Name: Podspojówkowe podawanie wektorów wirusa związanych z adenowirusem w małych modelach zwierzęcych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Poznaj metodę podspojówkowego podawania wektorów wirusa AAV w małych modelach zwierzęcych. Ta technika terapii genowej oferuje bezpieczne i mało inwazyjne dostarczanie leków do tkanek ocznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Vector Core z University of North Carolina za dostarczenie wektorów scAAV8-GFP użytych w tym badaniu, CGIBD Histology Core, oraz laboratorium Dr. Briana C. Gilgera za pomoc w ocenie klinicznej tego badania. Badanie to było wspierane przez Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship oraz Career Development Award od American Society of Gene & Cell Therapy i Cystic Fibrosis Foundation. Odpowiedzialność za treść spoczywa wyłącznie na autorach i niekoniecznie reprezentuje oficjalne poglądy American Society of Gene & Cell Therapy lub Cystic Fibrosis Foundation.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Północnej Karoliny w Chapel Hill. Stosowanie wektorów AAV stanowi zagrożenie biologiczne na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1. Podczas obchodzenia się z AAV należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary. W opisanym w niniejszym eksperymencie wykorzystano rekombinowany wektor AAV zapakowany w kapsyd serotypu 8 i kodujący generyczny wszechobecny promotor wirusa cytomegalii (CMV) kontrolujący ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP).
1. Obsługa i przechowywanie wektorów AAV
<ol>
	<li>Wirusa należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach o pojemności 100 μl w silikonowanych lub nisko retencyjnych probówkach wirówkowych.</li>
	<li>Przed użyciem rozmrozić wszystkie wektorowe roztwory podstawowe na lodzie. 
	UWAGA: Barwniki, takie jak roztwór fluoresceiny sodu (o końcowym stężeniu 0,1-2%) są często mieszane z wektorami AAV w celu wizualizacji wstrzykniętego roztworu. Dodatkowo wizualizacja wstrzykiwanych roztworów pomaga wykrywać pęcherzyki powietrza i monitorować dystrybucję AAV i/lub wyciek po wstrzyknięciu.</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie podspojówkowe (SCJ)
<ol>
	<li>Zmontuj układ wtryskowy.
	<ol>
		<li>Aby zmontować system iniekcyjny, należy umieścić mikroskop stereoskopowy i pompę strzykawkową w komorze bezpieczeństwa biologicznego. 
		UWAGA: Do wykonywania iniekcji z dużą precyzją potrzebna jest pompa infuzyjna. W tym przypadku stosowana jest standardowa programowalna pompa strzykawkowa do zaparzania/pobierania (patrz tabela materiałów), która zawiera mocny uchwyt i bezpieczny zacisk strzykawki do strzykawek o objętości od 0,5 μl do 60 ml. Pompa ta oferuje również zwiększoną wydajność przepływu z wysoką dokładnością i płynnymi natężeniami przepływu od 1,28 pl/min do 88,28 ml/min.</li>
		<li>Przyciąć rurkę polietylenową na długość około 50 cm (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Włóż końcówkę piasty igły 36 G do jednego z końców rurki. 
		UWAGA: Wsuń końcówkę piasty igły do rurki na ~3 mm, aby upewnić się, że nie dojdzie do wycieku. Igła 36 G jest używana do kolejnego wstrzyknięcia SCJ. Igły o wadze od 32 G do 36 G są najczęściej używanymi rozmiarami do wstrzykiwań SCJ. Zdecydowanie zaleca się stosowanie hemostatu w celu wspomagania tego etapu, aby uniknąć potencjalnego ryzyka zranienia ostrymi narzędziami.</li>
		<li>Napełnij jednorazową strzykawkę o pojemności 3 ml sterylną wodą; włóż tę jednorazową strzykawkę z boku rurki przeciwnej do igły i przepłucz wodę przez rurkę/igłę. Powtórz ten krok z 70% alkoholem.</li>
		<li>Powtórz krok 2.1.4 jeszcze trzy razy, naprzemiennie spłukując sterylną wodą i 70% alkoholem, aby zdezynfekować rurkę i upewnić się, że nie ma wycieków, zatkań ani uszkodzeń w całym przewodach.</li>
		<li>Użyj jednorazowej strzykawki o pojemności 3 ml, aby napełnić rurkę sterylną wodą i pozostaw rurkę podłączoną do jednorazowej strzykawki.</li>
		<li>Umieść kawałek parafilmu na powierzchni ławki i dodaj do niego kałużę sterylnej wody (~1 ml). Zanurz część rurki podłączoną do igły w kałuży sterylnej wody. Wyciągnąć jednorazową strzykawkę z otworu rurki na przeciwległym końcu, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do systemu przewodów/igieł po wyjęciu strzykawki. Pozostaw część rurki podłączoną do igły zanurzoną w kałuży wody. 
		UWAGA: Procedury od 2.1.4 do 2.1.7 należy wykonać w okapie laminarnym.</li>
		<li>Napełnij strzykawkę/igłę Hamiltona o pojemności 10 μl sterylną wodą i unikaj przedostawania się powietrza do strzykawki. Podłącz strzykawkę/igłę Hamiltona do pozostałego otwartego końca rurki, zanurzając rurkę i końcówkę igły strzykawki Hamilton w kałuży sterylnej wody na parafilmie.</li>
		<li>Nacisnąć przycisk szybkiego cofania na ekranie pompy, aby przesunąć blok popychacza do przybliżonej długości strzykawki. Odkręcić wspornik clamppokrętła, aby poluzować wsporniki mocujące na popychaczu i blokach uchwytu strzykawki. Załadować strzykawkę Hamilton na blok uchwytu strzykawki i zabezpieczyć strzykawkę zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Aby zabezpieczyć strzykawkę, zacisk cylindra strzykawki powinien być mocno przylegający do cylindra strzykawki; Nie należy jednak dokręcać zbyt mocno, zwłaszcza w przypadku używania szklanych strzykawek. Tłok strzykawki powinien być zabezpieczony wspornikiem mocującym blok popychacza.</li>
		<li>Dostosuj parametry na ekranie ustawień pompy.
		<ol>
			<li>Naciśnij przycisk Force i ustaw poziom siły na 30%. Zaakceptuj zmiany, aby wrócić do ekranu ustawień.</li>
			<li>Naciśnij przycisk szybkiego startu i wybierz Metoda | Zaparz/wycofaj.</li>
			<li>Do strzykawki wybierz Hamilton 1700, szkło, 10 μL. Wybrać szybkość infuzji i wycofania oraz objętość wstrzyknięcia. 
