Name: Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Poznaj powierzchniowy rezonans plazmonowy do badania interakcji białko-glikan w czasie rzeczywistym. Ta metoda pozwala określić stałe kinetyczne i afinitety wiązania CV-N z różnymi glikanami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor dziękuje Dr. Christianowi Derntlowi z Wydziału Biotechnologii i Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu oraz Wydziałowi Medycyny III, Oddziału Nefrologii i Dializy Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu, szczególnie Dr. Markusowi Wahrmannowi za wsparcie techniczne i naukowe. Ekspresja białek w komórkach ssaków była wspierana przez Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Zasobów Naturalnych i Nauk Przyrodniczych (BOKU) w Wiedniu. Autorka pragnie wyrazić swoje głębokie podziękowania dla dr Nico Dankbara z XanTec bioanalytics w Duesseldorfie w Niemczech za pomocne dyskusje naukowe na temat wykonywania testów wiązania SPR.

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Powinowactwo wiązania CV-N jest skorelowane z liczbą funkcjonalnych miejsc wiązania [2H na domenach B i 2L na domenach A, gdy są zaprojektowane jako dimer z zamianą domen]. Wariant o zmienionym powinowactwie wiązania (CVN2L0-V2, homodimeryczny stabilny fałd CV-N zawierający nokaut mostka dwusiarczkowego) ulega ekspresji w E. coli, jest oczyszczany i pozytywnie testowany pod kątem wiązania z białkiem HA (H3N2) przy użyciu SPR10 i wykazuje zmianę konformacyjną po związaniu HA z miejscami wi...

