Name: Mikroskopia konfokalna do pomiaru trzech trybów dynamiki porów fuzyjnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Poznaj mikroskopię konfokalną do pomiaru trzech trybów dynamiki porów fuzyjnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy. Ta metoda łączy obrazowanie z rejestracją patch-clamp, umożliwiając wizualizację otwierania i zamykania porów fuzyjnych oraz określenie ich kinetyki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Wewnętrznym Programom Badawczym NINDS (ZIA NS003009-13 i ZIA NS003105-08) za wsparcie tej pracy.

<ol><li>Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+and+endocytosis%3A+modes%2C+functions%2C+and+coupling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li>
<li>Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pores+and+their+control+of+neurotransmitter+and+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release.</a> Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).</li>
<li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Viral membrane fusion.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).</li>
<li>Zhao, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemi-fused+structure+mediates+and+controls+fusion+and+fission+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells.</a> Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).</li>
<li>Klyachko, V. A., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitance+steps+and+fusion+pores+of+small+and+large-dense-core+vesicles+in+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals.</a> Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li>
<li>Chiang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-fusion+structural+changes+and+their+roles+in+exocytosis+and+endocytosis+of+dense-core+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles.</a> Nature Communications. 5, 3356(2014).</li>
<li>Sharma, S., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fusion+pore%2C+60+years+after+the+first+cartoon%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Letters%22%5BJournal%5D)">The fusion pore, 60 years after the first cartoon.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).</li>
<li>Jorgacevski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Munc18-1+tuning+of+vesicle+merger+and+fusion+pore+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).</li>
<li>Rituper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+cholesterol+controls+exocytotic+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore.</a> Cell Calcium. 101, 102503(2021).</li>
<li>Gucek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+negative+SNARE+peptides+stabilize+the+fusion+pore+in+a+narrow%2C+release-unproductive+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).</li>
<li>Grabner, C. P., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+synaptic+vesicles+mediate+stimulated+exocytosis+from+cochlear+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).</li>
<li>Wen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+provides+membrane+tension+to+merge+fusing+vesicles+into+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane.</a> Nature Communications. 7, 12604(2016).</li>
<li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Membrane+Pore+in+Live+Cells+Reveals+a+Dynamic-Pore+Theory+Governing+Fusion+and+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis.</a> Cell. 173 (4), 934-945 (2018).</li>
<li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+Shrinking+and+Enlargement+Play+Opposing+Roles+in+the+Release+of+Exocytotic+Contents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents.</a> Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).</li>
<li>Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+sequential+compound+fusion+and+kiss-and-run+in+live+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+control+of+kiss-and-run+and+vesicular+reuse+probed+with+single+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles.</a> Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).</li>
<li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+features+between+chromaffin+and+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Common features between chromaffin and neural progenitor cells.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 351(2012).</li>
<li>Bornstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromaffin+cells%3A+the+peripheral+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Chromaffin cells: the peripheral brain.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).</li>
<li>Park, Y., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+plasticity+of+small+synaptic+vesicle+%28SSV%29+and+large+dense-core+vesicle+%28LDCV%29+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis.</a> Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).</li>
<li>Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThahouly%2C+T+%22Exocytosis+and+Endocytosis.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology</a>. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).</li>
<li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preformed+Omega-profile+closure+and+kiss-and-run+mediate+endocytosis+and+diverse+endocytic+modes+in+neuroendocrine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells.</a> Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).</li>
<li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).</li>
<li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Tension+Inhibits+Rapid+and+Slow+Endocytosis+in+Secretory+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells.</a> Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).</li>
<li>Revelo, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+probe+for+super-resolution+imaging+of+membranes+elucidates+trafficking+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways.</a> Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).</li>
<li>Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAAX-box+protein%2C+prenylation+process+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+translational+research%22%5BJournal%5D)">CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis.</a> American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+demystified%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li>
<li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+vesicles+from+frog+neuromuscular+junctions+by+prolonged+tetanic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation.</a> Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18(2009).</li>
<li>Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MINFLUX+nanometer-scale+3D+imaging+and+microsecond-range+tracking+on+a+common+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope.</a> Nature Communications. 12 (1), 1478(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opisano metodę obrazowania pod mikroskopem konfokalnym w celu wykrycia dynamiki porów fuzyjnych i uwalniania nadajnika, a także trzech trybów fuzji: fuzji zamkniętej, fuzji podtrzymującej i fuzji skurczowej w komórkach chromochłonnych nadnerczybydła 4,24. Opisano elektrofizjologiczną metodę depolaryzacji komórki, a tym samym wywołania egzo- i endocytozy. Systematyczne przetwarzanie obrazu konfokalnego dostarcza informacji o różnych trybach zachowania porów w przy...

