6 kwietnia 2022
Protokół opisuje bioreaktor z obsługą obrazowania, który pozwala na selektywne usuwanie endogennego nabłonka z tchawicy szczura i jednorodne rozmieszczenie komórek egzogennych na powierzchni światła, a następnie długoterminową hodowlę in vitro konstruktu komórka-tkanka.
Protokół ten umożliwia hodowlę in vitro i bezpośrednią wizualizację mikroskopową izolowanych tkanek dróg oddechowych podczas różnych procedur manipulacji tkankami, takich jak usuwanie nabłonka i regeneracja tkanek dróg oddechowych. Obrazowanie in situ zaproponowane w tym badaniu umożliwia szybkie i nieniszczące monitorowanie światła tchawicy podczas kontrolowanego obrazowania usuwania endogennego nabłonka i dostarczania komórek egzogennych. Platforma bioreaktywna sterowana obrazowaniem i protokoły manipulacji tkankami mogą być wykorzystywane do generowania bioinżynieryjnej tkanki dróg oddechowych do modelowania chorób i badań przesiewowych leków.
Budowę i zastosowanie bioreaktora tkankowego dróg oddechowych z funkcją obrazowania zademonstrują dwaj doktoranci z naszej grupy badawczej, Mohammad Mir i Jiawen Chen. Aby rozpocząć tworzenie urządzenia do obrazowania in situ, włóż soczewkę tubusu do tubusu obiektywu, który można układać jeden na drugim, i zabezpiecz go za pomocą pierścienia ustalającego. Następnie zamontuj zespół stołu obiektywu na naukowej kamerze CMOS za pomocą adaptera C-mount.
Użyj oprogramowania Micromanager do obsługi aparatu oraz pozyskiwania zdjęć i filmów. Celując w obiekt znajdujący się w odległości 10 metrów od kamery, dostosuj odległość między obiektywem tubusu a czujnikiem obrazowania aparatu, aż na ekranie komputera utworzy się ostry obraz obiektu. Następnie użyj elementów systemu klatki optycznej, takich jak pręt montażowy, gwintowana płyta klatki i sześcian klatki, aby zamontować soczewkę filtra na dwukrawędziowym, superrozdzielczym, dichroicznym lustrze i laserze do urządzenia.
Podłącz obiektyw 20X do urządzenia. Następnie zamontuj zieloną soczewkę o średnicy 500 mikrometrów na dystalnym końcu tubusu obiektywu za pomocą translatora X-Y. Dostosuj odległość między soczewkami zielonymi a soczewkami obiektywu, aby uzyskać zogniskowane obrazy mikroskopowe.
Aby uwidocznić izolowane światło tchawicy szczura w jasnym polu lub fluorescencyjnym, umieść bioreaktor na stoliku do obrazowania. Następnie wlej 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego estru sukcynimidylowego karboksyfluoresceiny lub roztworu CFSE z szybkością przepływu pięciu mililitrów na minutę przez tchawicę za pomocą pompy strzykawkowej podłączonej do rurki kaniuli tchawicy. Gdy roztwór CFSE wypełni tchawicę, zatrzymaj pompę.
Po 10 minutach przemyj światło tchawicy, podając 10 mililitrów PBS za pomocą pompy strzykawkowej w celu usunięcia pozostałości niewbudowanych odczynników CFSE. Po umyciu włóż dystalną końcówkę obrazowania zielonej soczewki do tchawicy za pomocą złącza luer przymocowanego do jednego końca tchawicy. Następnie delikatnie przesuń zieloną soczewkę wewnątrz tchawicy, aż powierzchnia tchawicy zostanie zogniskowana.
Aby uchwycić obrazy w jasnym polu w oprogramowaniu micromanager, należy oświetlić światło tchawicy białym światłem przez kostkę klatkową. Następnie kliknij ikonę Na żywo, aby wyświetlić powierzchnię światła tchawicy w czasie rzeczywistym. Użyj zakładek Ustawienia obrazowania i Ekspozycja, aby zmienić czas ekspozycji na żądaną wartość.
