nN), o rząd wielkości większych niż siły poszczególnych receptorów17,18. Techniki jednocząsteczkowe, w tym AFM i pęseta optyczna, są wrażliwe na siły pikonewtonu pojedynczego białka (pN), ale mierzą tylko jeden receptor na raz i nie oferują dobrej (lub żadnej) rozdzielczości przestrzennej. Sondy napięcia molekularnego oparte na DNA i sondy TGT oferują rozdzielczość siły pN z ograniczoną dyfrakcją (lub lepszą) rozdzielczością przestrzenną, co nadaje im wyjątkową rolę w badaniu sił pojedynczych komórek19,20 z różnych typów komórek, w tym fibroblastów, komórek rakowych, płytek krwi i komórek odpornościowych21,22,23,24. Podczas gdy sondy napięcia molekularnego mają wysuwany element "sprężynowy", idealny do obrazowania w czasie rzeczywistym, sondy TGT nieodwracalnie pękają, pozostawiając fluorescencyjną "historię sił". TGT dodatkowo modulują próg naprężenia podłoża znajdującego się pod spodem; seria sond o podobnym składzie chemicznym, ale różnych siłach zerwania lub tolerancjach naprężenia (Ttol) może być wykorzystana do ilościowego określenia minimalnego napięcia wymaganego do tworzenia adhezji ogniskowej i rozprzestrzeniania się komórek. Sondy TGT składają się z dwóch komplementarnych nici DNA, z których jedna jest zakotwiczona w powierzchni, a druga przedstawia komórce ligand. Jeśli receptor wiąże ligand i wywiera siłę większą niżT tol sondy, nici zostaną rozdzielone. Ttol definiuje się jako stałą siłę potrzebną do rozerwania 50% sond w odstępie 2 s w idealnych warunkach. W "włączających" sondach TGT wygaszacz na górnym splocie można oddzielić od fluoroforu na dolnym splocie. Tylko w przypadku, gdy sonda TGT została zerwana, przypuszczalnie przez siły większe lub równe Ttol, zostanie wygenerowany sygnał fluorescencyjny. Sondy TGT mogą być również zamocowane, co pozwala na łatwą manipulację systemami biologicznymi i testowanie wielu warunków. Z tych powodów w pracach wykorzystano sondy TGT.
Sondy TGT zostały wykorzystane do zbadania, jak zależne od integryny adhezja komórek i siły mechaniczne są modulowane przez aktywowany EGFR21. Prace te ugruntowały pozycję EGFR jako "mechano-organizatora", dostrajającego organizację przyczepności ogniskowej i generowanie naprężeń. Ponadto stwierdzono, że stymulacja EGF wpływa na dystrybucję i dojrzałość zrostów ogniskowych oraz zwiększa rozprzestrzenianie się komórek. Podejście to może zostać wykorzystane w przyszłych badaniach w celu zbadania, w jaki sposób czynniki wzrostu wpływają na siły mechaniczne w progresji i dynamice guza. Podczas gdy rola przesłuchu EGFR-integryna w regulacji przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego jest już ustalona, rola sił mechanicznych w tym procesie pozostaje niedostatecznie zbadana10.
Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół dla tych eksperymentów, obejmujący syntezę i montaż 56 sond TGT pN, generowanie powierzchni TGT na szklanych szkiełkach nakrywkowych, zastosowanie komórek Cos-7 na powierzchni TGT i stymulację EGF, utrwalanie i barwienie komórek falloidyną oraz przeciwciałem anty-paxillin, obrazowanie wysokiej rozdzielczości całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) i mikroskopii kontrastowej interferencji odbicia (RICM), i kwantyfikacja obrazu. Protokół ten, choć napisany w celu zbadania stymulacji EGF komórek Cos-7, można łatwo dostosować do wielu eksperymentów opartych na TGT. Różne ligandy, Ttol, typy komórek, parametry stymulacji, białka znakowane po utrwaleniu i analiza ilościowa mogą być łatwo zastąpione, dzięki czemu protokół ten jest solidny i szeroko użyteczny.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropylo)trietoksysilan</td><td>Millipore Sigma</td><td>440140</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr><tr><td>Kwas 3-hydroksypikolinowy (3-HPA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>56197</td><td>Maldi-TOF-MS Matrix</td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowaty</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38S</td><td>Rozcieńczanie EGF</td></tr><tr><td>Acetonitryl (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK</td><td>Preparat</td></tr> <tr>oligonukleotydowy<td>Alexa Fluor 488</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td> falloidyny <td>8878S</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A687</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-paksylinowe [Y113]</td> <td>Abcam</td><td>ab32084</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>BD Strzykawki tylko z Luer-Lok</td><td>BD bioscience</td><td>309657</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr><tr><td>Bio-Gel P-2</td><td>Bio-Rad</td><td>1504118</td><td>Preparat oligonukleotydowy</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Proszek wolny od proteaz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr><tr><td>Komórki Cos-7</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>Hodowla komórkowa, numery pasażków 11-20</td></tr><tr><td>Mini-stojak na szkiełka nakrywkowe, na 8 szkiełek nakrywkowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>C14784</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr><tr><td>c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8- Kwas amino-3,6-dioksaoktanowy</td><td>Vivitide</td><td>PCI-3696-PI</td><td>Preparat oligonukleotydowy</td></tr><tr><td>Ester Cy3B NHS</td><td>GE Healthcare</td><td>PA63101</td><td>Preparat oligonukleotydowy Preparat oligonukleotydowy</td></tr><tr><td>dimetyloformamidu</td><td>Millipore Sigma</td><td>PHR1553</td><td></td></tr><tr><td>DMEM z L-glutaminą, glukozą 4,5 g / l i pirogronianem sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10013C</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu ludzki EGF</td><td>Millipore Sigma</td><td>E9644</td><td>Etanol z hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>, 