Ocena wiarygodnego biomarkera w mysim modelu sepsy wywołanym podwiązaniem i nakłuciem jelita ślepego
9 grudnia 2022
Ten protokół przedstawia szczegóły operacyjne podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP) w mysim modelu sepsy. CLP jest jedną z najczęściej stosowanych technik tworzenia zwierzęcego modelu sepsy. W związku z tym do uzyskania wiarygodnych wyników badań wymagany jest ustandaryzowany protokół CLP.
Głównym celem tego badania jest wykorzystanie mysiego modelu podwiązania jelita ślepego i sepsy wywołanej nakłuciem w celu oceny wiarygodnego biomarkera sepsy we krwi. Podwiązanie i nakłucie jelita ślepego, w skrócie CLP, jest klinicznie istotnym modelem sepsy. CLP jest powszechnie stosowanym modelem w badaniach nad sepsą.
Cytrulinowany histon H3 lub CitH3 pochodzi z NETozy wywołanej sepsą. Nasze poprzednie badanie pokazuje, że CitH3 jest wiarygodnym biomarkerem diagnostycznym sepsy. Wybierz samca myszy C57BL/6.
Zważ mysz i znieczul mysz przez inhalację 1,5% izofluranu. Zamocuj mysz na poduszce grzewczej. Nałóż krem do depilacji na brzuch i pozostaw nie dłużej niż minutę przed usunięciem kremu i włosów.
Przygotuj sterylne narzędzia chirurgiczne odpowiednie do chirurgii gryzoni. Zdezynfekuj skórę brzucha jodem co najmniej trzy razy. Przykryj operacyjne pole operacyjne odpowiednią sterylną draperią chirurgiczną.
Użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby wykonać około dwucentymetrowe nacięcie w ścianie brzucha, wzdłuż kresy białej. Zidentyfikuj i odizoluj jelito ślepe z jamy otrzewnej za pomocą sterylnej pęsety. Podwiązywać 75 objętość jelita ślepego za pomocą jedwabnego szwu 4-0.
Nie należy podwiązywać naczyń krwionośnych krezki. Należy zauważyć, że różny procent podwiązanego jelita ślepego decyduje o nasileniu sepsy. 25% prowadzi do sepsy o niskim stopniu nasilenia, 50% prowadzi do sepsy średniego stopnia, a 75% prowadzi do sepsy o wysokim stopniu złośliwości.
Nakłuć jelito ślepe przez jedną perforację na wylot za pomocą igły o rozmiarze 21 w punkcie środkowym między końcem ogona a podwiązaniem. Delikatnie wyciśnij kał z jelita ślepego przez otwory penetracyjne. Należy zauważyć, że ilość kału wciśniętego do jamy otrzewnej powinna być stała, ponieważ kał również decyduje o nasileniu sepsy.
Delikatnie włóż jelito ślepe oraz kał do jamy brzusznej. Zamknij warstwę mięśni brzucha i warstwę skóry za pomocą jedwabnego szwu 6-0. Zdezynfekuj nacięcie jodem.
Wstrzyknięcie ketoprofenu, pięć miligramów na kilogram, należy wykonać w lewy dolny kwadrant brzucha, aby uniknąć jelita ślepego. Umieść mysz na poduszce grzewczej do pełnego wyzdrowienia. Mysz jest trzymana w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i ma swobodny dostęp do jedzenia i wody.
Zwierzęta zostaną poddane eutanazji w wyniku przedawkowania dwutlenku węgla z objawami sepsy, istotnymi dla naszych wstępnie zdefiniowanych punktów końcowych na podstawie przedstawionego przez nas badania. Myszy są losowo przydzielane do grupy pozorowanej, grupy CLP i grupy leczonej CLP plus Cl-amidyną lub YW3-56. Myszy w grupie pozorowanej otrzymują wszystkie procedury CLP z wyjątkiem podwiązania i nakłucia jelita ślepego.
Krew obwodową należy pobrać po 24 godzinach od operacji i przygotować surowicę przez odwirowanie. Stężenie CitH3 określono za pomocą western blotting i samodzielnie opracowanego zestawu ELISA. Jak pokazano na rycinie drugiej, w grupie pozorowanej nie wykryto CitH3.
Poziomy CitH3 były podwyższone po insercji CLP, która została znacznie osłabiona przez hamowanie PAD. Na podstawie naszych danych wnioskujemy, że krążący CitH3 jest wiarygodnym biomarkerem diagnostycznym sepsy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia szczegóły operacyjne ligacji i punkcji kątnicy (CLP) w mysim modelu sepsy. CLP jest jedną z najpowszechniej stosowanych technik tworzenia zwierzęcego modelu sepsy, co wymaga standaryzacji protokołu w celu uzyskania wiarygodnych wyników badań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Badania nad sepsą
Wprowadzenie
- Podwiązanie i punkcja kątnicy (CLP) jest klinicznie istotnym modelem sepsy.
