Name: Obrazowanie migracji neutrofili w skórze myszy w celu zbadania przebudowy błony subkomórkowej w warunkach fizjologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj mikroskopię subkomórkową in vivo do badania dynamiki błony neutrofili w skórze myszy. Ta technika umożliwia wizualizację przebudowy błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez wewnętrzny program badawczy National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

<ol><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).</li>
<li>Oudin, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+gradients+in+the+tumor+microenvironment+regulate+tumor+cell+invasion%2C+migration%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical gradients in the tumor microenvironment regulate tumor cell invasion, migration, and metastasis.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 81, 189-205 (2016).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+networks+that+regulate+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling networks that regulate cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 005959(2015).</li>
<li>Alexandrova, A. Y., Chikina, A. S., Svitkina, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+in+mesenchymal-to-amoeboid+transition+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton in mesenchymal-to-amoeboid transition of cancer cells.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 356, 197-256 (2020).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li>
<li>Wagner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWagner%2C+R+%22Explanatory+panels+on+physiology+and+development+history+1839%22">Explanatory panels on physiology and development history 1839</a>. , Leopold Voss. Leipzig, Germany. (1839).</li>
<li>Yaniv, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+lymphatic+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Live imaging of lymphatic development in the zebrafish.</a> Nature Medicine. 12 (6), 711-716 (2006).</li>
<li>Vinegoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (30), e1510(2009).</li>
<li>Sack, F. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+pulmonary+microcirculation+after+single+lung+transplantation+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of pulmonary microcirculation after single lung transplantation in pigs.</a> Transplantation Proceedings. 38 (3), 737-740 (2006).</li>
<li>Rehberg, M., Krombach, F., Pohl, U., Dietzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+3D+visualization+of+cellular+and+tissue+structures+in+intact+muscle+with+second+and+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Label-free 3D visualization of cellular and tissue structures in intact muscle with second and third harmonic generation microscopy.</a> PloS One. 6 (11), 28237(2011).</li>
<li>Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+third+harmonic+generation+microscopy+of+collective+melanoma+cell+invasion%3A+Principles+of+interface+guidance+and+microvesicle+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics.</a> Intravital. 1, 32-43 (2012).</li>
<li>Poole, J. J. A., Mostaço-Guidolin, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microscopy+and+the+extracellular+matrix+structure%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Optical microscopy and the extracellular matrix structure: A review.</a> Cells. 10 (7), 1760(2021).</li>
<li>Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third+harmonic+generation+microscopy+of+cells+and+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Third harmonic generation microscopy of cells and tissue organization.</a> Journal of Cell Science. 129 (2), 245-255 (2016).</li>
<li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+polyhedral+actomyosin+lattices+remodel+micron-scale+curved+membranes+during+exocytosis+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).</li>
<li>Shitara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+negatively+regulates+endocytosis+during+apical+membrane+maintenance+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc42 negatively regulates endocytosis during apical membrane maintenance in live animals.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (3), 324-332 (2019).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li>
<li>Subramanian, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+LTB4-BLT1+axis+regulates+actomyosin+and+%CE%B22-integrin+dynamics+during+neutrophil+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The LTB4-BLT1 axis regulates actomyosin and β2-integrin dynamics during neutrophil extravasation.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (10), 201910215(2020).</li>
<li>Yan, S. L. S., Hwang, I. -Y., Kamenyeva, O., Kehrl, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+F-Actin+filament+organization+during+lymphocyte+transendothelial+and+interstitial+migration+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">In vivo F-Actin filament organization during lymphocyte transendothelial and interstitial migration revealed by intravital microscopy.</a> iScience. 16, 283-297 (2019).</li>
<li>Porat-Shliom, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tissue-wide+synchronization+of+mitochondrial+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo tissue-wide synchronization of mitochondrial metabolic oscillations.</a> Cell Reports. 9 (2), 514-521 (2014).</li>
<li>Takihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+of+mitochondria+in+the+diseased+and+aged+mammalian+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10515-10520 (2015).</li>
<li>Calvo-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mitochondrial+calcium+levels+associated+with+neuronal+death+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Increased mitochondrial calcium levels associated with neuronal death in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 11, 2146(2020).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Li, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+immune+responses+in+the+mouse+ear+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin.</a> Nature Protocols. 7 (2), 221-234 (2012).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (77), e50586(2013).</li>
