Lokalizacja czynnika jednokomórkowego na chromatynie przy użyciu ultra-niskiego rozszczepienia wejściowego pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy

CUT&RUN to potężna technika określania lokalizacji białek na chromatynie, a tutaj opisujemy jednokomórkową wersję tej techniki w ręcznym formacie 96-dołkowym. Większość technik lokalizacji białek, takich jak ChIP-seq, wymaga dużego wkładu komórkowego i zajmuje około trzech dni. CUT&RUN, ze względu na wysoki sygnał i niskie tło, został zoptymalizowany do zastosowań niskokomórkowych i jednokomórkowych i może być ukończony w ciągu jednego dnia.

Przewidujemy, że technika ta może być zastosowana do prawie każdej próbki biologicznej i może być szczególnie skuteczna w określaniu lokalizacji czynników w rzadkich i mało obfitych próbkach, takich jak cenne próbki pacjentów. Przed wykonaniem jakichkolwiek eksperymentów na pojedynczych komórkach przetestuj przeciwciało i technikę na dużej liczbie komórek nieszlachetnych. Głównym ograniczeniem tego eksperymentu jest zależność od silnego przeciwciała.

Procedurę demonstruje Santana Lardo, doświadczony specjalista ds. badań z mojego laboratorium. Po posortowaniu pojedynczych komórek i związaniu jąder w koraliki, umieść 96-dołkową płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym i pozwól kulkom związać się przez co najmniej pięć minut. Następnie usunąć i wyrzucić supernatant.

Dodać 100 mikrolitrów buforu blokującego do kulek związanych z jądrem, wymieszać z delikatnym pipetowaniem i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieścić płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym i pozostawić supernatant do usunięcia przez co najmniej pięć minut. Następnie usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania kulek.

Zdjąć płytkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu do przemywania na reakcję, delikatnie pipetując. Umieść płytkę z powrotem na 96-dołkowym stojaku magnetycznym, poczekaj, aż supernatant się oczyści, a następnie wyjmij i wyrzuć supernatant. Zawiesić kulki w 25 mikrolitrach buforu do przemywania na reakcję, delikatnie pipetując.

Wykonać pierwszorzędową mieszaninę główną przeciwciał, podając 25 mikrolitrów buforu płuczącego na reakcję, a następnie dodać 0,5 mikrolitra przeciwciała na reakcję. Dodać 25,5 mikrolitra mieszanki buforowej do przemywania przeciwciał, a następnie delikatnie pipetować do każdej próbki, która jest traktowana przeciwciałem skierowanym przeciwko białemu będącemu przedmiotem zainteresowania. Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie ponownie umieść próbki z powrotem na 96-dołkowym stojaku magnetycznym. Gdy supernatant jest czysty, usuń go i wyrzuć bez naruszania kulek. Po wyjęciu płytki ze stojaka magnetycznego umyj kulki 100 mikrolitrami buforu do przemywania i ponownie zawieś przez pipetowanie.

Po umieszczeniu płytki z powrotem na 96-dołkowym stojaku magnetycznym i odrzuceniu supernatantu, jak pokazano wcześniej, ponownie zawiesić każdą próbkę w 25 mikrolitrach buforu do przemywania . Przygotuj główną mieszaninę białka A MNazy, dodając 25 mikrolitrów buforu do przemywania i zoptymalizowaną ilość białka A MNazy na reakcję. Dodać 25 mikrolitrów głównej mieszaniny białka A MNazy do każdej próbki, w tym do próbek kontrolnych.

Próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umieść płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym. Pozostawić supernatant do usunięcia się przez co najmniej pięć minut, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania kulek.

Po wyjęciu płytki ze stojaka magnetycznego umyj kulki 100 mikrolitrami buforu do płukania i ponownie zawieś przez delikatne pipetowanie. Umieścić płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym i wyrzucić supernatant, jak pokazano wcześniej. Następnie wyjmij próbki ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś kulki w 50 mikrolitrach buforu do płukania przez delikatne pipetowanie.

Zrównoważyć próbki do zera stopni Celsjusza w mieszaninie lodowatej wody przez pięć minut, a następnie usunąć próbki z lodowatej łaźni wodnej. Dodaj jeden mikrolitr 100-milimolowego chlorku wapnia za pomocą pipety wielokanałowej. Dobrze wymieszać trzy do pięciu razy z delikatnym pipetowaniem za pomocą wielokanałowej pipety o dużej pojemności, a następnie przywrócić próbki do zera stopni Celsjusza.