200 dowodów (100%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22032601</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr><tr><td>Falcon Standardowe naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772E</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-438-026</td><td>Flurobryt do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td> DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>koziego przeciwciała anty-króliczego IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21244</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-210-064</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Hank' s zrównoważone sole (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-161</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Surowica konia</td><td>Fisher Scientific</td><td>16050130</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr><tr><td>Urządzenia odśrodkowe Nanosep MF</td><td>Laboratorium Pall</td><td>ODM02C35</td><td>Preparat oligonukleotydowy</td></tr><tr><td>NHS-azydek</td><td>Fisher Scientific</td><td>88902</td><td>Preparat oligonukleotydowy</td></tr><tr><td>Butla z azotem</td><td>Przygotowanie powierzchni</td><td>gazu</td><td></td> powietrznego</tr><tr><td>nr 2 okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe - 25 mm</td><td>VWR</td><td>48382-085</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr><tr><td>Folia laboratoryjna Parafilm M</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16%</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>PBS, 1X</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-030-CV</td><td>Przygotowanie powierzchni/Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (5,000 U/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-070-063</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>PYREX Low Form Griffin Beakers</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540G</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-606-310</td><td>Preparat oligonukleotydowy</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td>Preparat oligonukleotydowy</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>434301</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS-LC-Biotyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>21335</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300-500</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr><tr><td>TEAA</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0322726</td><td>Preparat oligonukleotydowy</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Millipore Sigma</td><td>471283</td><td>Preparat oligonukleotydowy</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI28901</td><td>Preparat oligonukleotydowy</td></tr><tr><td>THPTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1296293</td><td>Preparat oligonukleotydowy</td></tr><tr><td>Triton X 100 Detergent Surfact Ams Roztwór</td><td>Fisher Scientific</td><td>85111</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Woda, klasa DNA, DNASE, bez proteazy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24701</td><td>Preparat oligonukleotydowy</td></tr> <tr><td><silny>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent AdvanceBio Oligonukleotyd C18, 4,6 x 150 mm, 2,7 &mu; m</td><td>Agilent</td><td>653950-702</td><td>Preparat oligonukleotydowy</td></tr><tr><td>Wysokosprawna chromatografia cieczowa</td><td>Agilent</td><td>1100</td><td>Preparat oligonukleotydowy</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna o niskiej prędkości</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-320-813</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy czasu przelotu wspomagany desorpcją laserową / jonizacją matrycy (MALDI-TOF-MS)</td><td>Voyager STR</td><td></td><td>Przygotowanie oligonukleotydów</td></tr><tr><td>Sondy molekularne Komora komórkowa Attofluor</td><td>Fisher Scientific</td><td>A7816</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Preparat oligonukleotydowy</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse Ti</td> pe <td>Mikroskopia</td><td>Nikon Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Doskonały system ustawiania ostrości</td><td>Mikroskopia Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie NIS Elements</td><td>Mikroskopia</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 V3 Cyfrowy aparat CMOS</td><td>Mikroskopia Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czterozakresowa kostka TIRF 405/488/561/647 Mikroskopia</td><td>CHROMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kostka RICM Mikroskopia</td><td>CHROMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA V-nIR Light Engine</td><td>Lumencor</td><td></td><td>Mikroskopia</td></tr><tr><td>Thermo Forma Steri Cycle Inkubator CO2 370</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa VWR 75D</td><td>VWR</td><td>13710</td><td>Przygotowanie powierzchni</td></tr> <tr><td>< silny> Analiza danych</td><td></td><td></td><td>Zastosowanie</td></tr><tr><td>Fidżi (zdjęcie J)</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td>Analiza ilościowa</td></tr><tr><td>Wykres Pad Pryzmat</td><td></td><td></td><td>Analiza statystyczna</td></tr><tr><td><silny>Nazwa oligo< / silny></td><td><silny> 5' modyfikacja/ Modyfikacja 3'</silny></td><td><silny> Sekwencja (5' do 3')</silny></td><td><silny>Zastosowanie</silny></td></tr><tr><td>Alkine-21-BHQ2</td><td>5' Heksynyl/ 3' BHQ_2</td><td>GTGAAATACCGCACAGATGCGGGGGGG:</td><td>Sonda TGT z górnym pasmem</td></tr><tr><td>56 pN TGT</td><td>5' Biosg/ TTTTTT/iUniAmM</td><td>CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT</td><td>Dolna nić sonda TGT</td></tr><tr><td>12 pN TGT</td><td>5' AmMC6/ 3' BioTEG</td><td>CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT</td><td>Dolna żyła sonda TGT</td></tr></tbody></table>