			UWAGA: Poziom siły jest ustawiany w zależności od typu/materiału/pojemności/producenta strzykawki; Zapoznaj się z instrukcjami producenta fabrycznego, aby uzyskać informacje na temat sugerowanej siły dla każdej strzykawki. Prędkość wstrzykiwania użyta w tym eksperymencie wynosiła 200 nL/s. Zastrzyki SCJ są stosunkowo bezpieczne i istnieje mniejsza obawa o indukcję podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) wynikającego z wstrzyknięcia. Mniejsza prędkość wstrzykiwania jest często pożądana w przypadku niektórych zastosowań, aby uniknąć refluksu do igły i utrzymać spójność wstrzyknięć u zwierząt.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usunąć wodę ze strzykawki Hamiltona, ale pozostawić rurkę i igłę do wstrzykiwań pełne wody. Lekko pociągnąć strzykawkę Hamiltona, naciskając przycisk Reverse, aby wprowadzić mały pęcherzyk powietrza do rurki/igły. 
		UWAGA: Pęcherzyk powietrza będzie służył jako bariera między wodą w rurce a lekiem terapeutycznym (w tym przypadku AAV), zapewniając dokładność podawanej dawki.</li>
		<li>Usunąć wirusa, umieszczając igłę do wstrzykiwań w podwielokrotności zapasu wirusa. Upewnij się, że między wirusem a wodą w rurce pozostał widoczny pęcherzyk powietrza. 
		UWAGA: Wektory AAV mogą wiązać się z plastikową rurką i metalową igłą, prowadząc do utraty wirusa i/lub niedokładnych schematów dawkowania. Dlatego, aby zapewnić rygor, powtarzalność i dokładną dawkę AAV, zaleca się wstępne powlekanie powierzchni, które następnie stykają się z AAV. Aby pokryć system rurkowo-igły wirusem, należy pobrać roztwór wektora wirusa do rurki/igły i inkubować go w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić nasycenie wirusa wiążącego się ze ścianką igły i/lub rurki. Odrzuć wirusa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknięcie wirusa
	<ol>
		<li>Znieczulić mysz znieczuleniem wziewnym (izofluran) lub dootrzewnowym wstrzyknięciem ketaminy/ksylazyny/acepromazyny. Potwierdź chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia poprzez brak reakcji na mocne szczypanie palca. 
		UWAGA: Używaj samic i/lub samców myszy C57BL/6J lub BALB/c, które mają co najmniej 6 tygodni. Dawki ketaminy/ksylazyny/acepromazyny są następujące: ketamina w dawce 70 mg/kg, ksylazyna w dawce 7 mg/kg mc. i acepromazyna w dawce 1,5 mg/kg.</li>
		<li>Zastosować znieczulenie miejscowe do oka, które otrzyma wstrzyknięcie. 
		UWAGA: Do znieczulenia miejscowego należy stosować 0,1% chlorowodorek proparakainy i/lub roztwór okulistyczny chlorowodorku tetrakainy (0,5%).</li>
		<li>Nałóż miejscowo maść na drugie oko, które nie zostanie wstrzyknięte, aby zapobiec wysuszeniu i obrażeniom.</li>
		<li>Umieść mysz na mikroskopijnym stoliku i wystaw oko myszy pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
		<li>Połóż dwa palce na powiece i lekko odciągnij ją od oka myszy, aby odsłonić spojówkę, czyli wewnętrzną błonę łączącą powiekę z twardówką.</li>
		<li>Chwyć spojówkę kleszczami.</li>
		<li>Zwolnij powiekę i przytrzymaj igłę skosem skierowanym do góry, używając dominującej ręki.</li>
		<li>Wbić igłę do spojówki. Wbić igłę, aż skos zostanie całkowicie pokryty błoną spojówkową. Przyłóż igłę do kuli ziemskiej. 
		UWAGA: Ponieważ spojówka jest przezroczystą błoną, końcówka/skos igły jest dobrze widoczna.</li>
		<li>Wstrzyknięcie należy rozpocząć od naciśnięcia przycisku Start za pomocą przełącznika nożnego. 
		UWAGA: Ruch powietrza i tłoka Hamiltona jest zsynchronizowany; Każde opóźnienie wskazuje na nadmiar powietrza w układzie iniekcyjnym lub ewentualnie luźne połączenie między elementami rurki, igły i/lub strzykawki.</li>
		<li>Po zakończeniu wstrzyknięcia należy przytrzymać igłę na miejscu przez 10 s przed wyjęciem igły ze spojówki, aby zmniejszyć ryzyko przepływu wstecznego. 
		UWAGA: Często zdarza się, że w miejscu wstrzyknięcia SCJ pojawia się pęcherzyk. Takie pęcherzyki zwykle ustępują całkowicie w ciągu kilku godzin po wstrzyknięciu.</li>
		<li>Nałóż kroplę miejscowego żelu nawilżającego na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu/urazowi oka, a następnie umieść mysz na poduszce grzewczej, aby wyzdrowieć.</li>
		<li>Wykonaj badania okulistyczne, takie jak wytwarzanie łez, ciśnienie wewnątrzgałkowe i badanie lampą szczelinową w połączeniu z barwieniem fluoresceiną rogówki, aby ocenić nieprawidłowości w oku po wstrzyknięciu. 
		UWAGA: Produkcja łez jest mierzona za pomocą testu czerwonej nici fenolowej, a tonometr jest często używany do badania ciśnienia wewnątrzgałkowego oka myszy. Poinformowano, że niektóre wstrzyknięcia dogałkowe, takie jak iniekcje doszklistkowe, mogą powodować znaczny wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego; jednak zmiany IOP po wstrzyknięciu SCJ nie są oczywiste13,22,23,24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie skuteczności biodystrybucji i transdukcji AAV po iniekcji podspojówkowej
	<ol>
		<li>Aby zbadać biodystrybucję genomu wirusa i/lub profil transdukcji wektorów AAV dostarczanych przez SCJ, należy poddać myszy eutanazji metodą zatwierdzoną przez AVMA. 
		UWAGA: W tym eksperymencie myszy zostały uśmiercone 8 tygodni po wstrzyknięciu.</li>
		<li>Aby uzyskać biodystrybucję i ekspresję transgenu w docelowych przedziałach ocznych, należy przeanalizować odpowiednią tkankę będącą przedmiotem zainteresowania, taką jak powieki, rogówka, spojówka, mięsień oka, siatkówka i nerw wzrokowy. Błyskawiczne zamrożenie wszystkich tkanek i przechowywanie w temperaturze -80 °C. Aby zbadać biodystrybucję AAV w całym ciele, należy pobrać narządy, takie jak węzły chłonne podżuchwowe i wątroba, a następnie błyskawicznie zamrozić i przechowywać je w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Korzystając z zestawu do ekstrakcji DNA/RNA, zbierz gDNA i RNA z tej samej próbki, aby zbadać odpowiednio ekspresję transgenu i biodystrybucję AAV. Jeśli pożądana jest tylko biodystrybucja wektorów, użyj zestawu do ekstrakcji DNA do ekstrakcji gDNA.</li>
