Mikroskopia konfokalna do pomiaru trzech trybów dynamiki porów fuzyjnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy

Fuzja błonowa pośredniczy w wielu funkcjach biologicznych. Protokół ten opisuje metodę wykrywania otwarcia porów fuzyjnych i dynamiki uwalniania nadajnika oraz rozróżnienia trzech trybów fuzji; Fuzja bliska, fuzja pozostań i fuzja skurczona. Połączenie mikroskopu konfokalnego i zapisu patch-clamp ułatwia wizualizację otwierania i zamykania porów fuzyjnych oraz określenie ich kinetyki.

Chociaż opisana dla komórek chromochłonnych, zasada opisanej tutaj metody może być szeroko stosowana do wielu komórek wydzielniczych, znacznie wykraczających poza komórki chromochłonne. Pomyślne wdrożenie tej metody zależy od kilku ogólnych etapów, takich jak generowanie zdrowej pierwotnej hodowli komórek chromochłonnych, wystarczająca wydajność transfekcji plazmidu i wysoki wskaźnik powodzenia zapisu elektrofizjologicznego. Wybierz trzy nienaruszone gruczoły bez nacięć i krwawień na powierzchni i usuń tkankę tłuszczową nożyczkami.

Przemyj gruczoły przez perfuzję roztworem Locke'a, aż krew przestanie wypływać. W celu trawienia wstrzyknąć roztwór enzymu przez żyłę nadnerczy za pomocą 30-milimetrowej strzykawki dołączonej do filtra 0,22 mikrometra, aż gruczoł zacznie puchnąć. Następnie pozostaw gruczoły w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut.

Wstrzyknąć ponownie i pozostawić gruczoły w temperaturze 37 stopni Celsjusza na kolejne 10 minut. Po strawieniu przeciąć gruczoł wzdłuż od żyły nadnerczy do drugiego końca nożyczkami, aby rozłożyć gruczoł. Wyizoluj biały rdzeń, wyjmując go na kawałki na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór Locke'a.

Wytnij i zmiel rdzeń nożyczkami. Przefiltrować zawiesinę rdzenia za pomocą siatki nylonowej o grubości od 80 do 100 mikrometrów do zlewki. Przenieść filtrat do 50-mililitrowej probówki stożkowej i odwirować w temperaturze pokojowej 48 x g przez trzy minuty ze spowolnieniem o trzy.

Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy roztworem Locke'a przez pipetowanie. Przefiltrować zawiesinę komórkową za pomocą sitka o wielkości od 80 do 100 mikrometrów i odwirować w temperaturze pokojowej 48 x g przez trzy minuty z trzykrotnym opóźnieniem. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 30 mililitrami pożywki hodowlanej.

Określ liczbę komórek za pomocą komory zliczającej hemocytometr. Przenieś 2 800 000 komórek do 15-mililitrowej probówki. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 48 x g przez dwie minuty, ze spowolnieniem o trzy.

Do osadu komórkowego dodać 100 mikrolitrów buforu do przesiewania dostarczonego przez producenta. A następnie dodaj dwa mikrogramy plazmidu PH-mNG. Delikatnie wymieszać zawiesinę, przepuszczając roztwór w górę i w dół, a następnie niezwłocznie przenieść mieszaninę do kuwety elektroporacyjnej.

Natychmiast przenieś kuwetę do elektroporatora, wybierz program 005 z listy ekranowej i naciśnij Enter, aby wykonać elektroporację. Po elektroporacji natychmiast dodaj 1,8 mililitra pożywki do kuwety i delikatnie wymieszaj mikropipetą wyposażoną w sterylną końcówkę. Dodać 300 mikrolitrów zawiesiny elektroporowanych ogniw na szkiełko nakrywkowe w każdym naczyniu, posiewając w sumie od pięciu do sześciu szalek na jedną reakcję elektroporacji.