sondy mocujące do pomiaru naprężenia do ilościowego określania mechaniki integryny i adhezji za pośrednictwem czynnika wzrostu

Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion

Organizmy wielokomórkowe polegają na interakcjach między receptorami błonowymi i pokrewnymi ligandami w otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) do zarządzania wieloma funkcjami, w tym adhezją, proliferacją, migracją i różnicowaniem. Siły mechaniczne mogą być przenoszone z komórki za pośrednictwem integryny receptora adhezyjnego do ligandów w ECM. Ilość i organizacja przestrzenna tych sił generowanych przez komórki może być modulowana przez receptory czynnika wzrostu, w tym receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR). Obecnie dostępne narzędzia do ilościowego określania zmian w mechanice komórek spowodowanych przesłuchami i powiązania ich ze zrostami ogniskowymi, morfologią komórkową i sygnalizacją są ograniczone. Do ilościowego określenia tych zmian wykorzystano oparte na DNA czujniki siły molekularnej, znane jako uwięzi miernika napięcia (TGT). Sondy TGT są wyjątkowe pod względem zdolności zarówno do modulowania podstawowego progu siły, jak i raportowania sił receptora w skali Piconewtona na całej przylegającej powierzchni komórki w rozdzielczości przestrzennej ograniczonej dyfrakcją. Zastosowane tutaj sondy TGT opierają się na nieodwracalnej dysocjacji dupleksu DNA przez siły receptor-ligand, które generują sygnał fluorescencyjny. Pozwala to na ilościowe określenie skumulowanego napięcia integryny (historii sił) komórki. W artykule opisano protokół wykorzystujący TGT do badania wpływu EGFR na mechanikę integryny i tworzenie adhezji. Montaż mechanicznej platformy detekcyjnej TGT jest systematycznie szczegółowy, a procedura obrazowania sił, zrostów ogniskowych i rozprzestrzeniania się komórek jest nakreślona. Ogólnie rzecz biorąc, zdolność do modulowania podstawowego progu siły sondy, liganda adhezyjnego oraz rodzaju i stężenia czynnika wzrostu zastosowanego do stymulacji sprawiają, że jest to solidna platforma do badania wzajemnych oddziaływań różnych receptorów błonowych w regulacji sił za pośrednictwem integryny.

