Name: Lokalizacja czynnika jednokomórkowego na chromatynie przy użyciu ultra-niskiego rozszczepienia wejściowego pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj technikę CUT&RUN do lokalizacji białek na chromatinie w pojedynczych komórkach. Ta metoda w formacie 96-well wymaga minimalnej liczby komórek i pozwala uzyskać wyniki w ciągu jednego dnia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom Hainer Lab za przeczytanie i komentarze do wcześniejszej wersji tego manuskryptu. W ramach tego projektu wykorzystano NextSeq500 dostępny w Rdzeniu Sekwencjonowania Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu w Pittsburghu w Szpitalu Dziecięcym UPMC w Pittsburghu do sekwencjonowania, ze specjalnymi podziękowaniami dla jego dyrektora, Williama MacDonalda. Badania te były częściowo wspierane przez University of Pittsburgh Center for Research Computing poprzez udostępnione zasoby komputerowe. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (dla S.J.H.).

<ol><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
<li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking%3A+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li>
<li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li>
<li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li>
<li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III%2C+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li>
<li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-tube+linear+DNA+amplification+%28LinDA%29+for+robust+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li>
<li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li>
<li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232(2013).</li>
<li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cChIP-seq%3A+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083(2015).</li>
<li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033(2015).</li>
<li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChlC+and+ChEC%3B+genomic+mapping+of+chromatin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li>
<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733(2015).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856(2017).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314(2019).</li>
<li>Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li>
<li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT%26RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li>
<li>Zheng, X. -Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów związanych z tym projektem.

CUT&RUN to skuteczny protokół do określania lokalizacji białek na chromatynie. Ma wiele zalet w porównaniu z innymi protokołami, w tym: 1) wysoki stosunek sygnału do szumu, 2) szybki protokół i 3) wymagane niskie pokrycie odczytu sekwencjonowania, co prowadzi do oszczędności kosztów. Zastosowanie białka A lub białka A/G-MNazy umożliwia stosowanie CUT&RUN z dowolnym dostępnym przeciwciałem; W związku z tym ma potencjał do szybkiego i łatwego profilowania wielu białek. Jednak adaptacja do pojedynczej komórki w celu dowolne...