Aktywność przeciwwirusowa związana z tetheriną jest indukowana przez interferon-α i obejmuje białkowe wiązania, co prowadzi do zatrzymania w pełni sformowanych wirionów na powierzchniach zakażonych komórek1. Konieczność glikozylacji tetheriny w hamowaniu uwalniania wirusa pozostaje niepewna, co sugeruje znaczenie wzorców glikozylacji glikanów wyrażanych rekombinacyjnie w badaniach in vitro1,2, co zależy od konformacji (w przypadku wirusa grypy) powierzchniowej hemaglutyniny HA wirusa grypy3,4. Zauważono, że modyfikacja oligosacharydu związanego z glikozylacją typu N jest wystarczająca dla tetherina-zależnego ograniczenia uwalniania HIV typu 12, podczas gdy dimeryzacja odgrywa kluczową rolę w zapobieganiu uwalnianiu wirusa, angażując tym samym domenę transbłonową lub kotwicę glikozylopartydyloinozytową (GPI) w celu uwięzienia pączkujących wirionów5. Opisano unikalne cechy ludzkiej i mysiej tetheriny w blokowaniu wielu wirusów otoczkowych, retrowirusów i filowirusów. BST-2/tetherina jest indukowanym przez interferon białkiem przeciwwirusowym odporności wrodzonej1,6, wykazującym szerokie spektrum aktywności przeciwwirusowej, która jest antagonizowana przez glikoproteiny otoczki5 poprzez translokację tetheriny lub zaburzenie jej struktury6. Na przykład powierzchniowa glikoproteina otoczki HA i neuraminidaza wirusa grypy typu A są znane z antagonizowania tetheriny w sposób specyficzny dla szczepu7, co ułatwia rozpoznawanie miejsc wiązania receptorów gospodarza8. Przeciwciała celujące w glikany są badane pod kątem stechiometrii ich oddziaływań z szybko modyfikującymi się osłonami glikanowymi na HA, co przekłada się na powinowactwo wiązania do podtypów H3N2 i H1N1 wirusa grypy A4.
W celu wyjaśnienia mechanizmów wiązania między środkami przeciwwirusowymi a kolcami otoczki wirusa, tj. ligandami węglowodanowymi, przy użyciu komplementarnych metod immunologicznych i spektroskopowych, przeprowadzono chemiczną syntezę motywów mono-, di- i tri-mannozowych. Mannozylocylowane peptydy otrzymano via azidoglikozylację glicozyl {beta}-peracetatów do transformacji 1,2-trans-azydków glikozylowych9, naśladując typowo występującą N-acetyloglukozaminę oraz wysokomannozowe oligosacharydy na powierzchni wirusów zagrażających życiu. Bioizostery triazolowe wykorzystano do naśladowania wiązań tworzących mannozylowaną resztę peptydu HA10 oraz w celu ułatwienia specyficznych oddziaływań z przeciwwirusowymi pochodnymi CV-N w obrębie drugiego miejsca glikozylacji N-łańcuchowej w domenie głowy HA (góra HA z 4 glikanami N-łańcuchowymi N54, N97, N181, N301)8,11,12. Oddziaływania między kwasem glutaminowym (Glu) a argininą (Arg) oraz wynikający z nich dipol helisy wykazały dobrą stabilność zarówno modelowych peptydów, jak i białek, co zostało zwizualizowane za pomocą SPR. W porównaniu z rozpoznawaniem pojedynczego chemicznie zsyntetyzowanego miejsca glikozylacji na HA10 poprzez bezpośrednie hamowanie wiązania receptora na motywach glikanowych, wykazano, że wyższe powinowactwo zmutowanej struktury Fc w czterech miejscach do jej receptora indukuje funkcje efektorowe in vivo, ujawniając, że niezwiązany skład glikanów N-łańcuchowych przyłączonych do mutanta Fc jest określony mechanistycznie13.
CV-N wykazuje aktywność przeciwwirusową przeciwko HIV14,15, grypie16 oraz wirusowi Ebola, co jest zapśredniczone przez nanomolowe wiązanie z modyfikacjami oligosacharydowymi bogatymi w mannozę w białkach kolca otoczki12,17,18,19. Ustalono, że wiązanie HA grypy do jednego miejsca wiążącego węglowodany o wysokim powinowactwie (H) w CV-N lub dwóch miejscach H w kowalencyjnie połączonym dimerycznym CVN2 charakteryzuje się stałymi dysocjacji równowagowej (KD) wynoszącymi odpowiednio 5,7 nM (Rycina 1A) i KD = 2,7 nM. Zarówno CV-N, jak i CVN2 posiadają dodatkowo jedno lub dwa miejsca wiążące węglowodany o niskim powinowactwie (L)s12,17,20,21. Ebola GP1,2 wiąże się z 2H CVN2 z powinowactwem w dolnym zakresie nanomolarnym (KD = 26 nM). Wiązanie CV-N WT do Ebola GP1,2 oraz HA wykazuje powinowactwa od KD = 34 nM do KD = 5,7 nM (A/New York/55/04)12. Lektyny, takie jak CV-N, które specyficznie celują w glikany bogate w mannozę na otoczkach wirusowych, dodatkowo hamują replikację wirusa zapalenia wątroby C, SARS-CoV, herpeswirusa, wirusa Marburg oraz wirusa odry22.
