Name: Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 30 s
Description: Poznaj metodę śledzenia cząstek czułych na masę do badania dynamiki makrocząsteczek na błonach lipidowych. Technika iSCAT umożliwia bezetykietową obserwację biomolekuł w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Szczerze doceniamy wsparcie ze strony Philippa Kukury, Gavina Younga i zespołu oprogramowania Refeyn i dziękujemy za ich pomoc, udostępniając fragmenty kodu do analizy obrazu. Dziękujemy Cryo-EM MPIB Core Facility za udostępnienie komercyjnego fotometru masowego Refeyn. F.S. dziękuje za wsparcie i fundusze udzielone przez Jürgena Plitzko i Wolfganga Baumeistera. T.H. i P.S. otrzymali dofinansowanie za pośrednictwem Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) - Project-ID 201269156 - SFB 1032 (A09). Firma N.H. otrzymała wsparcie w postaci dotacji DFG na powrót HU 2462/3-1. P.S. dziękuje za wsparcie za pośrednictwem sieci badawczej MaxSynBio w ramach wspólnej inicjatywy finansowania niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) oraz Towarzystwa Maxa Plancka.

<ol><li>Robertson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+bilayer+membrane+and+its+protein+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">The lipid bilayer membrane and its protein constituents.</a> Journal of General Physiology. 150 (11), 1472-1483 (2018).</li>
<li>Grecco, H. E., Schmick, M., Bastiaens, P. I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+the+Living+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling from the Living Plasma Membrane.</a> Cell. 144 (6), 897-909 (2011).</li>
<li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 119-151 (2005).</li>
<li>Whited, A. M., Johs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interactions+of+peripheral+membrane+proteins+with+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">The interactions of peripheral membrane proteins with biological membranes.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 192, 51-59 (2015).</li>
<li>Gonzalez, L., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+membrane+trafficking%3A+Structural+insights+from+a+Rab%2Feffector+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of membrane trafficking: Structural insights from a Rab/effector complex.</a> Cell. 96 (6), 755-758 (1999).</li>
<li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+of+membrane+organization%3A+composition%2C+regulation+and+roles+of+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li>
<li>Bagheri, Y., Ali, A. A., You, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+detecting+cell+membrane+transient+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Current methods for detecting cell membrane transient interactions.</a> Frontiers in Chemistry. 8, 603259(2020).</li>
<li>Miller, H., Zhou, Z., Shepherd, J., Wollman, A. J. M., Leake, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+techniques+in+biophysics%3A+A+review+of+the+progress+in+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Single-molecule techniques in biophysics: A review of the progress in methods and applications.</a> Reports on Progress in Physics. 81 (2), 024601(2018).</li>
<li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+progress+in+single+particle+tracking%3A+From+methods+to+biophysical+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">A review of progress in single particle tracking: From methods to biophysical insights.</a> Reports on Progress in Physics. 78 (12), 124601(2015).</li>
<li>Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+kinesin-driven+movements+with+nanometre-scale+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision.</a> Nature. 331 (6155), 450-453 (1988).</li>
<li>Funatsu, T., Harada, Y., Tokunaga, M., Saito, K., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single+fluorescent+molecules+and+individual+ATP+turnovers+by+single+myosin+molecules+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging of single fluorescent molecules and individual ATP turnovers by single myosin molecules in aqueous solution.</a> Nature. 374 (6522), 555-559 (1995).</li>
<li>Schmidt, T., Schütz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single+molecule+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging of single molecule diffusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (7), 2926-2929 (1996).</li>
<li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li>
<li>Kukura, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+nanoscopic+tracking+of+the+position+and+orientation+of+a+single+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus.</a> Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).</li>
<li>Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+optical+detection+and+tracking+of+very+small+gold+nanoparticles+at+a+water-glass+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface.</a> Optics Express. 14 (1), 405(2006).</li>
<li>Ueno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+dark-field+microscopy+with+nanometer+spatial+precision+and+microsecond+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Simple dark-field microscopy with nanometer spatial precision and microsecond temporal resolution.</a> Biophysical Journal. 98 (9), 2014-2023 (2010).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 18 (5), 577-583 (2011).</li>
