Name: Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Poznaj bioreaktor z obrazowaniem do usuwania nabłonka z tchawicy szczura i dystrybucji komórek. Ta metoda umożliwia długoterminową hodowlę tkanek dróg oddechowych i ich regenerację.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były częściowo wspierane przez American Thoracic Society Foundation Research Program, New Jersey Health Foundation i National Science Foundation (CAREER Award 2143620) dla J.K.; oraz National Institutes of Health (P41 EB027062) dla G.V.N.

<ol><li>Rackley, C. R., Stripp, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+and+maintaining+the+epithelium+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Building and maintaining the epithelium of the lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).</li>
<li>Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Normal+Human+Bronchial+Epithelial+%28NHBE%29+cell+3D+cultures+for+in+vitro+lung+model+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 500(2019).</li>
<li>Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+the+epithelium+in+chronic+upper+airways+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Allergy%22%5BJournal%5D)">Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).</li>
<li>Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+function+of+airway+tract+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Barrier function of airway tract epithelium.</a> Tissue Barriers. 1 (4), 24997(2013).</li>
<li>De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelium+dysfunction+in+cystic+fibrosis+and+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD.</a> Mediators of Inflammation. 2018, 1309746(2018).</li>
<li>Horani, A., Ferkol, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+genetics+of+primary+ciliary+dyskinesia%3A+Clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications.</a> Chest. 154 (3), 645-652 (2018).</li>
<li>Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+facing+airway+epithelial+cell-based+therapy+for+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 74(2019).</li>
<li>Shrestha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-on-a-chip%3A+the+future+of+respiratory+disease+models+and+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).</li>
<li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li>
<li>Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPlebani%2C+R+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22">Journal of Cystic Fibrosis</a>. , (2021).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Gilpin, S. E., Wagner, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+human+lung+scaffolds+to+model+lung+disease+and+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Review%22%5BJournal%5D)">Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration.</a> European Respiratory Review. 27 (148), 180021(2018).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+lungs+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Thoracic+Surgery+Clinics%22%5BJournal%5D)">Bioengineering lungs for transplantation.</a> Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).</li>
<li>Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+regeneration%3A+steps+toward+clinical+implementation+and+use%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Anaesthesiology%22%5BJournal%5D)">Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).</li>
<li>Planchard, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPlanchard%2C+D+%22Engineering+Design+with+SOLIDWORKS+2022%3A+A+Step-by-Step+Project+Based+Approach+Utilizing+3D+Solid+Modeling%22">Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling</a>. , SDC Publications. (2022).</li>
<li>Coward, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoward%2C+C+%22A+Beginner%27s+Guide+to+3D+Modeling%3A+A+Guide+to+Autodesk+Fusion+360%22">A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360</a>. , No Starch Press. (2019).</li>
<li>Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeza%2C+G+%222018+IEEE+XXV+International+Conference+on+Electronics%2C+Electrical+Engineering+and+Computing+%28INTERCON%22">2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON</a>. , 1-4 (2018).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+decellularization+using+a+combination+of+chemical%2C+physical+and+bioreactor+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods.</a> The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).</li>
<li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li>
<li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+decellularized+porcine+lung+scaffolds+for+use+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering.</a> Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).</li>
<li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li>
<li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+generation+of+lung+and+airway+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).</li>
<li>Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+liquid+microvolumes+into+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).</li>
<li>Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+retraction+of+microvolume+aqueous+plugs+traveling+in+a+wettable+capillary%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary.</a> Applied Physics Letters. 107 (14), 144101(2015).</li>
<li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).</li>
<li>Sengyoku, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+hydroxide+based+non-detergent+decellularizing+solution+for+rat+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung.</a> Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).</li>
<li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respiratory Research. 14 (1), 135(2013).</li>
<li>O'Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-circulation+for+extracorporeal+support+and+recovery+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037(2017).</li>
<li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985(2019).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-destructive+vacuum-assisted+measurement+of+lung+elastic+modulus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus.</a> Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).</li>
<li>Dorrello, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+vascularized+lung+grafts+for+lung+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering.</a> Science Advances. 3 (8), 1700521(2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