Mała cząsteczka CV-N była szczegółowo badana przez ponad 20 lat ze względu na jej zdolność do wiązania szerokiego spektrum wirusów w celu hamowania ich wnikania do komórek16,18. Analizy strukturalne i testy powinowactwa wiązania wskazują na sieciowanie dwóch L w dimerze CVN2 z wymianą domen poprzez bivalentne wiązanie w zakresie mikromolarnym, co zwiększa awidność względem glikoprotein otoczki wirusowej10,19. Selektywne wiązanie Manα1-2Manα na ramionach D1D3 Man(8) oraz Man(9) obejmuje dwa miejsca wiązania o różnym powinowactwie, zlokalizowane na przeciwległych protomerach białka20, co pozwala na osiągnięcie nanomolarnego powinowactwa wiązania (Rysunek 1B). W związku z tym CVN2 jest uważany za pseudo-przeciwciało w kontekście jego zastosowania do wiązania epitopów na gp120 HIV, podobnie jak przeciwciała neutralizujące wirusy17. W niniejszej pracy autor jest zainteresowany zbadaniem potencjalnego wiązania CVN2 z białkiem spike SARS-CoV-2 via jego domeny wiążącej receptor (RBD). Krzywe wiązania unieruchomionej ludzkiej konwertazy angiotensyny (ACE)-2 z RBD SARS-CoV-2 dają wartość KD = 4.7 nM dla tej biologicznie istotnej interakcji wiązania23.
W przeciwieństwie do nich, wybrane klasy immunoglobulin rozpoznają specyficzne i powtarzalne wzorce białek strukturalnych, co stanowi podłoże dla dojrzewania powinowactwa w regionach HA zakotwiczonych w błonie24. CV-N wykazuje silną aktywność wobec niemal wszystkich wirusów grypy typu A i B16 i jest szeroko neutralizującym środkiem przeciwwirusowym. Nasza wiedza na temat lokalizacji celowanych epitopów na trzonie HA1 i HA2, które mogą obejmować struktury epitopowe dla celowania w glikany przez silnie neutralizujące przeciwciała w porównaniu z wiązaniem lektyn, pozostaje niepełna25.
<img alt="Spektroskopia rezonansu plazmonów powierzchniowych; wiązanie białek wirusowych przez CV-N; analiza kinetyczna; schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny opis badania wiązania SPR dla CV-N do kolców otoczki wirusa. (A) Analiza SPR wiązania CV-N do ligandu: pełnowymiarowe białko HA (90 kDa). Zbiór danych kinetycznych (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) pokazujący w czasie rzeczywistym podwójnie referencyjne wiązanie do HA grypy A/New-York/55/04 (H3N2). (B) Wiązanie wariantu V2 białka CVN2L0 do unieruchomionego ligandu DM w zakresie stężeń od 500 nM do 16 µM. Sekwencja: reszty L są zaznaczone na żółto. Reszty H są zaznaczone na szaro. E58 i R73 zastępują cysteiny w białku typu dzikiego, co sprawia, że V2 jest stabilną strukturą białkową z trzema zamiast czterech mostków disiarczkowych <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63541/63541fig1v5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Podczas gdy tarcza glikanowa na dystalnej części błonowej HA indukuje wiązanie o wysokim powinowactwie do CV-N12, zaobserwowano również wiązanie CVN2 do HA w sąsiedztwie mostka dwusiarczkowego górnej części HA w jego miejscach o niskim powinowactwie10,12. W procesie wiązania węglowodanów przez CV-N zidentyfikowano różne oddziaływania polarne oraz miejsca interakcji. Oddziaływania te zostały zweryfikowane poprzez generowanie wariantów z knock-outem w miejscu wiązania, aby skorelować powinowactwa wiązania z glikozylacją przewidzianą in silico12. Tym samym projekt ma na celu porównanie wcześniej badanych chemicznie mannozylanych peptydów HA pod kątem powinowactwa i specyficzności wiązania z krótkimi sekwencjami peptydowymi z białek kolca SARS-related 2019-nCoV oraz SARS-CoV-2, naturalnie zmodyfikowanych przez niewielką liczbę różnych miejsc glikozylacji typu N oraz glikozylacji typu O. Wykorzystując kriomikroskopię elektronową i testy wiązania, Pinto i współpracownicy zgłosili przeciwciało monoklonalne S309, które potencjalnie rozpoznaje epitop na białku kolca SARS-CoV-2 zawierający konserwatywny glikan w obrębie podrodzaju Sarbecovirus, nie konkurując przy tym z przyłączaniem receptora26. Protokół niniejszego badania opisuje, w jaki sposób projektowanie, ekspresja i charakterystyka wariantów CV-N są istotne dla badania sposobu, w jaki CV-N i CVN2 wiążą się z glikozylowanymi białkami i syntetycznymi mannozylowanymi peptydami przy użyciu technologii SPR10,12.
