Obrazowanie migracji neutrofili w skórze myszy w celu zbadania przebudowy błony subkomórkowej w warunkach fizjologicznych

Metoda ta opisuje technikę badania przebudowy błony podczas migracji neutrofili u żywego zwierzęcia przy użyciu mikroskopii subkomórkowej przyżyciowej. Protokół ten zapewnia unikalne podejście do badania dynamiki błony podczas migracji zwierząt w warunkach fizycznych oraz do odciążenia mikrośrodowiska tkanek. Technikę tę można dostosować do rozwiązywania problemów związanych z przebudową błony i cytoszkieletem, dynamiczną repozycją narządów i transportem błon w różnych typach komórek i komórkach migrujących.

Na początek dodaj zielony barwnik fluorescencyjny do zawiesiny neutrofili, oczyszczonej z myszy typu dzikiego w 1,5 mililitra probówki pokrytej BSA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem w rotatorze probówkowym. Wykonać trzy płukania za pomocą HBSS, a następnie odwirować w temperaturze pokojowej 400 razy G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrowym roztworze soli Hanksa.

Umieścić tę zawiesinę w probówce pokrytej BSA w rotatorze rurki pod delikatnym mieszaniem aż do procedury wstrzykiwania. Przed wstrzyknięciem należy ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze soli fizjologicznej, aby osiągnąć gęstość od 2 milionów do 5 milionów komórek na 20 mikrolitrów. Przenieś znieczulone zwierzę do podkładki rozgrzewającej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby utrzymać temperaturę ciała.

Po przetestowaniu odruchu wycofywania łapy usuń włoski z ucha za pomocą precyzyjnego trymera, aby zoptymalizować jakość obrazu. Połóż zwierzę na boku, przytrzymaj krawędź ucha i spłaszcz je wzdłuż podkładki rozgrzewającej za pomocą taśmy chirurgicznej, a następnie napełnij strzykawkę wyposażoną w igłę o rozmiarze 33 zawiesiną neutrofili i zamontuj ją na mikromanipulatorze. Delikatnie przesuń igłę w kierunku ucha i powoli przekłuj skórę.

Gdy igła znajdzie się w skórze, powoli popchnij tłok i dostarcz od dwóch do trzech mikrolitrów zawiesiny komórek. Po ostrożnym powtórzeniu wstrzyknięcia dla dwóch do trzech różnych obszarów ucha, ostrożnie usuń taśmę chirurgiczną i pozwól zwierzęciu odzyskać przytomność pod nadzorem. Przed przystąpieniem do obrazowania należy pozwolić zwierzęciu odpocząć przez godzinę, aby tkanka i komórki mogły dojść do siebie po zabiegu wstrzyknięcia.

Upewnij się, że mikroskop jest włączony, a stage i soczewki są wstępnie podgrzane do 37 stopni Celsjusza przed umieszczeniem znieczulonego zwierzęcia na stoliku mikroskopu. Zakryj otwór w stoliku szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Ostrożnie przenieś znieczulone zwierzę na scenę.

Jeśli obrazowanie jest planowane na więcej niż godzinę, należy nałożyć maść okulistyczną i zabezpieczyć system perfuzyjny oparty na infuzji skrzydlatej. Umieść kroplę soli fizjologicznej na środku szkiełka nakrywkowego i umieść na nim ucho z wstrzykniętymi neutrofilami. Delikatnie spłaszcz ucho za pomocą sterylnego bawełnianego wacika na środku szkiełka nakrywkowego, aby usunąć kieszenie powietrzne.

Zabezpiecz ucho, delikatnie dociskając drewniany patyczek do boku ucha bliżej głowy zwierzęcia i blokując je taśmą. Następnie znajdź obszar zainteresowania za pomocą okularu mikroskopu i przełącz się w tryb akwizycji wielu fotonów. Ustaw długość fali wzbudzenia laserowego na 900 do 930 nanometrów, aby umożliwić jednoczesne pozyskiwanie zielonego barwnika fluorescencyjnego, mTomato i kolagenu-I.