		<li>Wykonaj standardowe qPCR i RT-qPCR, aby określić biodystrybucję wektora AAV i obfitość cDNA za pomocą starterów/sond specyficznych dla transgenu wektora13,25.</li>
		<li>Do analizy histologicznej unieruchom oczy, zanurz je w parafinie i przekrój na grubość 5 μm. Wykonaj standardowe barwienie immunofluorescencyjne, aby ujawnić ekspresję transgenu26.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnitude%2C+temporal+trends%2C+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li>
<li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye%3A+implications+in+ocular+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10(2021).</li>
<li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Humam+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li>
<li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+%28AAV2-hRPE65v2%29+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy%3A+a+randomised%2C+controlled%2C+open-label%2C+phase+3+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li>
<li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-associated+defective+virus+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li>
<li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+%28AAV%29+in+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li>
<li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+injection%3A+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li>
<li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+perspectives+in+ocular+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Recent perspectives in ocular drug delivery.</a> Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).</li>
<li>Amado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+subretinal+readministration+of+a+viral+vector+in+large+animals+to+treat+congenital+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness.</a> Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+route+of+AAV2+vector+administration+defines+humoral+immune+response+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential.</a> Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).</li>
<li>Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+cytomegalovirus+retinitis+in+AIDS+patients+with+intravitreal+ganciclovir%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Association+of+Thailand%22%5BJournal%5D)">Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir.</a> Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).</li>
<li>Miyadera, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrastromal+gene+therapy+prevents+and+reverses+advanced+corneal+clouding+in+a+canine+model+of+mucopolysaccharidosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I.</a> Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+survey+of+AAV+gene+delivery+via+subconjunctival+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice.</a> Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).</li>
<li>Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li>
<li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCH+412499%3A+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21%28WAF-1%2FCIP-1%29+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Cutaneous+and+Ocular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li>
<li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats%3A+a+study+of+local+distribution%2C+transgene+duration+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956(2015).</li>
<li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li>
<li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Ocular drug delivery.</a> AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).</li>
<li>Short, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+evaluation+of+ocular+drug+delivery+formulations%3A+techniques+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).</li>
<li>Stevens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administering+a+subconjunctival+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Eye+Health%22%5BJournal%5D)">Administering a subconjunctival injection.</a> Community Eye Health. 22 (69), 15(2009).</li>
<li>Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li>
<li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248(2020).</li>
<li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal%2C+subretinal%2C+and+suprachoroidal+injections%3A+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Theraputics%22%5BJournal%5D)">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li>
<li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage%3A+innovative+techniques+compared%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li>
<li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+expression+of+HLA-G1%2F5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864(2019).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li>
<li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li>
<li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li>
<li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li>
<li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport%3A+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch%27s+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Terapia genowa za pośrednictwem AAV ma ogromny potencjał w leczeniu chorób oczu. Obecna oczna terapia genowa opiera się na dwóch głównych drogach podawania miejscowego, iniekcjach do ciała szklistego i podsiatkówkowych. Niestety, obie drogi są inwazyjne i mogą powodować poważne powikłania, w tym odwarstwienie siatkówki, powstawanie zaćmy i zapalenie wnętrza gałki ocznej. W związku z tym badanie stosunkowo mniej inwazyjnych dróg, takich jak wstrzyknięcie SCJ, jest bardzo interesujące.
Chociaż t...