Tandemowy dimer CVN2L027 oraz warianty miejsca wiązania (V2-V5) są ekspresowane rekombinacyjnie, a warianty te posiadają zamiany mostków dwusiarczkowych (C58E i C73R) (Rysunek 2A). Przygotowano również mutant z pojedynczą mutacją punktową E41A, ponieważ pozycja ta została zidentyfikowana jako reszta uczestnicząca w międzycząsteczkowych kontaktach krzyżowych. Mutant ten stanowi kolejną interesującą cząsteczkę do pomiarów wiązania metodą SPR pomiędzy lektyną a oligosacharydami wysokomannozowymi w celu rozszyfrowania domen wiążących i umożliwia porównanie z formą dimeryczną. Krystaliczna struktura CVN2 z zamianą domen wykazuje elastyczny łącznik, który obejmuje od 49 do 54 resyd). Dwie domeny mogą poruszać się wokół zawiasu jako ciała sztywne, tworząc albo monomer poprzez wewnątrzczeząsteczkowe oddziaływania domen (domena A – reszty 1-39; 90-101 – z domeną B – reszty 40-89), albo dimer poprzez międzycząsteczkową zamianę domen [domena A (pierwszego monomeru) z domeną B (drugiego) oraz domena B (pierwszego monomeru) z domeną A (drugiej kopii)]. Nie występują bliskie oddziaływania między domenami A i B obu protomerów, z wyjątkiem Glu4128. Gen CV-N można opracować za pomocą repetycyjnej metody PCR z wykorzystaniem syntetycznych oligosów o długości 40 merów29, a następnie podklonować do miejsc NdeI i BamHI wektora pET11a w celu transformacji (elektroporacji) do komórek elektrokompetentnych zgodnie z opisem Keeffe, J.R.27. Białko, które posłużyło do uzyskania odpowiedniej struktury krystalicznej (PDB ID 3S3Y), zawiera N-końcowy tag oczyszczający składający się z 6 histydyn, a następnie miejsce cięcia dla proteazy Factor Xa. Do wprowadzania mutacji punktowych, zmiany kodonów oraz wstawiania lub usuwania pojedynczych bądź wielu zasad lub kodonów w celu wymiany aminokwasów wykorzystuje się mutagenezę celowaną. Transformacje te dostarczają nieocenionych informacji na temat funkcji i struktury białek. Rekombinacyjnie ekspresowane i oczyszczone CV-N, CVN2 oraz CVN3 zostały dobrze przebadane biofizycznie20,21,27, są tanie w produkcji i dlatego wykorzystywane są do charakteryzacji testów wiązania z glikanami unieruchomionymi na chipach sensorycznych SPR. Konwencjonalny enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA) wykazuje mniejszą powtarzalność w zakresie techniki unieruchamiania ligandów glikanowych i przekształca wiązanie różnych wariantów miejsc wiążących w czasie rzeczywistym, co jest możliwe w SPR, w testy końcowe.
Wariant o zmodyfikowanym powinowactwie wiązania CVN2L0-V2 (zachowana struktura trzeciorzędowa homodimeru CV-N z substytucją mostka dwusiarczkowego)10) jest ekspresjonowane z oznakowaniem His-tag w Escherichia coli (E. coli), oczyszczone na kolumnie Ni-NTA z zastosowaniem chromatografii powinowactwa, a następnie przetestowane pod kątem wiązania z HA (H3N2), monomannozylowanym peptydem HA oraz dimannozylowanym peptydem HA przy użyciu SPR. Ligandami są chemicznie mannozylowane peptydy lub białka HA i S, które zostały sprzężone aminowo z hydrofilową powierzchnią chipa poprzez reaktywne estry lub inżynieria białek z wykorzystaniem układu biotyna-streptawidyna. Tę samą procedurę sekwencyjnych pomiarów zastosowano w przypadku tych ligandów, wstrzykując różne rozcieńczenia CV-N oraz wariantów CV-N (i CVN2), aby uzyskać informacje kinetyczne dla analiz oddziaływań molekularnych, opisanych poniżej30Do badań wiązania CV-N z peptydami S wykorzystano chip sensoryczny SPR z unieruchomionym RBD, a uzyskane powinowactwa porównano z wiązaniem SARS-CoV-2 z ludzkim ACE2.