Fuzja błonowa pośredniczy w wielu funkcjach biologicznych, w tym w transmisji synaptycznej, homeostazie stężenia glukozy we krwi, odpowiedzi immunologicznej i wnikaniu wirusa1,2,3. Egzocytoza, polegająca na fuzji pęcherzyków na błonie komórkowej, uwalnia neuroprzekaźniki i hormony w celu osiągnięcia wielu ważnych funkcji, takich jak aktywność sieci neuronalnej. Fuzja otwiera pory, aby uwolnić zawartość pęcherzykową, po czym pory mogą się zamknąć, aby odzyskać pęcherzyk łączący, który jest określany jako kiss-and-run1,4. Zarówno nieodwracalne, jak i odwracalne otwarcie porów fuzyjnych można zmierzyć za pomocą zapisów pojemnościowych dołączonych do komórek w połączeniu z zapisami przewodnictwa porowego fuzji pojedynczych pęcherzyków.
To jest często interpretowane jako odzwierciedlenie fuzji pełnego załamania, obejmującej dylatację fuzji aż do spłaszczenia pęcherzyka zgrzewającego, oraz kiss-and-run, obejmującej odpowiednio otwieranie i zamykanie porów fuzji5,6,7,8,9,10,11,12,13. Niedawne badania obrazowania konfokalnego i wymuszonego zubożenia emisji (STED) w komórkach chromochłonnych bezpośrednio zaobserwowały otwieranie i zamykanie porów fuzyjnych (kiss-and-run, zwane również close-fusion), otwieranie porów fuzyjnych, które utrzymuje kształt Ω z otwartym porem przez długi czas, zwane fuzją podtrzymującą, oraz kurczenie się pęcherzyka łączącego, aż do całkowitego połączenia się z błoną plazmatyczną, która zastępuje fuzję pełnego zapadnięcia w celu połączenia pęcherzyków łączących się z błoną plazmatyczną4, 8,14,15,16,17.
W neuronach wykryto otwieranie i zamykanie porów fuzyjnych za pomocą obrazowania pokazującego uwalnianie kropek kwantowych wstępnie załadowanych w pęcherzyki, które są większe niż pory fuzyjne oraz za pomocą pomiarów przewodnictwa porów fuzyjnych na powierzchni uwalniania zakończeń nerwowych5,18,19. Komórki chromochłonne nadnerczy są szeroko stosowane jako model do badania egzo- i endocytozy20,21. Chociaż komórki chromochłonne zawierają duże pęcherzyki o gęstym rdzeniu, podczas gdy synapsy zawierają małe pęcherzyki synaptyczne, białka egzocytozy i endocytozy w komórkach chromochłonnych i synapsach są dość podobne10,11,12,20,21,22,23.
Tutaj opisana jest metoda pomiaru tych trzech trybów fuzji za pomocą metody obrazowania konfokalnego połączonego z elektrofizjologią w komórkach chromochłonnych nadnerczy bydła (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Metoda ta polega na załadowaniu fluorescencyjnych fałszywych neuroprzekaźników (FFN511) do pęcherzyków w celu wykrycia egzocytozy; dodanie Atto 655 (A655) do roztworu kąpieli w celu wypełnienia profilu w kształcie Ω generowanego przez fuzję i znakowanie błony plazmatycznej domeną PH fosfolipazy C δ (PH), która wiąże się z PtdIns(4,5)P2 na błonie plazmatycznej8,15,24. Dynamikę porów fuzyjnych można wykryć poprzez zmiany intensywności fluorescencji. Chociaż opisana tutaj zasada działania tej metody może być szeroko stosowana do wielu komórek wydzielniczych, znacznie wykraczających poza komórki chromochłonne.

