Sondy mocujące do pomiaru naprężenia do ilościowego określania mechaniki integryny i adhezji za pośrednictwem czynnika wzrostu
11 lutego 2022
Powierzchnia TGT to innowacyjna platforma do badania przesłuchów czynnika wzrostu z integryną. Elastyczna konstrukcja sondy, specyficzność liganda adhezyjnego i precyzyjna modulacja warunków stymulacji pozwalają na solidną ocenę ilościową wzajemnych oddziaływań EGFR-integryna. Wyniki wskazują, że EGFR jest "mechano-organizatorem" dostrajającym mechanikę integryny, wpływającym na ogniskowy montaż adhezyjny i rozprzestrzenianie się komórek.
Protokół ten jest istotny ze względu na prostotę platformy czujników TGT wykorzystywanych do badania przesłuchów EGFR-integryna i jej wpływu na siły mechaniczne ogniw. Rao postanowił zbadać zależną od EGF regulację mechaniki komórki. Protokół można dostosować do różnych ligandów, typów komórek, paradygmatów stymulacji i można go łączyć z TGT o różnych progach napięcia.
Synteza powierzchniowa może na początku wydawać się onieśmielająca. Kluczem jest przygotowanie i zorganizowanie się tak, aby precyzyjnie wykonać skomplikowane kroki, wykorzystując listę kontrolną do przygotowania odczynnika i obliczeń. Pierwszego dnia umieść do ośmiu 25-milimetrowych szklanych wkładek osłonowych w stojaku z politetrafluoroetylenu.
Umieść stojak w 50-mililitrowej zlewce borokrzemianowej zawierającej 40 mililitrów 200-procentowego etanolu. Sonikować z częstotliwością roboczą 35 kiloherców przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Napełnij 50-mililitrową zlewkę 40 mililitrami świeżo przygotowanego roztworu piranii przez zmieszanie kwasu siarkowego i nadtlenku wodoru w stosunku 3:1 w zlewce Pyrex i wymieszanie szklaną pipetą.
Przenieść stojak na szkiełka nakrywkowe do zlewki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w dygestoriach w celu wytrawienia powierzchni szkiełka nakrywkowego. Po wytrawieniu przenieś stojak na szkiełka nakrywkowe do zlewki z ultraczystą wodą za pomocą pęsety. Sprawdź wzrokowo szkiełka nakrywkowe, aby upewnić się, że powierzchnie wyglądają na czyste, bez wzorów i cząstek kurzu na powierzchni szkła.
Przenieść stojak na szkiełka nakrywkowe do zlewki z 200-procentowym etanolem i umyć dwukrotnie przez 15 sekund, aby wyrównać powierzchnię z rozpuszczalnikiem organicznym. Przenieś stojak na szkiełka nakrywkowe do 200-procentowego roztworu etanolu z 3% APTES na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby zsilić szkiełka nakrywkowe. Zanurz ruszt w czystej zlewce z 200-procentowym roztworem etanolu.
Wysuszyć szkiełka nakrywkowe przy użyciu gazowego azotu o niskim ciśnieniu wyjściowym. Umieść pokrywę w 10-centymetrowym naczyniu z polistyrenowym kawałkiem folii parrafinowej ułożonym płasko w środku. Dodaj 100 mikrolitrów dwóch miligramów na mililitr roztworu biotyny NHS w DMSO do czterech szkiełek nakrywkowych umieszczonych na folii parafinowej.
Ustaw kanapkę z pozostałymi czterema szkiełkami nakrywkowymi na wierzchu, tak aby dwa szkiełka nakrywkowe były skierowane do siebie, z roztworem funkcjonalizacyjnym pomiędzy nimi. Drugiego dnia zdejmij naczynie z czterech stopni Celsjusza i oddziel kanapkowe szkiełka nakrywkowe. Unikaj zarysowania lub uszkodzenia funkcjonalizowanej powierzchni podczas oddzielania kanapki.
Następnie ustaw szkiełka nakrywkowe w stojaku tak, aby powlekana powierzchnia była skierowana do siebie. Suszyć gazowym azotem. Umieść szkiełka nakrywkowe w nowym naczyniu z folią parrafinową w środku.
Dodaj 800 mikrolitrów 0,1% albuminy surowicy bydlęcej w 1X PBS do każdego szkiełka nakrywkowego. Inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 30 minut w celu pasywizacji powierzchni i zablokowania niespecyficznego wiązania kolejnych odczynników funkcjonalizacyjnych. Aby funkcjonalizować szkiełka nakrywkowe, dodaj 800 mikrolitrów jednego mikrograma na mililitr streptawidyny w 1X PBS w temperaturze pokojowej przez 45 do 60 minut.
