Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

Udostępniamy szczegółowy protokół testu ubikwitylacji specyficznego substratu i ligazy ubikwityny E3 w komórkach ssaków. HEK293T linie komórkowe wykorzystano do nadekspresji białek, poliubikwitylowany substrat oczyszczono z lizatów komórkowych metodą immunoprecypitacji i rozdzielono w SDS-PAGE. Do wizualizacji tej modyfikacji potranslacyjnej wykorzystano immunoblotting.

Protokół ten pozwala na ocenę ubikwitylacji określonego substratu przez ligazę E3. Wiemy, że charakterystyka interakcji ligaza-substrat jest kluczowa dla zrozumienia ich funkcji w komórkach. Ta technika nie wymaga drogich odczynników ani wyrafinowanego sprzętu.

Potrzebuje plazmidów i kodowania interesujących genów, opracowania testu immunoprecypitacji z lizatami komórkowymi i Western blot do wykrycia ubikwitylacji substratu. Kilka chorób ludzkich, takich jak rak i zaburzenia neurologiczne, jest związanych z rozregulowaniem ligazy E3. W związku z tym identyfikacja ubikwitylacji substratu przez specyficzną ligazę E3 może pomóc w leczeniu lub diagnozowaniu tych chorób.

Procedurę zademonstruje Valentine Spagnol. Na początek wyhoduj linię komórkową HEK293T do 80 do 90% zbiegu w zmodyfikowanym pożywce Eagles firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 jednostkami penicyliny, 100 mikrogramami streptomycyny i 0,292 miligrama na mililitr L-glutaminy. Następnie inkubuj tę kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w 5% dwutlenku węgla.

Przejść przez komórki przez zasysanie pożywki z naczynia hodowlanego za pomocą pipety serologicznej i umyć je raz jednym mililitrem wysterylizowanego 1X PBS. Następnie odłącz komórki, dodając jeden mililitr roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego trypsyny i po pięciu minutach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza ponownie zawieś te komórki w dwóch mililitrach pożywki wzrostowej za pomocą pipety serologicznej. Przenieś zawiesinę komórkową do świeżej i czystej 15-mililitrowej probówki i odwiruj w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie delikatnie usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w trzech mililitrach pożywki wzrostowej, pipetując w górę iw dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek. Następnie przenieś jeden mililitr tej zawiesiny komórkowej do 100-milimetrowej płytki hodowlanej poddanej działaniu TC zawierającej dziewięć mililitrów pożywki wzrostowej. Przed transfekcją należy sprawdzić, czy komórki są wolne od zanieczyszczeń i znajdują się w odpowiednim momencie zbiegu dla transfekcji przejściowych.

Dla każdej próbki transfekcyjnej należy przygotować kompleksy DNA-polietylenomina, rozcieńczając trzy mikrogramy każdego plazmidu w 100 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy Opti-MEM 1 bez suplementacji i delikatnie mieszając, pipetując roztwór w górę iw dół. Następnie rozmrozić DNA-polietylenominę w temperaturze pokojowej i dodać ją do roztworu w proporcji trzech mikrolitrów DNA-polietylenoiminy na jeden mikrogram DNA. Homogenizować roztwór, pipetując w górę i w dół.

Następnie inkubuj go przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów DNA-polietylenomina. Dodaj całkowitą objętość kompleksów DNA-polietylenomina do każdego naczynia zawierającego kulturę komórkową i delikatnie wymieszaj, kołysząc płytką w przód iw tył. Następnie inkubuj te komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych.

Po inkubacji i sześć godzin przed lizą komórek należy potraktować transfekowane komórki 10-mikromolowym inhibitorem proteasomu MG132 i inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie odessać pożywkę z każdej pożywki hodowlanej za pomocą pipety serologicznej i przemyć komórki raz jednym mililitrem 1X PBS. Następnie odłącz komórki, dodając jeden mililitr trypsyny i inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki wzrostowej i przenieść zawiesinę komórkową do świeżej i czystej mikroprobówki o pojemności dwóch mililitrów i odwirować ją w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wirowania usuń supernatant, wylewając go ostrożnie i delikatnie ponownie zawieś osad komórkowy w 200 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy MP40 uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteazy i fosfatazy. Następnie przenieś ten roztwór do czystej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra.