<table><tbody><tr><td>Sól magnezowa adenozyno-5'-trifosforanu</td><td>Sigma</td><td>A9187-500MG</td><td>ATP do przygotowania roztworu wewnętrznego</td></tr><tr><td>Atto 655</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 655-21</td><td>Barwnik Atto do oznaczania roztworu do kąpieli</td></tr><tr><td>Podstawowy nukleofektor dla neuronów pierwotnych</td><td>Lonza</td><td>VSPI-1003</td><td>Bufor do transfekcji elektroporacyjnej wraz z zestawem</td></tr><tr><td>Pipeta ze szkła kapilarnego boroscilicate</td><td>Warner Instrumenty</td><td>64-0795</td><td>Standardowa ścianka z żarnikiem OD=2,0 mm ID=1,16 mm Długość=7,5 cm</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A2153-50G</td><td>Odczynnik do trawienia gruczołów</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia 2 M</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>351-130-721</td><td>Odczynnik do przygotowania roztworu do kąpieli</td></tr><tr><td>Sitka komórkowe, 100 &mikro; m</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td>Materiał do filtracji zawiesiny komórek chromochłonnych</td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku cezu</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td>Odczynnik do przygotowania roztworu wewnętrznego i buforu zapasowego Cs-glutaminianu/Cs-EGTA</td></tr><tr><td>Kolagenaza P</td><td>Sigma</td><td>11213873001</td><td>Enzym do trawienia gruczołów</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Neuvitro</td><td>GG-14-Laminin</td><td>GG-14-Laminin, średnica 14 mm#1 grube 60 sztuk Laminin powlekane niemieckie szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td>Odczynnik do przygotowania Locke'a' s roztwór i roztwór do kąpieli</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885092</td><td>Odczynnik do przygotowania pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>324626-25GM</td><td>Odczynnik do przygotowania buforu podstawowego Cs-EGTA do kąpieli roztworu</td></tr><tr><td>Elektroporacja i Nucleofector</td><td>Amaxa Biosystems</td><td>Nucleofector II</td><td>Transfekcja plazmidów do komórek</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10082147</td><td>Odczynnik do przygotowania pożywki</td></tr><tr><td>hodowlanej FFN511</td><td>Abcam</td><td>ab120331</td><td>Fluorescencyjny fałszywy neuroprzekaźnik do znakowania pęcherzyków</td></tr><tr><td>Hydrat soli sodowej 5'-trifosforanu guanozyny</td><td>Sigma</td><td>G8877-250MG</td><td>GTP do przygotowania roztworu wewnętrznego</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td>Odczynnik do przygotowania Locke'a s rozwiązanie</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Igor pro</td><td>Oprogramowanie do analizy patch-clamp i prezentacji danych obrazowych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Leica Application Suite X</td> Oprogramowanie <td>Leica</td><td>LAS X</td><td>Konfokalne oprogramowanie do zbierania i analizy danych obrazowych</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy Leica</td><td></td><td>Leica TCS SP5</td><td>Mikroskop konfokalny do zbierania</td></tr> <tr><td>danych obrazowychKwas L-glutaminowy</td><td>Sigma</td><td>49449-100G</td><td>Odczynnik do przygotowania buforu podstawowego Cs-glutaminianu do roztworu do kąpieli</td></tr><tr><td>Wzmacniacz typu lock-in</td><td>Heka</td><td>Lock-in</td><td>Oprogramowanie do zapisu pojemnościowego</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu 1 M</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>351-033-721EA</td><td>Odczynnik do przygotowania roztworu wewnętrznego i roztworu do kąpieli</td></tr><tr><td>Hemacytometr metalizowany Hausser Bright-Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>Komora licząca</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Polskie pipety poprawiające tworzenie i stabilność uszczelek giga-omowych</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Millex-GP, 0,22 i mikro; m</td><td>Millipore</td><td>SLGPR33RB</td><td>Materiał do płukania i trawienia gruczołów</td></tr><tr><td>mNG (mNeonGreen)</td> <td>Allele Biotechnology</td><td>ABP-FP-MNEONSB</td><td>Szablon do konstrukcji PH-mNeonGreen</td></tr><tr><td>Siatka nylonowa 100 mikronów</td><td>EIKO filtrująca co</td><td>03-100/32</td><td>Materiał do filtracji zawiesiny rdzenia</td></tr><tr><td>Zacisk krosowy EPC-10</td><td>Heka</td><td>EPC-10</td><td>Wzmacniacz do danych patch-clamp kolekcja</td></tr><tr><td>PH-EGFP</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #51407</td><td>Szkielet do konstrukcji PH-mNeonGreen</td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Zrób pipety do nagrywania patch-clamp</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P5404-500G</td><td>Odczynnik do przygotowania Locke'a s roztwór i roztwór do kąpieli</td></tr><tr><td>Oprogramowanie impulsowe</td><td>Heka</td><td>Pulse</td><td>Software do zbierania danych o patch-clampach</td></tr><tr><td>Komora nagraniowa</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1943/QR-40LP</td><td>komora nakrywkowa, nałóż pipetę krosową na żywe komórki</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td>Odczynnik do przygotowania Locke'a s roztwór, roztwór do kąpieli i roztwór wewnętrzny</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S5881-500G</td><td>Odczynnik do przygotowania Locke'a' s roztwór</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma</td><td>S0876-500G</td><td>Odczynnik do przygotowania Locke'a s roztwór</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>S8282-500G</td><td>Odczynnik do przygotowania Locke'a s roztwór</td></tr><tr><td>Mieszanie płyty grzejnej</td><td>Barnsted/Thermolyne</td><td>typ 10100</td><td>Grzałka do powlekania pipet woskiem</td></tr><tr><td>Strzykawka, 30 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>302832</td><td>Materiał do mycia gruczołów i trawienia</td></tr><tr><td>Chlorek tetraetyloamonu</td><td>Sigma</td><td>T2265-100G</td><td>HERBATA do przygotowania roztworu do kąpieli</td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Sigma</td><td>T9253-5G</td><td>Odczynnik do trawienia gruczołów</td></tr><tr><td>Typ F Płyn zanurzeniowy</td><td>Leica</td><td>195371-10-9</td><td>Olej do montażu konfokalnego Leica</td></tr></tbody></table>

