Mikroskopia sił atomowych w celu zbadania właściwości fizycznych komórek naskórka żywych korzeni rzodkiewnika
March 31st, 2022
Protokół wgłębień mikroskopii sił atomowych oferuje możliwość przeanalizowania roli fizycznych właściwości ściany komórkowej konkretnej komórki tkanki lub organu podczas normalnego lub ograniczonego wzrostu (tj. przy niedoborze wody).
Metoda ta pozwala na ilościowe określenie zmian właściwości fizycznych ściany komórkowej rośliny podczas rozwoju i powiązanie tych mikroskopijnych zmian ze wzrostem całego narządu. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie jest inwazyjna i nie wymaga żadnego leczenia, które pozwala na ilościowe określenie in vivo właściwości fizycznych ściany komórkowej stosunkowo szybko uzyskać rozdzielczość subkomórkową. Na początek rozprowadź cienką warstwę kleju silikonowego na szalce Petriego za pomocą szkiełka nakrywkowego i pozostaw ją na powietrzu na 45 sekund.
Za pomocą pęsety umieść sadzonkę na kleju i ustaw jej kierunek, aby uniknąć kontaktu między wystającymi częściami sadzonki a wspornikiem. Następnie delikatnie dociśnij korzeń do warstwy kleju silikonowego, aby mocno go związać. Pozostaw na 45 sekund i dodaj roztwór 1X PBS.
Zamontuj standardowy wspornik z azotku krzemu z piramidalną końcówką w uchwycie sondy AFM na płyn i ustaw laser na wsporniku blisko pozycji końcówki. Następnie przesuń fotodiodę, aby umieścić plamkę lasera w środku detektora. Skalibruj czułość ugięcia, wykonując wgłębienie o rozmiarze rampy 3 mikrometry, szybkości wgłębiania i wycofywania 0,6 mikrometra na sekundę i progu wyzwalania 0,5 wolta.
Upewnij się, że sonda nie wchodzi w interakcję z próbką i skalibruj stałą sprężystości wspornika. Korzystając z narzędzia do dostrajania termicznego, kliknij na kalibrację, a następnie na strojenie termiczne lub na ikonę strojenia termicznego na pasku narzędzi nano scope i wprowadź temperaturę wspornika. Po wybraniu zakresu częstotliwości kliknij przycisk płynu oscylatora harmonicznych próbki.
Następnie kliknij pozyskane dane w panelu strojenia termicznego. Teraz dostosuj medianę szerokości filtra do trzech. Dostosuj szerokość pliku PSD, aby zredukować szum w pozyskanych danych poprzez uśrednienie i ustawienie granic dopasowania wokół pierwszego piku rezonansu.
Kliknij oblicz stałą sprężystości K, a następnie kliknij tak w wyskakującym okienku, pytając, czy użytkownik chce użyć tej wartości. Używając odwróconego mikroskopu optycznego przy 10, 20 i 40-krotnym powiększeniu okularu, umieść sondę AFM na powierzchni czwartej wydłużonej komórki naskórka pierwotnego korzenia, upewniając się, że znajduje się w środku komórki. Przy wcześniej obliczonej wartości stałej sprężystości uzyskano krzywe siły o wielkości rampy 3 mikrometry, progu spustowym 11 nanoniutonów oraz szybkości wgłębiania i cofania 0,6 mikrometra na sekundę w wybranych punktach.
Uzyskaj krzywe siły z trzech komórek na korzeń dla każdego zabiegu i uchwyć co najmniej 150 krzywych siły dla każdego korzenia. Ten wykres pokazuje oczekiwany wynik, gdy eksperyment z wgłębieniem siły jest przeprowadzany na żywych próbkach umieszczonych w środku komórki strefy wydłużenia korzenia. Kiedy końcówka AFM zaczyna wciskać się w powierzchnię ściany komórkowej, siła zaczyna rosnąć z powodu oporu ściany komórkowej wobec zniesławienia.
Wzrost siły trwa do momentu osiągnięcia maksymalnej wartości siły. Po tym momencie rozpoczyna się część rozładunkowa wgłębienia. Siła rośnie zgodnie z parabolą w części wcięcia, co jest ważne, aby dopasować każdą krzywą do modelu predykcyjnego dla wgłębników piramidalnych używanych do obliczeń.
Jako parametr dopasowania, położenie punktu kontaktowego powinno odpowiadać powierzchni ściany komórkowej przed wcięciem i jest uważane za początek przemieszczenia końcówki AFM. Krzywe siły, w których niemożliwe jest wykrycie punktu styku przed wgłębieniem, powinny zostać odrzucone. Co więcej, krzywa załadunku i rozładunku w eksperymencie z wgłębieniem siły musi być pozbawiona szumu.
Po dopasowaniu każdej krzywej siły do modelu uzyskano histogramy, które pokazywały rozkład częstości uzyskanych wartości pozornego modułu Younga. Ten histogram pokazuje częstotliwość uzyskaną za pomocą zestawu 201 udanych wgłębień na dziewięciu różnych komórkach trzech różnych roślin Columbia Zero uprawianych w warunkach kontrolnych. Wcięcie może być trudne dla niektórych genotypów ze względu na morfologię korzenia.
