Wysoce zmultipleksowane obrazowanie tkanek za pomocą barwników Ramana

Obrazowanie wibracyjne o wysokiej multipleksie zapewnia jednorazowe podejście optyczne do badania wielu markerów białkowych w tkankach z rozdzielczością subkomórkową. Platforma ta zapewnia kompleksowy obraz interakcji białkowych w systemach biologicznych. Główną zaletą tej techniki jest jej bezcykliczna multipleksowość.

Technika ta jest szczególnie przydatna w zastosowaniach, w których strategie jazdy na rowerze nie działają dobrze, na przykład w grubych odcinkach tkanek. Metoda ta umożliwia charakterystykę poszczególnych komórek in situ w celu zrozumienia struktur złożonego systemu, takich jak budowanie atlasu tkanek, fenotypowanie mikrośrodowisk guza i profilowanie obwodu mózgu. Na początek przygotuj około 0,1 molowego wodorowęglanu sodu w buforze PBS o temperaturze PHA 0,3, który ma być użyty jako bufor koniugacyjny i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przygotować trzymilimolowy roztwór sondy MARS z funkcją n-hydroksysukcynimidu w bezwodnym dimetylosulfotlenku. Rozpuścić ciała stałe przeciwciał w buforze koniugacyjnym do stężenia dwóch miligramów na mililitr. W przypadku przeciwciał rozpuszczonych w innych należy je skoncentrować w filtrze odśrodkowym, a następnie dodać do buforu sprzężonego do stężenia od jednego do dwóch miligramów na mililitr.

Aby przeprowadzić reakcję koniugacji przeciwciał drugorzędowych, należy powoli dodawać 15-krotny molowy nadmiar roztworu barwnika do roztworu przeciwciał w szklanej fiolce, mieszając i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez godzinę. Aby przeprowadzić oczyszczanie, przygotuj zawiesinę, dodając 10 mililitrów żelowej żywicy filtracyjnej w proszku do 40 mililitrów buforu PBS w 50-mililitrowej probówce. Roztwór należy przechowywać w łaźni wodnej w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez godzinę.

Następnie zdekantować supernatant, dodać PBS do 40 mililitrów i przechowywać gnojowicę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wypełnij kolumnę wykluczającą rozmiar roztworem zawiesiny na wysokość od 10 do 15 centymetrów, a następnie przepłucz i umyj kolumnę około 10 mililitrami PBS, aby dalej zapakować żywicę. Następnie odpipetować mieszaninę z reakcji koniugacji do kolumny.

Po załadowaniu mieszaniny reakcyjnej natychmiast dodać jeden mililitr PBS jako bufor elucyjny. Następnie zbierz eluent sprzężonego roztworu, patrząc na kolor na kolumnie lub mierząc absorbancję przy 280 nanometrach. Za pomocą filtra odśrodkowego stęż zebrany roztwór do jednego do dwóch miligramów na mililitr.

Za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj granicę wokół odcinków tkanki na szkiełku. Następnie inkubować tkanki z 0,3 do 0,5% PBST przez 10 minut i buforem blokującym przez 30 minut. Aby przygotować pierwotny roztwór barwiący, dodaj wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe do 200 do 500 mikrolitrów buforu barwiącego w pożądanych stężeniach.

Odwirować pierwotny roztwór barwiący o temperaturze 13 000 razy G przez pięć minut i użyć supernatantu, jeśli pojawi się osad. Następnie inkubuj tkankę w pierwotnym roztworze przeciwciała w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni. Umyj szkiełka trzykrotnie 0,3 do 0,5% PBST przez pięć minut w temperaturze pokojowej w stojącym słoiku i upewnij się, że chusteczki są zanurzone w roztworze.

Później inkubuj tkankę w 200 do 500 mikrolitrach buforu blokującego przez 30 minut. Aby przygotować wtórny roztwór barwiący, dodaj wszystkie przeciwciała drugorzędowe do 200 do 500 mililitrów buforu barwiącego o pożądanych stężeniach. Następnie odwirować wtórny roztwór barwiący o temperaturze 13 000 razy G przez pięć minut i użyć supernatantu, jeśli pojawi się osad.

Następnie inkubuj tkanki w 200 do 500 mikrolitrach roztworu przeciwciał wtórnych w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie 0,3 do 0,5% PBST w temperaturze pokojowej przez pięć minut każde. Następnie inkubować z 200 do 500 mikrolitrami roztworu DAPI przez 30 minut.

Ponownie przemyć szkiełka trzykrotnie PBS w temperaturze pokojowej przez pięć minut każda i przenieść pływające skrawki tkanek do szkiełek za pomocą szklanej pipety. Rozprowadź chusteczkę za pomocą szczoteczki do chusteczek i w razie potrzeby wyczyść otoczenie chusteczkami. Następnie zamontuj chusteczkę w kropli odczynników zapobiegających blaknięciu za pomocą szklanego szkiełka nakrywkowego i zabezpiecz ją lakierem do paznokci.

Aby wykonać obrazowanie wielokanałowe-eprSRS, ustaw moc lasera wiązki pompy na 10 do 40 miliwatów, a wiązkę Stokesa na 40 do 80 miliwatów na panelu sterowania lasera. Następnie ustaw czas zatrzymania piksela na dwie do czterech mikrosekund i użyj wielu klatek, zwykle średnio od 10 do 20 klatek w oprogramowaniu mikroskopowym. Ponadto ustaw stałe czasowe wzmacniacza lock-in na połowę czasu przebywania pikseli.

Obrazowanie barwnikiem Ramana odrębnych markerów białkowych i komórek HeLa, kory mózgowej myszy utrwalonej paraformaldehydem i wilgotnej tkanki FFPE nerki przeprowadzono poprzez znakowanie immunologiczne. Obrazowanie immuno-eprSRS komórek HeLa z alfa-tubuliną ujawniło drobne struktury subkomórkowe, takie jak mikrotubule. Obrazowanie eprSRS astrocytów barwionych MARS 2145 i barwionych MARS 2228 neuronów ziarnistych móżdżku w tkance mózgowej myszy wykazało trójwymiarowe wzorce z rozdzielczością subkomórkową.

Przeprowadzono siedmiokolorowe obrazowanie tandemowe fluorescencji SRS hormonów i czynników transkrypcyjnych na zamrożonej tkance wysp trzustkowych myszy. Uzyskane obrazy wykazały dobry kontrast i prawidłowe wzorce. Przeprowadzono ośmiokolorowe, fluorescencyjne obrazowanie tandemowe SRS markerów typu komórki na tkankach móżdżku myszy utrwalonych paraformaldehydem.

Zidentyfikowano różne typy komórek, takie jak neurony ziarniste móżdżku, neurony Purkinjego, astrocyty, oligodendrocyty i neurony GABA-ergiczne. Procedura ta może być dalej połączona z oczyszczaniem tkanek w celu wykonania wysoce multipleksowanego obrazowania białek w grubych, nienaruszonych tkankach. Nasza grupa opracowała dla niego protokół oczyszczania tkanek dostosowany do barwnika Raman.