W ramach tej pracy stworzyliśmy bioreaktor sterowany obrazowaniem, który może umożliwić (i) monitorowanie światła tchawicy in situ po usunięciu komórek i dostarczeniu komórek egzogennych oraz (ii) długoterminową hodowlę in vitro tkanki tchawicy zasianej w komórkach. Korzystając z tego specjalnie zbudowanego bioreaktora, wykazaliśmy (i) selektywne usuwanie endogennych komórek nabłonka ze światła tchawicy za pomocą detergentu i płukania dróg oddechowych wspomaganego wibracjami oraz (ii) równomierne rozmie...

Powierzchnia świetlna dróg oddechowych jest pokryta warstwą nabłonka, która składa się głównie z komórek macierzystych wielorzęskowych, maczugowych, kielichowych i bazalnych1,2. Warstwa nabłonkowa służy jako podstawowy mechanizm obronny płuc, działając jako bariera biofizyczna, która chroni leżącą pod spodem tkankę dróg oddechowych przed wdychaniem patogenów, cząstek stałych lub gazów chemicznych. Chroni tkankę dróg oddechowych poprzez wiele mechanizmów, w tym tworzenie ścisłych połączeń międzykomórkowych, klirens śluzowo-rzęskowy oraz wydzielanie przeciwbakteryjne i przeciwutleniające3,4. Wadliwy nabłonek dróg oddechowych jest związany z wyniszczającymi chorobami układu oddechowego, takimi jak przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP)5, pierwotna dyskineza rzęsek (PCD)6 i mukowiscydoza (CF)7.
Postępy w technologii lung-on-chip (LOC) stanowią okazję do badania rozwoju płuc u ludzi, modelowania różnych chorób płuc i opracowywania nowych materiałów terapeutycznych w ściśle regulowanych środowiskach in vitro. Na przykład, nabłonek dróg oddechowych i śródbłonek mogą być hodowane po przeciwnych stronach cienkiej, porowatej błony, aby naśladować gaz wymieniający tkankę płucną, co pozwala na wierne modelowanie chorób i testowanie leków8. Podobnie, modele chorób in vitro zostały stworzone do modelowania chorób dróg oddechowych in vitro, takich jak POChP9 i mukowiscydoza10. Jednak głównym wyzwaniem związanym z urządzeniami LOC jest rekapitulacja złożonej trójwymiarowej (3D) architektury tkanki płucnej i dynamicznych interakcji komórka-tkanka macierz in vitro11.
Ostatnio opracowano innowacyjne metodologie inżynierii tkankowej, które pozwalają na manipulację tkankami płuc ex vivo12. Korzystając z tych metodologii, ogołocone allogeniczne lub ksenogeniczne przeszczepy tkanek mogą być przygotowywane poprzez usuwanie komórek endogennych z tkanki płucnej za pomocą chemicznych, fizycznych i mechanicznych zabiegów13. Ponadto zachowana macierzy zewnątrzkomórkowa tkanki natywnej (ECM) w zdecelularyzowanych rusztowaniach płuc dostarcza fizjo-mimetycznych strukturalnych, biochemicznych i biomechanicznych wskazówek dla wszczepionych komórek do przyczepiania, proliferacji i różnicowania14,15.
Tutaj opisano system bioreaktora sterowany obrazowaniem, stworzony przez połączenie technologii LOC i inżynierii tkankowej, aby umożliwić manipulację tkankami in vitro i hodowlę eksplantowanych tkanek tchawicy szczura. Korzystając z tego bioreaktora tkankowego dróg oddechowych, protokół wykazuje selektywne usuwanie endogennych komórek nabłonka bez zakłócania leżących pod spodnabłonkiem składników komórkowych i biochemicznych tkanki dróg oddechowych. Następnie pokazujemy jednorodną dystrybucję i natychmiastowe odkładanie się nowo wysianych komórek egzogennych, takich jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), na ogołoconym świetle dróg oddechowych poprzez wkroplenie obciążonego komórkami roztworu żelu collagen I. Ponadto, dzięki zastosowaniu urządzenia do obrazowania mikrooptycznego zintegrowanego z bioreaktorem, odbywa się również wizualizacja światła tchawicy podczas usuwania nabłonka i dostarczania komórek endogennych. Ponadto wykazano, że tchawica i nowo wszczepione komórki mogą być hodowane w bioreaktorze bez zauważalnej śmierci komórki i degradacji tkanek przez 4 dni. Przewidujemy, że platforma bioreaktora z obsługą obrazowania, technika usuwania nabłonka oparta na cienkiej warstwie oraz metoda dostarczania komórek zastosowana w tym badaniu mogą być przydatne do generowania tkanek dróg oddechowych do modelowania chorób in vitro i badań przesiewowych leków.
Bioreaktor zawiera prostokątną komorę podłączoną do programowalnej pompy strzykawkowej, pompy perfuzyjnej i respiratora do hodowli izolowanej tchawicy szczura. Bioreaktor posiada wloty i wyloty podłączone do tchawicy lub komory hodowli tkankowej, które oddzielnie dostarczają odczynniki (np. pożywki hodowlane) do wewnętrznych i zewnętrznych przestrzeni tchawicy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Specjalnie zbudowany system obrazowania może być wykorzystany do wizualizacji wnętrza tchawicy szczura hodowanej in vitro na poziomie komórkowym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Endogenny nabłonek tchawicy jest usuwany poprzez wkroplenie roztworu decelularyzacyjnego na bazie detergentu, a następnie wspomagane wibracjami płukanie dróg oddechowych (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3). Roztwór hydrożelu, taki jak kolagen typu I, jest używany jako nośnik do równomiernego i natychmiastowego wysiewu komórek egzogennych przez ogołocone światło tchawicy (<klasa silna = "xfig">Rysunek 4). Wszystkie materiały użyte do budowy bioreaktora i przeprowadzenia eksperymentów znajdują się w Tabeli Materiałów.

