Name: Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj metodę oceny ubikwitylacji substratu przez ligazę E3 w lizatach komórek ssaków HEK293T. Ta technika wykorzystuje immunoprecypitację i Western blot do badania modyfikacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

F.R.T jest wspierany przez grant FAPESP o numerze 2020/15771-6 oraz CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P i V.S są obsługiwane przez CAPES. C.R.S.T.B.C był wspierany przez stypendium FAPESP nr 2019/23466-1. Dziękujemy Sandrze R. C. Maruyamie (FAPESP 2016/20258-0) za wsparcie materialne.

UWAGA: Przegląd protokołu analizy ubikwitynacji w komórkach ssaków przedstawiono na Rysunku 1.
<img alt="Schemat procesu oczyszczania białek; konfiguracja transfekcji, inkubacja komórek, SDS-PAGE, immunoblotting." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63561/63561fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przegląd procedury badania ubikwitynacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63561/63561fig01large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hodować linię komórkową HEK293T w 100 mm naczyniu hodowlanym traktowanym TC do uzyskania 80%-90% konfluencji w pożywce wzrostowej (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), penicylinę (100 units), streptomycynę (100 µg) i L-glutaminę (0.292 mg/mL)). Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych przy 5% CO2.</li>
	<li>W celu pasażowania komórek, odessać pożywkę z naczynia hodowlanego za pomocą pipety serologicznej. Przemyć komórki raz 1 mL sterylnego 1x roztworu soli fosforanowo-buforowanej (PBS 1x).</li>
	<li>Odczepić komórki, dodając 1 mL roztworu trypsyny/EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego). Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 5 min. Resuspender komórki za pomocą pipety serologicznej w 2 mL pożywki wzrostowej.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórkową do nowej, czystej probówki 15 mL i odwirować przy 500 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT). Usunąć nadsącz, ostrożnie go wylewając. Delikatnie resuspender osad komórkowy w 3 mL pożywki wzrostowej, pipetując w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórkową.</li>
	<li>Przenieść 1 mL zawiesiny komórkowej do 100 mm naczynia hodowlanego traktowanego TC zawierającego 9 mL pożywki wzrostowej. 
	UWAGA: Jeśli komórki są w dobrym stanie, każde naczynie hodowlane z HEK293T o konfluencji 80%-90% może dać trzy naczynia hodowlane z konfluencją 80% dwa dni po pasażowaniu.</li>
</ol>
2. Transfekcja komórek
UWAGA: Nie zaleca się transfekcji hodowli komórkowej, jeśli osiągnięta konfluencja jest mniejsza niż 80%.
<ol>
	<li>Przed transfekcją należy upewnić się, że komórki nie są zanieczyszczone i osiągnęły odpowiednią konfluencję dla transfekcji przejściowych.</li>
	<li>Dla każdej próbki do transfekcji przygotować kompleksy DNA-poliethylenimina (PEI 1 µg/µL przy pH 7,2) w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 3 µg każdego plazmidu w 100 µL medium Opti-MEM I z obniżoną zawartością surowicy, bez dodatków, i delikatnie wymieszać, pipetując roztwór w górę i w dół. 
		UWAGA: W tym przypadku komórki zostały transfekowane 4 µg każdego plazmidu: pustego wektora (pcDNA3) lub konstruktów FLAG-Fbxo7 oraz UXT-V2-HA, z lub bez 6xHis-myc-ubiquityny. Całkowita zawartość DNA wynosiła 12 µg.</li>
		<li>Rozmrozić PEI w temperaturze pokojowej i dodać do roztworu, zachowując proporcję 3 µL PEI na 1 µg DNA. Homogenizować roztwór poprzez pipetowanie w górę i w dół. Następnie inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów DNA-PEI. 
		UWAGA: Optymalna proporcja objętości PEI do ilości DNA różni się w zależności od wybranej linii komórkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać całą objętość kompleksów DNA-PEI do każdej płytki z hodowlą komórkową i delikatnie wymieszać, kołysząc płytką przód-tył. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych przy 5% CO2.</li>
	<li>Wymienić medium hodowlane po 5 h, ponieważ przedłużona ekspozycja na PEI może być toksyczna dla komórek HEK293T. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych przy 5% CO2 przez 36 h.</li>
</ol>
3. Lizaza komórek i immunoprecypitacja
<ol>
	<li>Po okresie inkubacji i na 6 h przed lizą komórek, potraktuj transfekowane komórki 10 µM inhibitora proteasomów MG-132. Ponownie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do kultur komórkowych przy 5% CO2.</li>
	<li>Odsaj cały medium z każdej płytki hodowlanej za pomocą pipety serologicznej i wypłucz ją raz 1 mL 1x PBS. Odklej komórki, dodając 1 mL trypsyny i inkubując płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 min. Resuspenduj komórki w 1 mL medium wzrostowego.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórkową do świeżej i czystej probówki 15 mL i odwiruj przy 500 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Usuń supernatant, ostrożnie go wylewając. Delikatnie resuspenduj pellet komórkowy w 200 µL schłodzonego do temperatury lodowej buforu do lizy NP-40 (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 225 mM KCl i 1% NP-40), uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteaz i fosfataz (10 mM NaF i 1 mM Na3VO4), a następnie przenieś roztwór do czystej mikroprobówki 1,5 mL.</li>