<table><tbody><tr><td>&Auml; kta primeplus</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki Amicon</td><td>Merck</td><td>C7715</td><td></td></tr><tr><td>Ampillicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5354</td><td></td></tr><tr><td>Beckmann Coulter Cooler Wirówka Allegra X-30R Beckman</td><td>Coulter</td><td>B06320</td><td></td></tr><tr><td>Rozsiewacz komórek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS86655</td><td>srebrny stal nierdzewna, pręt L 33&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Niestandardowe Oligonukleotydy DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowa Gensynteza GenScript</td><td></td><td>#1390661&nbsp;</td><td>wektor klonowania: pET27b(+)&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytiva&nbsp; HBS-EP+ Bufor 10, 4x50mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>50-105-5354</td><td></td></tr><tr><td>Dionex UlitMate 3000</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAAGABHFAPBMBFB</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny Dpn I (10 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ER1701</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Merck</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Merck</td><td>39391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Minispin&nbsp; i osobista mikrowirówka MiniSpin Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z606235</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>Etanoloamina HCl</td><td>Merck</td><td>E6133</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Stożkowe probówki</td> wirówkowe <td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z zatrzaskiem, sterylna, 25/opakowanie</td><td>Corning</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Merck</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna HCl</td><td>Merck</td><td>55097</td><td></td></tr><tr><td>HA H3 białko</td><td>Abcam</td><td>ab69751</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>His-select Ni2 +</td> <td>Merck</td><td>H0537</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Merck</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Merck</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>Kromasil 300-5-C4</td> Agar <td>Nouryon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Merck</td><td>52062</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Merck</td><td>19344</td><td></td></tr><tr><td>LB Lennox</td><td>Merck</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Merck</td><td>10837059001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Merck</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Merck</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaH2P04</td><td>Merck</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop UV-Vis2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Merck</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>NZ amina ( hydrolizat kazeiny)</td><td>Merck</td><td>C0626</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>PD MidiTrap G-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE28-9180-11</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Merck</td><td>70171</td><td></td></tr><tr><td>pET11a</td><td>Merck Millipore (Novagen)</td><td>69436&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Merck</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)</td><td>Pakiet oprogramowania Qiagen</td><td>27106X4</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Autolink1-1-9</td> Dwukanałowy system <td></td> Reichert Reichert <td></td><td></td></tr><tr><td>SPR SR7500DC</td><td></td> Scrubber2-2012-09-04 do analizy danych Reichert SDS <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>11667289001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, w tym plazmid kontrolny pUC18</td><td>Stratagene</td><td>#200518</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu. Trójwodzian</td> Chip czujnika <td>Merck</td><td>236500</td><td></td></tr><tr><td>SPR C19RBDHC30M</td> Chip czujnika <td>XanTec bioanalytics</td><td>SCR C19RBDHC30M</td><td></td></tr><tr><td>SPR CMD500D</td><td>XanTec bioanalytics</td><td>SCR CMD500D</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin Standard 90mm Szalki Petriego</td><td>Thermo Scientific</td><td>101R20</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>Merck</td><td>T5912</td><td>10x, roztwór</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Merck</td><td>93657</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Merck</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Mikser Vortex-Genie 2</td><td>Merck</td><td>Z258423</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Merck</td><td>XGAL-RO</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Niebieskie superkompetentne komórki</td><td>Stratagene</td><td>#200236</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Merck</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) jest używany do pomiaru wiązania hemaglutyniny (HA) z dimerem cyjanowiryny-N (CV-N) z podmienioną domeną oraz do monitorowania interakcji między mannozylowanymi peptydami a miejscem wiązania CV-N o wysokim powinowactwie. Doniesiono, że kolce otoczki wirusa gp120, HA i glikoproteina Ebola (GP) 1,2 wiążą zarówno wysokie, jak i niskie powinowactwo na dimerycznym CVN2. Dimannozylowany peptyd HA jest również związany w dwóch miejscach wiązania o niskim powinowactwie do zmodyfikowanej cząsteczki CVN2, która ma miejsce o wysokim powinowactwie do odpowiedniego ligandu i jest zmutowany w celu zastąpienia stabilizującego wiązania dwusiarczkowego w kieszeni wiążącej węglowodany, potwierdzając w ten sposób wiązanie wielowartościowe. Wykazano wiązanie HA z jednym miejscem wiązania pseudoprzeciwciała CVN2 o wysokim powinowactwie przy stałej dysocjacji (KD) wynoszącej 275 nM, która dodatkowo neutralizuje ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) poprzez oligomeryzację. Korelacja liczby mostków dwusiarczkowych w CVN2 z zamianą domeny, które są zmniejszone z 4 do 2 przez podstawienie cystyn do par reszt polarnych kwasu glutaminowego i argininy, powoduje zmniejszenie powinowactwa wiązania do HA. Wśród najsilniejszych oddziaływań, Ebola GP1,2 jest wiązana przez CVN2 z dwoma miejscami wiązania o wysokim powinowactwie w dolnym zakresie nanomolowym przy użyciu glikanu otoczkowego bez domeny transbłonowej. W niniejszym badaniu wiązanie wielospecyficznego monomerycznego CV-N z glikoproteiną kolca (S) koronawirusa zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) mierzy się przyK D = 18,6 μM w porównaniu z nanomolowymK D do tych innych kolców wirusa oraz poprzez domenę wiążącą receptor w średnim zakresie μ-molowym.