Uruchom 10-minutowy timer, gdy tylko talerz znajdzie się z powrotem w lodowatej kąpieli wodnej. Zatrzymać reakcję, odpipetując 50 mikrolitrów roztworu zawierającego dwukrotne stężenie RSTOP+ i buforować do każdej studzienki w tej samej kolejności, w jakiej dodano chlorek wapnia. Inkubować próbki przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Obracaj płytkę z prędkością 16 000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść płytkę na 96-dołkowym stojaku magnetycznym. Pozostawić supernatant do oczyszczenia przez co najmniej pięć minut.

Następnie przenieś supernatanty na świeżą 96-dołkową płytkę i wyrzuć kulki. W przypadku ekstrakcji DNA dodaj jeden mikrolitr 10% SDS i 0,83 mikrolitra 20 miligramów na mililitr proteinazy K do każdej próbki i wymieszaj próbki przez delikatne pipetowanie. Inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza.

Przywróć płytkę do temperatury pokojowej. Dodać 46,6 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i 90 mikrolitrów 50%PEG4000 i wymieszać delikatnym pipetowaniem. Dodaj 33 mikrolitry kulek magnetytu polistyrenowego do każdej próbki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Umieścić płytkę na stojaku magnetycznym i pozostawić supernatant do usunięcia przez około pięć minut. Następnie ostrożnie wyrzuć supernatant, nie naruszając kulek. Spłucz dwukrotnie 150 mikrolitrami 80% etanolu, nie naruszając kulek.

Obracaj płytkę krótko z prędkością 1000 razy G przez 30 sekund. Umieść płytkę z powrotem na 96-dołkowym stojaku magnetycznym i usuń wszystkie pozostałości etanolu bez naruszania kulek. Suszyć próbki na powietrzu przez około dwie do pięciu minut.

Ponownie zawiesić kulki w 37,5 mikrolitrach 10-milimolowego chlorowodorku TRIS o pH 8 i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieść talerz z powrotem na stojaku magnetycznym i pozwól koralikom związać się przez pięć minut. Przenieś 36,5 mikrolitra supernatantu na świeżą 96-dołkową płytkę kompatybilną z termocyklerem i wyrzuć kulki.

Po przeprowadzeniu oceny jakości komórek zbadano ich wygląd i procent, wykazując, że nie należy stosować embrionalnych komórek macierzystych niskiej jakości. Sortowanie pojedynczych komórek przeprowadzono przy użyciu barwienia Hoechst 33342, a komórki testowe policzono, aby upewnić się, że w każdym dołku znajduje się zero lub jedna komórka. Analiza żelu agarozowego ujawniła drabinę o niskiej masie cząsteczkowej i indywidualne biblioteki uliCUT&RUN z pojedynczymi komórkami.

Suboptymalna i optymalna analiza biblioteki wykazuje drabinę o niskiej masie cząsteczkowej, nieoptymalną bibliotekę z powodu nieefektywnej mineralizacji Mnase oraz udaną bibliotekę z odpowiednim trawieniem. Rozkład analizatora fragmentów pokazuje, że oczekiwany rozmiar pojedynczej komórki waha się od 150 do 500 par zasad. Jednak w dużych białkach DNA będzie miało około 270 par zasad.

Zajętość białek przy użyciu przeglądarki genomu pojedynczego locus przedstawiającej wysoką liczbę komórek lub kontrolę ujemną oraz jednokomórkowego CTCF uliCUT&RUN ujawniła, że pojedyncza komórka w dużej mierze reprezentowała silne szczyty, podobne do wysokokomórkowej uliCUT&RUN. Mapy cieplne jednokomórkowego CTCF lub kontroli ujemnej ujawniły wyraźny wzorzec wzbogacania odczytu bezpośrednio nad ustalonymi miejscami wiązania CTCF w komórkach. Jednowymiarowe mapy cieplne wykazują większą gęstość odczytu w stosunku do ustalonych miejsc wiązania CTCF w bibliotekach jednokomórkowych w stosunku do otaczających regionów i kontroli bez przeciwciał, wykazując wzbogacenie specyficzne dla przeciwciał w ustalonych miejscach wiązania.

Zrównoważenie jąder związanych z kulkami w lodowatej kąpieli wodnej i nie przegrzanie próbki po dodaniu chlorku wapnia jest ważne, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu chromatyny.