<li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ly6C%2FLy6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li>
<li>Lakschevitz, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neutrophil+surface+marker+changes+in+health+and+inflammation+using+high-throughput+screening+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry.</a> Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Isolation+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Isolation Protocol.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (17), e745(2008).</li>
<li>MATLAB - Bio-Formats 6.1.0 documentation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/6.1.0/users/matlab/index.html">https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/6.1.0/users/matlab/index.html</a> (2022).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li>
<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).</li>
<li>Xu, C., Prince, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakes%2C+shapes%2C+and+gradient+vector+flow%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%3A+A+Publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">Snakes, shapes, and gradient vector flow.</a> IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (3), 359-369 (1998).</li>
<li>Driscoll, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+of+nuclear+shape%3A+what+can+we+learn+from+a+prematurely+aged+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis of nuclear shape: what can we learn from a prematurely aged cell.</a> Aging. 4 (2), 119-132 (2012).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li>
<li>Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigating+phototoxicity+during+multiphoton+microscopy+of+live+Drosophila+embryos+in+the+1.0-1.2+%C2%B5m+wavelength+range%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range.</a> PloS One. 9 (8), 104250(2014).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li>
<li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoregulin+regulates+a+shedding+mechanism+that+drives+melanosome+transfer+from+melanocytes+to+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Melanoregulin regulates a shedding mechanism that drives melanosome transfer from melanocytes to keratinocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 2101-2109 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Pomimo dziesięcioleci postępów w dziedzinie migracji komórek i przebudowy błon, w bardzo niewielu badaniach wykorzystano IVM do wizualizacji cech subkomórkowych u żywych zwierząt. Procedury opisane w tym protokole stanowią potężne narzędzie do uzyskania nowego wglądu w migrację neutrofili u żywych zwierząt, a w szczególności w przebudowę błony komórkowej podczas tego procesu. Takie podejście umożliwia badanie migracji neutrofili w warunkach fizjologicznych, biorąc pod uwagę nieodłączną złożoność mikrośrodowiska tkankowego. Rzeczywiście, zastosowanie MPM umożliwia wizualizację wielu cech w tkance gospodarza za pomocą kombinacji szczepów myszy wyrażających wybrane markery fluorescencyjne, znakowania tkanek egzogennych, wzbudzania endogennej fluorescencji oraz sygnałów generowanych przez SHG lub THG12,13.
Jednym z potencjalnych problemów, które należy wziąć pod uwagę w tej procedurze, jest fotouszkodzenie. Mimo że MPM jest ogólnie bezpieczniejszy niż mikroskopia konfokalna pod względem fotowybielania i fototoksyczności, należy zachować ostrożność podczas obrazowania żywych tkanek34. Fototoksyczność może drastycznie utrudnić wyniki, tworząc artefakty obrazowania, od małych jasnych plamek po większe obszary uszkodzonej tkanki, lub hamując/stymulując różne szlaki wewnątrzkomórkowe. Aby zapobiec fototoksyczności, moc lasera powinna być utrzymywana na minimalnym poziomie, a odpowiednie kontrole muszą być zaprojektowane w celu sprawdzenia, czy warunki fizjologiczne są utrzymywane (np. pomiar przepływu krwi, sondy do wykrywania stresu oksydacyjnego)35,36. Co więcej, w tej specyficznej procedurze, która obejmuje skórę, wysoce zalecane są szczepy albinosów, ponieważ melanina obecna u zwierząt o ciemnej sierści jest bardziej wrażliwa na fototoksyczność 36,37,38.
Do głównych ograniczeń procedury należą zastosowany system mikroskopowy i charakter neutrofili. Chociaż zastosowanie MPM znacznie zwiększa głębokość obrazowania tkanek w porównaniu z innymi technikami mikroskopii świetlnej (np. konfokalnym, wirującym dyskiem), możliwość wizualizacji dynamiki subkomórkowej w uchu jest ograniczona do najbardziej zewnętrznych warstw tkanki (80-100 μm). Wynika to z intensywnego rozpraszania światła wytwarzanego przez grubą warstwę ECM, co utrudnia badanie migracji w głębszych warstwach. Kolejnym ograniczeniem jest fakt, że neutrofile są bardzo krótkotrwałe i nie mogą być trzymane w kulturze wystarczająco długo, aby można było zastosować techniki edycji genów. Można temu zaradzić, modyfikując myszy tak, aby wytwarzały neutrofile pozbawione określonych genów lub zawierające wybrane mutacje, co oczywiście zwiększa koszty i czas trwania badań.
Opisane tutaj procedury, chociaż zaprojektowane do badania dynamiki błony, mogą być dostosowane do rozwiązania każdego problemu biologicznego komórki nie tylko w neutrofilach, ale także w innych typach komórek odpornościowych i komórkach migrujących. Informacje zebrane za pomocą IVM w małym powiększeniu dotyczące zachowań komórkowych (np. fenotypu migracyjnego, szybkości komórki i kierunkowości22) można uzupełnić i skorelować z informacjami mechanistycznymi uzyskanymi za pomocą ISMic na temat repozycji organelli, wydzielania białek, endocytozy, dynamiki jądrowej, dynamiki wapnia, organizacji cytoszkieletu i netozy. Zastosowanie manipulacji farmakologicznych i/lub genetycznych może uwypuklić rolę określonych szlaków molekularnych w procesie będącym przedmiotem zainteresowania, co czyni to podejście unikalnym i bardzo skutecznym.

