Podspojówkowe podawanie wektorów wirusa związanych z adenowirusem w małych modelach zwierzęcych
16 marca 2022
W tym manuskrypcie, iniekcja podspojówkowa jest demonstrowana jako prawidłowa metoda dostarczania wektora do tkanek oka u myszy za pomocą systemu iniekcyjnego składającego się z pompy strzykawkowej do infuzji/pobrania i gazoszczelnej wyjmowanej strzykawki połączonej z igłami do mikroiniekcji. Ten system iniekcji można również dostosować do innych dróg podawania wewnątrzgałkowego.
Protokół ten oferuje metodę dostarczania terapii genowej do wielu tkanek oka w bezpieczny, łatwy i skuteczny sposób. Można go również przystosować do iniekcji śródstromalnych i podsiatkówkowych u małych zwierząt. Stosowanie podspojówkowej drogi iniekcji jest minimalnie inwazyjne.
Stwarza mniejsze ryzyko i jest bardzo obiecujący w leczeniu wielu chorób oczu. Biorąc pod uwagę, że ponad 1 miliard ludzi na całym świecie cierpi na upośledzenie wzroku, stosowanie bezpiecznej i łatwej metody dostarczania leków ma szerokie zastosowanie w leczeniu wielu różnych przyczyn ślepoty. Metody dostarczania genów opisane w tym protokole są szczególnie interesujące dla tych, którzy opracowują potencjalne strategie interwencji i praktykujących okulistów, którzy ostatecznie dostarczą te leki pacjentom.
Największym wyzwaniem dla kogoś, kto wykonuje ten protokół po raz pierwszy, jest prawdopodobnie wprowadzenie igły w pojętą przestrzeń spojówkową. Aby rozpocząć, należy zmontować system iniekcyjny, umieszczając mikroskop stereoskopowy i pompę strzykawkową w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Następnie przytnij rurkę polietylenową na długość około 50 centymetrów.
Włóż koniec igły o rozmiarze 36 do jednego końca rurki. Następnie napełnij jednorazową strzykawkę o pojemności 3 mililitrów sterylną wodą i włóż ją do boku rurki naprzeciwko igły. Przepłucz rurkę trzy razy, na przemian sterylną wodą i 70% alkoholem, aby zdezynfekować rurkę i upewnić się, że nie ma wycieków, zatkań ani uszkodzeń w całej rurce.
Za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 3 mililitrów napełnij rurkę sterylną wodą i pozostaw rurkę podłączoną do jednorazowej strzykawki. Następnie umieść kawałek parapianki na powierzchni szafy bezpieczeństwa biologicznego i dodaj do niej kałużę sterylnej wody. Zanurz część rurki podłączoną do igły w kałuży sterylnej wody.
Następnie wyciągnąć jednorazową strzykawkę z otworu rurki, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do systemu rurkowego po wyjęciu strzykawki. Następnie napełnij 10-mikrolitrową strzykawkę Hamiltona sterylną wodą. Następnie podłącz igłę strzykawki Hamilton do otwartego końca rurki, zanurzając końcówkę igły strzykawki Hamilton w kałuży sterylnej wody na folii para.
Naciśnij i przytrzymaj przycisk szybkiego cofania na ekranie pompy, aby przesunąć bloki popychacza do przybliżonej długości strzykawki. Następnie odkręć pokrętła zaciskowe wspornika, aby poluzować wsporniki mocujące na popychaczu i blokach uchwytu strzykawki. Następnie załadować strzykawkę Hamilton na blok uchwytu strzykawki i zabezpieczyć strzykawkę zgodnie z instrukcjami producenta.
Aby dostosować parametry na ekranie ustawień pompy, naciśnij przycisk Force" i ustaw poziom siły na 30%Następnie zaakceptuj zmiany, aby wrócić do ekranu ustawień. Naciśnij przycisk Szybki start", wybierz Metoda, a następnie wybierz opcję Tylko zaparzanie". Jako opcję strzykawki wybierz Hamilton 1700, a następnie kliknij Szkło"i wybierz 10 mikrolitrów.