	<li>Inkubuj lizat komórkowy przez 30 min na lodzie. Po inkubacji odwiruj lizaty komórkowe przy 16 900 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W międzyczasie wyrównaj stan równowagi kulek agarozowych anti-HA w schłodzonym do temperatury lodowej buforze do lizy NP-40. Użyj 15 µL kulek agarozowych anti-HA dla każdej próbki. Wypłucz kulki 200 µL buforu do lizy NP-40, wirując w mikroprobówce przy 3 000 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety bardzo ostrożnie odessaj i usuń supernatant; powtórz ten proces trzy razy. Następnie przechowuj zrównoważone kulki na lodzie do momentu użycia.</li>
	<li>Po odwiruciu lizatów komórkowych odzyskaj supernatant. Oznacz zawartość białka w całkowitym lizacie metodą Bradforda16.</li>
	<li>Upewnij się, że każda próbka poddana immunoprecypitacji zawiera równą ilość białka. Inkubuj odpowiednią objętość lizatu komórkowego z zrównoważonymi kulkami agarozowymi anti-HA przez 4 h, delikatnie rotując w inkubatorze rotacyjnym w temperaturze 4 °C, co pozwoli na związanie UXT-V2-HA z kulkami agarozowymi anti-HA.</li>
	<li>Zbierz kulki agarozowe anti-HA, wirując je w mikroprobówce przy 3 000 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessaj i usuń supernatant. Wypłucz kulki trzy razy schłodzonym do temperatury lodowej buforem do lizy komórek NP-40 i dwa razy schłodzonym do temperatury lodowej buforem FLAG/HA (10 mM Hepes pH 7.9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl i 0,1% NP-40).</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu ostrożnie usuń cały supernatant za pomocą pipety i eluuj poliuubikwitylowane białko peptydem HA (300 µg/mL) rozcieńczonym w buforze FLAG/HA. Inkubuj kulki agarozowe anti-HA z peptydem HA przez 1 h w temperaturze 4 °C na platformie wstrząsowej.</li>
	<li>Odwiruj kulki przy 3 000 x g przez 2 min w temperaturze 4 °C i ostrożnie pobierz pipetą supernatant zawierający białka poliuubikwitylowane. W razie potrzeby przechowuj eluat w świeżej i czystej mikroprobówce w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rozdziel eluaty i lizaty komórkowe w 10% SDS-PAGE (elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu)17 i przeprowadź immunoblotting.</li>
	<li>W niniejszym badaniu wykonano mokry transfer WB. W przypadku tego rodzaju transferu umieść żel w kanapce transferowej składającej się z papieru filtracyjnego, żelu, membrany i papieru filtracyjnego, zabezpiecz ją podkładkami i zaciśnij za pomocą siatki wspierającej. Umieść ten układ pionowo w komorze wypełnionej buforem do transferu, pomiędzy elektrodami ze stali nierdzewnej/drutu platynowego. Transfer odbywa się przez 90 min przy 150 V w mokrym buforze do transferu (glicyna 192 mM, tris-base 25 mM, 0,025% SDS, 20% metanol). 
	UWAGA: Ponieważ ekstrakty komórkowe zostały skwantyfikowane (krok 3.7), przeprowadź SDS-PAGE z równą ilością białka dla każdej próbki. Ponadto, aby rozdzielić eluat, nałóż równe objętości każdej próbki.</li>
	<li>Przeanalizuj membranę immunoblotową przy użyciu wybranych przeciwciał 11. Upewnij się, że w eluacie z poliuubikwitylowanego substratu wyizolowanego w procesie IP wykryto sygnał w formie rozmycia (smear), stosując przeciwciało anti-myc w próbkach zawierających białko E3 ligazy typu dzikiego, substrat oraz myc-ub. W lizacie komórkowym (input) upewnij się, że wykryto sygnał z wybranego substratu, białka Fbxo7, białek ubikwitylowanych oraz białka referencyjnego (np. GAPDH i β-aktyny), aby zagwarantować taką samą ilość białek w każdej ścieżce. 
	UWAGA: Rozcieńczenie każdego użytego przeciwciała przygotowano zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Callis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitination+machinery+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">The ubiquitination machinery of the ubiquitin system.</a> The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).</li>
<li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ubiquitination+factor%2C+E4%2C+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li>
<li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7 (1), 6(2021).</li>
<li>Komander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+discrimination+of+structurally+equivalent+Lys+63-linked+and+linear+polyubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains.</a> EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).</li>
<li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143 (5), 682-685 (2010).</li>
<li>Davies, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vps9p+CUE+domain+ubiquitin+binding+is+required+for+efficient+endocytic+protein+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).</li>
<li>Raasi, S., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+receptors+and+ERAD%3A+A+network+of+pathways+to+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).</li>
<li>Pan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+Ubr1-mediated+N-degron+polyubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination.</a> Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).</li>