Ukierunkowana migracja komórek jest krytycznym wydarzeniem występującym podczas różnych procesów fizjologicznych i patologicznych, w tym rozwoju, odpowiedzi immunologicznej, naprawy tkanek oraz inicjacji, progresji i rozprzestrzeniania się nowotworu1,2. Proces ten opiera się na specyficznych zewnątrzkomórkowych sygnałach chemotaktycznych wyczuwanych przez pokrewne receptory na błonie plazmatycznej, a następnie przekształcanych w skomplikowane sygnały wewnątrzkomórkowe. Te szlaki z kolei aktywują migrację komórek poprzez szereg reakcji, w tym lokalną aktywację cytoszkieletu, transport i przebudowę błony oraz polaryzację komórek3. Dobrze scharakteryzowano dwa różne typy migracji komórek: mezenchymalną i ameboidalną4. Migracja mezenchymów jest stosunkowo powolna (<1 μm/min), opiera się na silnej adhezji między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) i zależy od degradacji macierzy indukowanej przez metaloproteazy. Natomiast migracja ameboidalna, charakterystyczna dla komórek odpornościowych szybko reagujących na sygnały zapalne, jest szybsza (>10 μm / min) i wykorzystuje słabe zrosty do poruszania się po ECM. Niezależnie od modalności, migracja komórek wymaga ciągłej przebudowy błony plazmatycznej, co skutkuje generowaniem wystających struktur na krawędzi natarcia komórek, które są ściśle skoordynowane z cofaniem błony na tylnej stronie1.
Aby rozwikłać mechanizmy molekularne leżące u podstaw tych procesów subkomórkowych, niezbędne jest wizualizację dynamiki błon w migrujących komórkach w odpowiedniej rozdzielczości czasowej i przestrzennej. Ponadto, ponieważ na przebudowę błony duży wpływ mają właściwości mikrośrodowiska tkankowego otaczającego migrujące komórki, kluczowe jest zobrazowanie tego procesu bezpośrednio w tkance rodzimej, u żywych zwierząt. Osiąga się to za pomocą mikroskopii przyżyciowej (IVM)5. Pierwsze obrazowanie IVM zostało wykonane ~200 lat temu, kiedy wynaczynienie leukocytów zostało uwidocznione za pomocą prostego mikroskopu trans-illuminacyjnego6, a następnie IVM było używane głównie na półprzezroczystych organizmach modelowych, takich jak Danio pręgowany i Drosophila7,8. W ciągu ostatnich dwóch dekad IVM został z powodzeniem wykorzystany do badania procesów komórkowych u myszy, szczurów i większych ssaków, takich jak świnie5,9. Było to możliwe dzięki 1) znaczącym postępom w mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej (MP) oraz 2) rozwojowi technologii edycji genów, takiej jak CRISPR-Cas9, która umożliwiła szybką inżynierię różnych modeli zwierzęcych w celu ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek i reporterów. Poza tym wizualizacja poszczególnych komórek i ich mikrośrodowiska podczas procesów takich jak inicjacja guza, migracja komórek i odpowiedź immunologiczna była możliwa zarówno dzięki innym formom znakowania egzogennego, takim jak ogólnoustrojowe wprowadzenie barwników do oznaczania układu krwionośnego10,11, jak i wzbudzenie cząsteczek endogennych, takich jak kolagen, poprzez generację drugiej harmonicznej (SHG)10,12 i włókna nerwowe poprzez generowanie trzeciej harmonicznej (THG)11,13. Wreszcie, udoskonalenie technik minimalizowania artefaktów ruchowych spowodowanych biciem serca i oddychaniem doprowadziło do opracowania mikroskopii subkomórkowej (ISMic), która pozwoliła naukowcom obrazować i badać kilka zdarzeń subkomórkowych bezpośrednio u żywych zwierząt na poziomie rozdzielczości podobnym do obserwowanych in vitro14,15,16,17. Przykłady ISMic obejmują badanie dynamiki cytoszkieletu podczas egzocytozy14,15,16,17 i endocytoza15, dynamiczna przebudowa cytoszkieletu podczas migracji komórek17,18, lokalizacja i metabolizm mitochondriów19,20, oraz sygnalizacja wapniowa w mózgu21.
Ten protokół szczegółowo opisuje różne kroki i procedury badania przebudowy błony komórkowej w rozdzielczości subkomórkowej podczas migracji neutrofili w skórze ucha żywej myszy za pomocą ISMic. Podejście to opiera się na wcześniej opisanych protokołach22,23 i jest dostosowane do osiągnięcia wyższej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