<li>Bezeljak, U., Loya, H., Kaczmarek, B., Saunders, T. E., Loose, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+activation+and+bistability+in+a+Rab+GTPase+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stochastic activation and bistability in a Rab GTPase regulatory network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (12), 6504-6549 (2020).</li>
<li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63 (1), 595-617 (2012).</li>
<li>Garcia-Parajo, M. F., Segers-Nolten, G. M. J., Veerman, J. A., Greve, J., Van Hulst, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+light-driven+dynamics+of+the+fluorescence+emission+in+single+green+fluorescent+protein+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time light-driven dynamics of the fluorescence emission in single green fluorescent protein molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7237-7242 (2000).</li>
<li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li>
<li>Piliarik, M., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+optical+sensing+of+single+unlabelled+proteins+and+super-resolution+imaging+of+their+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites.</a> Nature Communications. 5, 4495(2014).</li>
<li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photonics%22%5BJournal%5D)">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li>
<li>Heermann, T., Steiert, F., Ramm, B., Hundt, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-sensitive+particle+tracking+to+elucidate+the+membrane-associated+MinDE+reaction+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mass-sensitive particle tracking to elucidate the membrane-associated MinDE reaction cycle.</a> Nature Methods. 18 (10), 1239-1246 (2021).</li>
<li>Foley, E. D. B., Kushwah, M. S., Young, G., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+photometry+enables+label-free+tracking+and+mass+measurement+of+single+proteins+on+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mass photometry enables label-free tracking and mass measurement of single proteins on lipid bilayers.</a> Nature Methods. 18 (10), 1247-1252 (2021).</li>
<li>Voss, O. H., Lee, H. N., Tian, L., Krzewski, K., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+preparation+for+the+analysis+of+lipid-receptor+interaction+and+efferocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Liposome preparation for the analysis of lipid-receptor interaction and efferocytosis.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-21 (2018).</li>
<li>Pincet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+to+characterize+molecular+diffusion+and+interaction+in+various+membrane+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments.</a> PLoS ONE. 11 (7), 0158457(2016).</li>
<li>Howarth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monovalent+streptavidin+with+a+single+femtomolar+biotin+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site.</a> Nature Methods. 3 (4), 267-273 (2006).</li>
<li>Allan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((soft-matter%2Ftrackpy%3A+Trackpy+v.0.5.0%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">soft-matter/trackpy: Trackpy v.0.5.0.</a> Zenodo. , (2021).</li>
<li>Weimann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+comparison+of+single-dye+tracking+analysis+tools+using+Monte+Carlo+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A quantitative comparison of single-dye tracking analysis tools using Monte Carlo simulations.</a> PLoS ONE. 8 (5), 64287(2013).</li>
<li>Michalet, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mean+square+displacement+analysis+of+single-particle+trajectories+with+localization+error%3A+Brownian+motion+in+an+isotropic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E+-+Statistical%2C+Nonlinear%2C+and+Soft+Matter+Physics%22%5BJournal%5D)">Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium.</a> Physical Review E - Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4), 041914(2010).</li>
<li>Sygusch, J., Beaudry, D., Allaire, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+rabbit+skeletal+muscle+aldolase+at+2.7-A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of rabbit skeletal muscle aldolase at 2.7-A resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (22), 7846-7850 (1987).</li>
<li>Heath, G. R., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+AFM+height+spectroscopy+reveals+%C2%B5s-dynamics+of+unlabeled+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules.</a> Nature Communications. 9 (1), 4983(2018).</li>