<li>Raducu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+%28Fbxl17%29+ubiquitylation+of+Sufu+regulates+Hedgehog+signaling+and+medulloblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development.</a> The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).</li>
<li>Spagnol, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3+ubiquitin+ligase+SCF%28Fbxo7%29+mediates+proteasomal+degradation+of+UXT+isoform+2+%28UXT-V2%29+to+inhibit+the+NF-%CE%BAB+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754(2021).</li>
<li>Teixeira, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gsk3%CE%B2+and+Tomm20+are+substrates+of+the+SCFFbxo7%2FPARK15+ubiquitin+ligase+associated+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease.</a> Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).</li>
<li>Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+SCF+adaptor+capture+proteomics+reveals+a+role+for+SCFFBXL17+in+NRF2+activation+via+BACH1+repressor+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover.</a> Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).</li>
<li>van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+ubiquitination+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Visualizing ubiquitination in mammalian cells.</a> EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).</li>
<li>Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibitors%3A+From+research+tools+to+drug+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates.</a> Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).</li>
<li>Bradford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 228, 726-734 (1970).</li>
<li>Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -H., Nothwang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+UXT%2C+a+novel+gene+in+human+Xp11%2C+which+is+widely+and+abundantly+expressed+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue.</a> Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT-V1+facilitates+the+formation+of+MAVS+antiviral+signalosome+on+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria.</a> The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT-V1+protects+cells+against+TNF-induced+apoptosis+through+modulating+complex+II+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).</li>
<li>Sun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT+is+a+novel+and+essential+co-factor+in+the+NF-%CE%BAB+transcriptional+enhanceosome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).</li>
<li>Huang, X., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugging+the+undruggables%3A+Exploring+the+ubiquitin+system+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development.</a> Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).</li>
<li>Rajkumar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+2020+update+on+diagnosis%2C+risk-stratification+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management.</a> American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).</li>
<li>Hideshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteasome+inhibitor+PS-341+inhibits+growth%2C+induces+apoptosis%2C+and+overcomes+drug+resistance+in+human+multiple+myeloma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells.</a> Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).</li>
<li>Tietsche, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+proteasome+inhibitors+in+the+treatment+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%2C+Transfusion+and+Cell+Therapy%22%5BJournal%5D)">New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma.</a> Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).</li>
<li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activation+of+the+p53+pathway+by+small-molecule+antagonists+of+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2.</a> Science. 303 (5659), 844-848 (2004).</li>
<li>Kuiken, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+F-box+only+protein+7+as+a+negative+regulator+of+NF-kappaB+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li>
<li>Iconomou, M., Saunders, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+approaches+to+identify+E3+ligase+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates.</a> Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).</li>
<li>Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitinases+sharpen+substrate+discrimination+during+membrane+protein+degradation+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER.</a> Cell. 154 (3), 609-622 (2013).</li>
<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age+of+crosstalk%3A+Phosphorylation%2C+ubiquitination%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond.</a> Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Ubikwitylacja jest istotną modyfikacją potranslacyjną, która reguluje poziomy kilku białek i odgrywa kluczową rolę w wielu szlakach sygnałowych i procesach biologicznych, zapewniając zdrowe środowisko wewnątrzkomórkowe. System ubikwityna-proteasom (UPS) jest jednym z głównych celów najnowszych badań farmaceutycznych, zapewniając możliwość stabilizacji supresorów nowotworowych lub indukowania degradacji produktów onkogennych22. Na przykład nieprawidłowa proliferacja nowotworów komórek plazmatycznyc...

