Name: Wysoce zmultipleksowane obrazowanie tkanek za pomocą barwników Ramana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj technikę epr-SRS do wysoce zmultipleksowanego obrazowania białek w tkankach z rozdzielczością subkomórkową. Metoda umożliwia analizę interakcji białkowych bez cyklicznego barwienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Ruth A. Singer i Richardowi K.P. Benningerowi za dostarczenie tkanek trzustki myszy. W.M. dziękuje za wsparcie ze strony NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) i US Army (W911NF-19-1-0214).

Protokół został przeprowadzony zgodnie z protokołem eksperymentalnym na zwierzętach (AC-AABD1552) zatwierdzonym przez Institutional Animal Care and Use Committee na Uniwersytecie Columbia.
1. Przygotowanie przeciwciał sprzężonych z barwnikiem Ramana
<ol>
	<li>Przygotować bufor koniugacyjny jako ~0,1 MNaHCO3 w buforze PBS, pH = 8,3, przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór sondy MARS (materiał uzupełniający) z funkcją N-hydroksysukcynimidy (NHS) z estrami w postaci 3 mM w bezwodnym DMSO. Synteza sond MARS może być odniesiona do wcześniejszych raportów13,17,18. 
	UWAGA: Do celów przechowywania roztwór estru barwnika NHS należy chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rozpuścić stałe przeciwciała w buforze koniugacyjnym do stężenia 2 mg/ml. W przypadku przeciwciał, które są rozpuszczone w innych, należy je wymienić na bufor koniugacyjny do stężenia 1-2 mg/ml z filtrami odśrodkowymi. 
	UWAGA: Wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciała drugorzędowe są preferowane do barwienia multipleksowego w celu zminimalizowania reaktywności międzygatunkowej. Zastosowane przeciwciała drugorzędowe są wymienione w Tabeli 1 i Tabeli Materiałów.</li>
	<li>Przeprowadź reakcję koniugacji.
	<ol>
		<li>W przypadku przeciwciał drugorzędowych dodać 15-krotny molowy nadmiar roztworu barwnika do roztworu przeciwciała w szklanej fiolce powoli, mieszając. Na przykład w 0,5 ml roztworu przeciwciał 2 mg/ml dodaj 35 μl 3 mM roztworu barwnika.</li>
		<li>Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze pokojowej (RT) mieszając przez 1 godzinę. Chronić reakcję przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>oczyszczanie.
	<ol>
		<li>Przygotować zawiesinę żelowej żywicy filtracyjnej (tabela materiałów) w buforze PBS, wykonując czynności 1.5.2-1.5.4.</li>
		<li>Dodaj 10 ml żelowej żywicy filtracyjnej w proszku do 40 ml buforu PBS w probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Roztwór należy przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 90 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Zdekantować supernatant i ponownie dodać PBS do 40 ml. Przechowywać gnojowicę w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Kolumnę wykluczającą wielkość (średnica 1 cm, kolumny grawitacyjnie) należy wypełnić roztworem gnojowicy na wysokość 10-15 cm.</li>
		<li>Przepłukać i umyć kolumnę ~10 ml buforu PBS, aby dalej zapakować żywicę.</li>
		<li>Odpipetować mieszaninę z reakcji koniugacji (~0,5 ml) do kolumny. Natychmiast dodać 1 ml buforu PBS jako bufor elucyjny, gdy cała mieszanina reakcyjna jest załadowana. Stale uzupełniać bufor elucyjny (PBS) do kolumny.</li>
		<li>Zebrać eluat roztworu sprzężonego, patrząc na kolor na kolumnie (barwniki MARS mają barwy od jasnozielonego do niebieskiego) lub mierząc absorbancję przy 280 nm (A280).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrany roztwór stężyć do 1-2 mg/ml z filtrem odśrodkowym.</li>
	<li>Określić stężenie i średni stopień znakowania (DOL, stosunek barwnika do białka), mierząc widmo widzialne w ultrafiolecie (UV-Vis) roztworu sprzężonego za pomocą czytnika płytek Nano. 
	UWAGA: Materiał uzupełniający zapewnia właściwości estrów NHS barwnika MARS do obliczeń. Prawidłowy DOL dla przeciwciała drugorzędowego wynosi około 3.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki tkanki
<ol>
	<li>Paraformaldehyd utrwala tkanki mózgowe myszy.
	<ol>
		<li>Znieczulenie myszy (C57BL/6J, samica, 25 dni po porodzie) izofluranem. Oceń prawidłowe znieczulenie za pomocą testu szczypania palców u stóp.</li>
		<li>Zabij myszy przez przemieszczenie szyjki macicy. Myszy należy natychmiast przeprowadzić transsercyjnie perfuzję z 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS.</li>
		<li>Zbierz mózg myszy, wykonując kroki 2.1.4-2.1.5</li>
		<li>Przeciąć w górę od pnia mózgu wzdłuż szwu strzałkowego. Oderwij dwie połówki czaszki na bok i zgarnij mózg pęsetą.</li>
		<li>Utrwalić pobrany mózg w 4% PFA w PBS w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Następnie przemyć mózg w buforze PBS w temperaturze 4 °C przez 24 godziny w celu usunięcia nadmiaru PFA.</li>
		<li>Umieścić stałą agarozę w wodzie do końcowego stężenia 7% (w/v) w zlewce z luźną pokrywką. Wymieszaj roztwór za pomocą szklanego pręta do mieszania. Podgrzej zawiesinę w kuchence mikrofalowej, aż roztwór będzie klarowny.</li>
		<li>Pozostawić agarozę do ostygnięcia do temperatury 45–55 °C.</li>
		<li>Wlej płynną agarozę do małej komory, a następnie przenieś mózg z PBS do płynnej agarozy i ustaw go za pomocą szpatułki, aby osadzić mózg. Poczekaj, aż blok tkankowo-agarozowy stwardnieje.</li>
		<li>Pokrój arozę tkankową na plastry koronalne o grubości 40 μm za pomocą wibratomu.</li>
		<li>Przenieś tkankę na płytkę 4-dołkową w celu następnego barwienia. Usuń agarozę pęsetą. Umyj chusteczkę trzykrotnie 1 ml PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naprawiono zamrożone tkanki trzustki myszy.
	<ol>
		<li>Utrwalić trzustkę myszy w 4% PFA w PBS w temperaturze 4 °C z kołysaniem przez 16-20 godzin.</li>
		<li>Przemyć próbkę w 1 ml PBS (4 °C) trzy razy w celu usunięcia PFA.</li>
		<li>Osadź próbkę (o wielkości ~0,3-0,5 cm) w blokach złożonych o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Wlej 2 krople OCT do plastikowej krioformy. Umieść tkankę we właściwej orientacji i wylej OCT na chusteczki, aż żadna z tkanek nie pozostanie odsłonięta.</li>
		<li>Pokrój trzustkę na plastry o grubości 8 μm i unieruchomij je na szkiełku podstawowym do wiązania tkanek, przechowuj w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Przed barwieniem należy zrównoważyć próbkę z RT. Umyj tkankę PBS, aby usunąć bloki OCT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki FFPE.
	<ol>
		<li>Piec szkiełko bibułkowe FFPE w temperaturze 60 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Deparafinizacja i ponowne nawodnienie: Umieścić próbki kolejno w następujących roztworach w probówce o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej przez 3 minuty za każdym razem, delikatnie wstrząsając: 
		Ksylen dwa razy, 
		etanol dwa razy, 
		95% (obj./obj.) etanol w wodzie dejonizowanej dwa razy, 
		70% (obj./obj.) etanol w wodzie dejonizowanej dwukrotnie, 
		50% (obj./obj.) etanol w wodzie dejonizowanej jednorazowo, 
		woda dejonizowana jednorazowo.</li>
		<li>Przenieść próbkę do 20 mM cytrynianu sodu (pH 8,0) w temperaturze 100 °C w szklanym słoiku. Upewnij się, że tkanki są zanurzone w roztworze.</li>
		<li>Umieść słoik w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C na 45 minut.</li>