Dimericzną cząsteczkę CVN2L0 z zamianą domen testuje się pod kątem wiązania z górnym regionem HA w trzech oddzielnych eksperymentach SPR, a powinowactwo wiązania przedstawiono w KD wartości. Przyjmuje się, że domena B składa się z miejsc wiązania H, na które wpływa zastąpienie wiązania dwusiarczkowego resztami jonowymi, a domena A tworzy L10,18W celu oszacowania pojemności wiązania przed przeprowadzeniem pomiarów kinetyki z wykorzystaniem autosamplera ...

Obecny protokół opisuje nowe narzędzia do testowania wiązania SPR do badania wiązania CV-N z HA, glikoproteiną S, pokrewnymi glikanami typu hybrydowego i oligosacharydami o wysokiej zawartości mannozy. SPR służy do oznaczaniaK D do wiązania dimerycznego lub monomerycznego CV-N z tymi glikanami.

Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...

Spektroskopia powierzchniowego rezonansu plazmonowego została opracowana do oznaczania ligandu białkowego w sposób średnio przepustowy. Wykazano różne powinowactwa do wariantów miejsc wiązania tej samej cząsteczki, a mianowicie do wiązania żelaza przez oligosacharydy na wirusach. SPR jest bezznacznikową techniką do badania makromolekularnego wiązania receptorów unieruchomionych powierzchniowo w czasie rzeczywistym.Interakcje wieloopozycyjne są rozpoznawane w analizie kinetycznej poprzez wiązanie konkurencyjne niezależnie od wielkości Specyficzne obszary w badaniach, które wykorzystują SPR, to opracowywanie leków w celu poszukiwania inhibitorów lub charakterystyki przeciwciał. Stałe kinetyczne i powinowactwa są obliczane bezpośrednio na podstawie odpowiedzi czujnika. Na początek przenieś 100 mikrolitrów roztworu na płytki LB-agar i delikatnie rozprowadź za pomocą sterylnego rozsiewacza komórek.Rozpocznij serię reakcji próbek przy użyciu wielu stężeń dwuniciowej matrycy DNA w zakresie od pięciu do 50 nanogramów, utrzymując stałe stężenie startera. Następnie dodaj enzym restrykcyjny DpnI poniżej nakładki oleju mineralnego i natychmiast inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę w celu trawienia rodzicielskiego superskręconego dwuniciowego DNA. Aby rozmrozić superkompetentne ogniwa XL1-Blue, należy je podzielić na porcje do wstępnie schłodzonej, małej, okrągłej dolnej rurki.Następnie przenieś jeden mikrolitr jednoniciowego DNA potraktowanego DpnI z każdej reakcji kontrolnej i próbki do oddzielnych podwielokrotności komórek superkompetentnych, które syntetyzują nić komplementarną. Po dokładnym zawirowaniu reakcji przemiany w celu wymieszania, inkubować reakcje na lodzie przez 30 minut. Zastosuj impuls cieplny do reakcji przemiany w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 45 sekund, a następnie umieść reakcje na lodzie na dwie minuty.Następnie dodaj 0,5 mililitra bulionu NZY+ i inkubuj reakcje przemiany w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 225 do 250 obr./min przez godzinę. Następnie umieść odpowiednią objętość każdej reakcji przemiany na płytkach agarowych LB Ampicillin, jak pokazano wcześniej. W przypadku kultury nasiennej należy zaszczepić niewielką ilość ampicyliny zawierającej pożywkę LB pojedynczą kolonią z przekształconej płytki.Używając kultury nocnej, zaszczepić kulturę ekspresji dodatkami, w tym 10 milimolami chlorku magnezu, 10 milimolami siarczanu magnezu i 20 milimolami glukozy, rozcieńczając kulturę nasion do jednego na 100. Następnie hoduj komórki z energicznym wstrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza do chłonnego 600 nanometrów między 0,4 a 0,6 przed schłodzeniem komórek do 20 stopni Celsjusza i indukuj jednym milimolowym IPTG i rosły przez noc. Następnie zebrać komórki, odwirowując 4 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant.Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w buforze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami, ostatnie schronienie w temperaturze 4 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Następnie ponownie zawieś pozostały osad w 10 mililitrach buforu do lizy i inkubuj zawiesinę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie oddzielić frakcje rozpuszczalne i nierozpuszczalne przez odwirowanie w temperaturze 4 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodatkowo użyj HIS-Select Ni2 + Affinity Gel w 14-mililitrowych probówkach, aby związać i ponownie zawiesić jego oznakowaną rekombinowaną cyjanowirynę-N w roztworach buforowych z odpowiednio 20 milimolowym imidazolem i 250 milimolowym imidazolem. Inkubować partiami przez co najmniej 30 minut pomiędzy tymi etapami.Dodanie buforu elucyjnego zawierającego 250 milimolowy imidazol w celu elucji białka. Przenieść roztwory białkowe do probówek wirówkowych z 10-kilogramowym filtrem odcinającym daltona i zagęścić je przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 4,500 g i czterech stopniach Celsjusza. Dodać działający bufor SPR do współczynnika rozcieńczenia 1 do 10 i odwirować cztery razy do początkowej objętości przez 10 minut w temperaturze 4,500 g i czterech stopniach Celsjusza.Następnie