mikroskopia konfokalna do pomiaru trzech trybów dynamiki porów fuzyjnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Dynamiczne otwieranie i zamykanie porów fuzji pośredniczy w egzocytozie i endocytozie oraz określa ich kinetykę. W tym miejscu pokazano szczegółowo, w jaki sposób mikroskopia konfokalna została wykorzystana w połączeniu z zapisem patch-clamp do wykrycia trzech trybów fuzji w komórkach chromochłonnych nadnerczy bydła hodowanych w hodowli pierwotnej. Trzy tryby fuzji obejmują: 1) fuzję bliską (zwaną również kiss-and-run), polegającą na otwieraniu i zamykaniu porów fuzyjnych, 2) fuzję pozostawczą, polegającą na otwieraniu porów fuzyjnych i utrzymywaniu otwartych porów, oraz 3) fuzję termokurczliwą, polegającą na kurczeniu się profilu w kształcie Ω generowanego przez fuzję, aż do całkowitego połączenia się z błoną plazmatyczną.
Aby wykryć te tryby fuzji, błona plazmatyczna została oznaczona nadekspresją mNeonGreen przyłączonego do domeny PH fosfolipazy C δ (PH-mNG), która wiąże się z fosfatydyloinozytolem-4,5-bisfosforanem (PtdIns(4,5)P2) w ulotce błony plazmatycznej skierowanej w stronę cytozolu; pęcherzyki zostały załadowane fluorescencyjnym fałszywym neuroprzekaźnikiem FFN511 w celu wykrycia uwolnienia zawartości pęcherzykowej; a Atto 655 zostało włączone do roztworu do kąpieli w celu wykrycia zamknięcia porów fuzyjnych. Te trzy sondy fluorescencyjne były obrazowane jednocześnie z prędkością ~20-90 ms na klatkę w żywych komórkach chromochłonnych w celu wykrycia otwarcia porów fuzyjnych, uwalniania zawartości, zamykania porów fuzyjnych i zmian wielkości pęcherzyków stapianych. Opisano metodę analizy w celu rozróżnienia trzech trybów fuzji z tych pomiarów fluorescencji. Opisana tutaj metoda może w zasadzie mieć zastosowanie do wielu komórek wydzielniczych poza komórkami chromochłonnymi.