Sondy TGT typu „turn-on” zostały wykorzystane do zbadania wpływu aktywowanego ligandem receptora epidermalnego czynnika wzrostu (EGFR) na mechanikę komórek oraz tworzenie adhezji zapośredniczonej przez integryny w komórkach Cos-721. Sondy te zawierają ligand cykliczny Arg-Gly-Asp-Phe-Lys (cRGDfK)21,23,25,26, który wykazuje selektywność wobec heterodimeru integryny αVβ3 przy niewielkim powinowactwie do integryn α5β127,28,29,30. Sonda TGT składa się z dupleksu DNA zfunkcjonalizowanego na powierzchni szkiełka przedmiotowego via niższa nić za pomocą wiązania biotyna-streptawidyna. Górna nić eksponuje ligand integryny i jest dostępna do wiązania z odpowiadającym mu receptorem integrynowym na błonie komórkowej (Rysunek 5A). Niższa nić jest znakowana fluoroforem, a górna wygaszaczem, co prowadzi do minimalnej fluorescencji tła, gdy dupleks TGT pozostaje nienaruszony. Jeśli integryna zwiąże ligand i przyłoży siłę o wartości większej niż Ttol sondy, dupleks DNA rozdzielą się, co doprowadzi do emisji fluorescencji (Rysunek 5A). Każda sonda TGT, która nie została zerwana przez siłę mechaniczną, pozostanie niefluorescencyjna. Ta selektywna względem siły fluorescencja typu „turn-on” umożliwia systematyczne i ilościowe mapowanie generowanych przez integryny sił w skali pN z rozdzielczością ograniczoną dyfrakcyjnie. Sondy TGT dodatkowo modulują próg napięcia podłoża.
Przedstawiono tutaj reprezentatywny przykład powierzchni TGT z Ttol wynoszącym 56 pN. Komórki Cos-7 wysiano na tę powierzchnię TGT z lub bez stymulacji EGF, aby zbadać wpływ aktywacji EGFR przez liganda na adhezję komórek i mechanikę integryn (Rysunek 5A,B). Komórki inkubowano z lub bez EGF na powierzchniach TGT przez 60 min, po czym utrwalono i poddano immunobarwieniu w celu wykazania rozkładu adhezji ogniskowych (paksylina) oraz organizacji cytoszkieletu (aktyna F) (Rysunek 5B). Następnie wykonano obrazowanie komórek z wykorzystaniem mikroskopii RICM i TIRF. Jak wyraźnie widać na obrazie RICM, rozprzestrzenianie się komórek Cos-7 na powierzchni TGT 56 pN było znacznie silniejsze po stymulacji EGF w porównaniu do braku stymulacji. Ilościowo określono to dla 50 komórek w każdym wariancie, mierząc wielkość obszaru kontaktu komórka-podłoże na obrazie RICM (Rysunek 5C). Stymulacja EGF doprowadziła do uzyskania bardziej okrągłej morfologii, reprezentatywnej dla komórek Cos-7 rozprzestrzeniających się i rosnących w ich naturalnym środowisku fizjologicznym (Rysunek 5D). Fluorescencja otwartych sond jest również wyższa przy stymulacji EGF, co zaobserwowano na obrazie fluorescencji naprężeń. Zintegrowana intensywność otwartych sond, która jest proporcjonalna do ich liczby, była znacznie wyższa po stymulacji EGF w porównaniu do próby bez stymulacji (Rysunek 5B,E). Stanowi to obraz wszystkich oddziaływań receptor-ligand, w których integryny wywarły siłę większą niż Ttol (56 pN).
Barwienie na paksyllinę wykazało, że stymulacja EGF wpłynęła również na rozkład, liczbę, stopień dojrzałości (rozmiar) oraz organizację adhezji ogniskowych. Adhezje ogniskowe w komórkach stymulowanych EGF wydawały się bardziej dojrzałe i zorientowane radialnie w porównaniu z kontrolami bez EGF. Organizacja cytoszkieletu aktynowego (F-aktyny) była również wzmocniona po stymulacji EGF, co oceniono za pomocą barwienia falloidyną (Rycina 5B). Te oceny jakościowe przeprowadzono poprzez wizualne porównanie obrazów z obu grup badawczych. Możliwa jest analiza ilościowa adhezji ogniskowych, jednak wykracza ona poza zakres niniejszego protokołu. W tym doświadczeniu powierzchnia TGT zapewniła platformę do systematycznego szczegółowego opisania wpływu aktywacji EGFR na rozprzestrzenianie się komórek, mechanikę integryn oraz tworzenie adhezji ogniskowych.