Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Spektroskopia powierzchniowego rezonansu plazmonowego została opracowana do oznaczania ligandu białkowego w sposób średnio przepustowy. Wykazano różne powinowactwa do wariantów miejsc wiązania tej samej cząsteczki, a mianowicie do wiązania żelaza przez oligosacharydy na wirusach. SPR jest bezznacznikową techniką do badania makromolekularnego wiązania receptorów unieruchomionych powierzchniowo w czasie rzeczywistym.

Interakcje wieloopozycyjne są rozpoznawane w analizie kinetycznej poprzez wiązanie konkurencyjne niezależnie od wielkości Specyficzne obszary w badaniach, które wykorzystują SPR, to opracowywanie leków w celu poszukiwania inhibitorów lub charakterystyki przeciwciał. Stałe kinetyczne i powinowactwa są obliczane bezpośrednio na podstawie odpowiedzi czujnika. Na początek przenieś 100 mikrolitrów roztworu na płytki LB-agar i delikatnie rozprowadź za pomocą sterylnego rozsiewacza komórek.

Rozpocznij serię reakcji próbek przy użyciu wielu stężeń dwuniciowej matrycy DNA w zakresie od pięciu do 50 nanogramów, utrzymując stałe stężenie startera. Następnie dodaj enzym restrykcyjny DpnI poniżej nakładki oleju mineralnego i natychmiast inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę w celu trawienia rodzicielskiego superskręconego dwuniciowego DNA. Aby rozmrozić superkompetentne ogniwa XL1-Blue, należy je podzielić na porcje do wstępnie schłodzonej, małej, okrągłej dolnej rurki.

Następnie przenieś jeden mikrolitr jednoniciowego DNA potraktowanego DpnI z każdej reakcji kontrolnej i próbki do oddzielnych podwielokrotności komórek superkompetentnych, które syntetyzują nić komplementarną. Po dokładnym zawirowaniu reakcji przemiany w celu wymieszania, inkubować reakcje na lodzie przez 30 minut. Zastosuj impuls cieplny do reakcji przemiany w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 45 sekund, a następnie umieść reakcje na lodzie na dwie minuty.

Następnie dodaj 0,5 mililitra bulionu NZY+ i inkubuj reakcje przemiany w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 225 do 250 obr./min przez godzinę. Następnie umieść odpowiednią objętość każdej reakcji przemiany na płytkach agarowych LB Ampicillin, jak pokazano wcześniej. W przypadku kultury nasiennej należy zaszczepić niewielką ilość ampicyliny zawierającej pożywkę LB pojedynczą kolonią z przekształconej płytki.

Używając kultury nocnej, zaszczepić kulturę ekspresji dodatkami, w tym 10 milimolami chlorku magnezu, 10 milimolami siarczanu magnezu i 20 milimolami glukozy, rozcieńczając kulturę nasion do jednego na 100. Następnie hoduj komórki z energicznym wstrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza do chłonnego 600 nanometrów między 0,4 a 0,6 przed schłodzeniem komórek do 20 stopni Celsjusza i indukuj jednym milimolowym IPTG i rosły przez noc. Następnie zebrać komórki, odwirowując 4 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant.

Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w buforze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami, ostatnie schronienie w temperaturze 4 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Następnie ponownie zawieś pozostały osad w 10 mililitrach buforu do lizy i inkubuj zawiesinę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie oddzielić frakcje rozpuszczalne i nierozpuszczalne przez odwirowanie w temperaturze 4 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodatkowo użyj HIS-Select Ni2 + Affinity Gel w 14-mililitrowych probówkach, aby związać i ponownie zawiesić jego oznakowaną rekombinowaną cyjanowirynę-N w roztworach buforowych z odpowiednio 20 milimolowym imidazolem i 250 milimolowym imidazolem. Inkubować partiami przez co najmniej 30 minut pomiędzy tymi etapami.

Dodanie buforu elucyjnego zawierającego 250 milimolowy imidazol w celu elucji białka. Przenieść roztwory białkowe do probówek wirówkowych z 10-kilogramowym filtrem odcinającym daltona i zagęścić je przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 4,500 g i czterech stopniach Celsjusza. Dodać działający bufor SPR do współczynnika rozcieńczenia 1 do 10 i odwirować cztery razy do początkowej objętości przez 10 minut w temperaturze 4,500 g i czterech stopniach Celsjusza.

Następnie określ stężenie białka na poziomie 280 nanometrów za pomocą spektrofotometru NanoDrop UV-Visible Spectrophotometer w oparciu o obliczony współczynnik ekstynkcji dla głównego białka CVN2L0 o wielkości 23 474 daltonów. W przypadku dwukanałowego systemu SPR należy użyć HBSCP plus jako buforu bieżącego, 10-milimolowego kwasu solnego glicyny o pH od 1,5 do 1,6 jako bufora regeneracyjnego i włączyć odgazowywacz przyrządu, automatyczny podajnik próbek i pompę. Następnie umyj cały system podwójnie destylowaną wodą przez godzinę.