		<li>Przemyć próbkę wodą dejonizowaną o temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Barwienie tkanek metodą immuno-eprSRS
<ol>
	<li>Użyj pisaka hydrofobowego, aby narysować granicę wokół odcinków tkanki na szkiełku. 
	UWAGA: Słoik do barwienia szkiełek służy do śledzenia etapów inkubacji tkanki na szkiełku. Pływające tkanki (skrawki mózgu myszy o grubości 40 μm) są barwione w płytkich studzienkowych.</li>
	<li>Inkubować tkanki z 0,3-0,5% PBST (Triton X-100 w PBS) przez 10 minut.</li>
	<li>Inkubować tkanki z buforem blokującym (5% surowicy osła, 0,5% Triton X-100 w PBS) przez 30 minut.</li>
	<li>Przygotować pierwotny roztwór barwiący: dodać wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe do 200-500 μl buforu barwiącego (2% surowicy osła, 0,5% Triton X-100 w PBS) w żądanych stężeniach. Odwirować pierwotny roztwór barwiący o stężeniu 13 000 x g przez 5 minut. Stosować supernatant tylko wtedy, gdy wytrąca się osad.</li>
	<li>Inkubować tkankę w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni. 
	UWAGA: W przypadku barwienia skrawków tkanki na szkiełku należy umieścić próbkę w pudełku do barwienia z wilgotną chusteczką, aby utrzymać wilgotność.</li>
	<li>Umyj szkiełka trzykrotnie 0,3-0,5% PBST w temperaturze pokojowej przez 5 minut każde. Użyj 1 ml PBST do tkanek pływających. W przypadku chusteczek znajdujących się na szkiełku należy je umyć w słoiku do barwienia szkiełek i upewnić się, że wszystkie chusteczki są zanurzone w roztworze.</li>
	<li>Inkubować tkankę w 200-500 μl buforu blokującego przez 30 minut.</li>
	<li>Przygotować wtórny roztwór barwiący: dodać wszystkie przeciwciała drugorzędowe (i lektyny, jeśli są wymagane) do 200-500 μl buforu barwiącego o pożądanych stężeniach (zwykle 10 μg/ml). Odwirować wtórny roztwór barwiący o stężeniu 13 000 x g przez 5 minut. Stosować supernatant tylko wtedy, gdy wytrąca się osad.</li>
	<li>Inkubować tkanki w 200-500 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni.</li>
	<li>Umyj szkiełka dwukrotnie 0,3-0,5% PBST w temperaturze pokojowej przez 5 minut każde.</li>
	<li>Inkubować z 200-500 μl roztworu DAPI przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj szkiełka trzy razy za pomocą PBS w temperaturze RT przez 5 minut każde.</li>
	<li>W przypadku pływających skrawków tkanek przenieś je na szkiełka podstawowe za pomocą szklanej pipety. Rozprowadź chusteczkę za pomocą szczoteczki do chusteczek i w razie potrzeby wyczyść otoczenie chusteczkami.</li>
	<li>Zamontuj chusteczkę w kropli odczynników zapobiegających blaknięciu za pomocą szklanego szkiełka nakrywkowego i zabezpiecz ją lakierem do paznokci.</li>
</ol>
4. Zespół mikroskopu SRS
UWAGA: Komercyjny system fluorescencji konfokalnej jest używany w tandemowym obrazowaniu fluorescencji SRS. Więcej opisów można znaleźć w poprzednim raporcie17. Protokół ten skupi się na stronie obrazowania SRS przy użyciu wzbudzenia wąskopasmowego.
<ol>
	<li>Przygotuj izolowany wibracją stół optyczny w pomieszczeniu z regulacją temperatury.</li>
	<li>Umieść zsynchronizowany system podwójnego lasera (pompa i Stokes) na stole optycznym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A) z podłączonym agregatem chłodniczym. 
	UWAGA: Podstawowy laser w systemie podwójnego lasera zapewnia wyjściowy ciąg impulsów o długości fali 1064 nm z szerokością impulsu 6 ps i częstotliwością powtarzania 80 MHz. Wiązka Stokesa pochodzi z lasera podstawowego. Natężenie wiązki Stokesa było modulowane sinusoidalnie przez wbudowany elektrooptyczny modulator amplitudy (EOM) na częstotliwości 8 MHz z głębokością modulacji powyżej 90%. Druga część lasera podstawowego jest podwojona pod względem częstotliwości do 532 nm, która jest dalej wykorzystywana do synchronicznego inicjowania pikosekundowego optycznego oscylatora parametrycznego (OPO) w celu wytworzenia ciągu impulsów z blokadą modów o szerokości impulsu 5-6 ps (wiązka luźna OPO jest zablokowana filtrem interferometrycznym). Długość fali wyjściowej OPO jest przestrajana w zakresie 720-950 nm, która służy jako wiązka pompy.</li>
	<li>Zamontuj zwierciadła (zakres długości fal: 750-1100 nm), dichroiczne rozdzielacze wiązki (DBS, filtr długoprzepustowy 980 nm, prostokątny) i soczewkę (achromatyczną, powłokę AR dla 650-1050 nm) do odpowiednich mocowań. Używaj bardzo stabilnych mocowań luster kinematycznych do luster i dichroicznych rozdzielaczy wiązki.</li>
	<li>Zmierz wysokość wyjścia lasera i rozmiary wiązki pompy i wiązek Stokesa. Dostosuj wysokość luster i soczewek, aby światło padało na środek wszystkich elementów optycznych.</li>
	<li>Umieść lustro M1 na stole optycznym i ustaw je pod kątem ~45° do wyjścia lasera (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Użyj pokręteł na uchwycie kinematycznym do regulacji przechyłu i nachylenia. Upewnij się, że światło dociera na tę samą wysokość wzdłuż stołu i w linii prostej w stosunku do stołu.</li>
	<li>Umieść i wyrównaj rozdzielacze wiązki dichroicznej (filtry długoprzepustowe 980 nm) i lustra, aby rozdzielić pompę i belki Stokesa (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2A-B).</li>
	<li>Umieść i wyrównaj pary soczewek (L1, L2 i L3, L4) na każdej ze ścieżek wiązki, aby skolimować wiązki i rozszerzyć średnice wiązki, aby dopasować je do tylnej źrenicy obiektywu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A-B).</li>
	<li>Użyj luster M7 i M8, aby wyrównać połączone wiązki laserowe w mikroskopie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Najpierw ustaw jedną wiązkę w mikroskopie i użyj par luster na drugiej wiązce, aby zapewnić przestrzenne zachodzenie na siebie dwóch wiązek.</li>
	<li>Skonfiguruj część wykrywania.
	<ol>
		<li>Załóż skraplacz oleju pokryty powłoką podczerwieni (1.4-NA), aby zebrać pompę skierowaną do przodu i wiązki Stokesa po przejściu przez próbki (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2C).</li>
		<li>Zamontuj wielkopowierzchniową fotodiodę Si na ekranowanej obudowie ze złączami BNC (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E). Dodaj zasilacz 64 V DC do zamontowanej fotodiody, aby zwiększyć jej próg nasycenia i pasmo odpowiedzi.</li>
		<li>Odbijaj światło skierowane do przodu za pomocą 2-calowego lustra. Ponownie skoncentruj światło na fotodiodzie za filtrem optycznym, aby zablokować modulującą wiązkę Stokesa (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
		<li>Wyślij prąd wyjściowy fotodiody do szybkiego wzmacniacza typu lock-in zakończonego liczbą 50 w celu demodulacji sygnału. Wyślij wyzwalacz 8 MHz do wzmacniacza lock-in jako sygnał odniesienia.</li>
		<li>Wyślij w fazie składową X wzmacniacza lock-in do skrzynki interfejsu analogowego mikroskopu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zoptymalizuj nakładanie się czasowe z wbudowanym zmotoryzowanym stopniem opóźniającym, mierząc sygnał SRS czystej cieczy D2O pod mikroskopem.</li>
</ol>
5. Akwizycja i analiza obrazu
<ol>
	<li>Wykonywanie wielokanałowego obrazowania epr-SRS z sekwencyjnym dostrajaniem długości fali pompy.
	<ol>
		<li>Ustaw moc lasera na pompę P = 10-40 mW i PStokes = 40-80 mW na panelu sterowania lasera.</li>