Wiele białek jądrowych funkcjonuje poprzez interakcję z chromatyną, aby promować lub zapobiegać aktywności szablonowej DNA. Aby określić funkcję tych białek oddziałujących z chromatyną, ważne jest zidentyfikowanie lokalizacji genomowych, w których te białka są związane. Od czasu swojego opracowania w 1985 roku, immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest złotym standardem w określaniu, gdzie białko wiąże się z chromatyną1,2. Tradycyjna technika ChIP ma następujący podstawowy przebieg pracy: komórki są zbierane i sieciowane (zwykle formaldehydem), chromatyna jest ścinana (zwykle przy użyciu ostrych metod sonikacji, co wymaga sieciowania), białko będące przedmiotem zainteresowania jest immunoprecypitowane przy użyciu przeciwciała, które celuje w białko (lub znakowane białko), a następnie przeciwciało drugorzędowe (sprzężone z agarozą lub kulkami magnetycznymi), sieciowanie jest odwrócone, białko i RNA są trawione w celu oczyszczenia DNA, a to wzbogacone DNA ChIP jest używane jako szablon do analizy (przy użyciu radioznakowanych sond1,2, qPCR3, microarrays5,6, lub sequencing4). Wraz z pojawieniem się mikromacierzy i masowo równoległego głębokiego sekwencjonowania, ChIP-chip5,6 i ChIP-seq4 zostały niedawno opracowane i pozwalają na identyfikację lokalizacji białek na chromatynie w całym genomie. Sieciowanie ChIP jest potężną i niezawodną techniką od czasu jego pojawienia się wraz ze znacznymi postępami w rozwiązywaniu problemów dzięki ChIP-exo7 i ChIP-nexus8. Równolegle z rozwojem ChIP-seq ustanowiono natywne (niesieciujące) protokoły dla ChIP (N-ChIP), które wykorzystują trawienie nukleazy (często przy użyciu nukleazy mikrokokowej lub MNazy) do fragmentacji chromatyny, w przeciwieństwie do sonikacji wykonywanej w tradycyjnych technikach sieciowania ChIP9. Jednak jedną z głównych wad zarówno technologii sieciowania ChIP, jak i N-ChIP było wymaganie dużej liczby komórek ze względu na niską wydajność DNA po eksperymentalnej manipulacji. Dlatego w ostatnich latach wiele wysiłków skierowano na optymalizację technologii ChIP pod kątem niskiego nakładu ogniw. Wysiłki te zaowocowały opracowaniem wielu potężnych technologii opartych na ChIP, które różnią się pod względem możliwości zastosowania i wymagań wejściowych10,11,12,13,14,15,16,17,18. Brakowało jednak technologii opartych na jednokomórkowym sekwencjonowaniu ChIP, zwłaszcza w przypadku białek niehistonowych.
W 2004 roku opracowano alternatywną technologię określania obecności białek na chromatynie, zwaną Endogennym Rozszczepieniem Chromatyny (ChEC) i Immunorozszczepieniem Chromatyny (ChIC)19. Te techniki pojedynczego locus wykorzystują fuzję MNazy z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania (ChEC) lub z białkiem A (ChIC) w celu bezpośredniego cięcia DNA sąsiadującego z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. W ostatnich latach zarówno ChEC, jak i ChIC zostały zoptymalizowane pod kątem profilowania białek w całym genomie na chromatynie (odpowiednio ChEC-seq i CUT&RUN)20,21. Podczas gdy ChEC-seq jest potężną techniką określania lokalizacji czynnika, wymaga opracowania białek fuzyjnych MNazy dla każdego celu, podczas gdy ChIC i jego odmiana obejmująca cały genom, CUT&RUN, opierają się na przeciwciałie skierowanym w kierunku białka będącego przedmiotem zainteresowania (jak w przypadku ChIP) i rekombinowanej białku A-MNazy, w którym białko A może rozpoznać stały region IgG przeciwciała. Jako alternatywę opracowano białko fuzyjne A / białko G-MNaza (pA / G-MNaza), które może rozpoznawać szerszy zakres regionów stałych przeciwciał 22. CUT&RUN szybko stał się popularną alternatywą dla ChIP-seq do określania lokalizacji białek w całym genomie chromatyny.
Ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN), odmiana CUT&RUN, która umożliwia korzystanie z niskich i jednokomórkowych wejść, została opisana w 201923. W tym miejscu opisano metodologię ręcznego stosowania pojedynczej komórki w formacie 96-dołkowym. Należy zauważyć, że od czasu opracowania uliCUT&RUN opracowano dwie alternatywy dla profilowania histonów, CUT&Tag i iACT-seq, zapewniające solidne i wysoce równoległe profilowanie białek histonowych24,25. Ponadto scCUT&Tag został zoptymalizowany pod kątem profilowania wielu czynników w jednej komórce (multiCUT&Tag) oraz do stosowania do białek niehistonowych26. Podsumowując, CUT&RUN stanowi atrakcyjną alternatywę dla niskonakładowego sekwencjonowania ChIP, gdzie uliCUT&RUN może być wykonywany w dowolnym laboratorium biologii molekularnej, które ma dostęp do sortownika komórek i standardowego wyposażenia.