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Schemat pierwszego dnia przygotowania powierzchni TGT. (A) Oczyszczanie szkiełek coverglass. (B) Trawienie powierzchni szkiełek. (C) Neutralizacja roztworu Piranha. (D) Silanizacja powierzchni w celu utworzenia reaktywnych grup aminowych. (E) Równoważenie szkiełek względem fazy organicznej. (F) Suszenie szkiełek gazem obojętnym. (G) Biotynylacja aminowych grup powierzchniowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Schemat drugiego dnia przygotowania powierzchni TGT. (A) Oczyszczenie i osuszenie szkiełek nakrywek w celu usunięcia resztek biotyny z dnia poprzedniego. (B) Pasywacja BSA w celu zapobiegania nieswoistemu wiązaniu odczynników w kolejnych etapach. (C) Funkcjonalizacja szkiełek nakrywek streptawidyną. (D) Hybrydyzacja sond w termocyklerze. (E) Nałożenie zsyntetyzowanych sond na szkiełka nakrywki. (F) Montaż szkiełka nakrywki w komorze do obrazowania komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Ogólny schemat przedstawiający główne etapy całego układu eksperymentalnego. (A) Proces odrywania komórek i wysiewania ich na powierzchnię TGT w pożywce podstawowej (DMEM) z lub bez stymulacji EGF. (B) Schemat blokowy kroków związanych z fiksacją i immunobarwieniem po przyczepieniu i rozprzestrzenianiu się komórek na powierzchni TGT. (C) Po barwieniu komórki są obrazowane przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z wykorzystaniem mikroskopii RICM i TIRF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Przykład przetwarzania danych i analizy ilościowej. (A) Etapowy opis potoku analizy wykorzystanego w programie Fiji (ImageJ) do ilościowego pomiaru obrazów RICM i naprężeń. (B) Reprezentatywny przykład wyników morfometrycznych komórek analizowanych za pomocą powyższego potoku. (C) Reprezentatywne przykłady wyników mechanicznych komórek analizowanych za pomocą wyżej wspomnianego potoku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig05.jpg" /> 
Rycina 5Przykładowe dane z eksperymentu TGT. (A) Schemat przedstawiający strefę kontaktu na interfejsie błony komórkowej i powierzchni TGT. Wstawka przedstawia integryny wchodzące w interakcję z ligandem cRGDfK po stymulacji EGF (po prawej) lub bez stymulacji EGF (po lewej). (B) obrazy RICM i TIRF komórek Cos-7 rozprzestrzenionych na powierzchni TGT o sile 56 pN. Obrazy uzyskano 60 minut po wysiewaniu, z lub bez stymulacją EGF. Przedstawiono poszczególne obrazy RICM (surowe), napięcia integryn (skala szarości), paxylliny (pomarańczowy hot) oraz aktyny F (niebiesko-zielony) wraz z nałożonymi obrazami dla obu warunków stymulacji. Pasek skali: 10 &#956;mWstawka przedstawia powiększony ROI (obszar zainteresowania), szczegółowo ukazujący kolokalizację generowanego napięcia integryn w miejscach tworzenia się adhezji znakowanych paksylliną oraz leżącą u podstaw organizacji subkomórkowego cytoszkieletu znakowanego aktyną. Pasek skali: 5 &#956;m. (C-E) Wykresy rozrzutu dla powierzchni rozprzestrzenienia (obrysu komórki w RICM) (C), kolistość (D), oraz zintegrowane napięcie (E) dla komórek Cos-7 ze stymulacją EGF lub bez niej. Słupki oznaczają średnią &#177; odchylenie standardowe. Różnice między grupami oceniono statystycznie za pomocą testu t Studenta t-test; ****P &#60; 0,001. n = 50 komórek w trzech niezależnych eksperymentach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63529/63529fig06.jpg" /> 
Rysunek 6: Przykłady powierzchni TGT z różnymi możliwymi problemami. (A) Obrazy napięcia i RICM idealnej powierzchni TGT zmontowaną sondą wygaszoną przed adhezją komórek. (B) Obrazy napięcia i RICM powierzchni TGT, w której sonda TGT nie posiada górnej nici (wygaszacza). Obraz napięcia wykazuje jednorodną fluorescencję z otwartego fluoroforu w nici dolnej. (C) Obrazy napięcia i RICM dla komórek rozprzestrzenionych na idealnej powierzchni TGT. (D) Obrazy napięcia i RICM dla komórek rozprzestrzenionych na źle przygotowanej powierzchni TGT z ograniczoną pasywacją lub zdegradowaną sondą. (E) Obrazy napięcia, RICM i w jasnym polu dla komórek wysianych na idealnej powierzchni z ligandem cRGDfK, wskazujące, że interakcje cRGDfK-integryna są kluczowe dla przylegania komórek i generowania napięcia. (F) Obrazy napięcia, RICM i w jasnym polu dla komórek wysianych na powierzchni bez ligandu cRGDfK na TGT. Chociaż komórki są widoczne na obrazie w jasnym polu, nie obserwuje się przylegania komórek ani generowania napięcia integrynowego. Pasek skali: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63529/63529fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Powierzchnia TGT to innowacyjna platforma do badania przesłuchów czynnika wzrostu z integryną. Elastyczna konstrukcja sondy, specyficzność liganda adhezyjnego i precyzyjna modulacja warunków stymulacji pozwalają na solidną ocenę ilościową wzajemnych oddziaływań EGFR-integryna. Wyniki wskazują, że EGFR jest "mechano-organizatorem" dostrajającym mechanikę integryny, wpływającym na ogniskowy montaż adhezyjny i rozprzestrzenianie się komórek.