Aby dostosować kontrast i jasność obrazów, użyj okna histogramu i skalowania intensywności, aby przesunąć czarno-białe strzałki w punkcie końcowym interaktywnego ekranu histogramu. Kliknij Zatrzymaj na żywo, aby aktywować ikonę Snap, a następnie kliknij ikonę Snap, aby zamrozić obraz. Następnie użyj ustawienia Eksportuj, a następnie Obrazy jako przemieszczone karty, aby zapisać obrazy w żądanym formacie.
Aby uzyskać zdjęcia i filmy w trybie fluorescencyjnym, oświetl światło tchawicy światłem laserowym specyficznym dla CFSE przez sześcian klatki i uzyskaj obrazy w czasie rzeczywistym, przesuwając sondę obrazującą do przodu iz powrotem. Po uzyskaniu zdjęć i filmów delikatnie wyjmij zieloną soczewkę z tchawicy. W celu usunięcia nabłonka tchawicy należy wkroplić 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego 2% dodecylosiarczanu sodu przez kaniulę tchawicy, aby wytworzyć cienką warstwę roztworu detergentu na świetle tchawicy.
Po wkropleniu zamknij połączenia rurkowe bioreaktora za pomocą męskich lub żeńskich zatyczek typu luer i przenieś bioreaktor do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut, aby SDS mógł zamieszkać w tchawicy. Powtórz wkraplanie raz. Po drugim wkropleniu usunąć zlizowany nabłonek i SDS, trzykrotnie nawadniając światło tchawicy 500 mikrolitrami PBS za pomocą pompy strzykawkowej przy natężeniu przepływu 10 mililitrów na minutę.
Następnie umieść bioreaktor na wytrząsarce, aby mechanicznie wibrował z częstotliwością 20 Hz i amplitudą przemieszczenia 0,3 milimetra, aby fizycznie sprzyjać oderwaniu się komórek nabłonka traktowanych SDS od światła tchawicy. Podczas gdy tchawica jest wibrowana mechanicznie, wlej 500 mikrolitrów PBS dwukrotnie przez światło tchawicy, aby usunąć resztki SDS i resztki komórek. Po usunięciu nabłonka oceń klirens warstwy nabłonkowej, mierząc intensywność CFSE za pomocą urządzenia do obrazowania z zieloną soczewką.
Po przygotowaniu pozbawionej nabłonka tchawicy szczura, rozmrażaj zamrożone mezenchymalne komórki macierzyste lub MSC przez 30 sekund w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru, a następnie przygotuj roztwór komórek o stężeniu pięć razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Następnie oznacz komórki fluorescencyjnie, inkubując je z dwoma mililitrami 100-mikromolowego roztworu CFSE w temperaturze pokojowej.
Po 15 minutach przepłucz komórki pięcioma mililitrami PBS trzy razy przed ponownym zawieszeniem ich w świeżej pożywce hodowlanej DMEM o końcowym stężeniu trzy razy 10 do siedmiu komórek na mililitr. Bezpośrednio po przygotowaniu hydrożelu collagen I, zgodnie z opisem w manuskrypcie, dodaj komórki do roztworu hydrożelu o pożądanym stężeniu. Następnie wymieszaj komórki i roztwór żelu za pomocą mikropipety, aby uzyskać jednolitą mieszaninę komórkowo-hydrożelową.
Następnie podłącz jeden koniec tchawicy w bioreaktorze do programowalnej pompy strzykawkowej za pomocą złącza luer i wprowadź pięć mililitrów świeżej pożywki hodowlanej do komory bioreaktora w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby pokryć zewnętrzną powierzchnię tchawicy. Następnie podaj 10 mikrolitrów bolusa mieszaniny komórka-hydrożel do pozbawionej nabłonka tchawicy w bioreaktorze, aby wytworzyć warstwę komórkowo-hydrożelową na świetle tchawicy. Po wstrzyknięciu komórek umieść bioreaktor w sterylnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla do galelacji na 30 minut, aby umożliwić galalizację.
Aby zobrazować rozmieszczenie wszczepionych komórek, wysterylizuj zieloną soczewkę 70% alkoholem izopropylowym lub etanolem i umieść bioreaktor na stoliku do obrazowania, aby uzyskać zdjęcia i filmy zarówno w trybie jasnego pola, jak i fluorescencyjnym. Po 30 minutach wysiewu komórek wlej jeden mililitr pożywki hodowlanej do światła tchawicy z szybkością przepływu jednego mililitra na minutę. Na koniec hoduj tchawicę zasianą komórkami w bioreaktorze w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez żądany czas.