<table><tbody><tr><td>Przezroczyste probówki do mikrofug o pojemności 1,5 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90410</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny w probówce 1,5 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml kompatybilna z probówką Zimna wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5404000537</td><td></td></tr><tr><td>10 cm sterylne płytki do hodowli tkankowych</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>10X T4 Lufor ligazy DNA</td><td>Nowość Anglia Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki stożkowe</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>1X TE bufor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Probówki do PCR</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>2X szybki bufor ligazy</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td>Bufor ligazy</td></tr><tr><td>5X KAPA Bufor HiFi</td><td>Roche</td><td></td><td>7958889001 5X wysokiej jakości bufor PCR</td></tr><tr><td>7-amino-aktynomycyna D (7-AAD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB559925</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy stojak magnetyczny</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12027 lub 12331D</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>VWR</td><td>82006-636</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>kulki polistyrenowo-magnetytowe; Ze względu na potencjalną zmienność między partiami ściegu AMPure XP zaleca się kalibrację roztworu AMPure Bead. Zobacz dane producenta s instrukcje</td></tr><tr><td>Przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania</td><td>różnią się</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>BioMag Plus Koraliki Concanavalin A</td><td>Polysciences</td><td>86057-10</td><td>Mikrosfery paramagnetyczne sprzężone z ConA</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ62905AP</td><td></td></tr><tr><td>Sortownik komórek Sortownik</td><td></td><td>komórek BD FACSAria II</td><td>Wymaga szkolenia</td></tr><tr><td>Pożywki specyficzne dla komórek do hodowli komórkowych</td><td>Różni się</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C298-500</td><td>Chloroform działa drażniąco na skórę i działa szkodliwie w przypadku połknięcia; Obsługa w oparach chemicznych za pomocą rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i okularów</td></tr><tr><td>Komputer z procesorem 64-bitowym i dostępem do klastra</td><td></td><td></td> superkomputerowego<td>Do analiz obliczeniowych wynikowych zestawów danych sekwencjonowania</td></tr><tr><td>Kolumny wirowe DNA</td><td>Epoka Nauki przyrodnicze</td><td>1920-250</td><td></td></tr><tr><td>zestaw dNTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt do elektroforezy</td><td>różni się</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22032601</td><td>100% obj. / obj. etanol jest wysoce łatwopalny; obchodzić się z dygestoriami chemicznymi za pomocą rękawiczek, fartuch laboratoryjny, i gogle</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy&nbsp; Panie przewodniczący, panie i panowie!</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482100</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>VWR</td><td>97063-256</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Heterologiczny S. cerevisiae DNA kolce</td> domowej <td>roboty</td><td></td><td>Przygotowany z usieciowanego, trawionego przez MNazę i wyekstrahowanego żelu agarozowego genomowego DNA oczyszczonego z białka/RNA i rozcieńczonego do 10 ng/ml. Zalecamy genomowe DNA drożdży, ale w razie potrzeby można użyć innych organizmów.</td></tr><tr><td>Kwas solny&nbsp; (HCl)</td><td>Kwas</td> solny Fisher <td>Scientific A144-212</td><td>jest bardzo; obchodź się z nim w kapturze oparów chemicznych za pomocą rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i gogli</td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>różni</td><td></td><td></td></tr> się <tr><td>Platforma sekwencjonowania Illumina (np. NextSeq500)</td><td>Inkubator Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>z kontrolą temperatury i atmosfery</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51030284</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA KAPA HotStart HiFi z 5X buforem KAPA HiFi</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td>hotstart polimeraza o wysokiej wierności</td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>Firma piekarnicza</td><td>SG404</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek manganu (MnCl2)</td>Zestaw mikropipet <td>Sigma Aldrich</td><td>244589</td> Zestaw 30386597 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rainin Benchmark Minifuge</td><td>Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>Adapter NEB New</td><td>England Biolabs</td><td>E6612AVIAL</td><td>Adapter</td></tr><tr><td>NEB Uniwersalny podkład</td><td>New England Biolabs</td><td>E6611AVIAL</td><td>Uniwersalny podkład</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos do zestawu Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td><td>Indeksowane startery</td></tr><tr><td>Przeciwciała przeciwko kontroli ujemnej</td><td>Przeciwciała-Online</td><td>ABIN101961</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>New England Biolabs</td><td>B1500S</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler PCR</td><td>Eppendorf</td><td>2231000666</td><td></td></tr><tr><td>Rurki blokujące fazę</td><td>Qiagen</td><td>129046</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (PCI)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>15593049</td><td>Fenol jest szkodliwy w przypadku połknięcia lub kontaktu ze skórą; obsługiwać w osłonie oparów chemicznych za pomocą rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana przez fosfatum (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10814010</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Drummond Scientific</td><td># 4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy (PEG) 4000</td><td>VWR</td><td>A16151</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>UWAGA KOH działa drażniąco na oczy/skórę w postaci stałej i w roztworze. Trzymaj się w chemicznym kapturze oparowym w rękawicach, fartuchu laboratoryjnym i okularach</td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Białko A/G-MNaza</td><td>Epicypher</td><td>15-1016</td><td>pA/G-MNaza</td></tr><tr><td>BiałkoA-MNaza, oczyszczone z pK19pA-MN</td><td>Addgene</td><td>86973</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS Zestaw testowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do oznaczania kubitów</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Szybka ligaza z 2X szybkim buforem ligazy</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>New England Biolabs</td><td>T3010</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu&nbsp; (NaOAc)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5150-1L</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>SDS jest trujący w przypadku wdychania; należy obchodzić się z nim ostrożnie w dobrze wentylowanych pomieszczeniach, używając rękawic, ochrony oczu i respiratora klasy N95 podczas obchodzenia się z</td></tr><tr><td>wodorotlenkiem sodu (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td>NaOH działa drażniąco na oczy / skórę w postaci stałej i w roztworze. Obsługa w osłonie oparów chemicznych za pomocą rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i okularów</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy mikroskop ze światłem odwróconym</td><td>Leica</td><td>11526213</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe materiały laboratoryjne żelu agarozowego</td><td>Różni się</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardowe materiały laboratoryjne, takie jak pipety serologiczne i końcówki do pipet</td><td>Różni</td><td></td><td></td></tr> się <tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>Nowość Anglia Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polimeraza DNA</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Wirownik stołowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215414</td><td></td></tr><tr><td>Taq Polimeraza DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td>Alternatywnie, można korzystać z kąpieli wodnej</td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Triton X-100 jest niebezpieczny; używaj fartucha laboratoryjnego, rękawic i okularów do pracy z</td></tr><tr><td>trypsyną</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25052</td><td></td></tr><tr><td>Rotator rurkowy</td><td>VWR</td><td>10136084</td><td></td></tr><tr><td>USER enzym</td><td>New England Biolabs</td><td>M5505S</td><td></td></tr></tbody></table>