Sondy mocujące do pomiaru naprężenia do ilościowego określania mechaniki integryny i adhezji za pośrednictwem czynnika wzrostu

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate ...

Protokół ten jest istotny ze względu na prostotę platformy czujników TGT wykorzystywanych do badania przesłuchów EGFR-integryna i jej wpływu na siły mechaniczne ogniw. Rao postanowił zbadać zależną od EGF regulację mechaniki komórki. Protokół można dostosować do różnych ligandów, typów komórek, paradygmatów stymulacji i można go łączyć z TGT o różnych progach napięcia.Synteza powierzchniowa może na początku wydawać się onieśmielająca. Kluczem jest przygotowanie i zorganizowanie się tak, aby precyzyjnie wykonać skomplikowane kroki, wykorzystując listę kontrolną do przygotowania odczynnika i obliczeń. Pierwszego dnia umieść do ośmiu 25-milimetrowych szklanych wkładek osłonowych w stojaku z politetrafluoroetylenu.Umieść stojak w 50-mililitrowej zlewce borokrzemianowej zawierającej 40 mililitrów 200-procentowego etanolu. Sonikować z częstotliwością roboczą 35 kiloherców przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Napełnij 50-mililitrową zlewkę 40 mililitrami świeżo przygotowanego roztworu piranii przez zmieszanie kwasu siarkowego i nadtlenku wodoru w stosunku 3:1 w zlewce Pyrex i wymieszanie szklaną pipetą.Przenieść stojak na szkiełka nakrywkowe do zlewki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w dygestoriach w celu wytrawienia powierzchni szkiełka nakrywkowego. Po wytrawieniu przenieś stojak na szkiełka nakrywkowe do zlewki z ultraczystą wodą za pomocą pęsety. Sprawdź wzrokowo szkiełka nakrywkowe, aby upewnić się, że powierzchnie wyglądają na czyste, bez wzorów i cząstek kurzu na powierzchni szkła.Przenieść stojak na szkiełka nakrywkowe do zlewki z 200-procentowym etanolem i umyć dwukrotnie przez 15 sekund, aby wyrównać powierzchnię z rozpuszczalnikiem organicznym. Przenieś stojak na szkiełka nakrywkowe do 200-procentowego roztworu etanolu z 3% APTES na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby zsilić szkiełka nakrywkowe. Zanurz ruszt w czystej zlewce z 200-procentowym roztworem etanolu.Wysuszyć szkiełka nakrywkowe przy użyciu gazowego azotu o niskim ciśnieniu wyjściowym. Umieść pokrywę w 10-centymetrowym naczyniu z polistyrenowym kawałkiem folii parrafinowej ułożonym płasko w środku. Dodaj 100 mikrolitrów dwóch miligramów na mililitr roztworu biotyny NHS w DMSO do czterech szkiełek nakrywkowych umieszczonych na folii parafinowej.Ustaw kanapkę z pozostałymi czterema szkiełkami nakrywkowymi na wierzchu, tak aby dwa szkiełka nakrywkowe były skierowane do siebie, z roztworem funkcjonalizacyjnym pomiędzy nimi. Drugiego dnia zdejmij naczynie z czterech stopni Celsjusza i oddziel kanapkowe szkiełka nakrywkowe. Unikaj zarysowania lub uszkodzenia funkcjonalizowanej powierzchni podczas oddzielania kanapki.Następnie ustaw szkiełka nakrywkowe w stojaku tak, aby powlekana powierzchnia była skierowana do siebie. Suszyć gazowym azotem. Umieść szkiełka nakrywkowe w nowym naczyniu z folią parrafinową w środku.Dodaj 800 mikrolitrów 0,1% albuminy surowicy bydlęcej w 1X PBS do każdego szkiełka nakrywkowego. Inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 30 minut w celu pasywizacji powierzchni i zablokowania niespecyficznego wiązania kolejnych odczynników funkcjonalizacyjnych. Aby funkcjonalizować szkiełka nakrywkowe, dodaj 800 mikrolitrów jednego mikrograma na mililitr streptawidyny w 1X PBS w temperaturze pokojowej przez 45 do 60 minut.Zamontuj sondy TGT w probówce do PCR za pomocą termocyklera. Po inkubacji umyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1X PBS. Dodaj 100 mikrolitrów wstępnie zmontowanych sond TGT do czterech szkiełek nakrywkowych i przygotuj kanapki, używając pozostałych czterech szkiełek nakrywkowych funkcjonalizowaną stroną skierowaną w stronę sond.Przykryj folią aluminiową. Po inkubacji oddziel kanapki i trzykrotnie umyj szkiełka nakrywkowe 1X PBS. Ostrożnie zamontuj wkładki pokrywy we wstępnie oczyszczonych komorach obrazowania.Aby zbadać wpływ stymulacji naskórkowego czynnika wzrostu na