Name: Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj proteomikę opartą na spektrometrii mas sterowaną linią komórkową w rozwijającym się zarodku Xenopus laevis. Ta metoda pozwala na analizę białek z rozdzielczością przestrzenną i czasową, ułatwiając badanie mechanizmów rozwoju tkanek oraz determinacji losu komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Jie Li (University of Maryland, College Park) za cenne dyskusje na temat dysocjacji embrionalnej i FACS. Dziękujemy Vi M. Quach i Camille Lombard-Banek za pomoc w przygotowaniu próbek i zebraniu danych w poprzednich badaniach, które ilustrują zastosowania proteomiczne, które zostały podkreślone w tym protokole. Część tych prac była wspierana przez National Science Foundation w ramach nagrody o numerze IOS-1832968 CAREER (dla P.N.), National Institutes of Health pod numerem nagrody R35GM124755 (dla P.N.), University of Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (dla P.N.) oraz nagrody badawcze COSMOS Club Foundation (dla A.B.B. i L.R.P.).

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Protokół ten umożliwia scharakteryzowanie ekspresji białek w zidentyfikowanych liniach komórkowych w zarodkach z gatunku Xenopus . Metodologia ta, wywodząca się z HRMS, łączy w sobie wyjątkową specyficzność w identyfikacji molekularnej, zdolność do wykrywania wielu białek bez sond molekularnych (zwykle od setek do tysięcy różnych białek) oraz zdolność do kwantyfikacji. Zdolność adaptacji do klasycznych narzędzi i procesów pracy w (neuro)biologii komórkowej i rozwojowej rozszerza proteomikę HRMS o ekscytujące zas...

Nasze zrozumienie różnicowania komórkowego oraz genezy tkanek i organów jest wynikiem dziesięcioleci drobiazgowych, celowanych badań przesiewowych genów i ich produktów. Rozszerzenie wiedzy o wszystkie biomolekuły i ich ilości podczas kluczowych zdarzeń komórkowych pomogłoby w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych kontrolujących przestrzenne i czasowe wzorce budowy ciała kręgowców. Technologie umożliwiające amplifikację molekularną i sekwencjonowanie pozwalają obecnie rutynowo raportować o dużych liczbach genów i transkryptów, wspierając badania oparte na hipotezach w podstawowych badaniach biologicznych i translacyjnych. Aby zrozumieć rozwijające się układy, złożona zależność między transkrypcją a translacją wskazuje na konieczność bezpośredniej analizy wielu białek i ich modyfikacji potranslacyjnych. Proteomika globalna z wykorzystaniem biologicznych systemów in vitro, takich jak indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, zaczęła wyznaczać mechanizmy indukcji tkanek1,2. W złożonych organizmach, takich jak zarodek kręgowca, rozwój opiera się na gradientach morfogenów w kontekście przestrzeni i czasu3. Z tego wynika, że zdobycie wiedzy o zmianach proteomicznych podczas różnicowania się komórek w wyspecjalizowane tkanki, takie jak tkanki nerwowe, stanowi klucz do odblokowania programów molekularnych kontrolujących prawidłowy i wadliwy rozwój oraz do opracowania terapii nowej generacji.
Kręgowca reprezentująca żaba południowoafrykańska (Xenopus laevis) jest uznanym modelem w biologii komórki, biologii rozwoju, neurobiologii oraz biologii regeneracyjnej. Nagroda Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny z 2012 roku4,5 przyznana sir Johnowi Gurdonowi za odkrycie pluripotencji jądra somatycznego podkreśliła znaczenie tego modelu dla odkryć w badaniach podstawowych i translacyjnych. Zarodki Xenopus rozwijają się poza organizmem matki, co ułatwia bezpośrednią manipulację komórkami, klonami komórkowymi oraz ekspresją genów na różnych etapach rozwoju. Asymetryczna pigmentacja i stereotypowe podziały komórkowe umożliwiły stworzenie powtarzalnych map losów komórek już od etapu zarodka 16-6 oraz 32-komórkowego7,8. W przypadku proteomiki opartej na wysokorozdzielczej spektrometrii mas (HRMS), dodatkowe zalety tego modelu obejmują stosunkowo duży rozmiar (~1 mm średnicy), co zapewnia obfitą zawartość białek do analizy (~130 µg w zarodkach na wczesnym etapie podziałów, ~10 µg zawartości białek w pojedynczych komórkach zarodka 16-komórkowego)9,10.
