Mikroskopia elektronowa zamrażalno-pękająca do analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

W filmie prezentujemy protokół likologicznego pękania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek raka pęcherza moczowego in vitro. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe to pęcherzyki ograniczone błoną, które pochodzą z komórek, są uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i odgrywają rolę w komunikacji międzykomórkowej. W pęcherzykach zewnątrzkomórkowych rozróżniamy trzy populacje, egzosomy, mikropęcherzyki i ciała apoptotyczne, które różnią się pochodzeniem, wielkością i składem cząsteczkowym.

Skład molekularny pęcherzyków zewnątrzkomórkowych odzwierciedla profil molekularny komórki dawcy i zakłóca procesy biologiczne w komórce biorcy. Jednak skład błony ograniczającej pęcherzyków komórkowych ma kluczowe znaczenie dla interakcji z błoną komórkową biorcy. Aby przeanalizować organizację błony ograniczającej, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe muszą być najpierw wyizolowane, a następnie poddane technice zamrażania i pękania.

Freeze-fracture to technika mikroskopii elektronowej dedykowana do badania dwuwymiarowej organizacji błon biologicznych, w tym pęcherzyków. Etapy zamrażania i szczelinowania to szybkie zamrażanie próbki, pękanie próbki, tworzenie repliki z zamrożonej i pękniętej powierzchni oraz czyszczenie repliki w celu usunięcia materiałów biologicznych. Repliki są finalnie wizualizowane za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Naszym celem było wykorzystanie techniki zamrażania i pękania do scharakteryzowania mikropęcherzyków pod względem kształtu, wielkości i składu błony. Zacznij od wyhodowania komórek w inkubatorze komórkowym. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić ich zmienność i zbieżność.

Zebrać pożywkę hodowlaną z mikropęcherzykami do probówek i odwirować przy sile 300 g przez 10 minut. Zebrać supernatant. Następnie odwirować supernatant przy siłach 2000 g i 10 000 siłach g.

Następnie obserwuj końcówkę probówki pod kątem białawego osadu wskazującego na mikropęcherzyki. Ostrożnie usunąć supernatant. Dodaj 1,5 mililitra PBS i ponownie zawieś osad zawierający mikropęcherzyki.

Następnie odwirować przy sile 10 000 g. Obserwuj białawe granulki. Usuń supernatant i delikatnie dodaj utrwalacz.

Pozostaw na 20 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie usuń utrwalacz i dodaj bufor myjący, aby wypłukać osad bez ponownego zawieszania. Pozostaw na 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Usuń bufor myjący i dodaj 30% glicerolu do granulek. Ponownie zawiesić osad w jednorodnej zawiesinie i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przygotować czyste nośniki miedzi z wgłębieniem środkowym i rozwinąć kolbę z marszczeniem brwi i ciekłym azotem.

Pod mikroskopem przenieś próbkę do środkowego dołu miedzianego nośnika. Wymieszaj zestalony freon, aby uzyskać płynność. Chwyć pęsetą zewnętrzny pierścień nosidełka i zanurz go w schłodzonym freonie.

Po ośmiu sekundach szybko przenieść nośnik do kolby rozwijalnej z ciekłym azotem. Mark kriogeniczny i fajny to. Pod ciekłym azotem zebrać nośniki do podziemia, zamknąć je i przechowywać w pojemniku z ciekłym azotem do momentu zamrożenia szczelinowania.

Przygotować jednostkę frakcji zamrażającej zgodnie z instrukcją obsługi producenta. Uruchom system próżniowy i schłodzić komorę urządzenia do minus 150 stopni Celsjusza. Przenieść nośniki miedzi z zamrożoną próbką do jednostki zamrażająco-frakcjonującej.

Ustaw temperaturę noża na minus 100 stopni Celsjusza i poczekaj na podciśnienie. Rozpocznij dzielenie próbki na sekcje, włączając zmotoryzowany ruch noża, aż powierzchnia próbki będzie gładka. Do szczelinowania należy wyłączyć zmotoryzowany ruch noża i przystąpić do powolnego ręcznego sterowania nożem.

Kontynuuj cieniowanie platynowe pod kątem 45 stopni. Włącz wysokie napięcie i zwiększ prąd do pistoletu platynowego. Iskry platyny powinny zacząć zacieniać próbkę.

Nadzoruj położenie platyny na monitorze grubości kryształu kwarcu. Zalecana grubość platyny to 2,5 nanometra. Wyłącz prąd i wysokie napięcie.

Kontynuuj cieniowanie węglowe pod kątem 90 stopni. Włącz wysokie napięcie i zwiększ prąd do pistoletu węglowego. Iskry węgla powinny zacząć zacieniać próbkę.

Po uzyskaniu 2,5 nanometra węgla należy wyłączyć prąd i wysokie napięcie. Przenieść te próbki wraz z replikami z jednostki zamrażania i szczelinowania na 12-zaworową płytkę wypełnioną wodą podwójnie destylowaną. Repliki będą unosić się na powierzchni wody, podczas gdy nośniki toną.

Przenieść repliki z drucianą pętlą na 12-zaworową płytkę wypełnioną hipoklorytem sodu i inkubować przez noc. Umyj repliki w wodzie podwójnie destylowanej. Zbierz je na siatkowym miedzianym ruszcie TM i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez dwie godziny.

Użyj transmisyjnego mikroskopu elektronowego do obrazowania replik i uzyskania mikrofotografii. W celu dokładnej interpretacji replik i mikrofotografii należy postępować zgodnie ze wskazówkami dotyczącymi prawidłowej orientacji w nomenklaturze. Analizy replik wykazały, że pożywka kondycjonowana izolacyjnie zawierała wzbogaconą frakcję pęcherzyków.

Izolowane pęcherzyki były albo zebrane w skupiska po trzy lub więcej, albo bardzo indywidualnie rozmieszczone. Pęcherzyki miały kulisty kształt. Średnica pęcherzyków odpowiadała średnicy mikropęcherzyków.

Szczelinowanie zamrażalne ujawniło również dwuwymiarową organizację błony mikropęcherzyków. Faza egzoplazmatyczna mikropęcherzyków miała gładki, jednolity wygląd, natomiast w fazie protoplastów obserwowaliśmy cząstki międzybłonowe. Cząstki międzybłonowe pojawiały się sporadycznie, co oznacza, że mikropęcherzyki wyizolowane z komórek materiału nowotworowego zawierają tylko niewielką ilość białek błonowych lub zespołów białkowych.

Reasumując, technika lipozy-złamania zastosowana w prezentowanym protokole okazała się optymalną techniką do charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i może być wykorzystana do oceny innych populacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Istotną zaletą techniki zamrażania i pękania jest jej zdolność do rozwiązywania wewnętrznej organizacji błony ograniczającej pęcherzyki, która determinuje biologiczną funkcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.