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) są ważnym mechanizmem regulującym białka, co jest niezbędne dla homeostazy komórek. Ubikwitylacja białek to dynamiczna i skomplikowana modyfikacja, która tworzy asortyment różnych sygnałów, co skutkuje kilkoma wynikami komórkowymi w organizmach eukariotycznych. Ubikwitylacja to odwracalny proces polegający na przyłączeniu białka ubikwityny zawierającego 76 aminokwasów do substratu, zachodzącego w kaskadzie enzymatycznej złożonej z trzech odrębnych reakcji1. Pierwszy etap charakteryzuje się aktywacją ubikwityny, która zależy od hydrolizy ATP w celu wytworzenia wysokoenergetycznej ubikwityny połączonej z tioestrem między C-końcem ubikwityny a resztą cysteiny obecną w miejscu aktywnym enzymu E1. Następnie ubikwityna jest przenoszona do enzymu E2, tworząc tioester podobny do kompleksu z ubikwityną. Następnie ubikwityna jest kowalencyjnie przyłączana do substratu przez E2 lub, częściej, przez enzym E3, który rozpoznaje i oddziałuje z substratem2,3. Czasami enzymy E4 (czynniki wydłużające łańcuch ubikwityny) są niezbędne do promowania składania łańcuchów multiubikwityny3.
Ubikwityna ma siedem reszt lizyny (K6, K11, K27, K29, K33, K48 i K63), co pozwala na tworzenie łańcuchów poliubikwityny, które generują odrębne połączenia w celu wytworzenia różnych trójwymiarowych struktur, które będą rozpoznawane przez kilka białek efektorowych4,5. W związku z tym rodzaj łańcucha poliubikwityny wprowadzony do substratu jest niezbędny do decydowania o losie jego komórki6,7,8. Co więcej, substrat może być również ubikwitynowany przez swoje N-końcowe reszty zwane N-degronami. Specyficzne ligazy ubikwityny E3 są odpowiedzialne za rozpoznawanie N-degronu, umożliwiając poliubikwitylację pobliskich reszt lizyny9.
Obecnie scharakteryzowano ponad 40 różnych substratów specyficznych dla SCF. Wśród nich można znaleźć kluczowe regulatory kilku szlaków biologicznych, w tym różnicowania i rozwoju komórek, a także przeżywania i umierania komórek10,11,12,13. W związku z tym identyfikacja specyficznych substratów każdej ligazy ubikwityny E3 jest niezbędna do zaprojektowania kompleksowej mapy różnych zdarzeń biologicznych. Mimo że identyfikacja prawdziwych substratów jest wyzwaniem biochemicznym, zastosowanie metod opartych na biochemii jest bardzo odpowiednie do oceny specyficzności łańcucha i rozróżnienia między mono- i poliubikwitylacją14. W badaniu tym opisano kompletny protokół testu ubikwitylacji z wykorzystaniem linii komórkowej ssaków HEK293T nadekspresji substratu UXT-V2 (Wszechobecnie eksprymowana izoforma 2 białka opiekuńczego podobnego do prefoldyny) z kompleksem E3 ubikwityna-ligaza SCF (Fbxo7). UXT-V2 jest niezbędnym kofaktorem dla sygnalizacji NF-κB, a gdy białko to zostanie zniszczone w komórkach, hamuje indukowaną przez TNF-α aktywację NF-κB11. Tak więc, aby wykryć poliubikwitylowany UXT-V2, stosuje się inhibitor proteasomu MG132, ponieważ ma on zdolność blokowania aktywności proteolitycznej podjednostki 26S kompleksu proteasomowego15. Ponadto ekstrakt komórkowy jest poddawany badaniu IP na małą skalę w celu oczyszczenia substratu, przy użyciu specyficznego przeciwciała unieruchomionego na żywicy agarozowej w celu późniejszego wykrycia przez WB przy użyciu wybranych przeciwciał. Protokół ten jest bardzo przydatny do walidacji ubikwitylacji substratu w środowisku komórkowym, a także może być dostosowany do różnych typów komórek ssaków i innych kompleksów ubikwityna-ligaza E3. Konieczna jest jednak walidacja badanego substratu za pomocą testu ubikwitylacji in vitro, ponieważ oba protokoły uzupełniają się nawzajem pod względem identyfikacji prawdziwych substratów.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml mikroprobówka</td><td>Axygen</td><td>PMI110-06A</td> Naczynie hodowlane <td></td></tr><tr><td>100 mm poddane działaniu TC</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>probówka 15 ml</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Cralplast</td><td>655111</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza-anty-HA</td><td>Przeciwciało Sigma-Aldrich</td><td>E6779</td><td></td></tr><tr><td>Anti Mouse</td><td>Seracare</td><td>5220-0341</td><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG</td></tr><tr><td>anty królicze</td><td>Seracare</td><td>5220-0337</td><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG</td></tr><tr><td>antyaktynowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3853</td><td>Zastosowane rozcieńczenie: 1:2000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Fbxo7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1407251</td><td>Zastosowane rozcieńczenie: 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-HA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3663</td><td>Zastosowane rozcieńczenie: 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Myc</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2272</td><td>Użyte rozcieńczenie: 1:1000</td></tr><tr><td>Odczynnik Bradford</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td>Surowica bydlęca Inkubator komórek albuminowych</td></tr><tr><td></td><td>Nuaire</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>500 x g przez 5 min</td></tr><tr><td>ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy pH-metr</td><td>Kasvi</td><td>K39-2014B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CRV</td><td>Wysoki poziom glukozy</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>F4135</td><td>Filtrat przed użyciem</td></tr><tr><td>Peptyd</td><td>HA Sigma-Aldrich</td><td>I2149</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Life Science</td><td>0365-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kline rotator</td><td>Global Trade Technology</td><td>GT-2OIBD</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Boston Biochem</td><td>I-130</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4 (Ortovanadato)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td>10600016</tr><tr><td>NP40 (IGEPAL CA-630)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny</td><td>Mikroskopy OPTIKA</td><td>SN510768</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>Do ekspresji ssaków</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7</td><td>&nbsp; Uprzejmie podarowane przez Dr. Marcelo Dam&aacute; </td><td></td> rio <td>Tag 2xFlag (N-terminal). Enzymy restrykcyjne: EcoRI i XhoI</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-&Delta; Skrzynka F&</td><td>nbsp; Uprzejmie podarowane przez Dr. Marcelo Dam&aacute; </td><td></td> rio <td>Tag 2xFlag (N-terminal). Enzymy restrykcyjne: EcoRI i XhoI. Złącze Delta; 335-367</td></tr><tr><td>pcDNA3-UXTV2-HA</td><td>&nbsp; Uprzejmie podarowane przez Dr. Marcelo Dam&aacute; </td><td></td> rio <td>Tag HA (zacisk C). Enzymy restrykcyjne: EcoRI i XhoI</td></tr><tr><td>pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin</td><td>&nbsp; Uprzejmie podarowane przez Dr. Marcelo Dam&aacute; </td><td></td> rio <td>Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Enzymy restrykcyjne: EcoRI i KpnI</td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamina 100x</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10x</td><td>AccuGENE</td><td>51226</td><td>Aby uzyskać 1x PBS, rozcieńczyć 10x PBS w ultraczystej wodzie</td></tr><tr><td>Polietyleniminy (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>VWR Life Science</td><td>0860-50G</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy SIGMAFAST</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka bujana</td><td>Kasvi</td><td>19010005</td><td></td></tr><tr><td>System SDS-PAGE</td><td>BioRad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator roztworu</td><td>Phoenix Luferco</td><td>AP-22</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (TrypLe Express)</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Western Blotting Luminol</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2048</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny e3 w lizatach komórek ssaków