Później należy wybrać szybkość infuzji i objętość wstrzyknięcia. Wysunąć wodę ze strzykawki Hamiltona, pozostawiając rurkę i igłę do wstrzykiwań pełną wody, naciskając przycisk "Infuse". Następnie należy usunąć wirusa, umieszczając igłę do wstrzykiwań w porcji zapasu wirusa.
Następnie lekko pociągnij strzykawkę Hamiltona, naciskając przycisk cofania, aby wprowadzić mały pęcherzyk powietrza do rurki. Po znieczuleniu zwierzęcia chwyć spojówkę kleszczami. Następnie włóż igłę do spojówki, aż skos zostanie całkowicie pokryty błoną spojówkową i przyłóż igłę do gałki ocznej.
Jednocześnie należy rozpocząć wstrzykiwanie, naciskając przycisk "Start" za pomocą przełącznika nożnego. Aby zbadać rozmieszczenie wektora AAV, oko i otaczające tkanki wybarwiono hematoksyliną i eozyną. Reprezentatywne przekroje strzałkowe wykazały, że dyspersja tuszu indyjskiego zachodziła głównie w sąsiedztwie mięśni zewnątrzgałkowych na zewnętrznej powierzchni twardówki w luźnych tkankach łącznych okołogałkowych.
Aby potwierdzić transdukcję samouzupełniającego się AAV 8 po ośmiu tygodniach od wstrzyknięcia, zbadano obfitość białka zielonej fluorescencji w przekrojach poprzecznych za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Wyniki ujawniły, że wektory AAV 8 skutecznie transdukowały mięśnie okołogałkowe za okiem i rogówką. Aby przeanalizować biodystrybucję wektora, liczbę kopii genomu wektora i wyraźne przedziały oka w innych narządach, w tym wątrobie i sercu, zbadano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy przy użyciu starterów i sond specyficznych dla transgenu.
Ekspresja transgenu została potwierdzona ilościową reakcją łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją, co sugerowało, że podspojówkowe wstrzyknięcie AAV 8 powoduje ekspresję transgenu w powiece, spojówce, rogówce i nerwie wzrokowym. Pęcherzyk powietrza będzie służył jako bariera między wodą w rurce a lekiem terapeutycznym. Technika ta pozwala innym badaczom na zbadanie możliwości wykorzystania podspojówkowej drogi podawania zarówno w przypadku roztworów okulistycznych, jak i ocznych terapii genowych w przypadku wielu chorób.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę dostarczania terapii genowej do wielu tkanek oka w sposób bezpieczny, prosty i skuteczny. Podspójówkowa droga podania jest małoinwazyjna i wiąże się z mniejszym ryzykiem, co daje duże nadzieje na skuteczne dostarczanie wirusów towarzyszących adenowirusom (AV) w celu leczenia różnych schorzeń oczu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Terapia genowa
- Metody podawania do oka
- Techniki małoinwazyjne
Wstęp
- Ponad 1 miliard ludzi na całym świecie cierpi na zaburzenia widzenia.
- Bezpieczne i łatwe metody dostarczania leków są kluczowe w leczeniu ślepoty.
- Protokół można dostosować do iniekcji śródstromowych i podsiatkówkowych u małych zwierząt.
- Opracowywanie strategii interwencyjnych w chorobach oczu budzi duże zainteresowanie.
Cel badania
- W celu zademonstrowania skutecznej metody dostarczania wektora do tkanek oka.
- W celu zapewnienia małoinwazyjnej opcji terapii genowej.
- W celu zwiększenia bezpieczeństwa i efektywności dostarczania leków do oka.
Zastosowane metody
- Iniekcja podspojówkowa przy użyciu pompy strzykawkowej do infuzji i aspiracji.
- Zastosowanie szczelnej, wymiennej strzykawki połączonej z igłami do mikroiniekcji.
- Adaptacja systemu wtrysku dla różnych dróg podania do wnętrza oka.