Podczas hodowli komórkowej pożywka powinna być utrzymywana w świetle statycznym, podczas gdy pożywka na zewnątrz tchawicy jest stale perfundowana przez jednokierunkowy przepływ. Na obrazach w jasnym polu i fluorescencyjnych pozbawionej nabłonka tchawicy nie zaobserwowano sygnału fluorescencyjnego przed znakowaniem CFSE. W przypadku CFSE zaobserwowano jednolity sygnał fluorescencyjny w całym nabłonku.
Po odfiltrowaniu nabłonka intensywność fluorescencji uległa znacznemu zmniejszeniu, co wskazuje na ablację nabłonka. Barwienie hematoksyliną i eozyną pozbawionej nabłonka tchawicy ilustrowało usunięcie pseudo-warstwowego nabłonka ze światła tchawicy oraz zachowanie komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej lub mikrostruktur ECM w leżących poniżej warstwach tkanki. Co więcej, barwienie pentachromem i trichromem potwierdziło utrzymanie architektury tkanki tchawicy i składników ECM, takich jak kolagen i proteoglikany.
Immunofluorescencja komórek nabłonka i kolagenu I wykazała całkowite usunięcie nabłonka i zachowanie kolagenu I w tkance podnabłonkowej. Skaningowe mikrofotografie elektronowe wykazały, że natywna tchawica była wypełniona komórkami wielorakimi i kubkowymi. W tchawicy pozbawionej nabłonka błona podstawna była odsłonięta, na co wskazuje sieć siatek włókien macierzy zewnątrzkomórkowej i brak komórek nabłonkowych.
Obrazy fluorescencyjne tchawicy pozbawionej nabłonka, po zasianiu PBS i kolagenu, są pokazane tutaj. W porównaniu z komórkami wysiewanymi za pomocą pożywki hodowlanej, znakowane fluorescencyjnie komórki dostarczone za pomocą hydrożelu pozostały bardziej równomiernie przylegające w całym świetle. Badanie żywotności komórek wykazało, że procedura dostarczania komórek nie miała wpływu na ich żywotność, a ponad 90% komórek pozostało zdolnych do życia.
Stworzenie cienkiej warstwy detergentu w procesie usuwania nabłonka i użycie hydrożelu jako nośnika dla komórek to niezbędne kroki dla powodzenia tego protokołu. Naszym kolejnym celem badawczym jest wszczepienie wyhodowanych w laboratorium komórek pierwotnych lub macierzystych dróg oddechowych do pozbawionej nabłonka tkanki dróg oddechowych, aby zbadać, czy można przygotować funkcjonalną tkankę dróg oddechowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Niniejszy protokół opisuje bioreaktor z możliwością obrazowania służący do selektywnego usuwania endogennego nabłonka z tchawki szczura, co ułatwia jednorodną dystrybucję egzogennych komórek na powierzchni światła. System ten umożliwia długoterminową hodowlę in vitro oraz bezpośrednią wizualizację mikroskopową tkanek dróg oddechowych podczas procedur manipulacyjnych.
Platformy bioreaktorowe z obrazowaniem umożliwiają precyzyjną manipulację i monitorowanie konstruktów tkanki dróg oddechowych, wspierając rozwój fizjologicznie istotnych modeli in vitro do badań nad chorobami układu oddechowego. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w przesiewaniu leków i modelowaniu chorób, zapewniając integralność tkanek i powtarzalność wyników. Integracja obrazowania w czasie rzeczywistym z procesami inżynierii tkankowej pozwala rozwiązać kluczowe problemy w początkowych etapach odkrywania leków i w procesach badań translacyjnych.
Ta metoda bioreaktora z obrazowaniem umożliwia połączenie wczesnych etapów odkryć, opracowywania testów oraz badań translacyjnych dzięki wprowadzeniu ilościowego monitorowania procesów inżynierii tkankowej dróg oddechowych w czasie rzeczywistym.