mechanikę Cos-7, adhezję i rozprzestrzenianie się komórek, trypsynizuj komórki Cos-7 za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA przez dwie minuty. Zneutralizuj trypsynę, przemywając HBSS i odwirowując przy 800 G przez pięć minut. Płytki komórkowe o gęstości 40 000 komórek na zmontowanych powierzchniach TGT w DMEM uzupełnione 50 nanogramami na mililitr EGF lub DMEM bez EGF.Po inkubacji przemyj komórki trzykrotnie 1X PBS. Napraw dwoma mililitrami 4% paraformaldehydu przez 12 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka okładki pięć razy za pomocą 1X PBS w odstępach pięciominutowych w temperaturze pokojowej.Opcjonalnie inkubować szkiełka nakrywkowe z 50-milimolowym chlorkiem amonu w 1X PBS przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodać bufor A i umieścić komory obrazowania z szkiełkami nakrywkowymi w pojemniku na wilgoć. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zablokować i przepuszczalność komórek.Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało anty-paksyliny w rozcieńczeniach 1:250 w buforze blokującym. Inkubować z 200 mikrolitrami roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na szkiełko nakrywkowe przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Znakować komórki jednocześnie mieszaniną di-sprzężonego przeciwciała drugorzędowego kozy/anty-królika w rozcieńczeniu 1:800 i di-sprzężonej falloidyny w rozcieńczeniach 1:400 w 200 mikrolitrach buforu blokującego na szkiełko nakrywkowe.Umyj powierzchnie pięć razy za pomocą 1X PBS w odstępach pięciominutowych. Na początek dodaj olej do obiektywu, wyczyść spód szkiełka nakrywkowego komory na próbkę i umieść próbkę na stoliku. Skoncentruj się na komórce i zaangażuj się w idealne skupienie.Wyrównaj RICM, zamykając i centrując przysłonę epi-illumination. Ustaw ostrość laser 488 nm na małym punkcie na suficie pomieszczenia i zwiększ kąt padania aż do przekroczenia kąta krytycznego, jednocześnie monitorując fluorescencję w kamerze w trybie na żywo. Obserwuj gwałtowne zmniejszenie fluorescencji tła i pojedynczą płaszczyznę ostrości po przekroczeniu kąta krytycznego.Zidentyfikuj komórki do obrazowania w trybie na żywo kamery za pomocą RICM. Uzyskaj obrazy RICM i TIRF aktyny przy wzbudzeniu 488 nanometrów, napięciu integryny przy wzbudzeniu 561 nanometrów i paxilliny przy wzbudzeniu 647 nanometrów. Uzyskuj obrazy sekwencyjnie, korzystając z czasu naświetlania wynoszącego 200 milisekund.Zmień szkiełka nakrywkowe, ustaw ostrość i powtórz. Komórki Cos-7 posiano na tej powierzchni TGT ze stymulacją EGF lub bez niej, aby zbadać wpływ aktywacji EGFR ze stymulacją ligandów na mechanikę integryn. Jeśli integryna wiąże ligand i przykłada siłę większą niż całkowity próg napięcia sondy, dupleks DNA oddzieli się, prowadząc do fluorescencji.Każda sonda TGT, która nie pękła pod wpływem siły mechanicznej, pozostanie niefluorescencyjna. Komórki inkubowano z EGF lub bez niego na powierzchniach TGT przez 60 minut, utrwalano i wybarwiono immunologicznie, aby wyświetlić ogniskowy rozkład adhezji i organizację cytoszkieletu. Na obrazie RICM rozprzestrzenianie się komórek Cos-7 na powierzchni 56-pikonewtonowego TGT było znacznie wzmocnione stymulacją EGF w porównaniu do bez stymulacji.Stymulacja EGF spowodowała bardziej kolistą morfologię, reprezentującą rozprzestrzenianie się i wzrost komórek Cos-7. Fluorescencja z otwartych sond jest również wyższa przy stymulacji EGF, co zaobserwowano na obrazie fluorescencji napięciowej. Zintegrowana intensywność otwartych sond proporcjonalna do liczby otwartych sond była znacznie wyższa przy stymulacji EGF niż bez stymulacji.Zawsze należy pamiętać o orientacji szkiełek nakrywkowych, utrzymując funkcjonalizowaną powierzchnię skierowaną do góry. Podczas oddzielania kanapki należy zachować ostrożność, aby powierzchnia nie została porysowana ani uszkodzona. Po syntezie powierzchniowej można sondować białka cytoplazmatyczne regulujące adhezję komórek lub transdukcję mechaniczną.Pozwala to na identyfikację dalszych cząsteczek sygnałowych zaangażowanych w orkiestrację mechaniki komórkowej w błonie plazmatycznej.