Zamontuj sondy TGT w probówce do PCR za pomocą termocyklera. Po inkubacji umyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1X PBS. Dodaj 100 mikrolitrów wstępnie zmontowanych sond TGT do czterech szkiełek nakrywkowych i przygotuj kanapki, używając pozostałych czterech szkiełek nakrywkowych funkcjonalizowaną stroną skierowaną w stronę sond.
Przykryj folią aluminiową. Po inkubacji oddziel kanapki i trzykrotnie umyj szkiełka nakrywkowe 1X PBS. Ostrożnie zamontuj wkładki pokrywy we wstępnie oczyszczonych komorach obrazowania.
Aby zbadać wpływ stymulacji naskórkowego czynnika wzrostu na mechanikę Cos-7, adhezję i rozprzestrzenianie się komórek, trypsynizuj komórki Cos-7 za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA przez dwie minuty. Zneutralizuj trypsynę, przemywając HBSS i odwirowując przy 800 G przez pięć minut. Płytki komórkowe o gęstości 40 000 komórek na zmontowanych powierzchniach TGT w DMEM uzupełnione 50 nanogramami na mililitr EGF lub DMEM bez EGF.
Po inkubacji przemyj komórki trzykrotnie 1X PBS. Napraw dwoma mililitrami 4% paraformaldehydu przez 12 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka okładki pięć razy za pomocą 1X PBS w odstępach pięciominutowych w temperaturze pokojowej.
Opcjonalnie inkubować szkiełka nakrywkowe z 50-milimolowym chlorkiem amonu w 1X PBS przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodać bufor A i umieścić komory obrazowania z szkiełkami nakrywkowymi w pojemniku na wilgoć. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zablokować i przepuszczalność komórek.
Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało anty-paksyliny w rozcieńczeniach 1:250 w buforze blokującym. Inkubować z 200 mikrolitrami roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na szkiełko nakrywkowe przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Znakować komórki jednocześnie mieszaniną di-sprzężonego przeciwciała drugorzędowego kozy/anty-królika w rozcieńczeniu 1:800 i di-sprzężonej falloidyny w rozcieńczeniach 1:400 w 200 mikrolitrach buforu blokującego na szkiełko nakrywkowe.
Umyj powierzchnie pięć razy za pomocą 1X PBS w odstępach pięciominutowych. Na początek dodaj olej do obiektywu, wyczyść spód szkiełka nakrywkowego komory na próbkę i umieść próbkę na stoliku. Skoncentruj się na komórce i zaangażuj się w idealne skupienie.
Wyrównaj RICM, zamykając i centrując przysłonę epi-illumination. Ustaw ostrość laser 488 nm na małym punkcie na suficie pomieszczenia i zwiększ kąt padania aż do przekroczenia kąta krytycznego, jednocześnie monitorując fluorescencję w kamerze w trybie na żywo. Obserwuj gwałtowne zmniejszenie fluorescencji tła i pojedynczą płaszczyznę ostrości po przekroczeniu kąta krytycznego.
Zidentyfikuj komórki do obrazowania w trybie na żywo kamery za pomocą RICM. Uzyskaj obrazy RICM i TIRF aktyny przy wzbudzeniu 488 nanometrów, napięciu integryny przy wzbudzeniu 561 nanometrów i paxilliny przy wzbudzeniu 647 nanometrów. Uzyskuj obrazy sekwencyjnie, korzystając z czasu naświetlania wynoszącego 200 milisekund.
Zmień szkiełka nakrywkowe, ustaw ostrość i powtórz. Komórki Cos-7 posiano na tej powierzchni TGT ze stymulacją EGF lub bez niej, aby zbadać wpływ aktywacji EGFR ze stymulacją ligandów na mechanikę integryn. Jeśli integryna wiąże ligand i przykłada siłę większą niż całkowity próg napięcia sondy, dupleks DNA oddzieli się, prowadząc do fluorescencji.
Każda sonda TGT, która nie pękła pod wpływem siły mechanicznej, pozostanie niefluorescencyjna. Komórki inkubowano z EGF lub bez niego na powierzchniach TGT przez 60 minut, utrwalano i wybarwiono immunologicznie, aby wyświetlić ogniskowy rozkład adhezji i organizację cytoszkieletu. Na obrazie RICM rozprzestrzenianie się komórek Cos-7 na powierzchni 56-pikonewtonowego TGT było znacznie wzmocnione stymulacją EGF w porównaniu do bez stymulacji.
Stymulacja EGF spowodowała bardziej kolistą morfologię, reprezentującą rozprzestrzenianie się i wzrost komórek Cos-7. Fluorescencja z otwartych sond jest również wyższa przy stymulacji EGF, co zaobserwowano na obrazie fluorescencji napięciowej. Zintegrowana intensywność otwartych sond proporcjonalna do liczby otwartych sond była znacznie wyższa przy stymulacji EGF niż bez stymulacji.