<li>Day, C. A., Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+the+confined+diffusion+of+cholera+toxin+B-subunit+in+intact+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying the confined diffusion of cholera toxin B-subunit in intact cell membranes.</a> PLOS ONE. 7 (4), 34923(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Prezentowany protokół rozszerza fotometrię masową21, technikę analizującą masę pojedynczych biomolekuł adsorbujących na szkle, do jeszcze bardziej wszechstronnego narzędzia zdolnego do jednoczesnego pomiaru masy i dyfuzji nieznakowanych biomolekuł oddziałujących z błoną. Rozszerzenie tej analizy osiągnięto poprzez zastosowanie zmodyfikowanej strategii usuwania tła dostosowanej do ruchu bocznego cząsteczek24,25. Ogólnie rzecz biorąc, usuwanie tła ma ogromne znaczenie dla podejść opartych na iSCAT, ponieważ silne rozproszenie chropowatości powierzchni szkła stanowi główną przeszkodę w analizie, a dokładne określenie lokalnego tła każdego piksela jest niezbędne do ilościowego określenia masy i lokalizacji cząstek. Oprócz analizy obrazu dostosowanej do ruchu cząstek, późniejsza detekcja cząstek, łączenie trajektorii i analiza danych uzupełniają nowatorską ekspansję MP w kierunku śledzenia cząstek czułych na masę (MSPT).
Ogólnie rzecz biorąc, dokładnie oczyszczone szkiełka podstawowe i czyste środowisko pracy są kluczowymi wymaganiami dla pomyślnego przeprowadzenia eksperymentów MSPT. Ze względu na brak znakowania makrocząsteczek uzyskany sygnał jest z natury nieselektywny. Czyste próbki, a także właściwe obchodzenie się z próbkami mają zatem kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że obserwacje nie zostaną błędnie zinterpretowane. W szczególności, gdy badane są cząsteczki o niskiej masie cząsteczkowej, zatwierdza się pomiary kontrolne błon bezbiałkowych w celu oceny wkładu tła (rysunek uzupełniający 1). Oprócz włączenia pomiarów kontrolnych, zaleca się zatem postępowanie zgodnie z krokami przygotowania przedstawionymi na rysunku 2 dla każdej studzienki przepływowej. W połączeniu te środki bezpieczeństwa zapewnią, że wykryty sygnał pochodzi z biomolekuły będącej przedmiotem zainteresowania, a nie na przykład z zanieczyszczonej komory przepływowej, bufora lub membrany.
Oprócz środków ostrożności dotyczących projektu eksperymentalnego, należy również zachować ostrożność podczas przetwarzania obrazu MSPT. Podczas przetwarzania wideo należy starannie dobrać wartość trzech parametrów, aby zapewnić prawidłowe wyniki: i) długość mediany okna do usunięcia tła, ii) próg wykrywania cząstek oraz iii) maksymalny promień wyszukiwania podczas przypisywania linków. Większe okno środkowe (i) na ogół ułatwia oddzielanie dyfuzyjnych cząstek od nałożonego quasi-stałego tła. Jednak w przypadku zbyt dużych rozmiarów okien dryft próbki w końcu stanie się zauważalny i zmniejszy dokładność oszacowania tła. Optymalne ustawienia w dużym stopniu zależą od właściwości próbki i warunków pomiaru. Niemniej jednak wartość 1 001 może być używana jako solidny punkt wyjścia. Parametr progowy (ii) musi być dostrojony w zależności od najmniejszej masy cząsteczkowej oczekiwanej w próbce. Wartość poniżej 0,0005 nie jest zalecana dla pomiarów wykonanych za pomocą fotometru masowego użytego w tym badaniu. Aby przyspieszyć czas analizy, można wybrać wyższe wartości, jeśli spodziewana jest próbka o dużej masie cząsteczkowej. Promień wyszukiwania w łączeniu trajektorii (iii) określa maksymalną odległość radialną w pikselach, w której przesunięte położenie cząstki będzie wyszukiwane w kolejnych klatkach. Powinien być dostosowany do najszybszej cząstki w próbce, a jeśli jest to preferowane, można zamiast tego użyć adaptacyjnego zakresu wyszukiwania (zobacz dokumentację trackpy) w celu skrócenia czasu obliczeń. Szczególnie w początkowej fazie projektu zalecana jest ponowna analiza filmów o różnych parametrach w celu walidacji uzyskanych wyników.
Ze względu na jednocząsteczkowy charakter MSPT należy unikać pomiaru przy dużej gęstości cząstek membrany, ponieważ mogą one zakłócać dokładny kontrast i określenie masy. Wykazano, że gęstości poniżej jednej cząstki na mikrometr kwadratowy są korzystne dla pomiarów MSPT24. Dodatkową kwestią są oczekiwane współczynniki dyfuzji w próbce. Chociaż ma zastosowanie do szerokiego zakresu współczynników dyfuzji, MSPT ma dolną granicę dostępnych współczynników dyfuzji. Lokalne ograniczenie do obszaru kilku pikseli przez znaczną część okresu mediany okna łączy cząstkę ze statycznym tłem. Dla warunków obrazowania stosowanych w tym protokole nie zaleca się pomiaru współczynników dyfuzji poniżej 0,01μm2/s. Na przykład przy tej prędkości dyfuzji średnie kwadratowe przemieszczenie cząstki w połowie rozmiaru okna mediany wynosi około 4 pikseli, a zatem ma podobny rozmiar jak rozmiar PSF. W związku z tym oszacowanie statycznego tła prawdopodobnie będzie zawierało wkłady sygnału od samej cząstki, co skutkuje pozornie zmniejszonym kontrastem cząstki, aż w końcu zbliży się do poziomu szumu. Jednak współczynniki dyfuzji makrocząsteczek w zakresie od 0,05 do 10 μm2/s mogą być wyraźnie określone.
Aby jeszcze bardziej rozszerzyć zakres zastosowań MSPT, można przewidzieć postęp algorytmu tła opartego na medianie poprzez eliminację pikseli, które są tymczasowo zajęte przez cząstkę, lub poprzez korekcję dryfu próbki, co umożliwia większe rozmiary mediany okien. Oba podejścia złagodziłyby problemy związane z pomiarami przy dużej gęstości cząstek i powolnej dyfuzji. Na horyzoncie pojawiają się ulepszenia w zakresie czułości na mniejszą masę dzięki nowej generacji fotometrów masowych, które mogą zapewnić dostęp do biomolekuł mniejszych niż 50 kDa. W związku z tym przyszłe eksperymenty MSPT będą w stanie badać dynamikę pojedynczych cząsteczek i interakcje związane z błonami dla jeszcze szerszego zakresu mimikry błonowej, takiej jak amortyzowane dwuwarstwy i układy makromolekularne.

