Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

To podejście oparte na linii genetycznej umożliwia proteomiczną analizę ważnych zdarzeń rozwojowych z rozdzielczością przestrzenną i czasową w obrębie zarodka kręgowców, przekazując informacje, które nie byłyby dostępne w przypadku pomiarów całego zarodka. Podejście to można łatwo rozszerzyć o badanie białek, metabolitów i transkryptów z różnych komórek embrionalnych, które różnicują się podczas rozwoju. Metoda ta może pogłębić naszą wiedzę na temat mechanizmów molekularnych, które kontrolują prawidłowy i chory rozwój, w tym mechanizmów indukcji tkanek i zaangażowania w los komórki we wczesnym okresie rozwoju.

Użyj pętli do włosów, aby wprowadzić każdy zarodek do studzienki i delikatnie ustawić je tak, aby docelowa komórka zainteresowania znajdowała się pod kątem prostym do mikroigły. Postępuj zgodnie z mapami losu tkanek xenopus laevis, aby zidentyfikować komórkę prekursorową interesującej Cię linii. Użyj dwóch zaostrzonych kleszczy, aby delikatnie usunąć błonę witeliny otaczającą zarodek.

Odizoluj pojedyncze komórki od zarodka poprzez ręczne wypreparowanie za pomocą kleszczy. Rozpocząć od założenia igły do wstrzykiwań zawierającej roztwór do śledzenia linii. Zamontuj igłę do mikroiniekcji w uchwycie na mikropipety sterowaną przez wieloosiowy mikromanipulator.

Podłącz uchwyt mikropipety do mikrowtryskiwacza i napełnij igłę znacznikiem linii, stosując podciśnienie. Skalibruj igłę i dostosuj rozmiar końcówki igły oraz czas wstrzyknięcia, aby dostarczyć około jednego nanolitra roztworu znacznika linii, mierzonego w oleju mineralnym. Upewnij się, że rozmiar wstrzykiwanej kropli jest dokładny i w razie potrzeby dostosuj ustawienia wtryskiwacza.

Zalej gliniane naczynie do mikroiniekcji 3% roztworem fCAL i przenieś około 10 zarodków do glinianego naczynia za pomocą pipety transferowej. Wstrzyknij do interesujących komórek około jednego nanolitra fluorescencyjnego dekstranu lub 200 pikogramów mRNA GFP. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego potwierdź powodzenie znakowania komórek.

Upewnij się, że wstrzyknięta została tylko zamierzona komórka. Odrzucaj zarodki zawierające uszkodzone lub nieprawidłowo oznakowane komórki zgodnie z polityką instytucjonalną. Przenieś wstrzyknięte zarodki na szalkę Petriego zawierającą 0,5x roztwór Steinberga.

Hoduj je w temperaturze od 14 do 25 stopni Celsjusza, aż osiągną pożądany etap rozwoju. Przenieś od trzech do pięciu zarodków do naczynia agarowego zawierającego 0,2x roztwór Steinberga do mikrosekcji. Użyj kleszczy, aby wypreparować oznaczony klon z zarodka.

Zbierz wypreparowaną tkankę za pomocą pipety o pojemności od 0,5 do 10 mikrolitrów i umieść je w pilniku mikrowirówki. Za pomocą pipety odessać pożywkę otaczającą pobraną tkankę, aby ograniczyć zawartość soli w próbce, aby uniknąć zakłóceń w analizie HRMS. Natychmiast zamrozić wyizolowane komórki, umieszczając fiolkę z próbką na suchym lodzie lub ciekłym azocie.

Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy spektrometrii mas. W przypadku przetwarzania próbki pojedynczej komórki metodą CE należy zdenaturować białka, podgrzewając próbkę do 60 stopni Celsjusza przez około 15 minut. Następnie równoważyć próbkę do temperatury pokojowej przez pięć minut i dodawać trypsynę do próbek w celu roztrawienia.

W celu analizy za pomocą NanoLC należy poddać lizie do pięciu wypreparowanych tkanek w 50 mikrolitrach buforu do lizy. Ułatw ten proces, pipetując próbkę w górę i w dół. Aby przetworzyć wypreparowane tkanki, inkubuj lizat w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie osadzać resztki komórek i płytki krwi w żółtku w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez odcentrowanie w temperaturze 4 500 RCF. Przenieść supernatant do czystej fiolki z mikrowirówką i dodać 10% SDS, aby uzyskać końcowe stężenie 1% SDS w lizacie. W przypadku tkanek dodać 0,5 molowego ditiotreitolu do lizatu, aby uzyskać końcowe stężenie około 25 milimolów.