		<li>Ustaw czas zatrzymania pikseli na 2-4 μs i używaj wielu klatek, zwykle średnio 10-20 klatek w oprogramowaniu mikroskopowym. 
		UWAGA: Należy unikać kombinatorycznego stosowania wysokiej mocy lasera (pompa P> 40 mW, PStokes> 80 mW) i małego rozmiaru piksela (<0,2 μm), które prawdopodobnie powodują "efekt wybielania" barwników Ramana z powodu wzbudzenia wielofotonowego.</li>
		<li>Ustaw stałe czasowe wzmacniacza uzależnionego od urządzenia na połowę czasu przebywania pikseli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liniowe mieszanie spektralne. 
	UWAGA: epr-SRS jest zgodny ze ścisłą liniową zależnością sygnału do stężenia w całym zakresie stężeń; W związku z tym liniowe rozmieszanie widmowe jest skuteczne w usuwaniu wszelkich potencjalnych przesłuchów między kanałami. W przypadku N-kanałowego pomiaru epr-SRS za pomocą sond N MARS, mierzone sygnały (S) mogą być wyrażone jako S = MC, gdzie C to stężenia sondy MARS, a M to matryca N x N wyznaczona przez przekroje ramanowskie sond MARS.
	<ol>
		<li>Zmierz matrycę M na jednokolorowych próbkach immuno-eprSRS znakowanych różnymi sondami MARS.</li>
		<li>Użyj równania C = M−1·S, aby wyznaczyć matrycę stężeń sondy MARS z pomiarem sygnału próbki multipleksowej S.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Goltsev, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+profiling+of+mouse+splenic+architecture+with+CODEX+multiplexed+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging.</a> Cell. 174 (4), 968-981 (2018).</li>
<li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Society+for+Immunotherapy+of+Cancer+statement+on+best+practices+for+multiplex+immunohistochemistry+%28IHC%29+and+immunofluorescence+%28IF%29+staining+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155(2020).</li>
<li>Lewis, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics+and+multiplexed+imaging+to+explore+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology.</a> Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).</li>
<li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+epitope-based+tissue+imaging+for+discovery+and+healthcare+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications.</a> Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).</li>
<li>Hickey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+protein+composition+and+tissue+organization%3A+a+primer+for+multiplexed+antibody-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging.</a> Nature Methods. , (2021).</li>
<li>Lin, J. -R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+immunofluorescence+imaging+of+human+tissues+and+tumors+using+t-CyCIF+and+conventional+optical+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes.</a> eLife. 7, 31657(2018).</li>
<li>Black, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CODEX+multiplexed+tissue+imaging+with+DNA-conjugated+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies.</a> Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).</li>
<li>Giesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+imaging+of+tumor+tissues+with+subcellular+resolution+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry.</a> Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).</li>
<li>Keren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIBI-TOF%3A+A+multiplexed+imaging+platform+relates+cellular+phenotypes+and+tissue+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure.</a> Science Advances. 5 (10), 5851(2019).</li>
<li>Gerdes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+single-cell+analysis+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982(2013).</li>
<li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+A+versatile+multiplex+optical+imaging+approach+for+deep+phenotyping+and+spatial+analysis+of+cells+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455(2020).</li>
<li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-multiplex+vibrational+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Super-multiplex vibrational imaging.</a> Nature. 544, 465(2017).</li>
<li>Wei, L., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+preresonance+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+resonant+stimulated+Raman+scattering+micro-spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).</li>
<li>Fujioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+activatable+Raman+probes+for+simultaneous+detection+of+plural+enzyme+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly-multiplexed+volumetric+mapping+with+Raman+dye+imaging+and+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing.</a> Nature Biotechnology. , (2021).</li>
<li>Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((9-Cyanopyronin+probe+palette+for+super-multiplexed+vibrational+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging.</a> Nature Communications. 12 (1), 4518(2021).</li>
<li>Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probe+design+for+super-multiplexed+vibrational+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Probe design for super-multiplexed vibrational imaging.</a> Physical Biology. 16 (4), 041003(2019).</li>
<li>Qian, N., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-multiplexed+vibrational+probes%3A+Being+colorful+makes+a+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115(2022).</li>
<li>Klimas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+biomolecules+using+molecule+anchorable+gel-enabled+nanoscale+in-situ+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Portfolio%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy.</a> Nature Portfolio. , (2021).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+vibrational+imaging+using+expansion+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+understanding+of+%CE%B2-cell+heterogeneity+and+in+situ+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">New understanding of β-cell heterogeneity and in situ islet function.</a> Diabetes. 67 (4), 537(2018).</li>
<li>Hu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supermultiplexed+optical+imaging+and+barcoding+with+engineered+polyynes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes.</a> Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).</li>
<li>Hu, F., Shi, L., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+of+chemical+bonds+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).</li>
<li>Coherent Raman Scattering Microscope. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/">https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/</a> (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy protokół immuno-eprSRS, który ma szerokie zastosowanie do typowych typów tkanek, w tym świeżo zakonserwowanych tkanek myszy, tkanek ludzkich FFPE i zamrożonych tkanek myszy. Immuno-eprSRS został zwalidowany dla panelu epitopów w komórkach i tkankach, jak wymieniono w Tabeli 1. Ta jednorazowa platforma jest szczególnie przydatna w zastosowaniach, w których strategie cykliczne nie działają dobrze. Na przykład fluorescencja cykliczna jest wymagająca dla grubych tkanek<sup class='...