Kiedyś postrzegane jedynie jako bariera przed szerokim zakresem warunków otoczenia, membrany biologiczne są obecnie uważane za jednostki funkcjonalne i platformy katalityczne1,2. Opierając się na ich zdolności do lokalizacji, wzmacniania i kierowania sygnałami w odpowiedzi na reakcje makrocząsteczkowe związane z błoną, interfejsy lipidowe stanowią kluczowy element dla szerokiej gamy procesów komórkowych, takich jak transport błonowy i kaskady sygnałowe3,4,5. Służąc jako miejsce zarodkowania do składania stabilnych kompleksów, przyłączanie błony często opiera się na dynamicznej równowadze między formami makrocząsteczek związanymi z błoną i cytozolowymi, a zatem ma charakter przejściowy6,7.
Pomimo ich wielkiego znaczenia w biologii, do tej pory wyzwaniem było opracowanie metod, które mogą zapewnić dostęp do niejednorodności składu, przestrzeni i czasu reakcji makromolekuł związanych z błoną w czasie rzeczywistym7,8. Aby rozwiązać podstawowe procesy molekularne, decydujące są dwa aspekty eksperymentalne: wystarczająca rozdzielczość czasowa i czułość pojedynczej cząstki. W związku z tym techniki uśredniania całego obrazu, takie jak odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP), ale także znacznie bardziej czuła spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS), mają ograniczenia, ponieważ w dużej mierze oddzielają informacje przestrzenne od informacji czasowej9. Ważnym krokiem w kierunku scharakteryzowania dynamiki poszczególnych cząsteczek było zatem pojawienie się śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) w połączeniu z bardzo czułą mikroskopią. W szczególności skuteczne w tym zakresie okazały się dwa podejścia SPT. Po pierwsze, wykorzystanie fluoroforów jako etykiet i odpowiadających im systemów detekcji fluorescencji utorowało drogę do nanometrowej precyzji i milisekundowej rozdzielczości czasowej10,11,12. Po drugie, detekcja oparta na rozpraszaniu przy użyciu nanocząstek złota poprawiła zarówno precyzję lokalizacji, jak i rozdzielczość czasową odpowiednio w zakresie subnanometrowym i mikrosekundowym13,14,15,16. Pomimo wielu zalet obu podejść i ich znaczącego wkładu w mechanistyczne zrozumienie systemów związanych z błonami17,18, obie techniki były do tej pory ograniczone: wymagają znakowania interesujących nas cząsteczek, co potencjalnie zaburza ich naturalne zachowanie i są niewrażliwe na skład molekularny cząstek związanych z błoną19,20.
Oba te ograniczenia zostały ostatnio przezwyciężone dzięki wprowadzeniu nowatorskiego podejścia opartego na rozpraszaniu interferometrycznym (iSCAT), zwanego fotometrią masową (MP)21,22,23. Technika ta pozwala na określenie rozkładu masowego biomolekuł w roztworze zgodnie z ich kontrastem iSCAT po wylądowaniu na szklanym interfejsie. Jednak w celu wykrycia i scharakteryzowania ruchomych cząsteczek dyfundujących na błonach lipidowych konieczne było opracowanie bardziej wyrafinowanego podejścia do analizy obrazu. W międzyczasie zostało to z powodzeniem wdrożone i pozwala wykrywać, śledzić i określać masę cząsteczkową pojedynczych, nieznakowanych biomolekuł dyfundujących na granicy lipidów24,25. Technika ta, określana jako dynamiczna fotometria masowa lub śledzenie cząstek wrażliwych na masę (MSPT), umożliwia obecnie ocenę złożonych oddziaływań makromolekuł poprzez bezpośrednie rejestrowanie zmian w masie cząsteczkowej śledzonych jednostek, a tym samym otwiera nowe możliwości mechanistycznej analizy dynamiki molekularnej związanej z błoną.
Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół przygotowania próbek, obrazowania i potoku analizy danych wymaganego dla MSPT. W szczególności omówiono wymagania dotyczące próbek i potencjalne problemy, które mogą wystąpić podczas pomiaru i analizy. Co więcej, niezrównany potencjał w zakresie analizy systemów makromolekularnych oddziałujących z błonami jest prezentowany przez różne reprezentatywne wyniki.