Choroby oczu obejmują szeroki zakres zarówno zaburzeń genetycznych, jak i nabytych. Szacuje się, że w 2015 roku 36 milionów ludzi na całym świecie było prawnie niewidomych, a ponad 1 miliard ludzi cierpi na przynajmniej pewien poziom upośledzenia wzroku, co podkreśla potrzebę zwiększenia wysiłków łagodzących na wszystkich poziomach1. Główne metody dostarczania leków do oczu obejmują zarówno podawanie miejscowe, jak i miejscowe, takie jak krople do oczu lub zastrzyki podspojówkowe (SCJ), dokomorowe, szkliste i podsiatkówkowe. Chociaż nieinwazyjna terapia miejscowa jest najczęstszą metodą dostarczania leków okulistycznych i jest szeroko stosowana w przypadku wielu zaburzeń przedniego odcinka, obecność barier anatomicznych rogówki stanowi wyzwanie dla biodostępności, biodystrybucji i skuteczności substancji podawanych miejscowo, co sugeruje, że może to nie być najlepsza potencjalna droga leczenia wielu chorób oka wewnętrznego. Miejscowe wstrzyknięcie do określonego przedziału gałki ocznej dotkniętego chorobą może być bardziej skutecznym i ukierunkowanym podejściem do dostarczania leków2. Jednak działania niepożądane wynikające z powtarzających się wstrzyknięć mogą komplikować strategie podawania. Idealnie byłoby, gdyby terapia utrzymywała długoterminową skuteczność terapeutyczną po jednorazowym podaniu. Tak więc terapia genowa jest obiecującą opcją dla zminimalizowania liczby wymaganych wstrzyknięć i zapewnienia trwałej ekspresji transgenu w leczeniu chorób oczu3,4.
Liczne wektory wirusowe i niewirusowe są dostępne do terapii genowej; jednak wektory AAV cieszą się dużym zainteresowaniem ze względu na ich doskonały profil bezpieczeństwa. AAV to mały, jednoniciowy, bezotoczkowy wirus DNA, który został początkowo odkryty jako zanieczyszczenie preparatu adenowirusowego w 1965 roku przez Atchison et al.5,6 AAV został następnie zaprojektowany jako wydajny wektor wirusowy do dostarczania genów w latach 1980. i stał się wektorem terapii genowej z wyboru w wielu chorobach, w tym zaburzeniach oczu, w ciągu ostatnich kilku dekad. Najbardziej godnym uwagi z nich jest pierwszy komercyjnie dostępny lek terapii genowej, voretigene neparvovec, który został zatwierdzony przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków do leczenia wrodzonej ślepoty Lebera, rzadkiej choroby tylnego odcinka oka. Chociaż voretigene neparvovec z powodzeniem pokonał bariery w rozwoju klinicznym, nadal istnieją wyzwania związane z komercjalizacją dodatkowych ocznych terapii genowych. Na przykład woretigene neparwowek podaje się pacjentom, którzy zachowują żywe komórki siatkówki poprzez wstrzyknięcie podsiatkówkowe. W związku z tym pacjenci z bardziej zaawansowanymi postaciami choroby, którzy nie mają żywotnych komórek siatkówki, nie kwalifikują się do leczenia, ponieważ nie przyniosłoby ono żadnych korzyści klinicznych. Ponadto zaobserwowano znane powikłania związane z procedurą wstrzyknięcia podsiatkówkowego, w tym zapalenie oka, zaćmę, rozdarcie siatkówki, makulopatię i ból7,8. Inne obawy związane z tą procedurą obejmują możliwość krwotoku, odwarstwienia siatkówki, zapalenia wnętrza gałki ocznej i cofnięcia uprzywilejowanego statusu odporności oka poprzez zniszczenie tkanki oka9,10,11,12. W związku z tym coraz ważniejsze stają się wysiłki mające na celu zbadanie mniej inwazyjnych dróg dostarczania genów, takich jak wstrzyknięcie SCJ13,14,15,16,17.
Spojówka to cienka błona zawierająca 3-5 warstw komórek łącząca przednie oko z wewnętrzną powieką. Zastrzyki SCJ są stosowane klinicznie do dostarczania leków okulistycznych zarówno do przedniego, jak i / lub tylnego odcinka oka w leczeniu chorób oczu, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, jaskra, zapalenie siatkówki i zapalenie tylnego odcinka błony naczyniowej oka18,19. Są one stosunkowo proste do wykonania, rutynowo stosowane do dostarczania leków okulistycznych w warunkach ambulatoryjnych20, są nieco bezbolesne, nie naruszają przywilejów immunologicznych oka i umożliwiają rozprzestrzenianie się podawanych leków przez duży obszar okołooczodołowy, który obejmuje nerw wzrokowy. W związku z tym zastrzyki SCJ są atrakcyjną drogą podawania do zastosowań w terapii genowej AAV. Naturalne serotypy AAV podawane przez wstrzyknięcie SCJ myszom zostały wcześniej scharakteryzowane pod kątem bezpieczeństwa, skuteczności transdukcji, immunogenności surowicy, biodystrybucji i swoistości tkankowej13,16,21. Dane te wykazały, że dostarczanie genów do poszczególnych tkanek oka poprzez podawanie SCJ jest formalną możliwością.
Ten artykuł opisuje prosty i adaptowalny protokół wstrzykiwania SCJ w celu dostarczania wektorów AAV w modelu mysim. Aby zapewnić powtarzalność tego podejścia, opisano system iniekcji składający się z mikroskopu stereoskopowego, programowalnej pompy strzykawkowej do infuzji/pobrania (która umożliwia stałą i precyzyjną prędkość i ciśnienie wstrzykiwania) oraz gazoszczelnej wyjmowanej strzykawki połączonej z igłami do mikroiniekcji. System ten można dostosować do innych dróg podawania wewnątrzgałkowego, takich jak wstrzyknięcia dostromalne, dokomorowe, doszklistkowe i podsiatkówkowe u małych zwierząt. Ponadto często stosuje się barwnik fluoresceinowy, aby umożliwić wizualizację miejsca wstrzyknięcia AAV. Szczegółowo omówione zostaną kluczowe kroki praktyczne na drodze podawania, konfiguracja platformy iniekcyjnej, przygotowanie do wstrzyknięcia oraz wskazówki wynikające z bezpośredniego doświadczenia. Na koniec pokrótce omówione zostaną powszechne techniki walidacji w celu potwierdzenia dostarczenia AAV do pożądanych tkanek.