lokalizacja czynnika jednokomórkowego na chromatynie przy użyciu ultra-niskiego rozszczepienia wejściowego pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

Określenie miejsc wiązania białka z chromatyną jest niezbędne do zrozumienia jego funkcji i potencjalnych celów regulacyjnych. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest złotym standardem w określaniu lokalizacji białek od ponad 30 lat i jest definiowana przez użycie przeciwciała do wyciągnięcia interesującego białka z sonikowanej lub trawionej enzymatycznie chromatyny. Ostatnio techniki wiązania przeciwciał stały się popularne do oceny lokalizacji białek na chromatynie ze względu na ich zwiększoną czułość. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) jest pochodną immunorozszczepienia chromatyny (ChIC) w całym genomie i wykorzystuje rekombinowane białko A połączone z nukleazą mikrokokową (pA-MNaza) w celu identyfikacji stałego regionu IgG przeciwciała skierowanego przeciwko białemu zainteresowaniu, umożliwiając w ten sposób specyficzne dla miejsca rozszczepienie DNA flankującego białko będące przedmiotem zainteresowania. CUT&RUN może być stosowany do profilowania modyfikacji histonów, czynników transkrypcyjnych i innych białek wiążących chromatynę, takich jak czynniki przebudowy nukleosomów. Co ważne, projekt CUT&RUN może być wykorzystywany do oceny lokalizacji białek związanych z euchromatycznością lub heterochromatycznością oraz modyfikacji histonów. Z tych powodów CUT&RUN jest skuteczną metodą określania profili wiązania szerokiej gamy białek. Ostatnio CUT&RUN został zoptymalizowany pod kątem profilowania czynników transkrypcyjnych w niskich populacjach komórek i pojedynczych komórkach, a zoptymalizowany protokół został nazwany ultra-niskim wkładem CUT&RUN (uliCUT&RUN). W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół profilowania czynnikowego jednokomórkowego za pomocą uliCUT&RUN w ręcznym formacie 96-dołkowym.

W niniejszym opracowaniu przedstawiono szczegółowy protokół profilowania białek w pojedynczych komórkach na chromatynie z wykorzystaniem 96-dołkowego manualnego formatu uliCUT&amp;RUN. Choć wyniki będą różnić się w zależności od profilowanego białka (ze względu na jego obfitość i jakość przeciwciał), rodzaju komórek oraz innych czynników wpływających na proces, w dalszej części omówiono oczekiwane wyniki dla tej techniki. Jakość komórek (wygląd komórek i procent komórek żywych) oraz sortowanie pojedynczych komórek należy...