Następnie upuść olejek immersyjny na detektor i zamontuj szklany chip czujnika pokryty cienką złotą folią. A na górnej stronie, funkcjonalizowany hydrożelem karboksymetylodekstranowym bezpośrednio na detektorze poniżej trzyportowej celi przepływowej. Następnie popraw ustawienie, pociągając w dół uchwyt.

Aby unieruchomić ligandy białkowe na chipach czujników, otwórz tabelę uruchamiania, klikając Formularz na pasku menu i uruchom edytor tabel w zintegrowanym oprogramowaniu SPP auto link. Następnie wybierz i kliknij Podstawowe Unieruchomienie z listy dostępnych tabel uruchamiania i postępuj zgodnie z krokami procedury eksperymentalnej na ekranie komputera. Następnie należy kliknąć na Edytor Zestawu Próbek w sekcji formularza, aby wypełnić listę odczynników dla dwóch stojaków umieszczonych w autosamplerze w celu dalszej analizy.

Kliknij Autosampler Direct Control jako narzędzie na pasku menu, aby przesunąć stojaki do przodu lub do tyłu i wybierz cztery stopnie Celsjusza jako temperaturę roboczą. Uruchom pompę, aby zainparować podwójnie destylowaną wodę, klikając narzędzia i bezpośrednie sterowanie pompą. I rejestruj dane, klikając SPR Instrument Direct Control.

I za każdym razem zacznij w nowo pojawiającym się oknie. Po dodaniu odczynników sprzęgających do fiolek o pojemności 300 mikrolitrów, umieść je w stojakach automatycznego podajnika próbek i uruchom tabelę przebiegów, klikając przycisk Uruchom. W przypadku prostej interakcji białko-białko, po napełnieniu pompy z prędkością 25 000 mikrolitrów na minutę, należy przeprowadzić regulację linii podstawowej przez 30 sekund.

Pozostawić na późniejszą korektę linii podstawowej za pomocą podwójnie destylowanej wody przez 1,5 minuty przed schlaszczeniem aktywowanej powierzchni chipa jednym molowym chlorowodorkiem etanoloaminy o pH 8,5. Następnie przełącz probówki z próbnika cieczy na odgazowywacz z podwójnie destylowanej wody do butelki za pomocą HBS-EP+Kliknij Formularz, przewiń w dół i przejdź do przetwarzania końcowego, klikając ten tryb działania. Następnie kliknij przycisk Dodaj, aby wybrać krzywe wiążące wygenerowane w czasie na platformie danych dla każdej komórki przepływu i wyeksportować nakładkę jako plik suwaka.

Następnie kliknij Plik, aby otworzyć opcje zapisywania pliku i uzyskać krzywe odpowiedzi, wyrównując krzywe w lewo i w prawo oraz odejmując sygnały drugiego kanału referencyjnego od sygnałów kanału liganda. Pojedyncze wstrzyknięcia CVN2L0 i wariancji V2 i V5 zostały najpierw przetestowane pod kątem wiązania z chipem czujnika sprzężonego z hemaglutyniną w celu oszacowania zdolności wiązania przy użyciu automatycznego podajnika próbek i edytora stołów roboczych. Wielokrotne wstrzykiwania były zautomatyzowane przy różnych stężeniach w zakresie nanomolowym i mikromolowym w systemie w czasie, wykazując, że nie osiągnięto nasycenia powierzchni chipa ani wiązania równowagi.

Stężenie w stosunku do odpowiedzi wykreślono dla wiązania CVN typu dzikiego z RBD, zakładając specyficzne ukierunkowanie na potencjalnie konserwatywne węglowodany na podjednostce RBD S1 o słabszym powinowactwie o stałym współczynniku dysocjacji wynoszącym 260 mikromoli. Ten sam wykres powinowactwa do wiązania CVN2L0-V4 z DM staje się już niemożliwy do analizy z powodu zastąpienia wiązań dwusiarczkowych, które zakłócają wiązanie o wysokim powinowactwie do małych peptydów glikozylowanych i daje wyższą odpowiedź niż maksymalna wartość odpowiedzi. Wiązanie CVN typu dzikiego z RBD na SARS-CoV-2 wykazuje wiązanie z białkiem S i RBD ze stałą wściekłości dysocjacji wynoszącą odpowiednio 18,6 mikromoli i 260 mikroli.

Chociaż odpowiedź SPR dla stężeń analitu skutkuje wysokimi jednostkami odpowiedzi i typowymi sensorgramami SPR dla CVN typu dzikiego i wiązania E41A. Jednak mutant jest niestabilny po rozcieńczeniu. Biodetekcja SPR zajmuje się wiązaniem oczyszczonych białek i ich wariantów z ligandami o wysokim i niskim powinowactwie.

W naszym przypadku glikoproteiny wykorzystujące odczyt optyczny i dwukanałowy system przepływu na powierzchni chipa czujnika. Test immunoenzymatyczny jest alternatywną metodą immunologiczną rozpoznającą epitopy białek, ale także dostarczającą danych na temat stężenia peptydów i małych cząsteczek ze złożonych matryc. Testowanie białek o ekspresji rekombinowanej za pomocą testów wiązania SPR obejmowało biodetekcję zmian potwierdzających, która jest przydatna do weryfikacji i przewidywania stabilności białka po stronie obliczeniowej białka.