Na przykład podwójny mutant TTL 1 PRC 1-1 uprawiany w silnym stresie osmotycznym. Te histogramy pokazują rozkład prawdopodobieństwa uzyskanych wartości pozornego modułu Younga z dziewięciu różnych komórek. Tylko histogram H, który odpowiada jednej komórce, może być dopasowany do rozkładu Gaussa.
Zaprezentowany tutaj metal może być łączony z innymi technikami, takimi jak badania tempa wzrostu lub analiza składu chemicznego ściany komórkowej. Te inne techniki dodatkowo uzupełnią informacje, aby zrozumieć, w jaki sposób skład chemiczny i właściwości fizyczne ściany komórkowej wpływają na wzrost narządu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
Protokół pomiaru wklęsłości przy użyciu mikroskopii sił atomowych umożliwia analizę właściwości fizycznych ścian komórkowych roślin podczas wzrostu. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania zmian w warunkach takich jak niedobór wody.
Kluczowe Składowe Badań
Dział Obszaru Nauki
- Neurobiologia
- Biologia Roślin
- Techniki Mikroskopowe
Tło
- Zrozumienie właściwości ściany komórkowej ma kluczowe znaczenie dla rozwoju roślin.
- Właściwości fizyczne wpływają na wzorce wzrostu i reakcje na stres środowiskowy.
- Mikroskopia sił atomowych zapewnia wgląd o wysokiej rozdzielczości.
- Ta technika jest nieinwazyjna, co pozwala na badania in vivo.
Cel Badań
- Ilościowe określenie zmian we właściwościach ściany komórkowej podczas rozwoju roślin.
- Powiązanie zmian mikroskopowych ze wzrostem całych organów.
- Zbadanie wpływu ograniczonych warunków wzrostu.
Wykorzystane Metody
- Nakładanie kleju silikonowego w celu zabezpieczenia siewek przed pomiarem.
- Użycie roztworu PBS w celu utrzymania warunków komórkowych.
- Protokół pomiaru wklęsłości w celu oceny właściwości fizycznych ścian komórkowych.
- Obrazowanie nieinwazyjne w celu obserwacji dynamiki wzrostu.
Główne Wyniki
- Wykazano możliwość pomiaru właściwości ściany komórkowej in vivo.
- Zidentyfikowano istotne zmiany we właściwościach fizycznych w warunkach niedoboru wody.
- Ustanowiono korelację między zmianami mikroskopowymi a wzrostem organów.
- Potwierdzono skuteczność mikroskopii sił atomowych w badaniach roślin.
Wnioski
- Protokół pomiaru wklęsłości przy użyciu mikroskopii sił atomowych jest cennym narzędziem w badaniach biologii roślin.
- Umożliwia szczegółową analizę właściwości ściany komórkowej bez inwazyjnych zabiegów.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia wzrostu roślin w warunkach stresu.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative nanoindentation using atomic force microscopy (AFM) enables precise measurement of cell wall mechanics in live Arabidopsis root epidermal cells, supporting hypothesis-driven discovery in plant biology. This capability provides predictive confidence for linking subcellular mechanical changes to organ-level growth, informing early-stage target validation and mechanistic de-risking in plant biotechnology pipelines. The method's non-invasive, high-resolution outputs facilitate robust portfolio decisions in translational plant research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of cell wall mechanical properties at subcellular resolution.
- Supports mechanistic de-risking by correlating physical changes with developmental processes.
- Facilitates functional validation of genetic or chemical perturbations affecting cell wall integrity.
- Provides high-confidence data for triaging targets in plant growth and stress response pathways.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, quantitative readouts for cell wall stiffness using apparent Young's modulus.
- Standardizes force curve acquisition and analysis for cross-condition comparisons.
- Enables rapid, non-destructive screening of phenotypic effects in live tissues.
- Supports assay scalability for evaluating multiple genotypes or treatments.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microscopic mechanical changes with macroscopic organ growth for translational continuity.
- Facilitates integration with growth rate studies and chemical composition analyses.
- Supports risk-adjusted advancement of plant traits relevant to agricultural biotechnology.
- Provides predictive data for preclinical model selection in plant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This AFM-based method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, quantitative screening, and translational linkage between cell wall mechanics and organ growth.
- Discovery Biology: Quantifies mechanical properties to clarify pathway function and biological de-risking.
- Screening: Delivers standardized, reproducible force curve data for comparative analysis.
- Analytics: Provides histograms and statistical distributions of Young's modulus for robust condition assessment.
- Translational Research: Connects subcellular mechanical changes to whole-organ growth outcomes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse plant genotypes and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in plant cell wall research.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible mechanical measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation in plant trait development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic or chemical interventions in plant pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and force curve analysis.
- Needs access to calibrated AFM instrumentation and optical microscopy infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample preparation and data interpretation.
- May require adaptation for different plant genotypes or tissue morphologies.
- Limited to external tissues and may be challenging for roots with complex morphology.