CUT&RUN i jego warianty mogą być używane do określania obecności białek na chromatynie. Protokół ten opisuje, w jaki sposób określić lokalizację białka na chromatynie za pomocą jednokomórkowego uliCUT&RUN.

Lokalizacja czynnika jednokomórkowego na chromatynie przy użyciu ultra-niskiego rozszczepienia wejściowego pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN to potężna technika określania lokalizacji białek na chromatynie, a tutaj opisujemy jednokomórkową wersję tej techniki w ręcznym formacie 96-dołkowym. Większość technik lokalizacji białek, takich jak ChIP-seq, wymaga dużego wkładu komórkowego i zajmuje około trzech dni. CUT&RUN, ze względu na wysoki sygnał i niskie tło, został zoptymalizowany do zastosowań niskokomórkowych i jednokomórkowych i może być ukończony w ciągu jednego dnia.Przewidujemy, że technika ta może być zastosowana do prawie każdej próbki biologicznej i może być szczególnie skuteczna w określaniu lokalizacji czynników w rzadkich i mało obfitych próbkach, takich jak cenne próbki pacjentów. Przed wykonaniem jakichkolwiek eksperymentów na pojedynczych komórkach przetestuj przeciwciało i technikę na dużej liczbie komórek nieszlachetnych. Głównym ograniczeniem tego eksperymentu jest zależność od silnego przeciwciała.Procedurę demonstruje Santana Lardo, doświadczony specjalista ds. badań z mojego laboratorium. Po posortowaniu pojedynczych komórek i związaniu jąder w koraliki, umieść 96-dołkową płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym i pozwól kulkom związać się przez co najmniej pięć minut. Następnie usunąć i wyrzucić supernatant.Dodać 100 mikrolitrów buforu blokującego do kulek związanych z jądrem, wymieszać z delikatnym pipetowaniem i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieścić płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym i pozostawić supernatant do usunięcia przez co najmniej pięć minut. Następnie usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania kulek.Zdjąć płytkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu do przemywania na reakcję, delikatnie pipetując. Umieść płytkę z powrotem na 96-dołkowym stojaku magnetycznym, poczekaj, aż supernatant się oczyści, a następnie wyjmij i wyrzuć supernatant. Zawiesić kulki w 25 mikrolitrach buforu do przemywania na reakcję, delikatnie pipetując.Wykonać pierwszorzędową mieszaninę główną przeciwciał, podając 25 mikrolitrów buforu płuczącego na reakcję, a następnie dodać 0,5 mikrolitra przeciwciała na reakcję. Dodać 25,5 mikrolitra mieszanki buforowej do przemywania przeciwciał, a następnie delikatnie pipetować do każdej próbki, która jest traktowana przeciwciałem skierowanym przeciwko białemu będącemu przedmiotem zainteresowania. Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie ponownie umieść próbki z powrotem na 96-dołkowym stojaku magnetycznym. Gdy supernatant jest czysty, usuń go i wyrzuć bez naruszania kulek. Po wyjęciu płytki ze stojaka magnetycznego umyj kulki 100 mikrolitrami buforu do przemywania i ponownie zawieś przez pipetowanie.Po umieszczeniu płytki z powrotem na 96-dołkowym stojaku magnetycznym i odrzuceniu supernatantu, jak pokazano wcześniej, ponownie zawiesić każdą próbkę w 25 mikrolitrach buforu do przemywania . Przygotuj główną mieszaninę białka A MNazy, dodając 25 mikrolitrów buforu do przemywania i zoptymalizowaną ilość białka A MNazy na reakcję. Dodać 25 mikrolitrów głównej mieszaniny białka A MNazy do każdej próbki, w tym do próbek kontrolnych.Próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umieść płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym. Pozostawić supernatant do usunięcia się przez co najmniej pięć minut, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania kulek.Po wyjęciu płytki ze stojaka magnetycznego umyj kulki 100 mikrolitrami buforu do płukania i ponownie zawieś przez delikatne pipetowanie. Umieścić płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym i wyrzucić supernatant, jak pokazano wcześniej. Następnie wyjmij próbki ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś kulki w 50 mikrolitrach buforu do płukania przez delikatne pipetowanie.Zrównoważyć