<table><tbody><tr><td>36 G NanoFil Igły</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF36BV-2</td><td></td></tr><tr><td>AAV wektor</td><td>&nbsp; Uniwersytet Karoliny Północnej w Chapel Hill</td><td>&nbsp; /</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0079-8</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-GFP</td><td>AVES labs Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Cannon</td><td>Cannon EOS T5i</td> zestaw do ekstrakcji <td></td></tr><tr><td>DNA/RNA</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>7654-01</td><td></td></tr><tr><td>India</td><td>atrament StatLab</td><td>NC9903975</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do wstrzykiwań chlorowodorku ketaminy</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Folia odporna na wilgoć</td><td>Parafilm</td><td>807-6</td><td></td></tr><tr><td>Rurki polietylenowe</td><td>Becton Dickinson i Firma</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Proparakaina 0,1%</td> <td>Bausch Health US</td><td>NDC 24208-730-06</td><td></td></tr><tr><td>Tonometr odbicia</td><td>Tonovet</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>roztwór fluoresceiny sodu</td><td>Sigma-Aldich</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa pompa do zaparzania/pobierania 11 Programowalna pompa strzykawkowa Pico Plus Elite</td><td>Harvard Bioscience</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia stereoskopowa</td><td>Leica</td><td>Mz6</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetrakainy Roztwór okulistyczny 0,5%</td> <td>Bausch i Lomb</td><td>Rx Tylko</td><td></td></tr><tr><td>maść do stosowania miejscowego</td><td>GenTeal</td><td>NDC 0078-0429-47</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 gwintów</td><td>ZONE-QUICK</td><td>PO6448</td><td></td></tr></tbody></table>