Zgodnie z procedurami eksperymentalnymi przedstawionymi na Rysunku 1 oraz Rysunku 2, komórki chromafinne z nadnerczy bydlęcych przetransfekowano PH-mNG w celu oznakowania błony plazmatycznej; do roztworu kąpieli dodano A655 w celu wykrycia zamknięcia poru fuzyjnego; a do pęcherzyków wprowadzono fluorescencyjny fałszywy neuroprzekaźnik FFN511 w celu wykrycia uwalniania. Następnie wykonano konfokalne obrazowanie timelapse w płaszczyźnie XY dla FFN511, PH-mNG oraz ...

Ten protokół opisuje technikę obrazowania konfokalnego do wykrywania trzech trybów fuzji w komórkach chromochłonnych nadnerczy bydlęcych. Te tryby fuzji obejmują: 1) fuzję bliską (zwaną również pocałunkiem i ucieczką), polegającą na otwieraniu i zamykaniu porów fuzyjnych, 2) fuzję pozostawaną, polegającą na otwieraniu porów fuzyjnych i utrzymywaniu otwartych porów, oraz 3) fuzję termokurczliwą, polegającą na kurczeniu się stopionych pęcherzyków.

Mikroskopia konfokalna do pomiaru trzech trybów dynamiki porów fuzyjnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

Fuzja błonowa pośredniczy w wielu funkcjach biologicznych. Protokół ten opisuje metodę wykrywania otwarcia porów fuzyjnych i dynamiki uwalniania nadajnika oraz rozróżnienia trzech trybów fuzji; Fuzja bliska, fuzja pozostań i fuzja skurczona. Połączenie mikroskopu konfokalnego i zapisu patch-clamp ułatwia wizualizację otwierania i zamykania porów fuzyjnych oraz określenie ich kinetyki.Chociaż opisana dla komórek chromochłonnych, zasada opisanej tutaj metody może być szeroko stosowana do wielu komórek wydzielniczych, znacznie wykraczających poza komórki chromochłonne. Pomyślne wdrożenie tej metody zależy od kilku ogólnych etapów, takich jak generowanie zdrowej pierwotnej hodowli komórek chromochłonnych, wystarczająca wydajność transfekcji plazmidu i wysoki wskaźnik powodzenia zapisu elektrofizjologicznego. Wybierz trzy nienaruszone gruczoły bez nacięć i krwawień na powierzchni i usuń tkankę tłuszczową nożyczkami.Przemyj gruczoły przez perfuzję roztworem Locke'a, aż krew przestanie wypływać. W celu trawienia wstrzyknąć roztwór enzymu przez żyłę nadnerczy za pomocą 30-milimetrowej strzykawki dołączonej do filtra 0,22 mikrometra, aż gruczoł zacznie puchnąć. Następnie pozostaw gruczoły w