próbki do zera stopni Celsjusza w mieszaninie lodowatej wody przez pięć minut, a następnie usunąć próbki z lodowatej łaźni wodnej. Dodaj jeden mikrolitr 100-milimolowego chlorku wapnia za pomocą pipety wielokanałowej. Dobrze wymieszać trzy do pięciu razy z delikatnym pipetowaniem za pomocą wielokanałowej pipety o dużej pojemności, a następnie przywrócić próbki do zera stopni Celsjusza.Uruchom 10-minutowy timer, gdy tylko talerz znajdzie się z powrotem w lodowatej kąpieli wodnej. Zatrzymać reakcję, odpipetując 50 mikrolitrów roztworu zawierającego dwukrotne stężenie RSTOP+ i buforować do każdej studzienki w tej samej kolejności, w jakiej dodano chlorek wapnia. Inkubować próbki przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Obracaj płytkę z prędkością 16 000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym. Pozostawić supernatant do oczyszczenia przez co najmniej pięć minut.Następnie przenieś supernatanty na świeżą 96-dołkową płytkę i wyrzuć kulki. W przypadku ekstrakcji DNA dodaj jeden mikrolitr 10% SDS i 0,83 mikrolitra 20 miligramów na mililitr proteinazy K do każdej próbki i wymieszaj próbki przez delikatne pipetowanie. Inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza.Przywróć płytkę do temperatury pokojowej. Dodać 46,6 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i 90 mikrolitrów 50%PEG4000 i wymieszać delikatnym pipetowaniem. Dodaj 33 mikrolitry kulek magnetytu polistyrenowego do każdej próbki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Umieścić płytkę na stojaku magnetycznym i pozostawić supernatant do usunięcia przez około pięć minut. Następnie ostrożnie wyrzuć supernatant, nie naruszając kulek. Spłucz dwukrotnie 150 mikrolitrami 80% etanolu, nie naruszając kulek.Obracaj płytkę krótko z prędkością 1000 razy G przez 30 sekund. Umieść płytkę z powrotem na 96-dołkowym stojaku magnetycznym i usuń wszystkie pozostałości etanolu bez naruszania kulek. Suszyć próbki na powietrzu przez około dwie do pięciu minut.Ponownie zawiesić kulki w 37,5 mikrolitrach 10-milimolowego chlorowodorku TRIS o pH 8 i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieść talerz z powrotem na stojaku magnetycznym i pozwól koralikom związać się przez pięć minut. Przenieś 36,5 mikrolitra supernatantu na świeżą 96-dołkową płytkę kompatybilną z termocyklerem i wyrzuć kulki.Po przeprowadzeniu oceny jakości komórek zbadano ich wygląd i procent, wykazując, że nie należy stosować embrionalnych komórek macierzystych niskiej jakości. Sortowanie pojedynczych komórek przeprowadzono przy użyciu barwienia Hoechst 33342, a komórki testowe policzono, aby upewnić się, że w każdym dołku znajduje się zero lub jedna komórka. Analiza żelu agarozowego ujawniła drabinę o niskiej masie cząsteczkowej i indywidualne biblioteki uliCUT&RUN z pojedynczymi komórkami.Suboptymalna i optymalna analiza biblioteki wykazuje drabinę o niskiej masie cząsteczkowej, nieoptymalną bibliotekę z powodu nieefektywnej mineralizacji Mnase oraz udaną bibliotekę z odpowiednim trawieniem. Rozkład analizatora fragmentów pokazuje, że oczekiwany rozmiar pojedynczej komórki waha się od 150 do 500 par zasad. Jednak w dużych białkach DNA będzie miało około 270 par zasad.Zajętość białek przy użyciu przeglądarki genomu pojedynczego locus przedstawiającej wysoką liczbę komórek lub kontrolę ujemną oraz jednokomórkowego CTCF uliCUT&RUN ujawniła, że pojedyncza komórka w dużej mierze reprezentowała silne szczyty, podobne do wysokokomórkowej uliCUT&RUN. Mapy cieplne jednokomórkowego CTCF lub kontroli ujemnej ujawniły wyraźny wzorzec wzbogacania odczytu bezpośrednio nad ustalonymi miejscami wiązania CTCF w komórkach. Jednowymiarowe mapy cieplne wykazują większą gęstość odczytu w stosunku do ustalonych miejsc wiązania CTCF w bibliotekach jednokomórkowych w stosunku do otaczających regionów i kontroli bez przeciwciał, wykazując wzbogacenie specyficzne dla przeciwciał w ustalonych miejscach wiązania.Zrównoważenie jąder związanych z kulkami w lodowatej kąpieli wodnej i nie przegrzanie próbki po dodaniu chlorku wapnia jest ważne, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu chromatyny.