podspojówkowe podawanie wektorów wirusa związanych z adenowirusem w małych modelach zwierzęcych

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

Choroby oczu obejmują szeroki zakres dziedzicznych zaburzeń genetycznych i nabytych, które są atrakcyjnym celem dla miejscowego dostarczania leków ze względu na ich względną łatwość dostępu za pomocą wielu dróg podawania. Zastrzyki podspojówkowe (SCJ) mają przewagę nad innymi drogami podawania wewnątrzgałkowego, ponieważ są proste, bezpieczne i zwykle wykonywane w warunkach ambulatoryjnych. Wstrzyknięcia SCJ u małych zwierząt zwykle wymagają pomocy mikroskopu operacyjnego ze względu na wielkość oka. Wcześniejsze prace wykazały, że wstrzyknięcie SCJ specyficznych serotypów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest ważną strategią dostarczania genów do ukierunkowanej transdukcji powierzchni oka, mięśnia oka, rogówki i nerwu wzrokowego, zapewniając potencjalne podejście do leczenia wielu chorób oczu.
Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół dla iniekcji SCJ w modelu mysim przy użyciu systemu iniekcyjnego składającego się z programowalnej pompy strzykawkowej do infuzji/odstawienia (która pozwala na stałą i precyzyjną prędkość i ciśnienie wstrzykiwania) oraz gazoszczelnej wyjmowanej strzykawki połączonej z igłami do mikroiniekcji. System iniekcji można również dostosować do innych dróg podawania wewnątrzgałkowego, takich jak wstrzyknięcia dostromalne, dokomorowe, szklistkowe i podsiatkówkowe u małych zwierząt. Chociaż opisano dostarczanie wektorów wirusowych związanych z adenowirusem do badań nad terapią genową oczu, protokół w niniejszym dokumencie można również dostosować do różnych rozwiązań okulistycznych w małych modelach zwierzęcych. Szczegółowo omówione zostaną kluczowe kroki praktyczne na drodze podawania, konfiguracja platformy iniekcyjnej, przygotowanie do wstrzyknięcia oraz wskazówki wynikające z bezpośredniego doświadczenia. Ponadto pokrótce omówione zostaną również typowe techniki walidacji potwierdzenia dostarczenia AAV do pożądanych tkanek.

Roztwór wstrzyknięty do przestrzeni podspojówkowej tworzy pęcherzyk, którego wielkość zależy od objętości iniekcji. 
W tym doświadczeniu 7 µL AAV (7 × 109 genomów wirusowych (vg)/oko) zmieszanego z fluoresceiną do końcowego stężenia 0,1% wstrzyknięto za pomocą igły 36 G pod stereomikroskopem, utrzymując stałą prędkość/ciśnienie iniekcji przy użyciu programowalnej pompy strzykawkowej z przepływem 1 µL/s. Po wstrzyknięciu może pojawić się pęcherzyk (strzałka). Mikroskopowy widok podania wekto...

W tym manuskrypcie, iniekcja podspojówkowa jest demonstrowana jako prawidłowa metoda dostarczania wektora do tkanek oka u myszy za pomocą systemu iniekcyjnego składającego się z pompy strzykawkowej do infuzji/pobrania i gazoszczelnej wyjmowanej strzykawki połączonej z igłami do mikroiniekcji. Ten system iniekcji można również dostosować do innych dróg podawania wewnątrzgałkowego.