Ostrożnie przenieś naczynia do nawilżonego inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 9% dwutlenkiem węgla na 30 minut i delikatnie dodaj dwa mililitry podgrzanego podłoża do każdego naczynia po 30 minutach. Przygotuj pipety plastrowe z kapilar ze szkła borokrzemianowego, ciągnąc je ściągaczem do pipet, pokrywając ich końcówki płynnym woskiem i polerując je mikrokuźnią. Włącz wzmacniacz nagrywający z zaciskiem krosowym i uruchom oprogramowanie.

Ustaw odpowiednie parametry zapisu prądu wapniowego i pojemności w oprogramowaniu. Ustaw protokół nagrywania trwający łącznie 60 sekund, w którym stymulacja rozpoczyna się po 10 sekundach. Ustaw potencjał podtrzymania dla napięcia cęgowego zapisu na 80 miliwoltów.

Ustaw jednosekundową depolaryzację od minus 80 miliwoltów do 10 miliwoltów jako bodziec do wywołania napływu wapnia i skoku pojemności. Włącz system mikroskopu konfokalnego i ustaw odpowiednie parametry w oprogramowaniu. Włącz lasery, w tym 458 nanometrów, 514 nanometrów i 633 nanometry i ustaw zakres zbierania emisji dla każdego lasera zgodnie z każdą sondą fluorescencyjną.

Wybierz naczynie o dobrym stanie komórek i odpowiedniej ekspresji i dodaj dwa mikrolitry fluorescencyjnego fałszywego neuroprzekaźnika FFN511 do pożywki w naczyniu. Włóż naczynie z powrotem do inkubatora na 20 minut. Po załadowaniu FFN511 przygotuj komorę zapisu i dodaj dwa mikrolitry barwnika fluorescencyjnego A655 do 50 mikrolitrów roztworu do kąpieli.

Przenieść szkiełko nakrywkowe z naczynia do komory zapisu za pomocą pęsety i natychmiast dodać roztwór do kąpieli zawierający A655. Umieść kroplę olejku na obiektywie 100X z zanurzeniem w olejku. Zamontuj komorę w mikroskopie i za pomocą pokrętła regulacyjnego olej powinien zetknąć się z dolną częścią szkiełka nakrywkowego.

Ustaw ostrość komórek i użyj jasnego pola i obrazowania konfokalnego, aby znaleźć odpowiednią komórkę z ekspresją mNG. Powiększ zaznaczoną komórkę i wyśrodkuj ją w polu widzenia, minimalizując puste obszary. Ustaw parametry obrazowania konfokalnego w płaszczyźnie XY w stałej płaszczyźnie Z FFN511, PH-mNG i A665 ze zminimalizowanym interwałem czasu.

Ustaw ostrość na dole komórki za pomocą pokrętła precyzyjnej regulacji. Dostosuj moc lasera wzbudzającego w oprogramowaniu, aby znaleźć ustawienie, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu i uniknąć znacznego wybielania fluorescencyjnego. Dodać dziewięć mikrolitrów roztworu wewnętrznego do pipety krosowej i przymocować pipetę do uchwytu clamp krosowego amplifier stage.

Zastosować niewielką ilość nadciśnienia za pomocą strzykawki i przesunąć końcówkę pipety, aby dotknąć roztworu do kąpieli za pomocą mikromanipulatora. Upewnij się, że wzmacniacz pokazuje, że rezystancja pipety wynosi w przybliżeniu od dwóch do czterech megaomów za pomocą testu impulsów napięcia. Naciśnij LJ/Auto, aby anulować złącze cieczy.

Przesuń pipetę w kierunku wybranej komórki za pomocą mikromanipulatora. Aby utworzyć tryb dołączania do komórki, przesuń końcówkę pipety tak, aby dotknąć komórki. Zmień potencjał utrzymywania od zera do minus 80 miliwoltów, stosując delikatne podciśnienie za pomocą strzykawki.