<table><tbody><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Igła Covidien</td><td>8881501400</td> 27 G Zestaw do infuzji skrzydełkowej Kendall 827112 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 G</td><td>Terumo</td><td>SV*27EL</td><td></td></tr><tr><td>30x obiektyw</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO30XS</td><td>1,05 NA, Zanurzenie w oleju silikonowym</td></tr><tr><td>40x</td><td>obiektyw Olympus</td><td>UPLSAPO40XS</td><td>1.23 NA, zanurzenie w oleju silikonowym</td></tr><tr><td>Naczynia 60 mm</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6 ml strzykawka</td><td>Kendall</td><td>8881516937</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazyna (10 mg / ml)</td><td>Vet one</td><td>13985-587-50</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy ACK</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>AND</td><td>EK-1200A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 40 i mikro; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do wizualizacji/analizy obrazu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Fluoview</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do akwizycji</td></tr><tr><td>FVB szczep myszy Jackson</td><td></td><td>Nie dotyczy</td> tła <td>FVB</td></tr><tr><td>System znieczulenia gazowego</td><td>Patterson weterynaryjny</td><td>07-8915712</td><td>Link 7 model</td></tr><tr><td>Green Cell tracker</td><td>Thermo</td><td>C2925</td><td>Solubilizowany w kulturze komórkowej klasy DMSO, aby osiągnąć stężenie 1 mM (1000x)</td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (bez Ca2+, Mg2+)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M pH 7,3</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>118-089-721</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1991</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11191-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do wizualizacji/analizy obrazu</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet one</td><td>13985-528-40</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (100 mg / ml)</td><td>Vet one</td><td>13985-584-10</td><td></td></tr><tr><td>LyzM-cre x mT/mG</td><td>wygenerowane w laboratorium</td><td>N/A</td><td>C57BL/6J tło</td></tr><tr><td>Ręczny mikromanipulator</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MatWorks</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do analizy</td></tr><tr><td>mtomato mysz</td><td>szczep generowany w laboratorium</td><td>N/A</td><td>mT/mG, tło FVB Laser</td></tr><tr><td>wielofotonowy</td><td>Spectra Physics</td><td>Insight DS+</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop wielofotonowy</td><td>Olympus</td><td>MPE-RS</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 10 i mikro; Strzykawka L</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33 G igła</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz obiektywu</td><td>Bioptechs</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik grzałki obiektywu</td><td>Bioptechs</td><td>150803</td><td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>Major</td><td>NDC 0904-6488-38</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator tlenu</td><td>Caire</td><td>VisionAire 5</td><td></td></tr><tr><td>PBS (bez Ca2+, Mg2+)</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>114-058-131</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>114-055-101</td><td></td></tr><tr><td>Grzałka sceniczna</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik grzałki scenicznej</td><td>Okolab</td><td>H401-T</td><td></td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td>Hipoalergiczny</td></tr><tr><td>sterownik strzykawki</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki rozgrzewające</td><td>Parkland Scientific</td><td>A2789B</td><td></td></tr><tr><td>Pompa grzewcza</td><td>Parkland Scientific</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna (100 mg / ml)</td><td>Vet one</td><td>13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie migracji neutrofili w skórze myszy w celu zbadania przebudowy błony subkomórkowej w warunkach fizjologicznych

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

Badania nad rekrutacją i funkcjonowaniem komórek odpornościowych w tkankach były bardzo aktywną dziedziną w ciągu ostatnich dwóch dekad. Neutrofile są jednymi z pierwszych komórek odpornościowych, które docierają do miejsca zapalenia i uczestniczą we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej podczas infekcji lub uszkodzenia tkanek. Do tej pory migrację neutrofili udało się zobrazować za pomocą różnych systemów eksperymentalnych in vitro opartych na jednolitej stymulacji lub ograniczonej migracji pod agarozą lub kanałami mikroprzepływowymi. Modele te nie oddają jednak złożonego mikrośrodowiska, z którym neutrofile spotykają się in vivo. Rozwój technik opartych na mikroskopii wielofotonowej (MPM), takich jak mikroskopia subkomórkowa przykomórkowa (ISMic), oferuje unikalne narzędzie do wizualizacji i badania dynamiki neutrofili w rozdzielczościach subkomórkowych w warunkach fizjologicznych. W szczególności ucho żywej, znieczulonej myszy zapewnia eksperymentalną przewagę w śledzeniu migracji śródmiąższowej neutrofili w czasie rzeczywistym ze względu na łatwość dostępu i brak ekspozycji chirurgicznej. ISMic zapewnia rozdzielczość optyczną, szybkość i głębokość akwizycji niezbędne do śledzenia zarówno procesów komórkowych, jak i, co ważniejsze, subkomórkowych w 3D w czasie (4D). Co więcej, multimodalne obrazowanie mikrośrodowiska śródmiąższowego (tj. naczyń krwionośnych, komórek rezydentnych, macierzy zewnątrzkomórkowej) można łatwo przeprowadzić przy użyciu kombinacji myszy transgenicznych wykazujących ekspresję wybranych markerów fluorescencyjnych, znakowania egzogennego za pomocą sond fluorescencyjnych, wewnętrznej fluorescencji tkanek oraz sygnałów generowanych przez drugą/trzecią harmoniczną. Protokół ten opisuje: 1) przygotowanie neutrofili do adoptywnego transferu do ucha myszy, 2) różne ustawienia dla optymalnego obrazowania subkomórkowego, 3) strategie minimalizacji artefaktów ruchu przy jednoczesnym zachowaniu odpowiedzi fizjologicznej, 4) przykłady przebudowy błony obserwowanej w neutrofilach przy użyciu ISMic oraz 5) przepływ pracy do analizy ilościowej przebudowy błony u migrujących neutrofili in vivo.