Podspojówkowe podawanie wektorów wirusa związanych z adenowirusem w małych modelach zwierzęcych

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

Protokół ten oferuje metodę dostarczania terapii genowej do wielu tkanek oka w bezpieczny, łatwy i skuteczny sposób. Można go również przystosować do iniekcji śródstromalnych i podsiatkówkowych u małych zwierząt. Stosowanie podspojówkowej drogi iniekcji jest minimalnie inwazyjne.Stwarza mniejsze ryzyko i jest bardzo obiecujący w leczeniu wielu chorób oczu. Biorąc pod uwagę, że ponad 1 miliard ludzi na całym świecie cierpi na upośledzenie wzroku, stosowanie bezpiecznej i łatwej metody dostarczania leków ma szerokie zastosowanie w leczeniu wielu różnych przyczyn ślepoty. Metody dostarczania genów opisane w tym protokole są szczególnie interesujące dla tych, którzy opracowują potencjalne strategie interwencji i praktykujących okulistów, którzy ostatecznie dostarczą te leki pacjentom.Największym wyzwaniem dla kogoś, kto wykonuje ten protokół po raz pierwszy, jest prawdopodobnie wprowadzenie igły w pojętą przestrzeń spojówkową. Aby rozpocząć, należy zmontować system iniekcyjny, umieszczając mikroskop stereoskopowy i pompę strzykawkową w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Następnie przytnij rurkę polietylenową na długość około 50 centymetrów.Włóż koniec igły o rozmiarze 36 do jednego końca rurki. Następnie napełnij jednorazową strzykawkę o pojemności 3 mililitrów sterylną wodą i włóż ją do boku rurki naprzeciwko igły. Przepłucz rurkę trzy razy, na przemian sterylną wodą i 70% alkoholem, aby zdezynfekować rurkę i upewnić się, że nie ma wycieków, zatkań ani uszkodzeń w całej rurce.Za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 3 mililitrów napełnij rurkę sterylną wodą i pozostaw rurkę podłączoną do jednorazowej strzykawki. Następnie umieść kawałek parapianki na powierzchni szafy bezpieczeństwa biologicznego i dodaj do niej kałużę sterylnej wody. Zanurz część rurki podłączoną do igły w kałuży sterylnej wody.Następnie wyciągnąć jednorazową strzykawkę z otworu rurki, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do systemu rurkowego po wyjęciu strzykawki. Następnie napełnij 10-mikrolitrową strzykawkę Hamiltona sterylną wodą. Następnie podłącz igłę strzykawki Hamilton do otwartego końca rurki, zanurzając końcówkę igły strzykawki Hamilton w kałuży sterylnej wody na folii para.Naciśnij i przytrzymaj przycisk szybkiego cofania na ekranie pompy, aby przesunąć bloki popychacza do przybliżonej długości strzykawki. Następnie odkręć pokrętła zaciskowe wspornika, aby poluzować wsporniki mocujące na popychaczu i blokach uchwytu strzykawki. Następnie załadować strzykawkę Hamilton na blok uchwytu strzykawki i zabezpieczyć strzykawkę zgodnie z instrukcjami producenta.Aby dostosować parametry na ekranie ustawień pompy, naciśnij przycisk Force" i ustaw poziom siły na 30%Następnie zaakceptuj zmiany, aby wrócić do ekranu ustawień. Naciśnij przycisk Szybki start", wybierz Metoda, a następnie wybierz opcję Tylko zaparzanie". Jako opcję strzykawki wybierz Hamilton 1700, a następnie kliknij Szkło"i wybierz 10 mikrolitrów.Później należy wybrać szybkość infuzji i objętość wstrzyknięcia. Wysunąć wodę ze strzykawki Hamiltona, pozostawiając rurkę i igłę do wstrzykiwań pełną wody, naciskając przycisk "Infuse". Następnie należy usunąć wirusa, umieszczając igłę do wstrzykiwań w porcji zapasu wirusa.Następnie lekko pociągnij strzykawkę Hamiltona, naciskając przycisk cofania, aby wprowadzić mały pęcherzyk powietrza do rurki. Po znieczuleniu zwierzęcia chwyć spojówkę kleszczami. Następnie włóż igłę do spojówki, aż skos zostanie całkowicie pokryty błoną spojówkową i przyłóż igłę do gałki ocznej.Jednocześnie należy rozpocząć wstrzykiwanie, naciskając przycisk "Start" za pomocą przełącznika nożnego. Aby zbadać rozmieszczenie wektora AAV, oko i otaczające tkanki wybarwiono hematoksyliną i eozyną. Reprezentatywne przekroje strzałkowe wykazały, że dyspersja tuszu indyjskiego zachodziła głównie w sąsiedztwie mięśni zewnątrzgałkowych na zewnętrznej powierzchni twardówki w luźnych tkankach łącznych okołogałkowych.Aby potwierdzić transdukcję samouzupełniającego się AAV 8 po ośmiu tygodniach od wstrzyknięcia, zbadano obfitość białka zielonej fluorescencji w przekrojach poprzecznych za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Wyniki ujawniły, że wektory AAV 8 skutecznie transdukowały mięśnie okołogałkowe za okiem i rogówką. Aby przeanalizować biodystrybucję wektora, liczbę kopii genomu wektora i wyraźne przedziały oka w innych narządach, w tym wątrobie i sercu, zbadano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy przy użyciu starterów i sond specyficznych dla transgenu.Ekspresja transgenu została potwierdzona ilościową reakcją łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją, co sugerowało, że podspojówkowe wstrzyknięcie AAV 8 powoduje ekspresję transgenu w powiece, spojówce, rogówce i nerwie wzrokowym. Pęcherzyk powietrza będzie służył jako bariera między wodą w rurce a lekiem terapeutycznym. Technika ta pozwala innym badaczom na zbadanie możliwości wykorzystania podspojówkowej drogi podawania zarówno w przypadku roztworów okulistycznych, jak i ocznych terapii genowych w przypadku wielu chorób.