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubikwitylacja to potranslacyjna modyfikacja zachodząca w komórkach eukariotycznych, która jest krytyczna dla regulacji kilku szlaków biologicznych, w tym przetrwania komórek, proliferacji i różnicowania. Jest to odwracalny proces, który polega na kowalencyjnym przyłączeniu ubikwityny do substratu poprzez reakcję kaskadową co najmniej trzech różnych enzymów, składających się z E1 (enzym aktywujący ubikwitynę), E2 (enzym sprzęgający ubikwitynę) i E3 (enzym ligazy ubikwityny). Kompleks E3 odgrywa ważną rolę w rozpoznawaniu substratów i ubikwitylacji. W tym miejscu opisano protokół oceny ubikwitylacji substratu w komórkach ssaków przy użyciu przejściowej kotransfekcji plazmidu kodującego wybrany substrat, ligazy ubikwityny E3 i znakowanej ubikwityny. Przed lizą transfekowane komórki są traktowane inhibitorem proteasomu MG132 (karbobenzoksy-leu-leu-leu-leucinalem), aby uniknąć degradacji proteasomów substratu. Ponadto ekstrakt komórkowy poddaje się immunoprecypitacji na małą skalę (IP) w celu oczyszczenia poliubikwitylowanego substratu w celu późniejszego wykrycia przez western blotting (WB) przy użyciu specyficznych przeciwciał dla znacznika ubikwityny. W związku z tym opisano spójny i nieskomplikowany protokół oznaczania ubikwitylacji w komórkach ssaków, aby pomóc naukowcom w rozwiązaniu problemu ubikwitylacji określonych substratów i ligaz ubikwityny E3.