<table><tbody><tr><td>1 i razy; PBS</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>10-010-031</td><td></td></tr><tr><td>Złącze 3-portowe</td><td>World Precision Instruments</td><td>14048-20</td><td></td></tr><tr><td>Złącze 4-portowe</td><td>World Precision Instruments</td><td>14047-10</td><td></td></tr><tr><td>Akcelerometr</td><td>STMicroelectronics</td><td>IIS3DWBTR</td><td></td></tr><tr><td>Achromatyczny dublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium kkońcówka szpilki</td><td>TED PELLA</td><td>16111</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybicza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Pręt montażowy</td><td>Thorlabs</td><td>ER1</td><td></td></tr><tr><td>z kulistym</td><td>McMaster-Carr</td><td>91255A274</td><td></td></tr><tr><td>Kostka koszykowa</td><td>Thorlabs</td><td>C4W</td><td></td></tr><tr><td>Dwustronna taśma przewodząca węglowa</td><td>TED PELLA</td><td>16073</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do etykietowania CFSE</td><td>Abcam</td><td>ab113853</td><td></td></tr><tr><td>Citrisolv (środek czyszczący)</td><td>Decon</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>Adapter C-mount</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A9</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5153</td><td></td></tr><tr><td>Przewodząca płynna farba srebrna</td><td>TED PELLA</td><td>16034</td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne</td><td>Semrock</td><td>DI03-R488</td><td>Odbite długości fal lasera:&nbsp; 473,0 +- 2 nm 488,0 +3/-2 nm</td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Dulbecco' Dulbecco' s medium</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Żeńska przejściówka grodziowa typu luer do króćca węża</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45501-30</td><td></td></tr> Żeńska przesuwnica <tr><td>luer do rurki</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45508-03</td><td></td></tr><tr><td>Złącze luer żeńskie na męskie</td><td>Cole-Parmer</td><td>ZY-45508-80</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka filtrująca</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET535/50m</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E1000 - D</td><td></td></tr><tr><td>Fusion 360</td><td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nakrętka sześciokątna</td><td>McMaster-Carr</td><td>91813A160</td><td></td></tr><tr><td>Heksametyldisilazan (HMDS)</td><td>Fisher Scientifc</td><td>AC120585000</td><td></td></tr><tr><td>Światłowód obrazujący</td><td>SELFOC, NSG grupa</td><td>Soczewka</td><td></td>GRIN</tr><tr><td>Laser</td><td>Opto Engine</td><td>MDL-D-488-150mW</td><td></td></tr><tr><td>Tubusy obiektywu</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L40</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Zestaw żywotności/cytotoksyczności (Invitrogen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>MACH 3 Oprogramowanie sterujące CNC</td><td>Newfangled Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soczewka obiektywowa</td><td>Olympus</td><td>UCPLFLN20X</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Cole Parmer</td><td>L/S standardowy cyfrowy system</td><td></td>pomp</tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Pierścień ustalający</td><td>Thorlabs</td><td>SM1RR</td><td></td></tr><tr><td>Naukowa kamera CMOS</td><td>PCO Panda</td><td>PCO Panda 4.2</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>VWR</td><td>97064-472</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks ( 2019)</td><td>Dassault Syst&egrave; mes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubus obiektywu do układania</td><td>w stosy Thorlabs</td><td>SM1L10</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz płytowy subwoofera</td><td>Dayton Audio</td><td>SPA250DSP</td><td></td></tr><tr><td>Głośnik niskotonowy</td><td>Dayton Audio</td><td>RSS21OHO-4</td><td>Średnica membrany: 21 cm</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>World Precision Instruments</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Gwintowana płyta klatkowa</td><td>Thorlabs</td><td>CP33</td><td></td></tr><tr><td>Gwintowany adapter luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45513-81</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka tubusu</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Rurka</td><td>Cole-Parmer</td><td>13-200-110</td><td></td></tr><tr><td>XY Translator</td><td>Thorlabs</td><td>CXY1</td><td></td></tr></tbody></table>

bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Powtarzające się uszkodzenia tkanki dróg oddechowych mogą upośledzać funkcję płuc i powodować przewlekłe choroby płuc, takie jak przewlekła obturacyjna choroba płuc. Postępy w medycynie regeneracyjnej i technologiach bioreaktorów oferują możliwości wytwarzania wyhodowanych w laboratorium funkcjonalnych tkanek i narządów, które można wykorzystać do badań przesiewowych leków, modelowania chorób i inżynierii zamienników tkanek. W tym miejscu opisano zminiaturyzowany bioreaktor w połączeniu z metodą obrazowania, która umożliwia wizualizację in situ wewnętrznego światła eksplantowanej tchawicy szczura podczas manipulacji tkankami in vitro i hodowli. Korzystając z tego bioreaktora, protokół demonstruje selektywne usuwanie endogennych składników komórkowych pod kontrolą obrazowania, przy jednoczesnym zachowaniu wewnętrznych cech biochemicznych i ultrastruktury macierzy tkankowej dróg oddechowych. Ponadto pokazano dostarczanie, równomierne rozprowadzanie, a następnie przedłużoną hodowlę komórek egzogennych w zdecelularnym świetle dróg oddechowych z monitorowaniem optycznym in situ. Wyniki podkreślają, że bioreaktor sterowany obrazowaniem może być potencjalnie wykorzystany do ułatwienia wytwarzania funkcjonalnych tkanek dróg oddechowych in vitro.

Modalność obrazowania in situ oparta na soczewkach GRIN umożliwia wizualizację wewnętrznego światła tchawicy in situ (Rycina 5A). Zastosowanie tej metody obrazowania pozwala na uzyskanie obrazów w polu jasnym oraz obrazów fluorescencyjnych zarówno dla tchawic natywnych, jak i pozbawionych nabłonka (Rycina 5B,C). Przed znakowaniem CFSE w tchawicy natywnej nie zaobserwowano sygnału fluorescencyjnego (Rycina 5...

Protokół opisuje bioreaktor z obsługą obrazowania, który pozwala na selektywne usuwanie endogennego nabłonka z tchawicy szczura i jednorodne rozmieszczenie komórek egzogennych na powierzchni światła, a następnie długoterminową hodowlę in vitro konstruktu komórka-tkanka.

Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Protokół ten umożliwia hodowlę in vitro i bezpośrednią wizualizację mikroskopową izolowanych tkanek dróg oddechowych podczas różnych procedur manipulacji tkankami, takich jak usuwanie nabłonka i regeneracja tkanek dróg oddechowych. Obrazowanie in situ zaproponowane w tym badaniu umożliwia szybkie i nieniszczące monitorowanie światła tchawicy podczas kontrolowanego obrazowania usuwania endogennego nabłonka i dostarczania komórek egzogennych. Platforma bioreaktywna sterowana obrazowaniem i protokoły manipulacji tkankami mogą być wykorzystywane do generowania bioinżynieryjnej tkanki dróg oddechowych do modelowania chorób i badań przesiewowych leków.Budowę i zastosowanie bioreaktora tkankowego dróg oddechowych z funkcją obrazowania zademonstrują dwaj doktoranci z naszej grupy badawczej, Mohammad Mir i Jiawen Chen. Aby rozpocząć tworzenie urządzenia do obrazowania in situ, włóż soczewkę tubusu do tubusu obiektywu, który można układać jeden na drugim, i zabezpiecz go za pomocą pierścienia ustalającego. Następnie zamontuj zespół stołu obiektywu na naukowej kamerze CMOS za pomocą adaptera C-mount.Użyj oprogramowania Micromanager do obsługi aparatu oraz pozyskiwania zdjęć i filmów. Celując w obiekt znajdujący się w odległości 10 metrów od kamery, dostosuj odległość między obiektywem tubusu a czujnikiem obrazowania aparatu, aż na ekranie komputera utworzy się ostry obraz obiektu. Następnie użyj elementów systemu klatki optycznej, takich jak pręt montażowy, gwintowana płyta klatki i sześcian klatki, aby zamontować soczewkę filtra na dwukrawędziowym, superrozdzielczym, dichroicznym lustrze i laserze do urządzenia.Podłącz obiektyw 20X do urządzenia. Następnie zamontuj zieloną soczewkę o średnicy 500 mikrometrów na dystalnym końcu tubusu obiektywu za pomocą translatora X-Y. Dostosuj odległość między soczewkami zielonymi a soczewkami obiektywu, aby uzyskać zogniskowane obrazy mikroskopowe.Aby uwidocznić izolowane światło tchawicy szczura w jasnym polu lub fluorescencyjnym, umieść bioreaktor na stoliku do obrazowania. Następnie wlej 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego estru sukcynimidylowego karboksyfluoresceiny lub roztworu CFSE z szybkością przepływu pięciu mililitrów na minutę przez tchawicę za pomocą pompy strzykawkowej podłączonej do rurki kaniuli tchawicy. Gdy roztwór CFSE wypełni tchawicę, zatrzymaj pompę.Po 10 minutach przemyj światło tchawicy, podając 10 mililitrów PBS za pomocą pompy strzykawkowej w celu usunięcia pozostałości niewbudowanych odczynników CFSE. Po umyciu włóż dystalną końcówkę obrazowania zielonej soczewki do tchawicy za pomocą złącza luer przymocowanego do jednego końca tchawicy. Następnie delikatnie przesuń zieloną soczewkę wewnątrz tchawicy, aż powierzchnia tchawicy zostanie zogniskowana.Aby uchwycić obrazy w jasnym polu w oprogramowaniu micromanager, należy oświetlić światło tchawicy białym światłem przez kostkę klatkową. Następnie kliknij ikonę Na żywo, aby wyświetlić powierzchnię światła tchawicy w czasie rzeczywistym. Użyj zakładek Ustawienia obrazowania i Ekspozycja, aby