confocal-microscopy-to-measure-three-modes-fusion-pore-dynamics

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy metodę izolacji szybkich (mikrosekundowych) zdarzeń wapniowych od wolniejszych przepływów w żywych komórkach z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii skanującej. Metoda ta mierzy fluktuacje intensywności fluorescencji wskaźników wapnia poprzez rejestrację skanów liniowych obejmujących kilkaset pikseli w komórce. Analiza histogramowa pozwala na wyizolowanie skal czasowych różnych przepływów wapnia.

Pomiar szybkich przepływów jonów wapnia w kardiomiocytach

Fuzję mitochondriów mierzono poprzez śledzenie wyrównywania rozkładu fotokonwertowanego GFP skierowanego do macierzy w całej sieci mitochondrialnej w czasie. Do tej pory jednorazowo analizie kinetycznej trwającej godzinę mogła zostać poddana tylko jedna komórka. Przedstawiamy metodę, która umożliwia jednoczesny pomiar w wielu komórkach, co przyspiesza proces gromadzenia danych.

Szybszy test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, oparty na mtPA-GFP, umożliwiający równoległe pozyskiwanie danych kinetycznych z wielu komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Opracowaliśmy platformę programową wykorzystującą Imaris Neuroscience, ImarisXT oraz MATLAB do pomiaru zmian morfologii nieokreślonego kształtu uzyskanego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc tym samym potencjalne dodatkowe narzędzie w procesie odkrywania leków.

Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Mikroskopia fluorescencyjna z pełnym wewnętrznym odbiciem (pTIRFM) oparta na polaryzacji umożliwia wykrywanie dynamiki błony komórkowej w czasie rzeczywistym. W artykule opisano implementację pTIRFM do badania przebudowy błony podczas regulowanej egzocytozy. Technikę tę można uogólnić na inne procesy w biologii komórki, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się ze zmianami kształtu błony.

Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM

Po egzocytozie, zrośnięta błona plazmatyczna jest odzyskiwana w procesie znanym jako endocytoza. Mechanizm ten reformuje nowe pęcherzyki synaptyczne do następnej rundy uwalniania. Poszczególne zdarzenia endocytarne są wychwytywane i analizowane za pomocą zapisów pojemności przyłączonych do komórek w chromochłonnych komórkach nadnerczy myszy.

Metody pomiarów pojemności przyłączonej do komórki w komórkach chromochłonnych nadnerczy myszy

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Ten protokół obrazuje zarówno powstawanie synaps immunologicznych, jak i późniejszy spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku synapsy immunologicznej. Koniugaty komórkowe utworzono między komórką Raji impulsową superantygenem (działającą jako komórka prezentująca antygen) a klonem Jurkat (działającym jako limfocyt T wspomagający efektor).

Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Ze względu na niski stosunek sygnału do szumu (SNR) czujników opartych na transferze energii rezonansu (FRET) Fӧrster, pomiar sygnałów cAMP był wyzwaniem, zwłaszcza w trzech wymiarach przestrzennych. W tym miejscu opisujemy metodologię obrazowania i analizy hiperspektralnej FRET, która umożliwia pomiar rozkładu cAMP w trzech wymiarach przestrzennych.

Pomiar trójwymiarowych rozkładów cAMP w żywych komórkach przy użyciu 4-wymiarowego (x, y, z i λ) hiperspektralnego obrazowania i analizy FRET

Poznaj mikroskopię konfokalną do pomiaru trzech trybów dynamiki porów fuzyjnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy. Ta metoda łączy obrazowanie z rejestracją patch-clamp, umożliwiając wizualizację otwierania i zamykania porów fuzyjnych oraz określenie ich kinetyki.

Mikroskopia konfokalna do pomiaru trzech trybów dynamiki porów fuzyjnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy

Przeglądaj więcej filmów