Złożone systemy tkankowe składają się z odrębnych subpopulacji komórkowych, których lokalizacje przestrzenne i sieci interakcji są głęboko powiązane z ich funkcjami i dysfunkcjami1,2. Aby odkryć architekturę tkankową i zbadać jej złożoność, niezbędna jest wiedza na temat lokalizacji przestrzennej białek w rozdzielczości pojedynczej komórki. W związku z tym wysoce multipleksowane technologie obrazowania białek są coraz bardziej doceniane i mogą stać się kamieniem węgielnym w badaniach biologii tkanki3,4,5. Obecnie popularne metody obrazowania białek multipleksowanych można podzielić na dwie główne kategorie. Jednym z nich jest seryjne obrazowanie immunofluorescencyjne polegające na wielu rundach barwienia i obrazowania tkanek, a drugim jest obrazowanie cytometrii masowej sprzężonej z przeciwciałami oznaczonymi metalami ciężkimi6,7,8,9,10,11,12.
Tutaj wprowadzana jest alternatywna strategia obrazowania białek opartych na multipleksowanych przeciwciałach. W przeciwieństwie do powszechnej metody obrazowania fluorescencyjnego, która może wizualizować tylko 4-5 kanałów jednocześnie ze względu na szerokie widma wzbudzenia i emisji (pełna szerokość przy połowie maksimum (FWHM) ~500 cm-1), mikroskopia Ramana wykazuje znacznie węższą szerokość linii widmowej (FWHM ~10 cm-1), a zatem zapewnia skalowalną multipleksowość. Niedawno, dzięki wykorzystaniu wąskiego spektrum, opracowano nowatorski schemat mikroskopii Ramanowskiej o nazwie mikroskopia rozpraszania Ramana stymulowanego elektronicznym rezonansem (epr-SRS), zapewniając potężną strategię obrazowania multipleksowego13. Badając elektronicznie sprzężone tryby drgań barwników Ramana, epr-SRS osiąga drastyczny efekt 10-krotnego zwiększenia przekrojów ramanowskich i pokonuje wąskie gardło czułości konwencjonalnej mikroskopii Ramanowskiej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)13,14,15. W rezultacie, granica wykrywalności epr-SRS została przesunięta do sub-μM, co umożliwia ramanowską detekcję interesujących markerów molekularnych, takich jak specyficzne białka i organelle wewnątrz komórek13,16. W szczególności, wykorzystując przeciwciała sprzężone z barwnikiem Ramana, obrazowanie epr-SRS specyficznych białek w komórkach i tkankach (zwane immuno-eprSRS) wykazano z porównywalną czułością do standardowej immunofluorescencji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B) 13,17. Dostrajając długość fali pompy tylko o 2 nm, sygnał epr-SRS będzie całkowicie wyłączony (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B), co pokazuje wysoki kontrast drgań.
Po stronie sondy, do koniugacji przeciwciał opracowano zestaw tęczowych sond Ramanowskich zwanych barwnikami rozpraszania Ramana na Manhattanie (MARS) do koniugacji przeciwciał13,18,19,20. Ta unikalna paleta Ramana składa się z nowych barwników zawierających π sprzężone wiązania potrójne (materiał uzupełniający), z których każdy wykazuje pojedynczy i wąski pik epr-SRS w bioortogonalnym zakresie widma Ramana (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C). Modyfikując strukturę chromoforu rdzenia i izotopowo edytując oba atomy wiązania potrójnego (materiał uzupełniający), opracowano spektralnie rozdzielone sondy Ramana. Wykorzystując skalowalną multipleksowość, mikroskopia epr-SRS w połączeniu z paletą barwników MARS oferuje optyczną strategię jednorazowego obrazowania białek multipleksowych w komórkach i tkankach.
Immuno-eprSRS stanowi alternatywną strategię dla obecnych metod obrazowania białek multipleksowych o unikalnych mocnych stronach. W porównaniu z podejściami fluorescencyjnymi z cyklicznym barwieniem, obrazowaniem i usuwaniem sygnału, ta platforma oparta na Ramanie zapewnia barwienie i obrazowanie w jednej rundzie. W związku z tym omija praktyczną złożoność procedur cyklicznych i znacznie upraszcza protokół, otwierając w ten sposób nowe terytoria multipleksowanego obrazowania białek. Na przykład, wykorzystując protokół oczyszczania tkanek dostosowany do barwnika Raman, immuno-eprSRS został rozszerzony do trzech wymiarów w celu wysoce multipleksowanego mapowania białek w grubych, nienaruszonych tkankach17. Zwizualizowano ponad 10 celów białkowych wzdłuż tkanki mózgowej myszy o grubości milimetra17. Niedawno, łącząc immuno-eprSRS ze zoptymalizowanym protokołem mikroskopii ekspansji retencji biomolekuł (ExM)21, zademonstrowano również jednostrzałowe obrazowanie wielu celów w nanoskali22. W porównaniu do obrazowania spektroskopii mas4,9, epr-SRS jest nieniszczący i ma naturalną zdolność do cięcia optycznego. Co więcej, epr-SRS jest bardziej efektywny czasowo w skanowaniu tkanek. Zazwyczaj obszar tkanki o wielkości 0,25mm2 i rozmiarze piksela 0,5 μm potrzebuje zaledwie kilku minut, aby zobrazować pojedynczy kanał epr-SRS. Na przykład całkowity czas obrazowania czterech kanałów SRS plus czterech kanałów fluorescencyjnych w Rysunek 4 wynosi około 10 minut.