<table><tbody><tr><td>Aneksyna V</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#SRP8026</td><td>przykładowe białko oddziałujące z błoną</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>#5000006</td><td>zestaw testowy Bradforda do oznaczania stężeń białka</td></tr><tr><td>albumina bydlęca znakowana biotyną</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A8549</td><td>przykładowe białko, które może być stosowane jako białko standardowe dla</td></tr><tr><td>podjednostki B toksyny</td> MSPT <td>Sigma Aldrich</td><td>#SAE0069</td> przykładowe okulary białkowe <td>oddziałujące z błoną</td></tr><tr><td>, #1.5, 24 x 24 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>#0102062</td><td></td></tr><tr><td>szkła nakrywkowe, #1,5, 24 x 60 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>#0102242</td><td></td></tr><tr><td>dioleoilo-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#850375</td><td>lipid - w postaci ekstrudowanych małych pęcherzyków jednowarstwowych niezbędnych do wspomaganego tworzenia dwuwarstwy lipidowej</td></tr><tr><td>dioleoilo-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotynyl (18:1 Biotinyl Cap PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#870273</td><td>lipid - w postaci ekstrudowanych małych pęcherzyków unilamelarnych niezbędnych do wspomaganego tworzenia dwuwarstw lipidowych</td></tr><tr><td>dioleoilo-sn-glycero-3-fosfogliccerol (DOPG)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#840475</td><td>lipid - w postaci ekstrudowanych małych pęcherzyków jednowarstwowych niezbędnych do wspomaganego tworzenia dwuwarstwy lipidowej</td></tr><tr><td>dioleoilo-sn-glycero-3-phospho-L-seryna (DOPS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#840035</td><td>lipid - w postaci ekstrudowanych małych pęcherzyków jednowarstwowych niezbędnych do podparcia tworzenia dwuwarstwowych warstw lipidowych</td></tr><tr><td></td><td>taśma dwustronna tesa</td><td>#57912-00000-02</td><td>potrzebna do montażu szklanych komór na próbki</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#610023</td><td>Wytłaczarka do lipidów umożliwiająca monodyspersyjną dystrybucję pęcherzyków</td></tr><tr><td>EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A39261</td><td>Biotyna ze stopioną maileimidem, która może być stosowana do biotynylacji standardowych białek dla MSPT</td></tr><tr><td>Fibronectin (Biotinylated)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>#FNR03-Przykładowe białko,</td><td>które może być używane jako standardowe białko do MSPT</td></tr><tr><td>Gel Filtration HMW Calibration Kit</td><td>Cytiva</td><td>#28403842</td><td>standardowych białek, np. aldolazy, która może być biotynylowana i stosowana jako wzorce masy cząsteczkowej dla MSPT</td></tr><tr><td>GM1 Gangliozyd (mózg, sól sodowa owczy)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>#860065</td><td>lipid - w postaci ekstrudowanych małych pęcherzyków jednowarstwowych niezbędnych do wspomaganego tworzenia dwuwarstwowych lipidów</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H+L), Biotyna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)</td><td>#31820</td><td>Przykładowe białko podkreślające istnienie różnych stanów białkowych</td></tr><tr><td>Izopropanol, 99,5%, do spektroskopii</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#10003643</td><td></td></tr><tr><td>Olejek</td> <td>immersyjny o niskiej autofluorescencjiOlympus K.K.</td><td>#IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>pET21a-Streptavidin-Alive</td><td>Addgene</td><td>#20860</td><td>wymagany do ekspresji i oczyszczania dwuwartościowej streptawidyny w połączeniu ze sobą</td></tr><tr><td>pET21a-Streptawidyna-Dead</td><td>Addgene</td><td>#20859</td><td>wymagany do ekspresji i oczyszczania dwuwartościowej streptawidyny w połączeniu ze sobą</td></tr><tr><td>Pierce Alkaline Phosphatase, biotynylowany</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#29339</td><td>przykładowe białko, które może być stosowane jako białko standardowe dla MSPT</td></tr><tr><td>Pierce Protein A, Biotinylated</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#29989</td><td>przykładowe białko, które może być stosowane jako białko standardowe dla MSPT</td></tr><tr><td>Refeyn Acquire</td><td>Refeyn Ltd.</td><td></td><td>oprogramowanie sterujące dla Refeyn OneMP</td></tr><tr><td>Refeyn One</td><td>Refeyn Ltd.</td><td>-</td><td>Fotometr masowy</td></tr><tr><td>sterylne filtry strzykawkowe 0,45 i mikro; m membrana octanu celulozy</td><td>VWR International</td><td>#514-0063</td><td>potrzebna do filtrowania cząstek z buforu będącego przedmiotem zainteresowania</td></tr><tr><td>czterowartościowa streptawidyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#SNN1001</td><td>czterowartościowa streptawidyna umożliwiająca obecność kilku miejsc wiązania biotyny</td></tr><tr><td>Hydrofilowa membrana Whatman Nuclepore, 0,05 i mikro; m Wielkość porów, 25 mm Okrąg</td><td>Cytiva</td><td>#110603</td><td>wielkość porów 50 nm jest zalecana do wspomaganego tworzenia dwuwarstw lipidowych w kontekście</td></tr><tr><td>myjki plazmowej MSPT Zepto model 2</td><td>Diener electronic GmbH</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Krótkotrwałe lub przejściowe interakcje makromolekuł na błonach lipidowych i z nimi, interfejsie, gdzie zachodzi wiele istotnych reakcji biologicznych, są z natury trudne do oceny za pomocą standardowych metod biofizycznych. Wprowadzenie śledzenia cząstek wrażliwych na masę (MSPT) stanowi ważny krok w kierunku dokładnej ilościowej charakterystyki takich procesów. Z technicznego punktu widzenia było to możliwe dzięki pojawieniu się interferometrycznej mikroskopii rozpraszającej (iSCAT) opartej na fotometrii masowej (MP). Gdy strategia usuwania tła jest zoptymalizowana w celu ujawnienia dwuwymiarowego ruchu cząstek związanych z błoną, technika ta umożliwia analizę w czasie rzeczywistym zarówno dyfuzji, jak i masy cząsteczkowej nieznakowanych makrocząsteczek na błonach biologicznych. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół wykonywania i analizy śledzenia wrażliwych na masę cząstek systemów związanych z membraną. Pomiary wykonywane na komercyjnym fotometrze masowym osiągają rozdzielczość czasową w zakresie milisekund oraz, w zależności od układu MP, granicę detekcji masy do 50 kDa. Aby pokazać potencjał MSPT w zakresie dogłębnej analizy dynamiki makrocząsteczek katalizowanych błonowo w ogóle, przedstawiono wyniki uzyskane dla przykładowych układów białkowych, takich jak natywny interaktor błonowy aneksyna V.