Inkubować ten lizat komórkowy przez 30 minut na lodzie, a po inkubacji odwirować lizaty komórkowe w temperaturze 16 900 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W międzyczasie zrównoważ kulki anty-HA agarozy z lodowatym buforem do lizy MP40. Użyj 15 mikrolitrów kulek anty-HA agarozy na każdą próbkę.

Umyj kulki 200 mikrolitrami buforu do lizy MP40, pulsując je w probówce mikrowirówki pod ciśnieniem 3 000 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant za pomocą pipety i powtórzyć ten proces trzy razy. Następnie utrzymuj kulki równo na lodzie aż do użycia.

Po odwirowaniu lizatów komórkowych odzyskać supernatant i określić ilościowo zawartość białka w całkowitym lizacie przy użyciu metody Bradforda, aby zapewnić, że każda próbka poddana immunoprecypitacji zawiera równą ilość białka. Inkubować niezbędną objętość lizatu komórkowego ze zrównoważonymi kulkami anty-HA agarozy przez cztery godziny, delikatnie obracając w inkubatorze obrotowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza, co pozwala UXT-V2-HA związać się z kulkami anty-HA agarozy. Zebrać kulki anty-HA z agarozy, pulsując nimi w probówce mikrowirówkowej pod ciśnieniem 3 000 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant. Umyj koraliki trzykrotnie lodowatym buforem do lizy komórek MP40 i dwukrotnie lodowatym buforem FLAG HA. Po ostatnim przemyciu ostrożnie usunąć cały supernatant za pomocą pipety i wymyć poliubikwitylowane białko za pomocą 300 mikrogramów na mililitr peptydu HA rozcieńczonego na buforze FLAG HA.

Inkubuj kulki anty-HA agarozy z peptydem HA przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na kołyszącej się platformie wytrząsającej. Następnie odwiruj kulki z prędkością 3000 razy G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie usuń supernatant zawierający poliubikwitynowane białka. W razie potrzeby przechowuj eluent w świeżej i czystej mikroprobówce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Rozpuścić eluenty i lizaty komórkowe w 10% dodecylosiarczanie sodu, elektroforezie w żelu poliakrylamidowym i immunoblottingu. Aby wykonać Western blotting z mokrym transferem, umieść żel w kanapce transferowej składającej się z bibuły filtracyjnej, bibuły filtracyjnej z membraną żelową, wyściełaj ją podkładkami i dociśnij do siebie za pomocą siatki nośnej. Następnie umieść ten system pionowo w zbiorniku wypełnionym buforem transferowym pomiędzy elektrodami ze stali nierdzewnej lub drutu platynowego.

Transfer odbywa się przez 90 minut przy napięciu 150 V w mokrym buforze transferowym. Na koniec zbadaj błonę immunoblot za pomocą przeciwciała anty-myc. Specyficzną poli-ubikwitylację UXT-V2-HA, w której pośredniczy białko F-box 7 w komórkach, zaobserwowano po sondowaniu eluentu z immunoprecypitacji anty-HA przeciwciałem anty-myc, które wykrywa myc-ub sprzężony z substratem.

Specyficzność anty-myc dla poliubikwitylowanego substratu uwidoczniono na torach pierwszym i drugim, w których rozmaz poli-ubikwitylowanych białek nie został wykryty, gdy komórki były transfekowane białkiem F-box 7 i myc-ub przy braku plazmidu UXT-V2-HA. Dodatkowo nie uwidoczniono rozmazu odpowiadającego poliubikwitynacji białek w połączeniu białka F-box 7 i UXT-V2-HA bez plazmidu myc-ub. Gdy mutant białka F-box 7 lub białka F-box 7 z pustym wektorem niezdolny do składania aktywnego SCF został przecięty w połączeniu z UXT-V2-HA i myc-ub, silny sygnał rozmazu poliubikwitylowanego UXT-V2 zaobserwowano tylko dla białka 7 F-box typu dzikiego, co sugeruje, że UXT-V2 był poliubikwitylowany przez kompleks SCF F-box protein 7 i komórki w porównaniu z kontrolami.

Etapy monoprecypitacji, w tym inkubacja lizatów komórkowych z równowagą kulek i wymywanie białek immunoprecypitowanych, są niezbędne do osiągnięcia celu tego protokołu. Po tej procedurze należy przeprowadzić test ubikwitylacji in vitro w celu potwierdzenia swoistości ubikwitylacji substratu przez ligazę E3.