W tym miejscu przedstawiono dwa różne zestawy wyników, aby zilustrować klasyczne IVM oraz ISMic, które zapewniają odpowiednio rozdzielczość komórkową i podkomórkową. W pierwszym przykładzie neutrofile wyizolowano z myszy typu dzikiego (WT), oznakowano barwnikiem Cell Tracker Green w celu zabarwienia cytoplazmy, a następnie wstrzyknięto do myszy transgenicznej wykazującej ekspresję białka fluorescencyjnego celowanego w błonę komórkową (mysz mTomato, znana również jako mT/mG)33, Rycina 1 i Film 1 i Film 2). Mysz ta, jako biorca, umożliwiła wizualizację cech strukturalnych w tkance ucha, takich jak naczynia krwionośne, komórki rezydentne oraz mieszki włosowe (Rysunek 1C i Film 1) poprzez Podejście oparte na IVM (krok 6.8.1). Włókna kolagenowe, widoczne poprzez SHG (wykrywane przy połowie długości fali wzbudzenia) układały się w skomplikowaną sieć w skórze właściwej, do której wstrzyknięto neutrofile. Wzdłuż krawędzi mieszków włosowych (HF) zaobserwowano warstwę komórek nabłonkowych (tj. keratynocytów). Sporadycznie widoczne były artefakty z pozostałości włosów, powodujące lokalne wgłębienie skóry (H). Uszkodzenia wywołane laserem były łatwo widoczne ze względu na ich silną autofluorescencję wykrywaną we wszystkich kanałach oraz zmiany w organizacji kolagenu (Rycina 1D). Bardziej kompletny obraz trójwymiarowej architektury skóry oraz lokalizacji wstrzykniętych neutrofili można dostrzec w Film 1, przedstawiające stos Z (Z-stack) skóry od warstw zewnętrznych do wewnętrznych oraz rendering objętościowy 3D. Obrazowanie poklatkowe wykazało, że neutrofile badają skórę ucha i oddziałują z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) oraz tkanką gospodarza (Film 2Obrazowanie w tej rozdzielczości i pozyskiwanie stosu Z co 30 s umożliwia śledzenie komórek oraz pomiar parametrów motywności (tj. prędkości i kierunkowości), jednak precyzyjna i szczegółowa analiza przebudowy błony jest w tej rozdzielczości utrudniona.
W drugim przykładzie oceniono przebudowę błony poprzez metoda ISMic (krok 6.8.2) z użyciem neutrofili wykazujących ekspresję mGFP, oczyszczonych z LyzM-cre mT/mG myszy i wstrzyknięto je zwierzętom WT (Rycina 2A, schemat doświadczalny). Stosując protokół ISMic (Film 3 oraz nieruchome obrazy w Rycina 2B) i po uszkodzeniu laserem obserwuje się dynamiczne remodelowanie błony plazmatycznej podczas migracji, a także wyraźnie widoczne są formowanie się wypustek błonowych na krawędzi natarcia oraz retrakcja tylnej części komórek (Rysunek 2 i Film 3). Sekwencje time-lapse wyróżnione w Film 3 ujawniają złożoność oddziaływań z ECM. Rzeczywiście, neutrofile migrowały przez przestrzeń śródmiąższową, poruszając się albo wzdłuż włókien, albo w przestrzeniach między nimi. Na koniec, dla każdego punktu czasowego określono aspekty ilościowe, takie jak zmiany krzywizny oraz zmiany powierzchni w przedniej i tylnej części komórek. Wykorzystując komórkę opisaną w Rysunek 2B przykładowo, lokalna dynamika błony plazmatycznej została przeanalizowana przy użyciu potoku algorytmicznego (patrz krok 7) opartego na identyfikacji 100 punktów granicznych leżących u podstawy powierzchni komórki (Rysunek 3A). Zmiany lokalnej krzywizny (Rycina 3B) oraz w obszarze podkreślonym przez wypustki błony komórkowej (Rycina 3C) obliczono dla każdego punktu granicznego i przedstawiono dla każdego przedziału czasowego w formie kymografów (Rycina 3D,E). Zarówno przód, jak i tył komórek wykazują wyższą krzywiznę niż ich boki (Rysunek 3D); ujemne zmiany powierzchni (retrakcje, obszary niebieskie) są bardziej widoczne w tylnej części komórek niż na krawędzi prowadzącej, gdzie bardziej wyraźne są dodatnie zmiany powierzchni (protruzje, obszary czerwone) (Rysunek 3E).