Ten protokół opisuje oparte na iSCAT przetwarzanie obrazów i śledzenie pojedynczych cząstek, które umożliwia jednoczesne badanie masy cząsteczkowej i dyfuzyjnego zachowania makrocząsteczek oddziałujących z błonami lipidowymi. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki, konwersji masy na kontrast, akwizycji filmu i obróbki końcowej są dostępne wraz ze wskazówkami, aby zapobiec potencjalnym pułapkom.

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Dzięki czułemu na masę śledzeniu cząstek możemy obserwować poszczególne biomolekuły dyfundujące na błonach lipidowych i określać ilościowo ich dynamikę w czasie rzeczywistym, a wszystko to całkowicie bez etykietowania. Ponieważ nie są wymagane żadne etykiety, nie ma niebezpieczeństwa zakłócenia dynamicznego zachowania biomolekuł. Kolejną zaletą tej metody jest jej czułość masowa, która pozwala na określenie stanów oligomerycznych związanych z błoną.Ze względu na jej wszechstronność możemy zastosować tę metodę do każdego systemu związanego z membraną. W szczególności może być stosowany do badania tworzenia kompleksów receptorowych indukowanych przez ligandy. Zacznij od rozprowadzenia równej liczby szkiełek mikroskopowych w uchwytach z PTFE.Przenieść uchwyty PTFE do zlewek. Dodaj ultraczystą wodę i poddawaj je sonikacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Użyj pęsety, aby przenieść uchwyty do czystych zlewek i dodaj ultraczysty izopropanol.Ponownie sonikować przez 15 minut, następnie ponownie zastąpić izopropanol ultraczystą wodą i sonikować zlewkę zawierającą uchwyty przez 15 minut. Wyjmij uchwyty ze zlewek i wysusz szkiełka mikroskopowe w uchwycie pod stałym strumieniem azotu lub sprężonego powietrza. Umieść wysuszony uchwyt zawierający duże szkiełka mikroskopowe w myjce plazmowej i włącz ją.Owiń płaski karton folią aluminiową. Oczyszczone szkiełka mikroskopowe o wymiarach 24 milimetry na 24 milimetry rozłóż na folii aluminiowej w wystarczającej odległości między sobą. Następnie przymocuj dwustronne paski taśmy do górnej i dolnej krawędzi prowadnic.Każde szkiełko mikroskopowe należy wyciąć skalpelem, tak aby można je było usunąć z folii aluminiowej. Każda zjeżdżalnia powinna posiadać paski taśmy dwustronnej przymocowane do górnej i dolnej krawędzi zjeżdżalni. Następnie przymocuj zjeżdżalnię z dwoma dwustronnymi paskami taśmy do zjeżdżalni hydrofilizowanej.Utworzy to ścieżkę przepływu między mniejszymi i większymi szkiełkami mikroskopowymi. Rozcieńczyć świeżo wytłaczane małe pęcherzyki jednowarstwowe lub SUV do końcowego stężenia 0,4 miligrama na mililitr w wymaganym buforze reakcyjnym. Opcjonalnie, aby przyspieszyć pękanie pęcherzyków, dodać dwa milimolowe chlorki wapnia do zawiesiny pęcherzyków.Zamontuj komorę przepływową na stoliku fotometru masy. Przepłukać 25 mikrolitrów zawiesiny pęcherzyków do komory przepływowej i inkubować komorę przez dwie minuty, a następnie usunąć niestopione pęcherzyki poprzez wielokrotne mycie komory przepływowej za każdym razem 200 mikrolitrami buforu reakcyjnego. Gdy błona lipidowa jest wolna od niepołączonych pęcherzyków, dodaj 50 mikrolitrów interesującego białka do komory próbki.Następnie ustaw warunki obrazowania, takie jak rozmiar pola widzenia, czas ekspozycji, liczba klatek na sekundę i czas akwizycji w oprogramowaniu do akwizycji. Automatyczna regulacja ostrości. W razie potrzeby użyj bocznego elementu sterującego, aby przesunąć pole widzenia do pozycji z jednorodną membraną.Utwórz folder projektu i rozpocznij nagrywanie filmu. Po zakończeniu nagrywania określ nazwę pliku w oknie dialogowym wyświetlanym przez oprogramowanie do akwizycji. Film zostanie automatycznie zapisany w folderze projektu jako plik MP do późniejszej analizy.Aby przeanalizować nagrane filmy wideo, uruchom aplikację Jupyter notebook. Na wyświetlonej liście folderów przejdź do lokalizacji, w której przeprowadzono analizę MSPT. Plik notatnika ipy jest przechowywany i kliknij plik.W notesach Jupyter kod jest zorganizowany w komórkach i można go wykonać krok po kroku. Kliknij mały przycisk Odtwórz obok komórki lub wybierz komórkę i naciśnij Shift Enter, aby uruchomić komórkę. Zacznij od zaimportowania wszystkich wymaganych pakietów do analizy.Wykonaj następną komórkę, aby uruchomić monit o plik. Wybierz folder zawierający jeden lub wiele plików wideo MP do analizy i naciśnij Wybierz folder. Lista wybranych plików jest drukowana pod komórką.Aby usunąć dominujące statyczne rozpraszanie światła za pomocą algorytmu estymacji tła w pikselach, wybierz opcję ciągłej mediany dla trybu parametru i ustaw odpowiednią długość przesuwanego okna mediany. Opcjonalnie zapisz filmy po usunięciu tła, ustawiając save_processed_movies True, aby używać ich do wykrywania cząstek i łączenia trajektorii. Upewnij się, że ustawiłeś równoległe wartości True i GPU False dla przetwarzania na procesorze CPU lub odwrotnie dla przetwarzania na procesorze GPU.Cząstki i ich położenie są identyfikowane i lokalizowane w całym