UXT (ubiquitously expressed transcript) jest białkiem podobnym do prefoldyny, które tworzy powszechnie występujące kompleksy fałdujące białka w tkankach myszy i człowieka, takich jak serce, mózg, mięśnie szkieletowe, łożysko, trzustka, nerka i wątroba18. Opisano dwie izoformy splicingowe UXT, nazwane UXT-V1 i UXT-V2, które pełnią odrębne funkcje i znajdują się w różnych lokalizacjach subkomórkowych. UXT-V1 lokalizuje się głównie w cytoplazmie oraz wewnątrz mitochondriów i bierze udział w apoptozie...

Udostępniamy szczegółowy protokół testu ubikwitylacji specyficznego substratu i ligazy ubikwityny E3 w komórkach ssaków. HEK293T linie komórkowe wykorzystano do nadekspresji białek, poliubikwitylowany substrat oczyszczono z lizatów komórkowych metodą immunoprecypitacji i rozdzielono w SDS-PAGE. Do wizualizacji tej modyfikacji potranslacyjnej wykorzystano immunoblotting.

Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Protokół ten pozwala na ocenę ubikwitylacji określonego substratu przez ligazę E3. Wiemy, że charakterystyka interakcji ligaza-substrat jest kluczowa dla zrozumienia ich funkcji w komórkach. Ta technika nie wymaga drogich odczynników ani wyrafinowanego sprzętu.Potrzebuje plazmidów i kodowania interesujących genów, opracowania testu immunoprecypitacji z lizatami komórkowymi i Western blot do wykrycia ubikwitylacji substratu. Kilka chorób ludzkich, takich jak rak i zaburzenia neurologiczne, jest związanych z rozregulowaniem ligazy E3. W związku z tym identyfikacja ubikwitylacji substratu przez specyficzną ligazę E3 może pomóc w leczeniu lub diagnozowaniu tych chorób.Procedurę zademonstruje Valentine Spagnol. Na początek wyhoduj linię komórkową HEK293T do 80 do 90% zbiegu w zmodyfikowanym pożywce Eagles firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 jednostkami penicyliny, 100 mikrogramami streptomycyny i 0,292 miligrama na mililitr L-glutaminy. Następnie inkubuj tę kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w 5% dwutlenku węgla.Przejść przez komórki przez zasysanie pożywki z naczynia hodowlanego za pomocą pipety serologicznej i umyć je raz jednym mililitrem wysterylizowanego 1X PBS. Następnie odłącz komórki, dodając jeden mililitr roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego trypsyny i po pięciu minutach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza ponownie zawieś te komórki w dwóch mililitrach pożywki wzrostowej za pomocą pipety serologicznej. Przenieś zawiesinę komórkową do świeżej i czystej 15-mililitrowej probówki i odwiruj w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie delikatnie usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w trzech mililitrach pożywki wzrostowej, pipetując w górę iw dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek. Następnie przenieś jeden mililitr tej zawiesiny komórkowej do 100-milimetrowej płytki hodowlanej poddanej działaniu TC zawierającej dziewięć mililitrów pożywki wzrostowej. Przed transfekcją należy sprawdzić, czy komórki są wolne od zanieczyszczeń i znajdują się w odpowiednim momencie zbiegu dla transfekcji przejściowych.Dla każdej próbki transfekcyjnej należy przygotować kompleksy DNA-polietylenomina, rozcieńczając trzy mikrogramy każdego plazmidu w 100 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy Opti-MEM 1 bez suplementacji i delikatnie mieszając, pipetując roztwór w górę iw dół. Następnie rozmrozić DNA-polietylenominę w temperaturze pokojowej i dodać ją do roztworu w proporcji trzech mikrolitrów DNA-polietylenoiminy na jeden mikrogram DNA. Homogenizować roztwór, pipetując w górę i w dół.Następnie inkubuj go przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów DNA-polietylenomina. Dodaj całkowitą objętość kompleksów DNA-polietylenomina do każdego naczynia zawierającego kulturę komórkową i delikatnie wymieszaj, kołysząc płytką w przód iw tył. Następnie inkubuj te komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych.Po inkubacji i sześć godzin przed lizą komórek należy potraktować transfekowane komórki 10-mikromolowym inhibitorem proteasomu MG132 i inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie odessać pożywkę z każdej pożywki hodowlanej za pomocą pipety serologicznej i przemyć komórki raz jednym mililitrem 1X PBS. Następnie odłącz komórki, dodając jeden mililitr trypsyny i inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki wzrostowej i przenieść