<img alt="Mikroskopia intravitalna myszy, znakowanie neutrofili, włókna kolagenowe in vivo, schematy doświadczalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: IVM neutrofili w skórze ucha myszy. (A) Schematyczna ilustracja przygotowania ucha na stole mikroskopu. (B) Schemat blokowy eksperymentu. (C) Reprezentatywny obraz skóry ucha myszy mTomato po wstrzyknięciu neutrofili znakowanych fluorescencyjnie, z różnymi projekcjami. Mieszek włosowy (HF), Naczynie krwionośne (BV), Naskórek (E), Skóra właściwa (D), Warstwa komórek podstawnych (BCL) oraz artefakt włosa (wynikający z pozostałego włosa na powierzchni skóry, H). (D) Reprezentatywny obraz skóry myszy po sterylnym uszkodzeniu laserowym: kanał niebieski (prawo), kanały zielony i czerwony (środek), obraz scalony (lewo). Uszkodzenie jest widoczne po lewej stronie obrazu poprzez silną emisję autofluorescencji w kanałach zielonym i czerwonym, a także zaburzenie ECM obserwowane jako otwór w włóknach kolagenu typu I. Na obrazach C i D, Zielony: neutrofile; Czerwony: tkanka gospodarza myszy; Cyjan: SHG kolagenu typu I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces migracji neutrofili; schemat i mikroskopia komórek znakowanych GFP w układzie myszy biorcy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Time-lapse migracji neutrofila mGFP w uchu myszy WT. (A) Schemat doświadczenia. (B) Reprezentatywne klatki z Filmu 3. (C) Rendering wolumetryczny tej samej komórki w celu wizualizacji trójwymiarowej organizacji błony. Obszar wysokiej dynamiki błony zaznaczono strzałkami (czerwoną dla retrakcji i niebieską dla protruzji). (D) Powiększona i nachylona wizualizacja wyrenderowanej objętości komórki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza ruchu granicy komórki; wykresy zmian krzywizny i pola powierzchni; mikroskopia i analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat analityczny do ilościowego określania dynamiki błon pozyskanej za pomocą ISMic. (A) Wyznaczanie konturu komórki i repartycja punktów granicznych (100 punktów granicznych) pomiędzy dwiema kolejnymi klatkami dla neutrofila mGFP opisanego na Rysunku 2B. (B) Kolorowe granice reprezentują lokalną krzywiznę błony wyznaczoną dla każdego punktu granicznego. (C) Lokalne zmiany pola powierzchni pomiędzy dwiema kolejnymi klatkami (obecna: niebieska, następna: czerwona). Zielone obszary reprezentują wyniki śledzenia lokalnego ruchu błony. Żółte strzałki wskazują ogólny kierunek przemieszczania się błony. (D) Kymograf krzywizny granicy komórki w czasie. Oś pionowa reprezentuje indeksy punktów granicznych, gdzie 1 i 100 reprezentują tył komórki zgodnie z kierunkiem jej migracji. (E) Kymograf lokalnej zmiany pola powierzchni odzwierciedlający protruzję błony (czerwony) i retrakcję błony (niebieski) komórki w czasie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Film 1: Neutrofile znakowane na zielono wizualizowane w uchu myszy mTomato za pomocą IVM. Czerwony: tkanka myszy gospodarza mTomato. Cyjan: Collagen-I SHG; Zielony: neutrofil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie1_Jove_final.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 2: IVM neutrofili migrujących w skórze ucha myszy mTomato. Filmy stanowią projekcje maksymalnej intensywności stosu obrazów zarejestrowanych przez 27 min przy częstotliwości 5 klatek/s. Kolor czerwony: tkanka myszy gospodarza mTomato. Kolor cyjan: SHG kolagenu typu I; kolor zielony: neutrofil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie2_Jove_final.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 3: ISMic przebudowy błony podczas migracji neutrofili w uchu myszy WT. Filmy przedstawiają projekcje maksymalnej intensywności stosu obrazów zarejestrowanego przez ῀8 min przy częstotliwości odświeżania 10 klatek/s. Czerwony: tkanka myszy gospodarza mTomato. Cyjan: SHG kolagenu typu I; Zielony: neutrofil mGFP; Jasnozielony: renderowany neutrofil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie3_Jove_final.mp4" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.</a>