<table><tbody><tr><td>16% paraformaldehyd,</td><td>mikroskopia elektronowa</td> klasy EM Nauki <td>15710</td><td></td></tr><tr><td>&alfa-tubulina</td><td>Abcam</td><td>ab18251</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>&alfa;-tubulina</td><td>BioLegend</td><td>625902</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>&beta;-III-tubulina</td><td>BioLegend</td><td>657402</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>&beta;-III-tubulina</td><td>Abcam</td><td>ab41489</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr> <tr><td>i beta;-tubulina</td><td>Abcam</td><td>ab131205</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Agaroza, niska temperatura gellingu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414</td><td>Do osadzania w mózgu</td></tr><tr><td>przeciwciała anty-a-tubuliny wytwarzane w króliku (&alfa;-tubulina)</td><td>Abcam</td><td>ab52866</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-kalbindynowe wytwarzane u myszy (Calbindin)</td><td>Abcam</td><td>ab82812</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-GABA B receptor R2&nbsp; wytwarzane u świnki morskiej (receptor GABA B R2)</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td> <td>Millipore Sigma</td><td>AB2255</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-GFAP wytwarzane u kóz (GFAP)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-18598</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-glukagon&nbsp; wytwarzane u myszy (Glukagon)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-514592</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciała antyinsulinowe wytwarzane u świnki morskiej (insulina)</td> <td>DAKO</td><td>IR00261-2</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-MBP wytwarzane u szczurów (MBP)</td> <td>Abcam</td><td>ab7349</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-NeuN wytwarzane u królika (NeuN)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>PA5-78639</td><td>Przeciwciała</td></tr> <tr><td>pierwszorzędowePrzeciwciało anty-Polipeptydowe trzustki (PP) wytwarzane u kóz- Polipeptyd trzustkowy (PP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SAB2500747</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Pdx1 wytwarzane u królika (Pdx1)</td><td>Milipore</td><td>06-1379</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-somatostatyny wytwarzane u szczura (Somatostatyna)</td><td>Abcam</td><td>ab30788</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-wimentynowe wytwarzane u kurczaka ( Vimentin)</td><td>Abcam</td><td>ab24525</td><td>Przeciwciała pierwotne</td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>KR Electronics</td><td>KR2724</td><td>8 MHz</td></tr><tr><td>BNC 50 Ohm</td><td>Terminator Mini obwody</td> <td>BNC STRM-50</td><td></td></tr><tr><td>koncentryczny</td><td>Thorlabs</td><td>2249-C</td><td>, BNC męski / męski</td></tr><tr><td>Szerokopasmowe lustro dielektryczne</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E03</td><td>750 - 1100 nm</td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka skraplacz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Olympus zanurzenie w oleju, 1.4 N.A.<tr><td>Cytokeratyna 18</td><td>Abcam</td><td>ab7797</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Cytokeratyna 18</td><td>Abcam</td><td>ab24561</td><td>Przeciwciała pierwotne</td></tr><tr><td>Zasilacz prądu stałego</td><td>TopWard</td><td>6302D</td><td>Napięcie polaryzacji: 64 V</td></tr><tr><td>Montaż dichroiczny</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td><td>Mocowanie kinematyczne do 1,3" (33 mm) wysokości Prostokątna optyka, leworęczny</td></tr><tr><td>osioł anty-Chicken IgY (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-005-155</td><td>Przeciwciała drugorzędowe w koniugacji MARS</td></tr><tr><td>Osioł anty-kozi IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-005-147</td><td>Przeciwciała drugorzędowe w koniugacji MARS Przeciwciała</td></tr><tr><td>anty-gwinejskie IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-005-148</td><td>Przeciwciała drugorzędowe w koniugacji MARS</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-mysie IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-005-151</td><td>Przeciwciała drugorzędowe w koniugacji MARS</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-królicze IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-005-152</td><td>Przeciwciała drugorzędowe w koniugacji MARS</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-szczurze IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-005-153</td><td>Przeciwciała drugorzędowe w koniugacji MARS</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-owcze IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>713-005-147</td><td>Wtórne przeciwciała do koniugacji MARS</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>Abcam</td><td>ab71916</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>443611</td><td></td></tr><tr><td>Szybki wzmacniacz look-in</td><td>Zurich Instruments</td><td>HF2LI</td><td>DC - 50 MHz</td></tr><tr><td>FFPE Próbka nerki</td><td>USBiomax</td><td>HuFPT072</td><td></td></tr><tr><td>Fibrillarin</td><td>Abcam</td><td>ab5821</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Giantin</td><td>Abcam</td><td>ab24586</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Glukagon</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-514592</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>H2B</td><td>Abcam</td><td>ab1790</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowoprzepustowy o wysokiej średnicy zewnętrznej</td><td>Chroma Technologia</td><td>ET890/220m</td><td>Filtruj wiązkę Stokesa i przesyłaj wiązkę pompy</td></tr><tr><td>Długopis hydrofobowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1384846</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>ThermoFisher</td><td>701265</td><td>Przeciwciała pierwotne</td></tr><tr><td>Zintegrowany system laserowy SRS</td><td>Fizyka stosowana i Elektronika, Inc.</td><td>picoEMERALD</td><td>picoEMERALD zapewnia wyjściowy ciąg impulsów o długości fali 1,064 nm z szerokością impulsu 6 ps i częstotliwością powtarzania 80 MHz, który służy jako wiązka Stokesa. Wiązka o podwójnej częstotliwości przy 532 nm jest używana do synchronicznego inicjowania pikosekundowego optycznego oscylatora parametrycznego (OPO) w celu wytworzenia ciągu impulsów z blokadą modów o szerokości impulsu pięć ~ 6 ps (wiązka luźna OPO jest zablokowana filtrem interferometrycznym). Długość fali wyjściowej OPO jest przestrajana od 720&ndash; 950 nm, który służy jako belka pompy. Intensywność wiązki Stokesa 1,064 nm jest modulowana sinusoidalnie przez wbudowany EOM na częstotliwości 8 MHz z głębokością modulacji ponad 90%. Belka pompy nakłada się przestrzennie na belkę Stokesa za pomocą dichroicznego lustra wewnątrz pikoEMERALD. Czasowe nakładanie się między pompą a ciągami impulsów Stokesa jest osiągane dzięki wbudowanemu stopniowi opóźniającemu i optymalizowane przez sygnał SRS czystego D2O pod mikroskopem.</td></tr><tr><td>Odwrócony laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>Kinematyczny montaż lustrzany</td><td>Thorlabs</td><td>POLARIS-K1-2AH</td><td>2 Niskoprofilowe regulatory sześciokątne</td></tr><tr><td>Lektyna z Triticum vulgaris (pszenica)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L0636-5 mg</td><td></td></tr><tr><td>Długoprzepustowy dichroiczny rozdzielacz wiązki</td><td>Semrock</td><td>Di02-R980-25x36</td><td>980 nm laser BrightLine&nbsp; jednoostrzowy, laserowo-płaski dichroiczny rozdzielacz wiązki</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>BioLegend</td><td>801810</td><td>Przeciwciała pierwotne</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego</td><td>Olympus</td><td>FluoView</td><td></td></tr><tr><td>NanoQuant Plate</td><td>Tecan</td><td></td><td>Do analiz małych objętości opartych na absorbancji w czytniku płytek.</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik NucBlue Fixed Cell ReadyProbes (DAPI)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 4-dołkowe naczynia</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-300</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka obiektywowa</td><td>Olympus</td><td>XLPlan N</td><td>x25, 1.05-NA, MP, odległość robocza&thinsp;=&thinsp; 2 i cienkie; mm</td></tr><tr><td>Pędzel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>malarski Zespół peryskopowy</td><td>Thorlabs</td><td>RS99</td><td>zawiera górną i dolną jednostkę, oraz Oslash; Słupek 1" i widelec mocujący.</td></tr><tr><td>pH-metr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Tecan</td><td>Infinite 200 PRO</td><td>Łatwy w obsłudze wielomodowy czytnik płytek. Możliwości pomiaru absorbancji w zakresie spektralnym 230&ndash; 1000 nm.</td></tr><tr><td>Odczynnik przeciwblaknięcia ProLong Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>PSD95</td><td>Invitrogen</td><td>51-6900</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Sephadex G-25 Medium</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0033-01</td><td>żelowa żywica filtracyjna do odsalania i wymiany buforu Skrzynka</td></tr><tr><td>ekranowana ze złączami BNC</td><td>Pomona Electronics</td><td>2902</td><td>Aluminiowa skrzynka z pokrywą, BNC żeńska/żeńska</td></tr><tr><td>Si fotodioda</td><td>Thorlabs</td><td>FDS1010</td><td>350&ndash; 1100 nm, 10 mm x 10 mm Obszar aktywny</td></tr><tr><td>Synapsin 2</td><td>ThermoFisher</td><td>OSS00073G</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Ścieżka tkankowa Szkiełka Superfrost Plus Gold Fisher</td><td>Scientific</td><td>22-035813</td><td>Szkiełko adhezyjne do przyciągania i chemicznego wiązania świeżych lub utrwalonych formaliną skrawków tkanek z powierzchnią szkiełka (szkiełka wiążące tiisue)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Abcam</td><td>ab8069</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Ksyleny</td><td>Sigma</td><td>Aldrich 214736</td><td></td></tr></tbody></table>