Obecnie HRMS jest wiodącą technologią z wyboru w wykrywaniu białek. Technologia ta umożliwia bezpośrednią, czułą i specyficzną detekcję oraz kwantyfikację wielu, zazwyczaj od setek do tysięcy różnych białek11. Proteomika bottom-up z wykorzystaniem HRMS obejmuje serię powiązanych ze sobą etapów. Po ekstrakcji z próbki komórkowej lub tkankowej białka są trawione enzymem proteolitycznym, takim jak trypsyna (proteomika bottom-up). Powstałe peptydy są rozdzielane na podstawie ich różnych właściwości fizykochemicznych, w tym hydrofobowości (cieczowa chromatografia odwróconej fazy, LC), ładunku netto (chromatografia wymiany jonowej), wielkości (chromatografia żelowa) lub ruchliwości elektroforetycznej (elektroforeza kapilarna, CE). Następnie peptydy są ładowane (jonizowane), zazwyczaj z użyciem jonizacji elektrycznej (ESI), a jony peptydowe są wykrywane i sekwencjonowane poprzez fragmentację w fazie gazowej za pomocą tandemowego HRMS. Uzyskane dane peptydowe są mapowane na proteom badanego organizmu. Dzięki temu, że intensywność sygnału jonów peptydów specyficznych dla białek (proteotypowych) koreluje z ich stężeniem, kwantyfikacja białek może być przeprowadzana metodami bezetykietowymi lub z użyciem etykiet (kwantyfikacja multipleksowa). Proteomika HRMS dostarcza bogatego zasobu informacji o stanie molekularnym badanego układu, co pozwala na formułowanie hipotez i przeprowadzanie dalszych badań funkcjonalnych.
<img alt="Schemat mikroaspiracji i izolacji komórek; od embrionu do gastruli, sortowanie za pomocą FACS, układ eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Proteomika skalowalna czasowo i przestrzennie umożliwiająca analizę proteomiczną HRMS sterowaną linią komórkową w rozwijającym się embrionie (żaby). (A) Wizualizacja preparatu (1) za pomocą stereomikroskopu (2) w celu iniekcji zidentyfikowanej komórki (wstawka), z wykorzystaniem wykonanej mikropipety (3) sterowanej przez stół przesuwny (4). (B) Pobieranie próbek podkomórkowych z zidentyfikowanej lewej komórki D11 w embrionie 16-komórkowym. (C) Wypreparowanie całej komórki D11 z embrionu 16-komórkowego. (D) Fluorescencyjne (zielone) śledzenie lewego i prawego potomstwa D111 od embrionu 32-komórkowego w celu przeprowadzenia sekcji ektodermy neuronalnej (NE) w gastruli (stadium 10) i izolacji tkanki pochodnej z kijanki za pomocą FACS. Paski skali: 200 µm dla embrionów, 1,25 mm dla fiolki. Rysunki zostały opracowane za zgodą autorów referencji15,19,21,59. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Przedstawiony tutaj protokół umożliwia ilościowe oznaczenie dużej liczby białek w zidentyfikowanych komórkach/tkankach rozwijających się zarodków X. laevis z wykorzystaniem HRMS. Podejście to opiera się na dokładnej identyfikacji komórek, powtarzalnych mapach losów komórkowych oraz uznanych metodologiach śledzenia linii komórkowych w tym modelu biologicznym6,7,8. Jak pokazano na Rysunku 1, badamy proteomy pojedynczych komórek, stosując mikrodysekcję całych komórek lub mikropróbkowanie kapilarne w celu aspiracji zawartości komórkowej. Monitorowanie linii komórkowej pozwala nam badać ewolucję czasowo-przestrzenną proteomu w miarę formowania się tkanek z komórek podczas gastrulacji. Potomstwo komórek jest znakowane fluorescencyjnie poprzez wstrzyknięcie fluoroforu sprzężonego z obojętnym dekstranem lub mRNA dla białka fluorescencyjnego (np. zielonego białka fluorescencyjnego, GFP). Znakowane potomstwo jest izolowane w wybranych punktach czasowych rozwoju. Podczas gastrulacji klony komórek, które tworzą ciasne skupiska, mogą być izolowane za pomocą dysekcji. Po gastrulacji klony komórek mogą być rozproszone w zarodku ze względu na ruchy migracyjne i mogą być izolowane z dysocjowanych tkanek za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Białka w tych komórkach i tkankach są mierzone za pomocą proteomiki bottom-up z zastosowaniem HPLC lub CE do rozdziału oraz tandemowej HRMS z jonizacją ESI do identyfikacji. Proteomika HRMS sterowana linią komórkową jest skalowalna dla różnych rozmiarów komórek i linii komórkowych w obrębie zarodka oraz jest specyficzna, czuła i ilościowa. Poprzez wybrane przykłady przedstawione w niniejszym opracowaniu wykazujemy również, że protokół ten jest skalowalny i szeroko adaptowalny do różnych typów komórek i linii komórkowych.