określ stężenie białka na poziomie 280 nanometrów za pomocą spektrofotometru NanoDrop UV-Visible Spectrophotometer w oparciu o obliczony współczynnik ekstynkcji dla głównego białka CVN2L0 o wielkości 23 474 daltonów. W przypadku dwukanałowego systemu SPR należy użyć HBSCP plus jako buforu bieżącego, 10-milimolowego kwasu solnego glicyny o pH od 1,5 do 1,6 jako bufora regeneracyjnego i włączyć odgazowywacz przyrządu, automatyczny podajnik próbek i pompę. Następnie umyj cały system podwójnie destylowaną wodą przez godzinę.Następnie upuść olejek immersyjny na detektor i zamontuj szklany chip czujnika pokryty cienką złotą folią. A na górnej stronie, funkcjonalizowany hydrożelem karboksymetylodekstranowym bezpośrednio na detektorze poniżej trzyportowej celi przepływowej. Następnie popraw ustawienie, pociągając w dół uchwyt.Aby unieruchomić ligandy białkowe na chipach czujników, otwórz tabelę uruchamiania, klikając Formularz na pasku menu i uruchom edytor tabel w zintegrowanym oprogramowaniu SPP auto link. Następnie wybierz i kliknij Podstawowe Unieruchomienie z listy dostępnych tabel uruchamiania i postępuj zgodnie z krokami procedury eksperymentalnej na ekranie komputera. Następnie należy kliknąć na Edytor Zestawu Próbek w sekcji formularza, aby wypełnić listę odczynników dla dwóch stojaków umieszczonych w autosamplerze w celu dalszej analizy.Kliknij Autosampler Direct Control jako narzędzie na pasku menu, aby przesunąć stojaki do przodu lub do tyłu i wybierz cztery stopnie Celsjusza jako temperaturę roboczą. Uruchom pompę, aby zainparować podwójnie destylowaną wodę, klikając narzędzia i bezpośrednie sterowanie pompą. I rejestruj dane, klikając SPR Instrument Direct Control.I za każdym razem zacznij w nowo pojawiającym się oknie. Po dodaniu odczynników sprzęgających do fiolek o pojemności 300 mikrolitrów, umieść je w stojakach automatycznego podajnika próbek i uruchom tabelę przebiegów, klikając przycisk Uruchom. W przypadku prostej interakcji białko-białko, po napełnieniu pompy z prędkością 25 000 mikrolitrów na minutę, należy przeprowadzić regulację linii podstawowej przez 30 sekund.Pozostawić na późniejszą korektę linii podstawowej za pomocą podwójnie destylowanej wody przez 1,5 minuty przed schlaszczeniem aktywowanej powierzchni chipa jednym molowym chlorowodorkiem etanoloaminy o pH 8,5. Następnie przełącz probówki z próbnika cieczy na odgazowywacz z podwójnie destylowanej wody do butelki za pomocą HBS-EP+Kliknij Formularz, przewiń w dół i przejdź do przetwarzania końcowego, klikając ten tryb działania. Następnie kliknij przycisk Dodaj, aby wybrać krzywe wiążące wygenerowane w czasie na platformie danych dla każdej komórki przepływu i wyeksportować nakładkę jako plik suwaka.Następnie kliknij Plik, aby otworzyć opcje zapisywania pliku i uzyskać krzywe odpowiedzi, wyrównując krzywe w lewo i w prawo oraz odejmując sygnały drugiego kanału referencyjnego od sygnałów kanału liganda. Pojedyncze wstrzyknięcia CVN2L0 i wariancji V2 i V5 zostały najpierw przetestowane pod kątem wiązania z chipem czujnika sprzężonego z hemaglutyniną w celu oszacowania zdolności wiązania przy użyciu automatycznego podajnika próbek i edytora stołów roboczych. Wielokrotne wstrzykiwania były zautomatyzowane przy różnych stężeniach w zakresie nanomolowym i mikromolowym w systemie w czasie, wykazując, że nie osiągnięto nasycenia powierzchni chipa ani wiązania równowagi.Stężenie w stosunku do odpowiedzi wykreślono dla wiązania CVN typu dzikiego z RBD, zakładając specyficzne ukierunkowanie na potencjalnie konserwatywne węglowodany na podjednostce RBD S1 o słabszym powinowactwie o stałym współczynniku dysocjacji wynoszącym 260 mikromoli. Ten sam wykres powinowactwa do wiązania CVN2L0-V4 z DM staje się już niemożliwy do analizy z powodu zastąpienia wiązań dwusiarczkowych, które zakłócają wiązanie o wysokim powinowactwie do małych peptydów glikozylowanych i daje wyższą odpowiedź niż maksymalna wartość odpowiedzi. Wiązanie CVN typu dzikiego z RBD na SARS-CoV-2 wykazuje wiązanie z białkiem S i RBD ze stałą wściekłości dysocjacji wynoszącą odpowiednio 18,6 mikromoli i 260 mikroli.Chociaż odpowiedź SPR dla stężeń analitu skutkuje wysokimi jednostkami odpowiedzi i typowymi sensorgramami SPR dla CVN typu dzikiego i wiązania E41A. Jednak mutant jest niestabilny po rozcieńczeniu. Biodetekcja SPR zajmuje się wiązaniem oczyszczonych białek i ich wariantów z ligandami o wysokim i niskim powinowactwie.W naszym przypadku glikoproteiny wykorzystujące odczyt optyczny i dwukanałowy system przepływu na powierzchni chipa czujnika. Test immunoenzymatyczny jest alternatywną metodą immunologiczną rozpoznającą epitopy białek, ale także dostarczającą danych na temat stężenia peptydów i małych cząsteczek ze złożonych matryc. Testowanie białek o ekspresji rekombinowanej za pomocą testów wiązania SPR obejmowało biodetekcję zmian potwierdzających, która jest przydatna do weryfikacji i przewidywania stabilności białka po stronie obliczeniowej białka.