single-cell-factor-localization-on-chromatin-using-ultra-low-input

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Opisano wysoce równoległą metodę pomiaru specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Protokół ten demonstruje technikę przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej NdeI. Metodę można łatwo zmodyfikować w celu zbadania dowolnego procesu, który prowadzi do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA.

Równoległy, wysokoprzepustowy test kinetyczny pojedynczej cząsteczki do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA

Szczepienie pod celami i tagmentacją (CUT&amp;Tag) to skuteczna strategia profilowania epigenomicznego chromatyny. Protokół ten przedstawia udoskonaloną strategię CUT&amp;Tag do profilowania modyfikacji histonów w roślinach.

Profilowanie modyfikacji H3K4me3 w roślinach przy użyciu rozszczepienia w ramach celów i tagowania

Hi-C 3.0 to ulepszony protokół Hi-C, który łączy sieciujące formaldehyd i glutaran disuccinimidylu z koktajlem enzymów restrykcyjnych DpnII i DdeI, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu i rozdzielczość wykrywania interakcji chromatyny.

Rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości

Protokół mapowania trójwymiarowej organizacji genomu z rozdzielczością nukleosomów przy użyciu metody przechwytywania konformacji chromosomów w całym genomie Micro-C-XL jest przedstawiony tutaj.

Mapowanie interakcji genomu 3D ssaków za pomocą Micro-C-XL

Prezentowany tutaj jest skuteczny protokół do izolacji komórek satelitarnych mięśni kończyn myszy aktywowanym fluorescencyjnie (FACS), przystosowany do badania regulacji transkrypcji we włóknach mięśniowych poprzez rozszczepienie pod tarczami i uwolnienie za pomocą nukleazy (CUT&amp;RUN).

Wydajny protokół do analizy CUT&RUN mysich komórek satelitarnych izolowanych od FACS

Ekspresja genów jest regulowana przez interakcje promotorów genów z dystalnymi elementami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób niski poziom wejściowy Capture Hi-C (liCHi-C) pozwala na identyfikację tych interakcji w rzadkich typach komórek, które wcześniej były niemierzalne.

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

Ten protokół prowadzi początkujących bioinformatyków przez wprowadzający potok analizy CUT&amp;RUN, który umożliwia użytkownikom przeprowadzenie wstępnej analizy i walidacji danych sekwencjonowania CUT&amp;RUN. Wykonanie opisanych tutaj kroków analizy, w połączeniu z adnotacją pików, pozwoli użytkownikom na uzyskanie mechanistycznego wglądu w regulację chromatyny.

Wstępna analiza i walidacja danych sekwencjonowania CUT&RUN

Opisano zoptymalizowany protokół rozszczepienia pod celami i uwalnianie z użyciem nukleazy, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (CUT&amp;RUN-seq) dla neuroendokrynnych linii komórkowych raka płuc z drobnymi komórkami. Umożliwia mapowanie różnych modyfikacji histonów oraz miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych (np. E2F7) na poziomie genomu w celu badania deregulacji epigenetycznej i transkrypcyjnej w patobiologii SCLC.

Mapowanie modyfikacji histonów i miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych w neuroendokrynnych liniach komórkowych raka płuc z wykorzystaniem CUT&RUN

Poznaj technikę CUT&RUN do lokalizacji białek na chromatinie w pojedynczych komórkach. Ta metoda w formacie 96-well wymaga minimalnej liczby komórek i pozwala uzyskać wyniki w ciągu jednego dnia.

Lokalizacja czynnika jednokomórkowego na chromatynie przy użyciu ultra-niskiego rozszczepienia wejściowego pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy (Wideo) | JoVE Journal

Lokalizacja czynnika jednokomórkowego na chromatynie przy użyciu ultra-niskiego rozszczepienia wejściowego pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy

Przeglądaj więcej filmów