Następnie ustaw odpowiedni zestaw luster i kombinacji filtrów na detektorach, aby zbierać emitowane światło. Określ ustawienie najbardziej odpowiednie dla konfiguracji sprzętowej. Nawet jeśli migrujące komórki można śledzić w odstępach od 30 sekund do jednej minuty, obrazuj zdarzenia subkomórkowe z większą prędkością, co najmniej w odstępach krótszych niż dziesięć sekund.

W klasycznym podejściu do mikroskopii przyżyciowej użyj soczewki 30X i skanera Galvo o rozmiarze obrazu 512 na 512 pikseli, aby śledzić migrację komórek i badać tkankę myszy gospodarza, a następnie ustaw przemieszczenie osi Z za pomocą zmotoryzowanego stolika o wielkości kroku dwóch mikrometrów, aby umożliwić obrazowanie objętości o głębokości 30 mikrometrów co 30 sekund. W podejściu do mikroskopii subkomórkowej przyżyciowej użyj soczewki 40X i skanera rezonansowego z trzykrotnym uśrednieniem, aby zobrazować wysoce dynamiczną przebudowę błony w większym powiększeniu i rozdzielczości. Ustaw również przemieszczenie osi Z za pomocą piezoelektrycznego kroku o wielkości jednego mikrometra, co pozwala na obrazowanie objętości na głębokość 20 mikrometrów co cztery do pięciu sekund.

Wywołaj sterylne uszkodzenie lasera, aby wywołać migrację neutrofili, skupiając laser wzbudzający o dużej mocy na wąskim obszarze 20 na 20 mikrometrów przez 10 sekund. Zidentyfikuj uraz wywołany laserem na podstawie silnych sygnałów autofluorescencyjnych pojawiających się we wszystkich kanałach i wynikającej z tego zmiany układu kolagenu. Zapisz dane po zakończeniu eksperymentowania do dalszych analiz.

Mysz biorczyni umożliwiła wizualizację cech strukturalnych w tkance ucha, takich jak naczynia krwionośne, komórki rezydentne i mieszki włosowe, za pomocą podejścia opartego na mikroskopii przyżyciowej. Urazy wywołane laserem były łatwe do uwidocznienia dzięki ich silnej autofluorescencji wykrytej we wszystkich kanałach oraz zmianom w ułożeniu kolagenu. Pełny widok trójwymiarowej architektury skóry i lokalizacji wstrzykniętych neutrofili przedstawia stos Z skóry od warstwy zewnętrznej do wewnętrznej w trójwymiarowym renderowaniu objętościowym.

Obrazowanie poklatkowe pokazało, że neutrofile pobierają próbki ze skóry ucha i wchodzą w interakcję z macierzą wewnątrzkomórkową i tkanką gospodarza. Za pomocą przyżyciowej mikroskopii subkomórkowej wyraźnie uwidoczniono dynamiczną przebudowę błony plazmatycznej podczas migracji, tworzenie się wypukłości błony na krawędzi natarcia oraz cofanie się tylnej części komórek. Sekwencje poklatkowe ujawniają złożoność interakcji z macierzą wewnątrzkomórkową.

Lokalną dynamikę błony plazmatycznej analizowano za pomocą algorytmu opartego na identyfikacji 100 punktów granicznych znajdujących się pod powierzchnią komórki. Zmiany w lokalnej krzywiźnie i obszarze podkreślonym przez wypukłości błony plazmatycznej zostały obliczone dla każdego punktu granicznego i zgłoszone dla każdego przedziału czasowego w postaci kymogramów. Zarówno przód, jak i tył komórek zachowują większą krzywiznę niż bok komórek.

Ujemne zmiany obszaru są bardziej widoczne z tyłu komórek niż na krawędzi natarcia, gdzie dodatnie zmiany obszaru są bardziej widoczne. Po obrazowaniu tkanka może zostać pobrana, utrwalona i przetworzona w celu barwienia w celu dalszej oceny celu zainteresowania i wyjaśnienia mechanizmów. Ta procedura mająca na celu obrazowanie dynamiki błony może być dostosowana do szerszego pytania dotyczącego biologii komórki w różnych typach komórek i komórkach migrujących w ich odpowiednich środowiskach.