subconjunctival-administration-adeno-associated-virus-vectors-small

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę wewnątrzczaszkowej iniekcji wektorów AAV w celu fluorescencyjnego znakowania neuronów i gleju w korze wzrokowej.

Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie wektorów wirusowych opartych na wirusach adeno-zależnych

W tym filmie pokazujemy dostarczanie rekombinowanego genu związanego z adeno na bazie wirusa u szczeniaka myszy. Metoda ta pomaga w badaniu ekspresji genów w docelowych komórkach.

Dostarczanie genów na podstawie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem: technika dostarczania transgenu i ekspresji specyficznej dla serca w modelu gryzoni

Źródło: Park, S. W., et al. Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy nabłonek barwnikowy siatkówki. J. Vis. Exp. (2015)Film opisuje metodę podsiatkówkowego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) w modelu mysim. Szczegółowo opisano w nim procedurę, od znieczulenia i przygotowania oka po precyzyjne dostarczenie wektora lentiwirusowego, zapewniając integrację i ekspresję genów w RPE.

Podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu mysim

Źródło: Grames, M. S., et al. Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wstrzyknięcie do żyły ogonowej rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (AAV) u szczurów. Po wstrzyknięciu do żyły ogonowej bocznej wirus dostaje się do krwiobiegu, krąży w sercu i dociera do mózgu, gdzie dostaje się do neuronów i ułatwia produkcję białka docelowego do zastosowań...

 Dożylne podawanie rekombinowanych wektorów wirusa związanego z adenowirusem w modelu szczurzym 

Aby zbadać przepuszczalność bariery krew-siatkówka i wewnętrzną integralność błony ograniczającej w zwierzęcych modelach chorób siatkówki, użyliśmy kilku wariantów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jako narzędzi do oznaczania neuronów siatkówki i gleju. Ekspresja genu reporterowego za pośrednictwem wirusa jest następnie wykorzystywana jako wskaźnik przepuszczalności bariery siatkówkowej.

Wykorzystanie wirusa związanego z adenowirusem jako narzędzia do badania barier siatkówkowych w chorobie

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe to technika chirurgiczna służąca skutecznemu dostarczaniu genów do nabłonka barwnikowego siatkówki w oku myszy.  Tutaj opisujemy łatwą i powtarzalną metodę subretinalnego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy eksperymentalnych.

Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy Nabłonek barwnikowy siatkówki

Omówiono metody dostarczania genów na szeroką skalę do ośrodkowego układu nerwowego u szczurów. W tym przykładzie celem jest naśladowanie choroby, która wpływa na cały rdzeń kręgowy. Rozległa transdukcja może być wykorzystana do dostarczenia białka terapeutycznego do OUN z jednorazowego podania obwodowego.

Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego

Tutaj prezentujemy technikę bezpośredniego wstrzykiwania dokanałowego przy użyciu 1% chlorowodorku lidokainy w roztworze wirusa, aby zapewnić efektywne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem małym zwierzętom i ustanowić system punktacji do przewidywania skuteczności transdukcji w ośrodkowym układzie nerwowym w zależności od stopnia przejściowego osłabienia wywołanego przez lidokainę.

Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy

Ten protokół pokazuje, jak określić ilościowo skuteczność transdukcji AAV w siatkówce myszy za pomocą cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) wraz z produkcją AAV na małą skalę, iniekcją doszklistkową, obrazowaniem siatkówki i izolacją genomowego DNA siatkówki.

Cyfrowa metoda kropelkowej PCR do ilościowego oznaczania skuteczności transdukcji AAV w siatkówce myszy

Tutaj szczegółowo opisujemy zoptymalizowany protokół wstrzykiwania bocznych żył ogonowych myszy w celu systemowego podawania wirusa związanego z adenowirusem (AAV) dorosłym myszom. Dodatkowo opisujemy protokoły powszechnie stosowanych testów do oceny transdukcji AAV.

Konsekwentne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem poprzez boczne wstrzyknięcie żyły ogonowej u dorosłych myszy

Poznaj metodę podspojówkowego podawania wektorów wirusa AAV w małych modelach zwierzęcych. Ta technika terapii genowej oferuje bezpieczne i mało inwazyjne dostarczanie leków do tkanek ocznych.

Podspojówkowe podawanie wektorów wirusa związanych z adenowirusem w małych modelach zwierzęcych

Przeglądaj więcej filmów