zmienić czas ekspozycji na żądaną wartość.Aby dostosować kontrast i jasność obrazów, użyj okna histogramu i skalowania intensywności, aby przesunąć czarno-białe strzałki w punkcie końcowym interaktywnego ekranu histogramu. Kliknij Zatrzymaj na żywo, aby aktywować ikonę Snap, a następnie kliknij ikonę Snap, aby zamrozić obraz. Następnie użyj ustawienia Eksportuj, a następnie Obrazy jako przemieszczone karty, aby zapisać obrazy w żądanym formacie.Aby uzyskać zdjęcia i filmy w trybie fluorescencyjnym, oświetl światło tchawicy światłem laserowym specyficznym dla CFSE przez sześcian klatki i uzyskaj obrazy w czasie rzeczywistym, przesuwając sondę obrazującą do przodu iz powrotem. Po uzyskaniu zdjęć i filmów delikatnie wyjmij zieloną soczewkę z tchawicy. W celu usunięcia nabłonka tchawicy należy wkroplić 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego 2% dodecylosiarczanu sodu przez kaniulę tchawicy, aby wytworzyć cienką warstwę roztworu detergentu na świetle tchawicy.Po wkropleniu zamknij połączenia rurkowe bioreaktora za pomocą męskich lub żeńskich zatyczek typu luer i przenieś bioreaktor do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut, aby SDS mógł zamieszkać w tchawicy. Powtórz wkraplanie raz. Po drugim wkropleniu usunąć zlizowany nabłonek i SDS, trzykrotnie nawadniając światło tchawicy 500 mikrolitrami PBS za pomocą pompy strzykawkowej przy natężeniu przepływu 10 mililitrów na minutę.Następnie umieść bioreaktor na wytrząsarce, aby mechanicznie wibrował z częstotliwością 20 Hz i amplitudą przemieszczenia 0,3 milimetra, aby fizycznie sprzyjać oderwaniu się komórek nabłonka traktowanych SDS od światła tchawicy. Podczas gdy tchawica jest wibrowana mechanicznie, wlej 500 mikrolitrów PBS dwukrotnie przez światło tchawicy, aby usunąć resztki SDS i resztki komórek. Po usunięciu nabłonka oceń klirens warstwy nabłonkowej, mierząc intensywność CFSE za pomocą urządzenia do obrazowania z zieloną soczewką.Po przygotowaniu pozbawionej nabłonka tchawicy szczura, rozmrażaj zamrożone mezenchymalne komórki macierzyste lub MSC przez 30 sekund w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru, a następnie przygotuj roztwór komórek o stężeniu pięć razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Następnie oznacz komórki fluorescencyjnie, inkubując je z dwoma mililitrami 100-mikromolowego roztworu CFSE w temperaturze pokojowej.Po 15 minutach przepłucz komórki pięcioma mililitrami PBS trzy razy przed ponownym zawieszeniem ich w świeżej pożywce hodowlanej DMEM o końcowym stężeniu trzy razy 10 do siedmiu komórek na mililitr. Bezpośrednio po przygotowaniu hydrożelu collagen I, zgodnie z opisem w manuskrypcie, dodaj komórki do roztworu hydrożelu o pożądanym stężeniu. Następnie wymieszaj komórki i roztwór żelu za pomocą mikropipety, aby uzyskać jednolitą mieszaninę komórkowo-hydrożelową.Następnie podłącz jeden koniec tchawicy w bioreaktorze do programowalnej pompy strzykawkowej za pomocą złącza luer i wprowadź pięć mililitrów świeżej pożywki hodowlanej do komory bioreaktora w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby pokryć zewnętrzną