Następnie inkubuj lizat przez 30 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby chemicznie zredukować wiązania dwusiarczkowe w białkach. Dodać 0,5 molowego jodoacetamidu, aby uzyskać końcowe stężenie około 75 milimolów w lizacie i inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Dodaj 0,5 molowego ditiotreitolu tyle samo, co objętość początkowa, aby schłodzić reagenty pozostałe po reakcji alkilacji.

Wytrącić białka w acetonie przez noc, jak opisano w protokole tekstowym, i rozpuścić w 0,5 molowym wodorowęglanie amonu. Dodaj trypsynę do trawienia próbki i inkubuj fiolki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby oddzielić peptydy za pomocą CE, należy rozpuścić strawione białko w jednym do dwóch mikrolitrów rozpuszczalnika próbki.

Wirować zmieszaną próbkę i centrować w temperaturze 10 000 RCF przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzać szczątki komórek. Zainicjuj instrument CE-ESI, przepłukując kapilarnę CE za pomocą BGE. Umieścić jeden mikrolitr próbki w fiolce z próbką i wstrzyknąć od jednego do 10 nanolitrów próbki do kapilary separacji CE przez wstrzyknięcie hydrodynamiczne.

Przenieś końcówkę wlotową kapilary separacji CE do BGE. Rozpocznij separację elektroforetyczną od stopniowego zwiększania napięcia separacji CE od uziemienia. Potencjały od 20 do 28 kilowoltów przy prądzie poniżej 10 mikroamperów zapewniają stabilną i powtarzalną wydajność instrumentalną do analizy.

Aby oddzielić za pomocą Nano LC, ponownie zawiesić próbkę peptydu w ruchomej fazie A. Stężenie próbki i objętość wstrzyknięcia zależą od dostępnego systemu LC i kolumny. Przenieść próbkę do fiolki LC. Załadować około 200 nanogramów do dwóch mikrogramów próbki peptydu do kolumny analitycznej C18 i rozdzielić peptydy z szybkością przepływu 300 nanolitrów na minutę za pomocą elucji gradientowej, jak opisano w manuskrypcie tekstowym.

Za pomocą kamery sprawdź przepływ cieczy przez emiter elektronatrysku i wizualnie sprawdź konfigurację pod kątem ewentualnych wycieków. Zdobądź zdarzenia spektrometrii mas i sekwencjonuj peptydy zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Wykryto różnice w translacji genów między komórkami D11 wypreparowanymi z różnych zarodków za pomocą CE-ESI-HRMS.

Wypreparowane klony komórek znakowane linią były analizowane za pomocą LC-HRMS. Analiza szlaku białek wykazała zwiększoną translację białek i metabolizm energetyczny w organizatorze Spemanna z neuroektodermą. Neuroectoderm prodeum został wzbogacony w białka związane z transportem jądrowym ładunku białkowego w komórce, co prawdopodobnie wskazuje na dalsze zdarzenia po sygnalizacji.

Analiza wzbogacenia funkcji molekularnych wykazała regulację w górę w inicjacji translacji, wiązaniu RNA i wiązaniu kompleksu proteasomu, co sugeruje rolę dynamicznego obrotu białek w rozwoju organizatora Spemanna. Do tego protokołu należy wybrać tylko stereotypowe zarodki, aby poprawić odtwarzalność i interpretację wyników. Wypreparowaną tkankę należy przenieść do fiolki i natychmiast zamrozić, zawierając jak najmniejszą ilość buforu pożywki, aby zminimalizować zanieczyszczenie solami buforowymi.

Takie podejście umożliwiło nam zbadanie dynamiki białek w zidentyfikowanych komórkach i liniach komórkowych w żywych zarodkach. Nowe informacje, które uzyskaliśmy na temat przestrzennej czasowej produkcji ważnych białek w rozwijających się tkankach, umożliwiły nam zaprojektowanie ukierunkowanych eksperymentów w celu oceny ich funkcji biologicznej.