Zawsze należy pamiętać o orientacji szkiełek nakrywkowych, utrzymując funkcjonalizowaną powierzchnię skierowaną do góry. Podczas oddzielania kanapki należy zachować ostrożność, aby powierzchnia nie została porysowana ani uszkodzona. Po syntezie powierzchniowej można sondować białka cytoplazmatyczne regulujące adhezję komórek lub transdukcję mechaniczną.
Pozwala to na identyfikację dalszych cząsteczek sygnałowych zaangażowanych w orkiestrację mechaniki komórkowej w błonie plazmatycznej.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje interakcje między receptorem naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) a integrynami z wykorzystaniem nowej platformy czujników TGT. Poprzez adaptację czujników TGT do różnych warunków, badanie wykazuje, w jaki sposób EGFR pełni rolę mechano-organizatora, wpływając na mechanikę integryn oraz procesy adhezji i rozprzestrzeniania się komórek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Mechanika komórki
- Sygnalizacja czynników wzrostu
- Biologia integryn
Wstęp
- Badanie oddziaływań białkowych na poziomie komórkowym
- Zrozumienie wpływu właściwości mechanicznych na procesy biologiczne
- Wykorzystanie zaawansowanej technologii czujników do analiz ilościowych
Zastosowane metody
- Zastosowanie platformy sensorowej TGT
- Linia komórkowa Cos-7 do eksperymentów
- Techniki obrazowania RICM i TIRF
Główne wyniki
- Modulacja EGFR zmienia mechanikę integryn
- Wpływ EGF na adhezję ogniskową i rozprzestrzenianie się komórek
- Ilościowa ocena oddziaływań białkowych
Wnioski
- Badanie podkreśla rolę EGFR w mechanice komórkowej
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia odpowiedzi komórkowych na sygnały zewnątrzkomórkowe
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Sondy oparte na miernikach napięcia (TGT) umożliwiają ilościowy pomiar sił mechanicznych pośredniczonych przez integryny, modulowanych przez sygnalizację czynników wzrostu, co pozwala wypełnić istotną lukę w walidacji celów terapeutycznych w mechanobiologii. Platforma ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych fazach odkrywania leków, łącząc wzajemne oddziaływania receptorów z funkcjonalnymi efektami adhezji w rozdzielczości pojedynczych komórek. Możliwość modulowania progów siły oraz kontekstu ligandów sprawia, że sondy TGT stanowią wielokrotnego użytku narzędzie do mechanistycznego ograniczania ryzyka oraz selekcji projektów w portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę interakcji między czynnikami wzrostu a integrynami w systemach z żywych komórek.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez kwantyfikację zależnej od siły aktywacji receptorów.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów terapeutycznych dzięki mapowaniu sił o rozdzielczości przestrzennej.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie priorytetyzacji i selekcji szlaków sygnałowych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje zwalidowane układy mechanoczułe do późniejszego przesiewu związków.
- Zapewnia ilościowe i powtarzalne odczyty napięcia integryn oraz dynamiki adhezji.
- Umożliwia standaryzację testów dla różnych typów ligandów i progów siły.
- Wspiera skalowalną, opartą na platformie ocenę czynników modulujących receptory.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie wyników mechanistycznych z fenotypami adhezji i sygnalizacji istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość przejścia od mechanobiologii na etapie odkryć do walidacji w modelach przedklinicznych.
- Wspiera dostosowany do ryzyka postęp badań poprzez łączenie molekularnych sygnatur sił z efektami funkcjonalnymi.
- Minimalizuje ryzyko strategii biomarkerów translacyjnych poprzez kwantyfikację historii sił na powierzchni komórki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Sondy TGT integrują się z continuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych oraz analizę ilościową mechanizmów receptorowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych dotyczących wpływu czynników wzrostu na mechanikę integryn.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty siły niezbędne do opracowywania analiz.
- Analityka: Dostarcza pomiary progów siły mechanicznej z rozdzielczością przestrzenną w oparciu o fluorescencję.
- Badania translacyjne: Łączy wglądy mechanistyczne z walidacją przedkliniczną szlaków adhezji i sygnalizacji.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje modułową, adaptacyjną platformę do różnorodnych badań receptorów, ligandów oraz progów siły.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w pomiarach siły i zwiększa powtarzalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go oraz efektywne pod względem kapitałowym zarządzanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów opartych na mechanobiologii.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu chemii powierzchni, obrazowania fluorescencyjnego i mechanobiologii.
- Wymaga dostępu do zaawansowanych platform mikroskopowych (RICM, TIRF) oraz infrastruktury analitycznej.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja montażu sond i protokołów obrazowania w obrębie zespołów.
- Metoda jest adaptowalna dla różnych typów komórek, ligandów i progów siły po optymalizacji protokołu.
- Synteza i obchodzenie się z powierzchniami wymagają szczególnej uwagi, aby uniknąć artefaktów funkcjonalizacji.