<img alt="Schemat przepływu pracy podczas sekcji komórek i tkanek obejmujący trawienie peptydami, chromatografię oraz analizę ESI-HRMS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Bioanalityczny schemat przepływu pracy. Mikrosekcja i aspiracja kapilarna lub pobieranie zawartości białek komórkowych i klonalnych wspomagane przez FACS. Usuwanie dominujących białek żółtka oraz rozdział za pomocą elektroforezy kapilarnej (CE) lub nanoprzepływowej chromatografii cieczowej (LC) zwiększyły czułość identyfikacji (ID) przy użyciu wysokorozdzielczej spektrometrii mas (HRMS) z jonizacją z rozpylania elektrycznego (ESI). Ilościowe oznaczenia ujawniły dysregulację, dostarczając nowych informacji do badań opartych na hipotezach w połączeniu z informacjami dostępnymi w ontologii genów (GO). Rysunki zostały dostosowane za zgodą z źródła15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl (klasa LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0492</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A643-500</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna analityczna</td><td>Thermo Scientific</td><td>164941</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowaga analityczna</td><td>Mettler-Toledo</td><td>XSE105DU</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna platforma do frakcjonowania peptydów</td><td>Agilent</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary borokrzemianowe</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary borokrzemianowe (do wytwarzania emiterów)</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny wirujące C18 (do odsalania)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Kamera ro monitor elektrospray</td><td>Edmund Optics Inc.</td><td>EO-2018C</td><td></td></tr><tr><td>Combretastatin A4</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7744</td><td></td></tr><tr><td>Komercyjny system CESI</td><td>AB SCIEX</td><td>CESI</td><td></td></tr><tr><td>(Cykloheksyloamino)-1-propanosulfonowy kwas (CAPS)</td><td>VWR</td><td>97061-492</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalazyna D</td><td>Milipora Sigma</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10 000 MW, anionowy, naprawialny</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D22910</td><td></td></tr><tr><td>Diothiothreitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0861</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ62786AP</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescencyjne źródło światła</td><td>Lumencore</td><td>AURA III</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBing mikrowirówki&nbsp; probówki: białko</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-698-793</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (klasa LC-MS)</td><td>Zamrażarka Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>(-20 &deg; C)</td><td>Fisher Scientific</td><td>97-926-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka (-80 &deg; C)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TSX40086A</td><td></td></tr><tr><td>Kapilarna z topionej krzemionki</td><td>Molex</td><td>1088150596</td><td></td></tr><tr><td>Heat Block</td><td>Benchmark</td><td>BSH300</td><td></td></tr><tr><td>Wysokociśnieniowy system chromatografii cieczowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td><td></td>Zasilacz</tr><tr><td>wysokiego napięcia</td><td>Spellman</td><td>CZE1000R</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Spektrometr</td><td></td></tr><tr><td>masowy Nakrętki HPLC</td><td>Fiolki Thermo Scientific</td><td>C4013-40A</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4013-11</td><td></td></tr><tr><td>Illuminator np. Gęsia szyja</td><td>Nikon</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity Analiza ścieżki</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC122275000</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (klasa LC-MS)</td><td>Metanol Fisher</td><td>Scientific A456</td><td></td></tr><tr><td>(klasa LC-MS)</td><td>Ściągacz</td> mikrokapilarny Fisher <td>Scientific A456-4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Suttor Instruments</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td>Warner Instrument, Handem, CT</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments Co.