powierzchnię tchawicy. Następnie podaj 10 mikrolitrów bolusa mieszaniny komórka-hydrożel do pozbawionej nabłonka tchawicy w bioreaktorze, aby wytworzyć warstwę komórkowo-hydrożelową na świetle tchawicy. Po wstrzyknięciu komórek umieść bioreaktor w sterylnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla do galelacji na 30 minut, aby umożliwić galalizację.Aby zobrazować rozmieszczenie wszczepionych komórek, wysterylizuj zieloną soczewkę 70% alkoholem izopropylowym lub etanolem i umieść bioreaktor na stoliku do obrazowania, aby uzyskać zdjęcia i filmy zarówno w trybie jasnego pola, jak i fluorescencyjnym. Po 30 minutach wysiewu komórek wlej jeden mililitr pożywki hodowlanej do światła tchawicy z szybkością przepływu jednego mililitra na minutę. Na koniec hoduj tchawicę zasianą komórkami w bioreaktorze w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez żądany czas.Podczas hodowli komórkowej pożywka powinna być utrzymywana w świetle statycznym, podczas gdy pożywka na zewnątrz tchawicy jest stale perfundowana przez jednokierunkowy przepływ. Na obrazach w jasnym polu i fluorescencyjnych pozbawionej nabłonka tchawicy nie zaobserwowano sygnału fluorescencyjnego przed znakowaniem CFSE. W przypadku CFSE zaobserwowano jednolity sygnał fluorescencyjny w całym nabłonku.Po odfiltrowaniu nabłonka intensywność fluorescencji uległa znacznemu zmniejszeniu, co wskazuje na ablację nabłonka. Barwienie hematoksyliną i eozyną pozbawionej nabłonka tchawicy ilustrowało usunięcie pseudo-warstwowego nabłonka ze światła tchawicy oraz zachowanie komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej lub mikrostruktur ECM w leżących poniżej warstwach tkanki. Co więcej, barwienie pentachromem i trichromem potwierdziło utrzymanie architektury tkanki tchawicy i składników ECM, takich jak kolagen i proteoglikany.Immunofluorescencja komórek nabłonka i kolagenu I wykazała całkowite usunięcie nabłonka i zachowanie kolagenu I w tkance podnabłonkowej. Skaningowe mikrofotografie elektronowe wykazały, że natywna tchawica była wypełniona komórkami wielorakimi i kubkowymi. W tchawicy pozbawionej nabłonka błona podstawna była odsłonięta, na co wskazuje sieć siatek włókien macierzy zewnątrzkomórkowej i brak komórek nabłonkowych.Obrazy fluorescencyjne tchawicy pozbawionej nabłonka, po zasianiu PBS i kolagenu, są pokazane tutaj. W porównaniu z komórkami wysiewanymi za pomocą pożywki hodowlanej, znakowane fluorescencyjnie komórki dostarczone za pomocą hydrożelu pozostały bardziej równomiernie przylegające w całym świetle. Badanie żywotności komórek wykazało, że procedura dostarczania komórek nie miała wpływu na ich żywotność, a ponad 90% komórek pozostało zdolnych do życia.Stworzenie cienkiej warstwy detergentu w procesie usuwania nabłonka i użycie hydrożelu jako nośnika dla komórek to niezbędne kroki dla powodzenia tego protokołu. Naszym kolejnym celem badawczym jest wszczepienie wyhodowanych w laboratorium komórek pierwotnych lub macierzystych dróg oddechowych do pozbawionej nabłonka tkanki dróg oddechowych, aby zbadać, czy można przygotować funkcjonalną tkankę dróg oddechowych.