Migracja neutrofili polega na szybkiej i ciągłej przebudowie błony plazmatycznej w odpowiedzi na chemoatraktant i jego interakcje z mikrośrodowiskiem zewnątrzkomórkowym. Opisana w niniejszym dokumencie jest procedura oparta na przyżyciowej mikroskopii subkomórkowej w celu zbadania dynamiki przebudowy błony w neutrofilach wstrzykniętych do ucha znieczulonych myszy.

Obrazowanie migracji neutrofili w skórze myszy w celu zbadania przebudowy błony subkomórkowej w warunkach fizjologicznych

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Metoda ta opisuje technikę badania przebudowy błony podczas migracji neutrofili u żywego zwierzęcia przy użyciu mikroskopii subkomórkowej przyżyciowej. Protokół ten zapewnia unikalne podejście do badania dynamiki błony podczas migracji zwierząt w warunkach fizycznych oraz do odciążenia mikrośrodowiska tkanek. Technikę tę można dostosować do rozwiązywania problemów związanych z przebudową błony i cytoszkieletem, dynamiczną repozycją narządów i transportem błon w różnych typach komórek i komórkach migrujących.Na początek dodaj zielony barwnik fluorescencyjny do zawiesiny neutrofili, oczyszczonej z myszy typu dzikiego w 1,5 mililitra probówki pokrytej BSA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem w rotatorze probówkowym. Wykonać trzy płukania za pomocą HBSS, a następnie odwirować w temperaturze pokojowej 400 razy G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrowym roztworze soli Hanksa.Umieścić tę zawiesinę w probówce pokrytej BSA w rotatorze rurki pod delikatnym mieszaniem aż do procedury wstrzykiwania. Przed wstrzyknięciem należy ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze soli fizjologicznej, aby osiągnąć gęstość od 2 milionów do 5 milionów komórek na 20 mikrolitrów. Przenieś znieczulone zwierzę do podkładki rozgrzewającej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby utrzymać temperaturę ciała.Po przetestowaniu odruchu wycofywania łapy usuń włoski z ucha za pomocą precyzyjnego trymera, aby zoptymalizować jakość obrazu. Połóż zwierzę na boku, przytrzymaj krawędź ucha i spłaszcz je wzdłuż podkładki rozgrzewającej za pomocą taśmy chirurgicznej, a następnie napełnij strzykawkę wyposażoną w igłę o rozmiarze 33 zawiesiną neutrofili i zamontuj ją na mikromanipulatorze. Delikatnie przesuń igłę w kierunku ucha i powoli przekłuj skórę.Gdy igła znajdzie się w skórze, powoli popchnij tłok i dostarcz od dwóch do trzech mikrolitrów zawiesiny komórek. Po ostrożnym powtórzeniu wstrzyknięcia dla dwóch do trzech różnych obszarów ucha, ostrożnie usuń taśmę chirurgiczną i pozwól zwierzęciu odzyskać przytomność pod nadzorem. Przed przystąpieniem do obrazowania należy pozwolić zwierzęciu odpocząć przez godzinę, aby tkanka i komórki mogły dojść do siebie po zabiegu wstrzyknięcia.Upewnij się, że mikroskop jest włączony, a stage i soczewki są wstępnie podgrzane do 37 stopni Celsjusza przed umieszczeniem znieczulonego zwierzęcia na stoliku mikroskopu. Zakryj otwór w stoliku szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Ostrożnie przenieś znieczulone zwierzę na scenę.Jeśli obrazowanie jest planowane na więcej niż godzinę, należy nałożyć maść okulistyczną i zabezpieczyć system perfuzyjny oparty na infuzji skrzydlatej. Umieść kroplę soli fizjologicznej na środku szkiełka nakrywkowego i umieść na nim ucho z wstrzykniętymi neutrofilami. Delikatnie spłaszcz ucho za pomocą sterylnego bawełnianego wacika na środku szkiełka nakrywkowego, aby usunąć kieszenie powietrzne.Zabezpiecz ucho, delikatnie dociskając drewniany patyczek do boku ucha bliżej głowy zwierzęcia i blokując je taśmą. Następnie znajdź obszar zainteresowania za pomocą okularu mikroskopu i przełącz się w tryb akwizycji wielu fotonów. Ustaw długość fali wzbudzenia laserowego na 900 do 930 nanometrów, aby umożliwić jednoczesne pozyskiwanie zielonego barwnika fluorescencyjnego, mTomato i kolagenu-I.Następnie ustaw odpowiedni zestaw luster i kombinacji filtrów na detektorach, aby zbierać emitowane światło. Określ ustawienie najbardziej odpowiednie dla konfiguracji sprzętowej. Nawet jeśli migrujące komórki można śledzić w odstępach od 30 sekund do jednej minuty, obrazuj zdarzenia subkomórkowe z większą prędkością, co najmniej w odstępach krótszych niż dziesięć sekund.W klasycznym podejściu do mikroskopii przyżyciowej użyj soczewki 30X i skanera Galvo o rozmiarze obrazu 512 na 512 pikseli, aby śledzić migrację komórek i badać tkankę myszy gospodarza, a następnie ustaw przemieszczenie osi Z za pomocą zmotoryzowanego stolika o wielkości kroku dwóch mikrometrów, aby umożliwić obrazowanie objętości o głębokości 30 mikrometrów co 30 sekund. W podejściu do mikroskopii subkomórkowej przyżyciowej użyj soczewki 40X i skanera rezonansowego z trzykrotnym uśrednieniem, aby zobrazować wysoce dynamiczną przebudowę błony w większym powiększeniu i rozdzielczości. Ustaw również przemieszczenie osi Z za pomocą piezoelektrycznego kroku o wielkości jednego mikrometra, co pozwala na obrazowanie objętości na głębokość 20 mikrometrów co cztery do pięciu sekund.Wywołaj sterylne uszkodzenie lasera, aby wywołać migrację neutrofili, skupiając laser wzbudzający o dużej mocy na wąskim obszarze 20 na 20 mikrometrów przez 10 sekund. Zidentyfikuj uraz wywołany laserem na podstawie silnych sygnałów autofluorescencyjnych pojawiających się we wszystkich kanałach i wynikającej z tego zmiany układu kolagenu. Zapisz dane po zakończeniu eksperymentowania do dalszych analiz.Mysz biorczyni umożliwiła wizualizację cech strukturalnych w tkance ucha, takich jak naczynia krwionośne, komórki rezydentne i mieszki włosowe, za pomocą podejścia opartego na mikroskopii przyżyciowej. Urazy wywołane laserem były łatwe do uwidocznienia dzięki ich silnej autofluorescencji wykrytej we wszystkich kanałach oraz zmianom w ułożeniu kolagenu. Pełny widok trójwymiarowej architektury skóry i lokalizacji wstrzykniętych neutrofili przedstawia stos Z skóry od warstwy zewnętrznej do wewnętrznej w trójwymiarowym renderowaniu objętościowym.Obrazowanie poklatkowe pokazało, że neutrofile pobierają próbki ze skóry ucha i wchodzą w interakcję z macierzą wewnątrzkomórkową i tkanką gospodarza. Za pomocą przyżyciowej mikroskopii subkomórkowej wyraźnie uwidoczniono dynamiczną przebudowę błony plazmatycznej podczas migracji, tworzenie się wypukłości błony na krawędzi natarcia oraz cofanie się tylnej części komórek. Sekwencje poklatkowe ujawniają złożoność interakcji z macierzą wewnątrzkomórkową.Lokalną dynamikę błony plazmatycznej analizowano za pomocą algorytmu opartego na identyfikacji 100 punktów granicznych znajdujących się pod powierzchnią komórki. Zmiany w lokalnej krzywiźnie i obszarze podkreślonym przez wypukłości błony plazmatycznej zostały obliczone dla każdego punktu granicznego i zgłoszone dla każdego przedziału czasowego w postaci kymogramów. Zarówno przód, jak i tył komórek zachowują większą krzywiznę niż bok komórek.Ujemne zmiany obszaru są bardziej widoczne z tyłu komórek niż na krawędzi natarcia, gdzie dodatnie zmiany obszaru są bardziej widoczne. Po obrazowaniu tkanka może zostać pobrana, utrwalona i przetworzona w celu barwienia w celu dalszej oceny celu zainteresowania i wyjaśnienia mechanizmów. Ta procedura mająca na celu obrazowanie dynamiki błony może być dostosowana do szerszego pytania dotyczącego biologii komórki w różnych typach komórek i komórkach migrujących w ich odpowiednich środowiskach.