zawiesinę komórkową do świeżej i czystej mikroprobówki o pojemności dwóch mililitrów i odwirować ją w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wirowania usuń supernatant, wylewając go ostrożnie i delikatnie ponownie zawieś osad komórkowy w 200 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy MP40 uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteazy i fosfatazy. Następnie przenieś ten roztwór do czystej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra.Inkubować ten lizat komórkowy przez 30 minut na lodzie, a po inkubacji odwirować lizaty komórkowe w temperaturze 16 900 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W międzyczasie zrównoważ kulki anty-HA agarozy z lodowatym buforem do lizy MP40. Użyj 15 mikrolitrów kulek anty-HA agarozy na każdą próbkę.Umyj kulki 200 mikrolitrami buforu do lizy MP40, pulsując je w probówce mikrowirówki pod ciśnieniem 3 000 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant za pomocą pipety i powtórzyć ten proces trzy razy. Następnie utrzymuj kulki równo na lodzie aż do użycia.Po odwirowaniu lizatów komórkowych odzyskać supernatant i określić ilościowo zawartość białka w całkowitym lizacie przy użyciu metody Bradforda, aby zapewnić, że każda próbka poddana immunoprecypitacji zawiera równą ilość białka. Inkubować niezbędną objętość lizatu komórkowego ze zrównoważonymi kulkami anty-HA agarozy przez cztery godziny, delikatnie obracając w inkubatorze obrotowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza, co pozwala UXT-V2-HA związać się z kulkami anty-HA agarozy. Zebrać kulki anty-HA z agarozy, pulsując nimi w probówce mikrowirówkowej pod ciśnieniem 3 000 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant. Umyj koraliki trzykrotnie lodowatym buforem do lizy komórek MP40 i dwukrotnie lodowatym buforem FLAG HA. Po ostatnim przemyciu ostrożnie usunąć cały supernatant za pomocą pipety i wymyć poliubikwitylowane białko za pomocą 300 mikrogramów na mililitr peptydu HA rozcieńczonego na buforze FLAG HA.Inkubuj kulki anty-HA agarozy z peptydem HA przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na kołyszącej się platformie wytrząsającej. Następnie odwiruj kulki z prędkością 3000 razy G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie usuń supernatant zawierający poliubikwitynowane białka. W razie potrzeby przechowuj eluent w świeżej i czystej mikroprobówce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Rozpuścić eluenty i lizaty komórkowe w 10% dodecylosiarczanie sodu, elektroforezie w żelu poliakrylamidowym i immunoblottingu. Aby wykonać Western blotting z mokrym transferem, umieść żel w kanapce transferowej składającej się z bibuły filtracyjnej, bibuły filtracyjnej z membraną żelową, wyściełaj ją podkładkami i dociśnij do siebie za pomocą siatki nośnej. Następnie umieść ten system pionowo w zbiorniku wypełnionym buforem transferowym pomiędzy elektrodami ze stali nierdzewnej lub drutu platynowego.Transfer odbywa się przez 90 minut przy napięciu 150 V w mokrym buforze transferowym. Na koniec zbadaj błonę immunoblot za pomocą przeciwciała anty-myc. Specyficzną poli-ubikwitylację UXT-V2-HA, w której pośredniczy białko F-box 7 w komórkach, zaobserwowano po sondowaniu eluentu z immunoprecypitacji anty-HA przeciwciałem anty-myc, które wykrywa myc-ub sprzężony z substratem.Specyficzność anty-myc dla poliubikwitylowanego substratu uwidoczniono na torach pierwszym i drugim, w których rozmaz poli-ubikwitylowanych białek nie został wykryty, gdy komórki były transfekowane białkiem F-box 7 i myc-ub przy braku plazmidu UXT-V2-HA. Dodatkowo nie uwidoczniono rozmazu odpowiadającego poliubikwitynacji białek w połączeniu białka F-box 7 i UXT-V2-HA bez plazmidu myc-ub. Gdy mutant białka F-box 7 lub białka F-box 7 z pustym wektorem niezdolny do składania aktywnego SCF został przecięty w połączeniu z UXT-V2-HA i myc-ub, silny sygnał rozmazu poliubikwitylowanego UXT-V2 zaobserwowano tylko dla białka 7 F-box typu dzikiego, co sugeruje, że UXT-V2 był poliubikwitylowany przez kompleks SCF F-box protein 7 i komórki w porównaniu z kontrolami.Etapy monoprecypitacji, w tym inkubacja lizatów komórkowych z równowagą kulek i wymywanie białek immunoprecypitowanych, są niezbędne do osiągnięcia celu tego protokołu. Po tej procedurze należy przeprowadzić test ubikwitylacji in vitro w celu potwierdzenia swoistości ubikwitylacji substratu przez ligazę E3.