- CLP jest powszechnie stosowane w badaniach nad sepsą.
- Niezawodne biomarkery są niezbędne do diagnozowania sepsy.
- Cytrylinowana histona H3 (CitH3) jest powiązana z indukowaną sepsą NETozą.
Cel badania
- Ocena wiarygodnych biomarkerów krwi w sepsie z wykorzystaniem modelu mysiego.
- Opracowanie zestandaryzowanego protokołu CLP w celu zapewnienia spójności badań.
- Zbadanie potencjału diagnostycznego CitH3 w sepsie.
Zastosowane metody
- Wybór samców myszy C57BL/6 do badania.
- Indukcja sepsy poprzez podwiązanie i nakłucie kątnicy.
- Ocena biomarkerów we krwi po indukcji.
- Porównanie poziomów CitH3 w celu oceny wiarygodności diagnostycznej.
Główne wyniki
- Wykazanie, że CitH3 jest wiarygodnym biomarkerem diagnostycznym.
- Zstandaryzowany protokół CLP zapewniający spójne wyniki.
- Identyfikacja indukowanej sepsą NETozy w modelu.
- Walidacja modelu mysiego do przyszłych badań nad sepsą.
Wnioski
- Model CLP jest skuteczny w badaniu sepsy.
- CitH3 stanowi obiecujący biomarker w diagnostyce sepsy.
- Zstandaryzowane protokoły zwiększają wiarygodność badań.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodne biomarkery wczesnego wykrywania są kluczowe dla minimalizacji ryzyka w procesie odkrywania leków na sepsę oraz zapewnienia ciągłości translacyjnej między modelami przedklinicznymi a badaniami klinicznymi. Model mysi indukowany CLP, w połączeniu z ilościowym pomiarem CitH3, stanowi standaryzowaną platformę do walidacji celu i analizy mechanistycznej w sepsie. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną i umożliwia selekcję projektów z portfolio w kluczowych punktach zwrotnych procesu odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczne testowanie hipotez dotyczących patofizjologii sepsy z wykorzystaniem klinicznie istotnego modelu zwierzęcego.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe oznaczanie CitH3 jako biomarkera mechanistycznego NETosis.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka oraz priorytetyzację potencjalnych celów terapeutycznych do dalszego rozwoju.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalny system oceny potencjalnych środków terapeutycznych ukierunkowanych na mechanizmy sepsy.
- Standaryzuje oznaczanie ilościowe biomarkerów za pomocą zwalidowanych testów ELISA oraz western blot dla CitH3.
- Umożliwia wiarygodne porównanie efektów interwencji w grupach eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica przedkliniczne wyniki biomarkerów z potrzebami diagnostyki klinicznej w przypadku sepsy.
- Zapewnia ciągłość przejścia od wyników uzyskanych w modelach zwierzęcych do translacyjnych strategii biomarkerowych u ludzi.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez ustanowienie solidnych, relewantnych dla choroby punktów końcowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model i schemat postępowania w zakresie biomarkerów łączą wczesną fazę odkrywania, identyfikację związków wiodących oraz walidację przedkliniczną w badaniach nad sepsą.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez mechanistycznych i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w przypadku NETozy indukowanej sepsą.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe odczyty CitH3 w celu opracowania zestandaryzowanych testów i oceny związków.
- Analityka: Dostarcza powtarzalne pomiary biomarkerów do porównywania skuteczności interwencji i stopnia ciężkości choroby.
- Badania translacyjne: Ułatwia uzgodnienie przedklinicznych danych dotyczących biomarkerów ze strategiami diagnostyki klinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Tworzy wielokrotnego użytku, zestandaryzowaną platformę do prowadzenia bieżących badań nad sepsą i oceny terapeutycznej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w sepsie.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację pomiędzy zespołami badawczymi i badaniami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową dzięki umożliwieniu wczesnej selekcji opartej na biomarkerach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów dotyczących sepsy.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu chirurgii zwierząt, opracowywania testów biomarkerów oraz analizy ilościowej.
- Niezbędny jest dostęp do zwalidowanych zestawów ELISA, infrastruktury do western blottingu oraz standaryzowanego animalarium.
- Wymagana jest rygorystyczna standaryzacja zmiennych procedury CLP oraz protokołów pomiaru biomarkerów pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych modeli chorób lub gatunków może wymagać optymalizacji i walidacji protokołu.
- Ograniczenia obejmują zmienność modelu zależną od techniki chirurgicznej oraz konieczność stosowania spójnych kryteriów punktu końcowego.
