Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Dzięki czułemu na masę śledzeniu cząstek możemy obserwować poszczególne biomolekuły dyfundujące na błonach lipidowych i określać ilościowo ich dynamikę w czasie rzeczywistym, a wszystko to całkowicie bez etykietowania. Ponieważ nie są wymagane żadne etykiety, nie ma niebezpieczeństwa zakłócenia dynamicznego zachowania biomolekuł. Kolejną zaletą tej metody jest jej czułość masowa, która pozwala na określenie stanów oligomerycznych związanych z błoną.

Ze względu na jej wszechstronność możemy zastosować tę metodę do każdego systemu związanego z membraną. W szczególności może być stosowany do badania tworzenia kompleksów receptorowych indukowanych przez ligandy. Zacznij od rozprowadzenia równej liczby szkiełek mikroskopowych w uchwytach z PTFE.

Przenieść uchwyty PTFE do zlewek. Dodaj ultraczystą wodę i poddawaj je sonikacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Użyj pęsety, aby przenieść uchwyty do czystych zlewek i dodaj ultraczysty izopropanol.

Ponownie sonikować przez 15 minut, następnie ponownie zastąpić izopropanol ultraczystą wodą i sonikować zlewkę zawierającą uchwyty przez 15 minut. Wyjmij uchwyty ze zlewek i wysusz szkiełka mikroskopowe w uchwycie pod stałym strumieniem azotu lub sprężonego powietrza. Umieść wysuszony uchwyt zawierający duże szkiełka mikroskopowe w myjce plazmowej i włącz ją.

Owiń płaski karton folią aluminiową. Oczyszczone szkiełka mikroskopowe o wymiarach 24 milimetry na 24 milimetry rozłóż na folii aluminiowej w wystarczającej odległości między sobą. Następnie przymocuj dwustronne paski taśmy do górnej i dolnej krawędzi prowadnic.

Każde szkiełko mikroskopowe należy wyciąć skalpelem, tak aby można je było usunąć z folii aluminiowej. Każda zjeżdżalnia powinna posiadać paski taśmy dwustronnej przymocowane do górnej i dolnej krawędzi zjeżdżalni. Następnie przymocuj zjeżdżalnię z dwoma dwustronnymi paskami taśmy do zjeżdżalni hydrofilizowanej.

Utworzy to ścieżkę przepływu między mniejszymi i większymi szkiełkami mikroskopowymi. Rozcieńczyć świeżo wytłaczane małe pęcherzyki jednowarstwowe lub SUV do końcowego stężenia 0,4 miligrama na mililitr w wymaganym buforze reakcyjnym. Opcjonalnie, aby przyspieszyć pękanie pęcherzyków, dodać dwa milimolowe chlorki wapnia do zawiesiny pęcherzyków.

Zamontuj komorę przepływową na stoliku fotometru masy. Przepłukać 25 mikrolitrów zawiesiny pęcherzyków do komory przepływowej i inkubować komorę przez dwie minuty, a następnie usunąć niestopione pęcherzyki poprzez wielokrotne mycie komory przepływowej za każdym razem 200 mikrolitrami buforu reakcyjnego. Gdy błona lipidowa jest wolna od niepołączonych pęcherzyków, dodaj 50 mikrolitrów interesującego białka do komory próbki.

Następnie ustaw warunki obrazowania, takie jak rozmiar pola widzenia, czas ekspozycji, liczba klatek na sekundę i czas akwizycji w oprogramowaniu do akwizycji. Automatyczna regulacja ostrości. W razie potrzeby użyj bocznego elementu sterującego, aby przesunąć pole widzenia do pozycji z jednorodną membraną.

Utwórz folder projektu i rozpocznij nagrywanie filmu. Po zakończeniu nagrywania określ nazwę pliku w oknie dialogowym wyświetlanym przez oprogramowanie do akwizycji. Film zostanie automatycznie zapisany w folderze projektu jako plik MP do późniejszej analizy.

Aby przeanalizować nagrane filmy wideo, uruchom aplikację Jupyter notebook. Na wyświetlonej liście folderów przejdź do lokalizacji, w której przeprowadzono analizę MSPT. Plik notatnika ipy jest przechowywany i kliknij plik.

W notesach Jupyter kod jest zorganizowany w komórkach i można go wykonać krok po kroku. Kliknij mały przycisk Odtwórz obok komórki lub wybierz komórkę i naciśnij Shift Enter, aby uruchomić komórkę. Zacznij od zaimportowania wszystkich wymaganych pakietów do analizy.

Wykonaj następną komórkę, aby uruchomić monit o plik. Wybierz folder zawierający jeden lub wiele plików wideo MP do analizy i naciśnij Wybierz folder. Lista wybranych plików jest drukowana pod komórką.

Aby usunąć dominujące statyczne rozpraszanie światła za pomocą algorytmu estymacji tła w pikselach, wybierz opcję ciągłej mediany dla trybu parametru i ustaw odpowiednią długość przesuwanego okna mediany. Opcjonalnie zapisz filmy po usunięciu tła, ustawiając save_processed_movies True, aby używać ich do wykrywania cząstek i łączenia trajektorii. Upewnij się, że ustawiłeś równoległe wartości True i GPU False dla przetwarzania na procesorze CPU lub odwrotnie dla przetwarzania na procesorze GPU.

Cząstki i ich położenie są identyfikowane i lokalizowane w całym filmie. Dostosuj czułość wykrywania cząstek za pomocą parametru progowego, który służy do podświetlania punktów kandydujących za pomocą binaryzacji obrazu. Zbadaj wpływ różnych parametrów progowych na czułość wykrywania punktowego w osobnym notesie o nazwie Wizualizacja filmu.