wysoce zmultipleksowane obrazowanie tkanek za pomocą barwników ramana

Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes

Wizualizacja szerokiego zakresu specyficznych biomarkerów w tkankach odgrywa istotną rolę w badaniu skomplikowanych organizacji złożonych systemów biologicznych. W związku z tym coraz bardziej doceniane są technologie obrazowania o wysokiej multipleksacji. W tym miejscu opisujemy wyłaniającą się platformę wysoce multipleksowanego obrazowania wibracyjnego specyficznych białek o porównywalnej czułości do standardowej immunofluorescencji za pomocą elektronicznego obrazowania rozpraszania Ramana stymulowanego przed rezonansem (epr-SRS) tęczowych barwników Ramana. Metoda ta omija limit kanałów rozwiązywalnych spektralnie w konwencjonalnej immunofluorescencji i zapewnia jednorazowe podejście optyczne do badania wielu markerów w tkankach o rozdzielczości subkomórkowej. Jest ogólnie kompatybilny ze standardowymi preparatami tkankowymi, w tym tkankami utrwalonymi paraformaldehydem, tkankami zamrożonymi i tkankami ludzkimi zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie. Przewidujemy, że platforma ta zapewni bardziej kompleksowy obraz interakcji białkowych w próbkach biologicznych, szczególnie w przypadku grubych, nienaruszonych tkanek. Protokół ten zapewnia przepływ pracy od przygotowania przeciwciał do barwienia próbki tkanki, do montażu mikroskopu SRS i obrazowania tkanek epr-SRS.