</td>Oprogramowanie do analizy danych <td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MS, komercyjne</td> oprogramowanie do analizy danych <td>ProteomeDiscoverer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS, opensource</td><td>MaxQuant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>non-idet 40 substytut</td><td>Millipore Sigma</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 60 mm i 80 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 10 &micro; Łóżko L Końcówki zamków błyskawicznych (do odsalania)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>87782</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek z kwasem bicynchoninowym</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Ilościowy test peptydowy kolorymetryczny</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Trypsin (klasa MS)Fiolki</td><td></td><td></td> Fisher Scientific PI90058 <td></td></tr><tr><td>Protein LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>0030108434 , 0030108442</td><td></td></tr><tr><td>wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z chłodzeniem</td><td>Thermo Scientific</td><td>PR505755R/3721</td><td></td></tr><tr><td>Milipore</td><td>Sigma</td><td>220078</td><td></td></tr><tr><td>pirofosforan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221368-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka BGE ze stali nierdzewnej</td><td>Wykonane</td><td></td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>fiolki na próbki ze stali nierdzewnej</td><td>Niestandardowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop stereoskopowy (obiektyw 10x)</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1270, SZX18</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>VWR</td><td>97063-790</td><td></td></tr><tr><td>Pompy strzykawkowe (2)</td><td>Aparat Harvard</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki (gazoszczelne): 500&ndash; 1000 &mikro; L</td><td>Hamilton</td><td>1750TTL</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe (plastikowe, jednorazowe)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna pułapkowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>164750</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (roztwór 1 M)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ22638AP</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator próżni zdolny do pracy z prędkością 4&ndash; 10 stopni Celsjusza; C</td><td>Labconco</td><td>7310022</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-mixer</td><td>Benchmark</td><td>BS-VM-1000</td><td></td></tr><tr><td>Woda (klasa LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Woda (klasa LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>XYZ Etap tłumaczenia</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>XYZ</td><td>Zbudowany</td><td></td><td></td> na zamówienie</tr></tbody></table>

proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Charakterystyka zdarzeń molekularnych, gdy komórki dają początek tkankom i organom, zwiększa potencjał do lepszego zrozumienia normalnego rozwoju i zaprojektowania skutecznych środków na choroby. Technologie umożliwiające dokładną identyfikację i kwantyfikację różnych typów i dużej liczby białek dostarczyłyby wciąż brakujących informacji na temat mechanizmów molekularnych zarządzających rozwojem tkanek i organizmów w czasie i przestrzeni. W tym miejscu przedstawiamy protokół oparty na spektrometrii mas, który umożliwia pomiar tysięcy białek w zidentyfikowanych liniach komórkowych w zarodkach Xenopus laevis (żaby). Podejście to opiera się na odtwarzalnych mapach losu komórek i ustalonych metodach identyfikacji, znakowania fluorescencyjnego, śledzenia i pobierania próbek komórek i ich potomstwa (klonów) na podstawie tego modelu rozwoju kręgowców. Po zebraniu zawartości komórkowej za pomocą mikropróbkowania lub wyizolowaniu komórek przez preparację lub sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, białka są ekstrahowane i przetwarzane do oddolnej analizy proteomicznej. Chromatografia cieczowa i elektroforeza kapilarna są stosowane w celu zapewnienia skalowalnej separacji w celu wykrywania i oznaczania ilościowego białek za pomocą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS). Podano reprezentatywne przykłady do charakterystyki proteomicznej komórek przeznaczonych w tkance nerwowej. Proteomika HRMS sterowana linią komórkową można dostosować do różnych tkanek i organizmów. Jest wystarczająco czuły, specyficzny i ilościowy, aby zajrzeć w czasoprzestrzenną dynamikę proteomu podczas rozwoju kręgowców.