Notatnik IPY. Po załadowaniu filmu do przeglądarki klatek użyj suwaka progu, aby dostosować próg wykrywania cząstek i znaleźć odpowiednie ustawienie. Wróć do drugiego notesu, wybierz trzy parametry do łączenia cząstek w kolejnych klatkach w trajektorie przy użyciu pakietu trackpy języka Python.

Ustaw maksymalne przemieszczenie cząstek z jednej klatki do drugiej zgodnie z maksymalną oczekiwaną prędkością dyfuzji. Wybierz maksymalną liczbę klatek, w których cząstka może zniknąć i pojawić się ponownie, ale nadal być uważana za tę samą cząstkę. Trajektorie ze zbyt małą liczbą punktów można usunąć za pomocą parametru minimum_trajectory_length w celu dokładniejszego określenia współczynników dyfuzji.

Napraw wszystkie parametry w komórce, wykonując ją. Wykonaj następną komórkę, aby przeanalizować wszystkie wybrane filmy z wybranymi parametrami. Paski postępu dla każdego kroku przetwarzania pojawią się poniżej komórki.

Może to chwilę potrwać, w zależności od długości filmu, ustawień parametrów i sprzętu. W kolejnym kroku oprogramowanie określa współczynniki dyfuzji dla trajektorii znalezionych w poprzednim rozdziale, na podstawie zarówno rozkładu odległości skoku, jak i analizy przemieszczenia średniokwadratowego. Zacznij od określenia frame_rate filmu i pixel_size.

Napraw je, wykonując komórkę, a następnie uruchom następną komórkę i wybierz katalog nadrzędny zawierający wszystkie pliki CSV wygenerowane przez trackpy. Lista znalezionych plików CSV jest drukowana poniżej komórki. W następnej komórce wybierz nazwę kontenera HDF5, w którym są przechowywane wyniki, i wykonaj go.

Na koniec wykonaj komórkę C.4, aby przeprowadzić analizę dyfuzji. W komórce C.5 wprowadź parametry linii kalibracji kontrastu do masy, czyli nachylenie i przesunięcie wyznaczone przy użyciu próbek o znanej masie i wykonaj je, aby przeliczyć wszystkie kontrasty cząstek na masę cząsteczkową. Oceń pozorną gęstość cząstek na membranie, wykonując komórkę C.6, która zwraca wartość mediany gęstości pod względem wykrytych cząstek i przedstawia trajektorie podczas każdej klatki jako dodatkowe kolumny w ramce danych.

Aby wygenerować końcowy wykres korelacji masy i współczynnika dyfuzji, uruchom komórkę D.1, aby załadować monit o plik i określ plik HDF5 zawierający wyniki MSPT, a następnie wybierz zestaw danych z pojedynczego filmu do wykreślenia w komórce D.2 lub połącz dane z wielu filmów w jedną klatkę danych, wykonując komórkę D.3. W tym przykładzie, ponieważ wszystkie filmy wideo są replikami identycznych próbek, zestaw danych jest łączony w pulę. Na koniec wykreśl gęstość jądra 2D, wykonując komórkę D.4.

Jeśli spełnione wymagania, określ lokalizację, w której chcesz zapisać wydruk w pliku PDF w komórce D.5 i wykonaj go. Przedstawiono tutaj reprezentatywne obrazy chropowatości powierzchni szkiełka nakrywkowego podczas tworzenia podpartej dwuwarstwy lipidowej z nienaruszoną podpartą dwuwarstwą lipidową oraz przykładowych białek odtworzonych na SLB. Wszystkie cztery przykłady są wyświetlane w trybie natywnym, do którego można uzyskać dostęp podczas samego pomiaru, oraz jako przetworzone obrazy ratiometryczne po usunięciu tła na podstawie mediany.

Kalibrację, która przekłada kontrast na masę cząsteczkową, można osiągnąć, przyłączając biomolekuły o znanej masie do SLB za pomocą kompleksu biotyna-streptawidyna-biotyna. Jako przykładową strategię można zastosować biotynylowane warianty albuminy surowicy bydlęcej, białka A, fosfatazy alkalicznej i fibronektyny, które wiążą się ze streptawidyną, która z kolei jest związana z lipidami zawierającymi biotynę w błonie. Coraz wyraźniejszy kontrast tych przykładowych makrocząsteczek odzwierciedla rosnącą masę cząsteczkową odpowiednich wzorców biotynylowanych.

Poprzez przypisanie każdego piku histogramów kontrastu do odpowiedniej masy stanu oligomerowego białka wzorcowego, ujawnia się liniowa zależność między kontrastem a masą, która może być następnie wykorzystana do analizy nieznanych układów makrocząsteczkowych. Przedstawiono tutaj oszacowania gęstości ziarna 2D zarówno masy, jak i współczynnika dyfuzji czterowartościowej streptawidyny w kompleksie z biotynylowaną aldolazą lub z modyfikowanym biotyną kozim przeciwciałem anty-IgG królika modyfikowanego biotyną. Reprezentatywne obrazy przedstawiają porównanie wyznaczonych mas oligomerów dla kompleksu czterowartościowej streptawidyny z aldolazą modyfikowaną biotyną lub IgG i oczekiwanymi masami cząsteczkowymi.

Dzięki MSPT możemy śledzić biomolekuły bezpośrednio na błonach lipidowych, określać, jaką mają masę, jak się poruszają i jak wchodzą w interakcje. Jestem przekonany, że ta technika zmieni nasze rozumienie procesów biologicznych zachodzących na błonach i z nimi związanych.