Rycina 3 przedstawia przykładowe obrazy epr-SRS w różnych próbkach, w tym w utrwalonych komórkach (Rycina 3A), tkankach mysich utrwalonych w paraformaldehydzie (PFA) (Rycina 3B) oraz ludzkich preparatach utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) (Rycina 3C). Rozdzielczość przestrzenna mikroskopii SRS jest ograniczona dyfrakcyjnie; typowa rozdzielczość boczna wynosi ~300 nm, a rozdzielczo...

Elektroniczne obrazowanie rozpraszania Ramana stymulowanego przed rezonansem (epr-SRS) tęczowych barwników Ramana to nowa platforma do wysoce multipleksowanego obrazowania białek opartych na epitopach. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny przewodnik obejmujący przygotowanie przeciwciał, barwienie próbki tkanki, montaż mikroskopu SRS i obrazowanie tkanek epr-SRS.

Wysoce zmultipleksowane obrazowanie tkanek za pomocą barwników Ramana

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. ...

Obrazowanie wibracyjne o wysokiej multipleksie zapewnia jednorazowe podejście optyczne do badania wielu markerów białkowych w tkankach z rozdzielczością subkomórkową. Platforma ta zapewnia kompleksowy obraz interakcji białkowych w systemach biologicznych. Główną zaletą tej techniki jest jej bezcykliczna multipleksowość.Technika ta jest szczególnie przydatna w zastosowaniach, w których strategie jazdy na rowerze nie działają dobrze, na przykład w grubych odcinkach tkanek. Metoda ta umożliwia charakterystykę poszczególnych komórek in situ w celu zrozumienia struktur złożonego systemu, takich jak budowanie atlasu tkanek, fenotypowanie mikrośrodowisk guza i profilowanie obwodu mózgu. Na początek przygotuj około 0,1 molowego wodorowęglanu sodu w buforze PBS o temperaturze PHA 0,3, który ma być użyty jako bufor koniugacyjny i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie przygotować trzymilimolowy roztwór sondy MARS z funkcją n-hydroksysukcynimidu w bezwodnym dimetylosulfotlenku. Rozpuścić ciała stałe przeciwciał w buforze koniugacyjnym do stężenia dwóch miligramów na mililitr. W przypadku przeciwciał rozpuszczonych w innych należy je skoncentrować w filtrze odśrodkowym, a następnie dodać do buforu sprzężonego do stężenia od jednego do dwóch miligramów na mililitr.Aby przeprowadzić reakcję koniugacji przeciwciał drugorzędowych, należy powoli dodawać 15-krotny molowy nadmiar roztworu barwnika do roztworu przeciwciał w szklanej fiolce, mieszając i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez godzinę. Aby przeprowadzić oczyszczanie, przygotuj zawiesinę, dodając 10 mililitrów żelowej żywicy filtracyjnej w proszku do 40 mililitrów buforu PBS w 50-mililitrowej probówce. Roztwór należy przechowywać w łaźni wodnej w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez godzinę.Następnie zdekantować supernatant, dodać PBS do 40 mililitrów i przechowywać gnojowicę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wypełnij kolumnę wykluczającą rozmiar roztworem zawiesiny na wysokość od 10 do 15 centymetrów, a następnie przepłucz i umyj kolumnę około 10 mililitrami PBS, aby dalej zapakować żywicę. Następnie odpipetować mieszaninę z reakcji koniugacji do kolumny.Po załadowaniu mieszaniny reakcyjnej natychmiast dodać jeden mililitr PBS jako bufor elucyjny. Następnie zbierz eluent sprzężonego roztworu, patrząc na kolor na kolumnie lub mierząc absorbancję przy 280 nanometrach. Za pomocą filtra odśrodkowego stęż zebrany roztwór do jednego do dwóch miligramów na mililitr.Za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj granicę wokół odcinków tkanki na szkiełku. Następnie inkubować tkanki z 0,3 do 0,5% PBST przez 10 minut i buforem blokującym przez 30 minut. Aby przygotować pierwotny roztwór barwiący, dodaj wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe do 200 do 500 mikrolitrów buforu barwiącego w pożądanych stężeniach.Odwirować pierwotny roztwór barwiący o temperaturze 13 000 razy G przez pięć minut i użyć supernatantu, jeśli pojawi się osad. Następnie inkubuj tkankę w pierwotnym roztworze przeciwciała w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni. Umyj szkiełka trzykrotnie 0,3 do 0,5% PBST przez pięć minut w temperaturze pokojowej w stojącym słoiku i upewnij się, że chusteczki są zanurzone w roztworze.Później inkubuj tkankę w 200 do 500 mikrolitrach buforu blokującego przez 30 minut. Aby przygotować wtórny roztwór barwiący, dodaj wszystkie przeciwciała drugorzędowe do 200 do 500 mililitrów buforu barwiącego o pożądanych stężeniach. Następnie odwirować wtórny roztwór barwiący o temperaturze 13 000 razy G przez pięć minut i użyć supernatantu, jeśli pojawi się osad.Następnie inkubuj tkanki w 200 do 500 mikrolitrach roztworu przeciwciał wtórnych w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie 0,3 do 0,5% PBST w temperaturze pokojowej przez pięć minut każde. Następnie inkubować z 200 do 500 mikrolitrami roztworu DAPI przez 30 minut.Ponownie przemyć szkiełka trzykrotnie PBS w temperaturze pokojowej przez pięć minut każda i przenieść pływające skrawki tkanek do szkiełek za pomocą szklanej pipety. Rozprowadź chusteczkę za pomocą szczoteczki do chusteczek i w razie potrzeby wyczyść otoczenie chusteczkami. Następnie zamontuj chusteczkę w kropli odczynników zapobiegających blaknięciu za pomocą szklanego szkiełka nakrywkowego i zabezpiecz ją lakierem do paznokci.Aby wykonać obrazowanie wielokanałowe-eprSRS, ustaw moc lasera wiązki pompy na 10 do 40 miliwatów, a wiązkę Stokesa na 40 do 80 miliwatów na panelu sterowania lasera. Następnie ustaw czas zatrzymania piksela na dwie do czterech mikrosekund i użyj wielu klatek, zwykle średnio od 10 do 20 klatek w oprogramowaniu mikroskopowym. Ponadto ustaw stałe czasowe wzmacniacza lock-in na połowę czasu przebywania pikseli.Obrazowanie barwnikiem Ramana odrębnych markerów białkowych i komórek HeLa, kory mózgowej myszy utrwalonej paraformaldehydem i wilgotnej tkanki FFPE nerki przeprowadzono poprzez znakowanie immunologiczne. Obrazowanie immuno-eprSRS komórek HeLa z alfa-tubuliną ujawniło drobne struktury subkomórkowe, takie jak mikrotubule. Obrazowanie eprSRS astrocytów barwionych MARS 2145 i barwionych MARS 2228 neuronów ziarnistych móżdżku w tkance mózgowej myszy wykazało trójwymiarowe wzorce z rozdzielczością subkomórkową.Przeprowadzono siedmiokolorowe obrazowanie tandemowe fluorescencji SRS hormonów i czynników transkrypcyjnych na zamrożonej tkance wysp trzustkowych myszy. Uzyskane obrazy wykazały dobry kontrast i prawidłowe wzorce. Przeprowadzono ośmiokolorowe, fluorescencyjne obrazowanie tandemowe SRS markerów typu komórki na tkankach móżdżku myszy utrwalonych paraformaldehydem.Zidentyfikowano różne typy komórek, takie jak neurony ziarniste móżdżku, neurony Purkinjego, astrocyty, oligodendrocyty i neurony GABA-ergiczne. Procedura ta może być dalej połączona z oczyszczaniem tkanek w celu wykonania wysoce multipleksowanego obrazowania białek w grubych, nienaruszonych tkankach. Nasza grupa opracowała dla niego protokół oczyszczania tkanek dostosowany do barwnika Raman.