imaging-neutrophil-migration-mouse-skin-to-investigate-subcellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy nieinwazyjną metodę mikroskopii dwufotonowej (2P) służącą do badania homingu leukocytów w poduszce stopy myszy. Omówiamy aspekty techniczne przygotowania tkanki do obrazowania i przeprowadzamy czytelnika przez typowy eksperyment – od początkowej konfiguracji, przez wykonanie, aż po gromadzenie danych.

Nieinwazyjne obrazowanie homingu i migracji leukocytów in vivo

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Ten film demonstruje obrazowanie in vivo w celu zbadania dynamiki rekrutacji neutrofili w miejscu infekcji u transgenicznej myszy z obniżoną odpornością, z neutrofilami wykazującymi ekspresję GFP. Polega na wstrzyknięciu bakterii luminescencyjnych w celu wywołania infekcji. Prowadzi to do rekrutacji neutrofili do miejsca infekcji, których śledzenie odbywa się za pomocą obrazowania.

Monitorowanie dynamiki rekrutacji neutrofili i obciążenia bakteryjnego w miejscu zakażenia w modelu mysim

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Ten obecny protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery, znakowanie in vivo i techniki obrazowania przyżyciowego, aby umożliwić monitorowanie dynamicznego procesu pobudzania neutrofili u żywych zwierząt.

Przyżyciowe obrazowanie torowania neutrofili przy użyciu myszy reporterowych DsRed napędzanych promotorem IL-1β

Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Tutaj prezentujemy trzy metody oceny migracji i infiltracji neutrofili zarówno in vivo, jak i in vitro. Metody te mogą być wykorzystane do odkrycia obiecujących terapii ukierunkowanych na migrację neutrofili.

Wykrywanie migracji i infiltracji neutrofili u myszy

Tutaj opisujemy protokoły do wykonywania obrazowania na żywo i analizy ilościowej dynamiki receptorów chemoatraktantu u neutrofili danio...

Obrazowanie na żywo receptorów chemokiny w neutrofilach danio pręgowanego podczas reakcji na ranę

Obrazowanie stawów in vivo to cenna technika wykrywająca migracyjne zachowania leukocytów oraz dynamikę molekularną w obrębie zapalonych stawów. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół obrazowania stawów in vivo z wykorzystaniem modelu myszego zapalenia stawów wywołanego kolagenem II (CIA).

In Vivo Obrazowanie ujawnia migracyjne zachowanie leukocytów w stawach

Poznaj mikroskopię subkomórkową in vivo do badania dynamiki błony neutrofili w skórze myszy. Ta technika umożliwia wizualizację przebudowy błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie migracji neutrofili w skórze myszy w celu zbadania przebudowy błony subkomórkowej w warunkach fizjologicznych

Przeglądaj więcej filmów