filmie. Dostosuj czułość wykrywania cząstek za pomocą parametru progowego, który służy do podświetlania punktów kandydujących za pomocą binaryzacji obrazu. Zbadaj wpływ różnych parametrów progowych na czułość wykrywania punktowego w osobnym notesie o nazwie Wizualizacja filmu.Notatnik IPY. Po załadowaniu filmu do przeglądarki klatek użyj suwaka progu, aby dostosować próg wykrywania cząstek i znaleźć odpowiednie ustawienie. Wróć do drugiego notesu, wybierz trzy parametry do łączenia cząstek w kolejnych klatkach w trajektorie przy użyciu pakietu trackpy języka Python.Ustaw maksymalne przemieszczenie cząstek z jednej klatki do drugiej zgodnie z maksymalną oczekiwaną prędkością dyfuzji. Wybierz maksymalną liczbę klatek, w których cząstka może zniknąć i pojawić się ponownie, ale nadal być uważana za tę samą cząstkę. Trajektorie ze zbyt małą liczbą punktów można usunąć za pomocą parametru minimum_trajectory_length w celu dokładniejszego określenia współczynników dyfuzji.Napraw wszystkie parametry w komórce, wykonując ją. Wykonaj następną komórkę, aby przeanalizować wszystkie wybrane filmy z wybranymi parametrami. Paski postępu dla każdego kroku przetwarzania pojawią się poniżej komórki.Może to chwilę potrwać, w zależności od długości filmu, ustawień parametrów i sprzętu. W kolejnym kroku oprogramowanie określa współczynniki dyfuzji dla trajektorii znalezionych w poprzednim rozdziale, na podstawie zarówno rozkładu odległości skoku, jak i analizy przemieszczenia średniokwadratowego. Zacznij od określenia frame_rate filmu i pixel_size.Napraw je, wykonując komórkę, a następnie uruchom następną komórkę i wybierz katalog nadrzędny zawierający wszystkie pliki CSV wygenerowane przez trackpy. Lista znalezionych plików CSV jest drukowana poniżej komórki. W następnej komórce wybierz nazwę kontenera HDF5, w którym są przechowywane wyniki, i wykonaj go.Na koniec wykonaj komórkę C.4, aby przeprowadzić analizę dyfuzji. W komórce C.5 wprowadź parametry linii kalibracji kontrastu do masy, czyli nachylenie i przesunięcie wyznaczone przy użyciu próbek o znanej masie i wykonaj je, aby przeliczyć wszystkie kontrasty cząstek na masę cząsteczkową. Oceń pozorną gęstość cząstek na membranie, wykonując komórkę C.6, która zwraca wartość mediany gęstości pod względem wykrytych cząstek i przedstawia trajektorie podczas każdej klatki jako dodatkowe kolumny w ramce danych.Aby wygenerować końcowy wykres korelacji masy i współczynnika dyfuzji, uruchom komórkę D.1, aby załadować monit o plik i określ plik HDF5 zawierający wyniki MSPT, a następnie wybierz zestaw danych z pojedynczego filmu do wykreślenia w komórce D.2 lub połącz dane z wielu filmów w jedną klatkę danych, wykonując komórkę D.3. W tym przykładzie, ponieważ wszystkie filmy wideo są replikami identycznych próbek, zestaw danych jest łączony w pulę. Na koniec wykreśl gęstość jądra 2D, wykonując komórkę D.4.Jeśli spełnione wymagania, określ lokalizację, w której chcesz zapisać wydruk w pliku PDF w komórce D.5 i wykonaj go. Przedstawiono tutaj reprezentatywne obrazy chropowatości powierzchni szkiełka nakrywkowego podczas tworzenia podpartej dwuwarstwy lipidowej z nienaruszoną podpartą dwuwarstwą lipidową oraz przykładowych białek odtworzonych na SLB. Wszystkie cztery przykłady są wyświetlane w trybie natywnym, do którego można uzyskać dostęp podczas samego pomiaru, oraz jako przetworzone obrazy ratiometryczne po usunięciu tła na podstawie mediany.Kalibrację, która przekłada kontrast na masę cząsteczkową, można osiągnąć, przyłączając biomolekuły o znanej masie do SLB za pomocą kompleksu biotyna-streptawidyna-biotyna. Jako przykładową strategię można zastosować biotynylowane warianty albuminy surowicy bydlęcej, białka A, fosfatazy alkalicznej i fibronektyny, które wiążą się ze streptawidyną, która z kolei jest związana z lipidami zawierającymi biotynę w błonie. Coraz wyraźniejszy kontrast tych przykładowych makrocząsteczek odzwierciedla rosnącą masę cząsteczkową odpowiednich wzorców biotynylowanych.Poprzez przypisanie każdego piku histogramów kontrastu do odpowiedniej masy stanu oligomerowego białka wzorcowego, ujawnia się liniowa zależność między kontrastem a masą, która może być następnie wykorzystana do analizy nieznanych układów makrocząsteczkowych. Przedstawiono tutaj oszacowania gęstości ziarna 2D zarówno masy, jak i współczynnika dyfuzji czterowartościowej streptawidyny w kompleksie z biotynylowaną aldolazą lub z modyfikowanym biotyną kozim przeciwciałem anty-IgG królika modyfikowanego biotyną. Reprezentatywne obrazy przedstawiają porównanie wyznaczonych mas oligomerów dla kompleksu czterowartościowej streptawidyny z aldolazą modyfikowaną biotyną lub IgG i oczekiwanymi masami cząsteczkowymi.Dzięki MSPT możemy śledzić biomolekuły bezpośrednio na błonach lipidowych, określać, jaką mają masę, jak się poruszają i jak wchodzą w interakcje. Jestem przekonany, że ta technika zmieni nasze rozumienie procesów biologicznych zachodzących na błonach i z nimi związanych.