highly-multiplexed-tissue-imaging-with-raman-dyes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Espinoza, R., et al. Dwukolorowe, stymulowane w czasie rzeczywistym obrazowanie rozpraszania Ramana mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek. J. Vis. exp. (2022).  Film przedstawia dwukolorowe, stymulowane rozpraszanie Ramana (SRS) wycinków tkanki mózgowej myszy. Dwie zsynchronizowane wiązki laserowe są kierowane na przekrój tkanki w celu wzbudzenia drgań molekularnych, co powoduje względną zmianę intensywności wiązek. Lipidy i białka w tkance są wykrywane za pomocą różnych par...

Dwukolorowe, stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana tkanki mózgowej myszy

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie biomolekuł na podstawie ich wewnętrznej wibracji określonych wiązań chemicznych. W tym protokole opisano instrumentalną konfigurację zintegrowanego mikroskopu SRS i dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego w celu wizualizacji struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym żywych myszy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) jest potężną, nieniszczącą i bezznacznikową techniką obrazowania. Jednym z pojawiających się zastosowań jest stymulowana histologia Ramana, w której dwukolorowe obrazowanie SRS w przejściach Ramana białek i lipidów jest wykorzystywane do generowania obrazów pseudo-hematoksyliny i eozyny. W tym miejscu demonstrujemy protokół dwukolorowego obrazowania SRS w czasie rzeczywistym w diagnostyce tkanek.

Dwukolorowe, stymulowane rozpraszaniem Ramana w czasie rzeczywistym mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek

Ten artykuł przedstawia integrację modułu spektralnego ogniskowania i lasera impulsowego o podwójnym wyjściu, umożliwiającego szybkie obrazowanie hiperspektralne nanocząsteczek złota i komórek rakowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów multimodalnych nieliniowych technik optycznych na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym.

Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej

Przedstawiamy protokół do pozyskiwania obrazów chemicznych za pomocą mikroskopii SRS (ang. broadband stimulated Raman scattering). Opierając się na mikroskopie SRS, który działa z różnicową detekcją wielokanałową typu lock-in, protokół opisuje przygotowanie próbki, regulację aparatury SRS i chemometrię w celu rozplątania różnych składników chemicznie niejednorodnych próbek.

Multipleksowe obrazowanie chemiczne oparte na szerokopasmowej mikroskopii rozpraszania Ramana stymulowanego

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Protokół ten przedstawia multimodalne podejście łączące spektroskopię Ramana i tomograficzną mikroskopię fazową w celu bezznacznikowego, nieinwazyjnego fenotypowania żywych ludzkich komórek raka piersi. Zawiera przyjazny dla użytkownika, wolny od uprzedzeń człowieka potok analityczny do szybkiej, ilościowej analizy morfochemicznej, dostarczając szczegółowych informacji molekularnych i strukturalnych z zastosowaniami w badaniach nad rakiem i biologii komórki.

Ramy obrazowania multimodalnego w celu przyspieszenia fenotypowania żywych, bezznacznikowych komórek raka piersi

Spektralne iteracyjne wybielanie rozszerza multipleksencję (IBEX) opiera się na podstawowej technice IBEX, dodając blokowanie heparyny w celu minimalizacji wiązania niespecyficznego oraz wykorzystując detekcję spektralną z obliczeniowym rozmieszaniem w celu tłumienia autofluorescencji. Takie podejście przyspiesza akwizycję obrazu, jednocześnie ograniczając źródła tła, umożliwiając solidne wielorundowe, wysokoparametryczne analizy przestrzenne proteomiczne.

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

Poznaj technikę epr-SRS do wysoce zmultipleksowanego obrazowania białek w tkankach z rozdzielczością subkomórkową. Metoda umożliwia analizę interakcji białkowych bez cyklicznego barwienia.

Wysoce zmultipleksowane obrazowanie tkanek za pomocą barwników Ramana

Przeglądaj więcej filmów