imaging-guided-bioreactor-for-generating-bioengineered-airway-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Nasz zespół opracował system hodowli w bioreaktorze, który naśladuje fizjologiczne naprężenia pulsacyjne układu sercowo-naczyniowego w celu regeneracji wszczepialnych zastążek naczyniowych o małej średnicy.

Projektowanie biologicznych przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem bioreaktora pulsacyjnego

Opracowaliśmy zdecelularyzowaną macierz zewnątrzkomórkową płuca oraz nowatorski bioreaktor biomimetyczny, które mogą być wykorzystywane do generowania funkcjonalnej tkanki płucnej. Poprzez zasiewanie komórek do macierzy i ich hodowlę w bioreaktorze, otrzymujemy tkankę wykazującą efektywną wymianę gazową po krótkotrwałym przeszczepieniu in vivo.

Procedura inżynierii płuc

Decelularyzacja całego narządu tworzy naturalne biologiczne rusztowania, które mogą być wykorzystane w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiono opis modelu regeneracji płuc u naczelnych u zwierząt innych niż człowiek, w którym całe płuca są decelularyzowane, a następnie wysiewane dorosłymi komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka w bioreaktorze ułatwiającym krążenie naczyniowe i wentylację płynnych mediów.

Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

Rekapitulacja mikrośrodowiska specyficznego dla danego narządu, która stymuluje miejscową angiogenezę, jest niezbędna do skutecznej regeneracji uszkodzonych tkanek. W niniejszym raporcie przedstawiono nowatorską metodę wszczepiania żeli fibrynowych na powierzchnię płuc żywej myszy w celu zbadania, w jaki sposób mikrośrodowisko specyficzne dla płuc moduluje angiogenezę i regenerację pęcherzyków płucnych u dorosłych myszy.

Implantacja żelu fibrynowego do płuca myszy w celu zbadania angiogenezy specyficznej dla płuc

Postępy w technologiach biomateriałów umożliwiają rozwój trójwymiarowych konstruktów wielokomórkowych. Opracowaliśmy protokoły elektroprzędzenia w celu wytworzenia trzech pojedynczych rusztowań do hodowli głównych komórek strukturalnych dróg oddechowych, aby zapewnić model 3D in vitro ściany oskrzelików dróg oddechowych.

Dostosowanie procesu elektroprzędzenia w celu zapewnienia trzech unikalnych środowisk dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych in vitro

Zwężenie przeszczepu stanowi krytyczną przeszkodę w wymianie dróg oddechowych za pomocą inżynierii tkankowej. Aby zbadać mechanizmy komórkowe leżące u podstaw zwężenia, wykorzystujemy mysi model wymiany tchawicy za pomocą inżynierii tkankowej z wysiewanymi komórkami jednojądrzastymi szpiku kostnego (BM-MNC). Tutaj szczegółowo opisujemy nasz protokół, w tym produkcję rusztowań, izolację BM-MNC, siew przeszczepu i implantację.

Wysiew i implantacja biosyntetycznego przeszczepu tchawicy zmodyfikowanego tkankowo w modelu mysim

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie dynamicznej ko-hodowli ludzkich makrofagów i miofibroblastów w rurowych rusztowaniach elektroprzędzonych w celu zbadania regeneracji tkanek sterowanej materiałem, przy użyciu bioreaktora, który umożliwia oddzielenie naprężeń ścinających od cyklicznego rozciągania.

Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

Ten protokół opisuje metodę generowania powtarzalnych, małych tkanek płuc, poprzez ponowne zaludnienie decelularyzowanych, precyzyjnie wyciętych wycinków płuc komórkami nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2, fibroblastami i komórkami śródbłonka.

Zmodyfikowane tkanki płuc przygotowane z bezkomórkowych plastrów płuc

Obecny protokół opisuje ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki nabłonkowe typu 2 z pęcherzyków płucnych typu 2 (iAT2). Komórki te mogą być hodowane jako samoodnawiające się kulki w hodowli 3D lub przystosowane do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI).

Generowanie sfer 3D i kultur 2D granicy faz powietrze-ciecz indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Ostatnie postępy w protokołach różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pozwalają na stopniowe wyprowadzanie typów komórek specyficznych dla narządów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące utrzymania i ekspansji komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC oraz ich różnicowania w nabłonek śluzowo-rzęskowy w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz.

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Protokół ten określa generowanie organoidów z komórek nabłonka pęcherzykowego A549 oraz fibroblastów płuc MRC-5 na rusztowaniu hydrożelowym z macierzy zewnątrzkomórkowej, a następnie osadzenie w żelach kolagenowych 3D oraz ekspozycję na mechaniczne obciążenia za pomocą bioreaktora rozciągającego komórki do badania mechanobiologii pęcherzykowej.

Generowanie trójwymiarowych organoidów pęcherzykowych A549/MRC-5 z wykorzystaniem mechanicznego bioreaktora rozciągającego komórki

Poznaj bioreaktor z obrazowaniem do usuwania nabłonka z tchawicy szczura i dystrybucji komórek. Ta metoda umożliwia długoterminową hodowlę tkanek dróg oddechowych i ich regenerację.

Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

Przeglądaj więcej filmów