mass-sensitive-particle-tracking-to-characterize-membrane-associated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Multiple-Target Tracing to autorski algorytm opracowany do śledzenia pojedynczo znakowanych cząsteczek w błonie plazmatycznej żywych komórek. Efektywne wykrywanie, szacowanie i śledzenie cząsteczek w czasie przy wysokiej gęstości znakowania zapewnia przyjazne dla użytkownika, kompleksowe narzędzie do badania dynamiki błon w skali nanometrycznej.

Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą Multiple-Target Tracing (MTT)

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Prezentujemy metodę przygotowania dwuwarstwowych lipidów na podłożu miki do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Mika jest przezroczysta i płaska w skali atomowej, ale rzadko stosowana w obrazowaniu ze względu na trudności w obsłudze; Nasze przygotowanie skutkuje równomiernym osadzaniem się arkusza miki i zmniejsza ilość materiału używanego do przygotowania dwuwarstwowego.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych na podłożu miki do obrazowania mikroskopii optycznej o wysokiej rozdzielczości

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Tutaj prezentujemy protokół do analizy obrazu śledzenia pojedynczych cząstek, który umożliwia ilościową ocenę współczynników dyfuzji, typów ruchu i rozmiarów klastrów pojedynczych cząstek wykrywanych przez mikroskopię fluorescencyjną.

Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Tutaj pokazujemy użycie tradycyjnej mikroskopii ciemnego pola do monitorowania dynamiki nanoprętów złota (AuNR) na błonie komórkowej. Lokalizacja i orientacja pojedynczych AuNR są wykrywane za pomocą ImageJ i MATLAB, a stany dyfuzyjne AuNR są charakteryzowane przez analizę śledzenia pojedynczych cząstek.

Wizualizacja dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonie komórkowej przy użyciu mikroskopii ciemnego pola pojedynczych nanocząstek

Analiza średniego kwadratu (iMSD) wyprowadzona z obrazowania jest stosowana do makropinosomów, aby podkreślić ich wewnętrzną, ewoluującą w czasie naturę pod względem właściwości strukturalnych i dynamicznych. Makropinosomy są następnie porównywane z granulkami wydzielniczymi insuliny (ISG) jako odniesienie dla struktur subkomórkowych o niezmiennych w czasie średnich właściwościach strukturalnych/dynamicznych.

Badanie właściwości strukturalnych i dynamicznych transportujących nanostruktur subkomórkowych za pomocą spektroskopii fluktuacji czasoprzestrzennej

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę śledzenia cząstek czułych na masę do badania dynamiki makrocząsteczek na błonach lipidowych. Technika iSCAT umożliwia bezetykietową obserwację biomolekuł w czasie rzeczywistym.

Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Przeglądaj więcej filmów