engineering-antiviral-agents-via-surface-plasmon-resonance

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film opisuje technikę powierzchniowego rezonansu plazmonowego, czyli SPR, do badania interakcji między dwiema cząsteczkami za pomocą chipa czujnika. Zmiana kąta rezonansu i natężenie odbitego światła są wykrywane jako funkcja asocjacji i dysocjacji dwóch cząsteczek, a to dostarcza informacji o oddziaływaniach między dwiema cząsteczkami.

Powierzchniowy rezonans plazmonów do badania oddziaływań biomolekularnych za pomocą chipa czujnika

Ten film demonstruje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu do analizy relacji antygenowych między wirusami grypy A i B. Zapewnia ilościowy i wizualny sposób oceny skuteczności przeciwciał lub innych metod leczenia w zapobieganiu infekcji wirusowej.

Analiza związku antygenowego między wirusami przy użyciu testu mikroneutralizacji opartego na obrazie

Ten film demonstruje test przyczepiania wirusów do badania przesiewowego związków przeciwwirusowych. Wykorzystując genetycznie zmodyfikowany wirus zapalenia wątroby typu C i lucyferazy, ocenia hamujący wpływ na przyłączanie się wirusa, na co wskazuje niższe natężenie światła w studzienkach poddanych działaniu kooperacji w porównaniu ze studzienkami leczonymi samym wirusem.

Test przyłączania wirusa do badań przesiewowych związków przeciwwirusowych

Ten film demonstruje metodę przeprowadzania testu płytki nazębnej przy użyciu wirusa uzyskanego z zakażonej rogówki świni. Rogówka świni służy do testowania skuteczności przeciwwirusowej leków eksperymentalnych.

Określanie skuteczności przeciwwirusowej leków eksperymentalnych za pomocą testu płytki nazębnej

Trzy testy, w tym test oparty na działaniu cytopatycznym (CPE), test dawka-odpowiedź i test czasu dodania (ToA) zostały opracowane, zoptymalizowane, zatwierdzone i wykorzystane do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV), a także do określenia możliwego mechanizmu działania (MoA) dla nowo zidentyfikowanych leków przeciwwirusowych.

Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka

Tutaj prezentujemy protokół, który bada konkretne etapy wejścia wirusa w celu identyfikacji i oceny nowych środków przeciwwirusowych.

Testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Udostępniamy protokół, który może być ogólnie stosowany do wybranych aptamerów, które wiążą się tylko z wirusami zakaźnymi, a nie z wirusami, które stały się niezakaźne za pomocą metody dezynfekcji lub z innymi podobnymi wirusami. Otwiera to możliwość określenia statusu zakaźności w testach przenośnych i szybkich.

Selekcja aptamerów in vitro w celu odróżnienia wirusów zakaźnych od niezakaźnych

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Opracowaliśmy zdecelularyzowaną macierz zewnątrzkomórkową płuca oraz nowatorski bioreaktor biomimetyczny, które mogą być wykorzystywane do generowania funkcjonalnej tkanki płucnej. Poprzez zasiewanie komórek do macierzy i ich hodowlę w bioreaktorze, otrzymujemy tkankę wykazującą efektywną wymianę gazową po krótkotrwałym przeszczepieniu in vivo.

Procedura inżynierii płuc

Poznaj powierzchniowy rezonans plazmonowy do badania interakcji białko-glikan w czasie rzeczywistym. Ta metoda pozwala określić stałe kinetyczne i afinitety wiązania CV-N z różnymi glikanami.

Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Przeglądaj więcej filmów