Gdy rezystancja przekroczy jeden gigaom, odczekaj około 30 sekund, aż konfiguracja się ustabilizuje. Naciśnij C-fast/Auto, aby skompensować dużą pojemność. Aby utworzyć tryb hurtowy, zastosuj krótkie, ale silne impulsy podciśnienia za pomocą strzykawki, aż membrana pęknie.

Naciśnij C-slow/Auto, aby skompensować niską pojemność. Nieznacznie dostosuj ostrość obrazowania, aby ustawić ostrość na dnie komórki. Rozpocznij jednocześnie konfokalne obrazowanie poklatkowe i nagrywanie z zaciskiem krosowym, klikając przycisk Start w dwóch różnych aplikacjach.

Po nagraniu upewnij się, że dane zostały zapisane. Zmień potencjał podtrzymania z powrotem na zero miliwoltów. Wyjąć pipetę z roztworu do kąpieli i wyrzucić ją.

Otwórz pliki obrazów RAW za pomocą dowolnego producenta lub dostarczonego oprogramowania. Przejdź do Proces, kliknij ProcessTools i użyj narzędzi do generowania plików średniej kroczącej dla każdego obrazu poklatkowego. Zapisz te pliki.

W obszarze kwantyfikacji przejdź do Narzędzia i kliknij przyciski Profil stosu, aby sprawdzić punkty czasowe przed i po stymulacji oraz zidentyfikować zmiany fluorescencji w każdym kanale. Kliknij przycisk Narysuj elipsę, aby zakreślić obszary zainteresowania dla zdarzeń fuzji. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i kliknij Zapisz zwrot z inwestycji, aby zapisać.

Kliknij przycisk Otwórz projekty, aby zlokalizować plik raw. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i kliknij Załaduj ROI, aby załadować plik ROI do pliku obrazowania RAW w celu zmierzenia intensywności fluorescencji. Przejdź do Narzędzi i kliknij Sortuj ROI w oprogramowaniu i narysuj ślady dla wszystkich trzech kanałów każdego ROI.

Kliknij przycisk Raport, aby zapisać dane ROI, w tym dane cyfrowe i ślady obrazowania dla każdego ROI, w folderze plików. Zapis całej komórki patch-clamp i zastosowanie jednosekundowej depolaryzacji od 80 do 10 miliwoltów przeprowadzono w celu wywołania egzo i endocytozy. Zastosowana depolaryzacja indukowała wewnętrzny prąd wapnia, skok pojemności, wskazujący na egzocytozę, oraz zanik pojemności po skoku, wskazujący na endocytozę.

W przypadku obrazowania poklatkowego na dnie komórki, zdarzenia fuzji wywołane jednosekundowym protokołem depolaryzacji zostały wskazane jako spadek FFN odzwierciedlający uwolnienie FFN511, któremu towarzyszył wzrost fluorescencji punktowej FPH i A655, odzwierciedlający dyfuzję PH-mNG i A655 z błony plazmatycznej i roztworu kąpieli do pęcherzyka łączącego. Rysunek przedstawia ścisłą fuzję zidentyfikowaną jako pociemnienie F655, podczas gdy FPH utrzymywało się lub zanikało z opóźnieniem. Rysunek przedstawia fuzję podtrzymującą wykrytą przez obecność plamek zarówno PH-mNG, jak i A655.

Rysunek przedstawia fuzję skurczową wykrytą jako równoległy rozpad FPH i F655, któremu towarzyszy równoległe zmniejszenie rozmiaru plamki PH-mNG i plamki A655 Pomyślne nagranie wymaga wygenerowania całej konfiguracji komórki za pomocą patch-clamp i obrazowania na dnie komórki z odpowiednią intensywnością fluorescencji dla każdego kanału. Opisane tutaj połączenie elektrofizjologii i mikroskopii superrozdzielczej jest cennym narzędziem do pomiaru dynamiki porów fuzyjnych i obwodów nerwowych.