Mikroskopia sił atomowych w celu zbadania właściwości fizycznych komórek naskórka żywych korzeni rzodkiewnika

Metoda ta pozwala na ilościowe określenie zmian właściwości fizycznych ściany komórkowej rośliny podczas rozwoju i powiązanie tych mikroskopijnych zmian ze wzrostem całego narządu. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie jest inwazyjna i nie wymaga żadnego leczenia, które pozwala na ilościowe określenie in vivo właściwości fizycznych ściany komórkowej stosunkowo szybko uzyskać rozdzielczość subkomórkową. Na początek rozprowadź cienką warstwę kleju silikonowego na szalce Petriego za pomocą szkiełka nakrywkowego i pozostaw ją na powietrzu na 45 sekund.

Za pomocą pęsety umieść sadzonkę na kleju i ustaw jej kierunek, aby uniknąć kontaktu między wystającymi częściami sadzonki a wspornikiem. Następnie delikatnie dociśnij korzeń do warstwy kleju silikonowego, aby mocno go związać. Pozostaw na 45 sekund i dodaj roztwór 1X PBS.

Zamontuj standardowy wspornik z azotku krzemu z piramidalną końcówką w uchwycie sondy AFM na płyn i ustaw laser na wsporniku blisko pozycji końcówki. Następnie przesuń fotodiodę, aby umieścić plamkę lasera w środku detektora. Skalibruj czułość ugięcia, wykonując wgłębienie o rozmiarze rampy 3 mikrometry, szybkości wgłębiania i wycofywania 0,6 mikrometra na sekundę i progu wyzwalania 0,5 wolta.

Upewnij się, że sonda nie wchodzi w interakcję z próbką i skalibruj stałą sprężystości wspornika. Korzystając z narzędzia do dostrajania termicznego, kliknij na kalibrację, a następnie na strojenie termiczne lub na ikonę strojenia termicznego na pasku narzędzi nano scope i wprowadź temperaturę wspornika. Po wybraniu zakresu częstotliwości kliknij przycisk płynu oscylatora harmonicznych próbki.

Następnie kliknij pozyskane dane w panelu strojenia termicznego. Teraz dostosuj medianę szerokości filtra do trzech. Dostosuj szerokość pliku PSD, aby zredukować szum w pozyskanych danych poprzez uśrednienie i ustawienie granic dopasowania wokół pierwszego piku rezonansu.

Kliknij oblicz stałą sprężystości K, a następnie kliknij tak w wyskakującym okienku, pytając, czy użytkownik chce użyć tej wartości. Używając odwróconego mikroskopu optycznego przy 10, 20 i 40-krotnym powiększeniu okularu, umieść sondę AFM na powierzchni czwartej wydłużonej komórki naskórka pierwotnego korzenia, upewniając się, że znajduje się w środku komórki. Przy wcześniej obliczonej wartości stałej sprężystości uzyskano krzywe siły o wielkości rampy 3 mikrometry, progu spustowym 11 nanoniutonów oraz szybkości wgłębiania i cofania 0,6 mikrometra na sekundę w wybranych punktach.

Uzyskaj krzywe siły z trzech komórek na korzeń dla każdego zabiegu i uchwyć co najmniej 150 krzywych siły dla każdego korzenia. Ten wykres pokazuje oczekiwany wynik, gdy eksperyment z wgłębieniem siły jest przeprowadzany na żywych próbkach umieszczonych w środku komórki strefy wydłużenia korzenia. Kiedy końcówka AFM zaczyna wciskać się w powierzchnię ściany komórkowej, siła zaczyna rosnąć z powodu oporu ściany komórkowej wobec zniesławienia.

Wzrost siły trwa do momentu osiągnięcia maksymalnej wartości siły. Po tym momencie rozpoczyna się część rozładunkowa wgłębienia. Siła rośnie zgodnie z parabolą w części wcięcia, co jest ważne, aby dopasować każdą krzywą do modelu predykcyjnego dla wgłębników piramidalnych używanych do obliczeń.

Jako parametr dopasowania, położenie punktu kontaktowego powinno odpowiadać powierzchni ściany komórkowej przed wcięciem i jest uważane za początek przemieszczenia końcówki AFM. Krzywe siły, w których niemożliwe jest wykrycie punktu styku przed wgłębieniem, powinny zostać odrzucone. Co więcej, krzywa załadunku i rozładunku w eksperymencie z wgłębieniem siły musi być pozbawiona szumu.

Po dopasowaniu każdej krzywej siły do modelu uzyskano histogramy, które pokazywały rozkład częstości uzyskanych wartości pozornego modułu Younga. Ten histogram pokazuje częstotliwość uzyskaną za pomocą zestawu 201 udanych wgłębień na dziewięciu różnych komórkach trzech różnych roślin Columbia Zero uprawianych w warunkach kontrolnych. Wcięcie może być trudne dla niektórych genotypów ze względu na morfologię korzenia.

Na przykład podwójny mutant TTL 1 PRC 1-1 uprawiany w silnym stresie osmotycznym. Te histogramy pokazują rozkład prawdopodobieństwa uzyskanych wartości pozornego modułu Younga z dziewięciu różnych komórek. Tylko histogram H, który odpowiada jednej komórce, może być dopasowany do rozkładu Gaussa.

Zaprezentowany tutaj metal może być łączony z innymi technikami, takimi jak badania tempa wzrostu lub analiza składu chemicznego ściany komórkowej. Te inne techniki dodatkowo uzupełnią informacje, aby zrozumieć, w jaki sposób skład chemiczny i właściwości fizyczne ściany komórkowej wpływają na wzrost narządu.