evaluation-substrate-ubiquitylation-e3-ubiquitin-ligase-mammalian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ubikwitynacja jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Mutacje genów zaangażowanych w tę modyfikację są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych in vivo oraz w probówkach in vitro.

Wykrywanie ubikwitynacji białek

Ten film demonstruje metodę in vitro do SUMOylacji białek substratowych przy użyciu sekwencyjnej kaskady enzymatycznej. Ponadto status SUMOylacji białka jest identyfikowany za pomocą techniki elektroforezy i immunoblottingu.

Test SUMOylacji: technika in vitro do wykrywania stanu SUMOylacji białek substratowych za pomocą immunoblottingu

W przeciwieństwie do ligaz ubikwityny, zidentyfikowano kilka ligaz E3 SUMO. Ten zmodyfikowany protokół SUMOylacji in vitro jest w stanie zidentyfikować nowe ligazy SUMO E3 za pomocą testu rekonstytucji in vitro.

In vitro Test SUMOylacji do badania aktywności ligazy SUMO E3

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Ubikwitynacja to modyfikacja potranslacyjna, która odgrywa ważną rolę w procesach komórkowych i jest ściśle koordynowana przez deubikwitynację. Defekty w obu reakcjach leżą u podstaw ludzkich patologii. Udostępniamy protokoły do przeprowadzania reakcji ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych składników.

Testy ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro histonów nukleosomalnych

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie zarysu kompleksowych badań biochemicznych i funkcjonalnych ligaz ubikwityny typu E3 typu RING. Ten wieloetapowy potok, ze szczegółowymi protokołami, weryfikuje aktywność enzymatyczną badanego białka i pokazuje, jak powiązać tę aktywność z funkcjonowaniem.

Charakterystyka funkcjonalna ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta

Ta metoda opisuje ocenę globalnych zmian w topologii łańcucha ubikwityny. Ocena jest przeprowadzana poprzez zastosowanie ukierunkowanego podejścia proteomicznego opartego na spektrometrii mas.

Analiza łańcucha ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji

Niniejsze badanie dostarcza szczegółowych protokołów testów ubikwitylacji in vitro do analizy aktywności katalitycznej ligazy ubikwityny E3. Rekombinowane białka ulegały ekspresji przy użyciu systemów prokariotycznych, takich jak hodowla Escherichia coli.

In vitro Analiza funkcji ligazy ubikwityny E3

Ubikwitynacja jest kluczowym regulatorem funkcji białek wewnątrzkomórkowych. Tutaj opisujemy dwie metody lizy komórek do wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych w komórkach ssaków oraz porównujemy ich skuteczność w analizie poziomów ubikwitynacji. Nadekspresja białek w HEK293T komórkach została wywołana przejściową transfekcją, a białka ubikwitynowane wykryto analizą western blota.

Porównawcze strategie wykrywania ubiquitynacji w lizatach komórek ssaków z wykorzystaniem SMAD2/SMURF2 jako modelu

Protokół ten opisuje metodę ubikwitynacji Streptococcus pneumoniae przy użyciu lizatu komórek ssaków lub czystego kompleksu enzymów ubikwityny, a następnie leczenie oczyszczonym kompleksem białkowym VCP/p97-UFD1-NPLOC4 w celu oceny aktywności bakteriolitycznej, umożliwiającej badanie efektorów immunologicznych zależnych od ubikwityny.

In vitro Rekonstrukcja ubikwitynacji bakteryjnej i eliminacja pośredniczona przez VCP/p97

Poznaj metodę oceny ubikwitylacji substratu przez ligazę E3 w lizatach komórek ssaków HEK293T. Ta technika wykorzystuje immunoprecypitację i Western blot do badania modyfikacji białek.

Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

Przeglądaj więcej filmów