tension-gauge-tether-probes-for-quantifying-growth-factor-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Film demonstruje metodę oceny sił receptorów wywieranych przez komórki odpornościowe za pomocą nanocząsteczek złota zakotwiczonych w glikolu polietylenowym i sond napinających spinki do włosów DNA. Interakcje limfocytów T CD8-dodatnich powodują rozwijanie sondy, emitując fluorescencję, podczas gdy nici blokujące podtrzymują sygnał do ilościowego określania sił wywieranych przez komórki odpornościowe.

Wykorzystanie sond napięcia opartych na DNA do oceny sił receptorowych wywieranych przez komórki odpornościowe

Zmierzyliśmy spadek napięcia w aksonie, który został częściowo uszkodzony za pomocą laserowego dysektora, za pomocą jednoczesnego pomiaru spektroskopii siły wykonanego na optycznie uwięzionej sondzie przyklejonej do membrany aksonu. Opracowany protokół eksperymentalny ocenia adhezję aksonów do substratu hodowli.

Pomiar zwolnienia napięcia podczas uszkodzenia aksonu indukowanego laserem w celu oceny adhezji aksonów do podłoża z rozdzielczością pikontonów i milisekund

Zrosty powierzchniowe komórek są kluczowe w mechanotransdukcji, ponieważ przenoszą napięcie mechaniczne i inicjują szlaki sygnałowe zaangażowane w homeostazę i rozwój tkanek. W tym miejscu przedstawiamy protokół preparowania szlaków biochemicznych, które są aktywowane w odpowiedzi na napięcie, przy użyciu mikrokulek magnetycznych pokrytych ligandem i przyłożenia siły do receptorów adhezyjnych.

Analiza remodelingu adhezji powierzchni komórek w odpowiedzi na naprężenia mechaniczne za pomocą kulek magnetycznych

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Napięcie integryny odgrywa ważną rolę w różnych funkcjach komórki. Dzięki zintegrowanemu czujnikowi naprężenia, napięcie integryny jest kalibrowane z czułością pikoNewtona (pN) i obrazowane w rozdzielczości submikronowej.

Obrazowanie napięcia integryny i siły komórkowej w rozdzielczości submikronowej za pomocą zintegrowanego czujnika napięcia

Ta metoda jest przydatna do ilościowego określania wczesnej dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek zależnych od zakotwiczenia na fibronektynie. Ponadto test ten może być wykorzystany do zbadania wpływu zmienionej homeostazy redoks na rozprzestrzenianie się komórek i/lub wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe związane z adhezją komórek.

Badanie dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek nabłonka na fibronektynie podczas stresu oksydacyjnego

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół użycia sond napięcia opartych na DNA do obrazowania sił receptorowych wywieranych przez komórki odpornościowe. Takie podejście może mapować siły receptorowe &gt;4,7pN w czasie rzeczywistym i może integrować siły w czasie.

Sondy napięcia DNA do mapowania przejściowych sił receptora pikoningtona przez komórki odpornościowe

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Szczegółowy protokół obrazowania pojedynczych migrujących płytek krwi za pomocą funkcjonalizowanych RGD uwięzi awidyna-biotyna o regulowanej gęstości jest dostarczony, ujawniając, że płytki krwi generują wystarczającą siłę, aby zerwać wiązanie awidyna-biotyna.

Test in vitro do badania migracji płytek krwi przy użyciu funkcjonalizowanych RGD tetherów awidyna-biotyna

Ta metoda mierzy skłonność komórki do pękania unieruchomionych dupleksów DNA prezentujących ligand, aby zgłosić względne siły przyciągania komórkowego. Pęknięte oligonukleotydy fluorescencyjne są dostarczane do komórki i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej, rejestrując historię mechaniczną komórki. Pozwala to na wysokoprzepustowy pomiar generowania siły komórkowej w kontekście mechanofentypowania komórkowego.

Wysokoprzepustowy pomiar mechanotypu komórkowego metodą cytometrii przepływowej w oparciu o pęknięcie i dostarczenie sond napięcia DNA do komórek

Poznaj metodę pomiaru naprężenia integryn za pomocą platformy czujników TGT w liniach komórkowych Cos-7. Technika ta umożliwia ilościową analizę wpływu EGFR na mechanikę komórkową i adhezję.

Sondy mocujące do pomiaru naprężenia do ilościowego określania mechaniki integryny i adhezji za pośrednictwem czynnika wzrostu

Przeglądaj więcej filmów