- Ocena metod dostarczania w modelach zwierząt laboratoryjnych.
Główne wyniki
- Metoda iniekcji podspójówkowej jest skuteczna w okulistycznej terapii genowej.
- Minimalna inwazyjność zmniejsza ryzyko związane z iniekcjami do oka.
- Metoda ta wykazuje szerokie zastosowanie w leczeniu wielu chorób oczu.
- Potencjał do znaczącego wpływu na leczenie zaburzeń widzenia.
Wnioski
- Iniekcja podspójnówkowa jest obiecującą metodą dostarczania leków do oka.
- Stanowi ona bezpieczne i skuteczne podejście w terapii genowej.
- Protokół ten może pomóc okulistom w podawaniu terapii pacjentom.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Podconjunktywalna administracja wektorów wirusów towarzyszących adenowirusom (AAV) w modelach małych zwierząt rozwiązuje problem bezpiecznego, lokalnego dostarczania genów w chorobach oczu. Ta małoinwazyjna metoda umożliwia precyzyjne celowanie w tkanki oka, co zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad terapią genową we wczesnej fazie. Jej elastyczność i powtarzalność sprawiają, że jest ona cennym narzędziem w procesie selekcji projektów oraz zapewnianiu ciągłości translacyjnej w opracowywaniu leków okulistycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących dostarczania genów do tkanek oka przy minimalnej inwazyjności.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez umożliwienie celowanej transdukcji i analizy ekspresji specyficznej dla danej tkanki.
- Ułatwia przewidywanie skuteczności wyboru wektora oraz drogi podania w programach terapii genowej oka.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane modele zwierząt laboratoryjnych do dalszej oceny ekspresji genów i celowania tkankowego.
- Standaryzuje parametry iniekcji w celu zapewnienia powtarzalności i ilościowej oceny rozprzestrzeniania się wektora.
- Umożliwia wiarygodne porównanie serotypów AAV i dróg podania w celu weryfikacji gotowości do badań przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami ocznymi istotnymi dla danej choroby, co pozwala na ocenę ekspresji biomarkerów translacyjnych po podaniu preparatu.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez potwierdzenie tkankowo specyficznej ekspresji transgenu.
- Dostarcza danych z uwzględnieniem ryzyka, niezbędnych do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju projektów w obszarze terapii genowej oka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając testowanie hipotez, optymalizację wektorów oraz ilościową walidację w modelach ocznych u małych zwierząt.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ukierunkowaną dostarczalność genów oraz analizę ekspresji.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki służące do porównywania wydajności wektorów i dróg podania.
- Analityka: Umożliwia pomiary oparte na immunofluorescencji i qPCR w celu oceny tkankowo specyficznej ekspresji transgenu oraz biodystrybucji.
- Badania translacyjne: Łączy wczesną fazę odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez potwierdzenie dostarczalności i ekspresji w tkankach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Oferuje zestandaryzowaną, adaptowalną platformę dla wielu badań nad terapią genową i dostarczaniem leków do oczu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad genoterapią oka.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, odtwarzalność i skalowalność protokołów dostarczania leków do oka.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową dzięki dostarczeniu rzetelnych danych na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój kandydatów do genoterapii oka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przeprowadzaniu zabiegów okulistycznych u małych zwierząt oraz technik mikroiniekcji.
- Wymaga dostępu do programowalnych pomp strzykawkowych, mikroskopów operacyjnych i narzędzi analitycznych do walidacji.
- Wymaga standaryzacji parametrów iniekcji i testów walidacyjnych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych dróg podania doszklistego i różnych roztworów okulistycznych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wymagania dotyczące umiejętności technicznych oraz specyficzne dla modelu rozważania anatomiczne.
Najczęściej zadawane pytania z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:26
Preparation and Administration of Adeno-Associated Virus via Subconjunctival Injection
4:21
Results: Analysis of AAV Vector Administration, Biodistribution and Transgene Expression into the Subconjunctival Space
5:41
Conclusion