Niniejszy protokół umożliwił badanie białek w pojedynczych komórkach i ich liniach komórkowych podczas tworzenia tkanek w *X. laevis* zarodki Rysunek 1 ilustruje jedną z takich aplikacji tego podejścia do badania białek w komórkach przeznaczonych na tkankę nerwową oraz w nowo indukowanym ektodermie nerwowym w embrionie. Jak pokazano w Rycina 1Aprzepływ pracy bioanalitycznej integrował tradycyjne narzędzia biologii komórki i biologii rozwoju w celu ident...

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

To podejście oparte na linii genetycznej umożliwia proteomiczną analizę ważnych zdarzeń rozwojowych z rozdzielczością przestrzenną i czasową w obrębie zarodka kręgowców, przekazując informacje, które nie byłyby dostępne w przypadku pomiarów całego zarodka. Podejście to można łatwo rozszerzyć o badanie białek, metabolitów i transkryptów z różnych komórek embrionalnych, które różnicują się podczas rozwoju. Metoda ta może pogłębić naszą wiedzę na temat mechanizmów molekularnych, które kontrolują prawidłowy i chory rozwój, w tym mechanizmów indukcji tkanek i zaangażowania w los komórki we wczesnym okresie rozwoju.Użyj pętli do włosów, aby wprowadzić każdy zarodek do studzienki i delikatnie ustawić je tak, aby docelowa komórka zainteresowania znajdowała się pod kątem prostym do mikroigły. Postępuj zgodnie z mapami losu tkanek xenopus laevis, aby zidentyfikować komórkę prekursorową interesującej Cię linii. Użyj dwóch zaostrzonych kleszczy, aby delikatnie usunąć błonę witeliny otaczającą zarodek.Odizoluj pojedyncze komórki od zarodka poprzez ręczne wypreparowanie za pomocą kleszczy. Rozpocząć od założenia igły do wstrzykiwań zawierającej roztwór do śledzenia linii. Zamontuj igłę do mikroiniekcji w uchwycie na mikropipety sterowaną przez wieloosiowy mikromanipulator.Podłącz uchwyt mikropipety do mikrowtryskiwacza i napełnij igłę znacznikiem linii, stosując podciśnienie. Skalibruj igłę i dostosuj rozmiar końcówki igły oraz czas wstrzyknięcia, aby dostarczyć około jednego nanolitra roztworu znacznika linii, mierzonego w oleju mineralnym. Upewnij się, że rozmiar wstrzykiwanej kropli jest dokładny i w razie potrzeby dostosuj ustawienia wtryskiwacza.Zalej gliniane naczynie do mikroiniekcji 3% roztworem fCAL i przenieś około 10 zarodków do glinianego naczynia za pomocą pipety transferowej. Wstrzyknij do interesujących komórek około jednego nanolitra fluorescencyjnego dekstranu lub 200 pikogramów mRNA GFP. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego potwierdź powodzenie znakowania komórek.Upewnij się, że wstrzyknięta została tylko zamierzona komórka. Odrzucaj zarodki zawierające uszkodzone lub nieprawidłowo oznakowane komórki zgodnie z polityką instytucjonalną. Przenieś wstrzyknięte zarodki na szalkę Petriego zawierającą 0,5x roztwór Steinberga.Hoduj je w temperaturze od 14 do 25 stopni Celsjusza, aż osiągną pożądany etap rozwoju. Przenieś od trzech do pięciu zarodków do naczynia agarowego zawierającego 0,2x roztwór Steinberga do mikrosekcji. Użyj kleszczy, aby wypreparować oznaczony klon z zarodka.Zbierz wypreparowaną tkankę za pomocą pipety o pojemności od 0,5 do 10 mikrolitrów i umieść je w pilniku mikrowirówki. Za pomocą pipety odessać pożywkę otaczającą pobraną tkankę, aby ograniczyć zawartość soli w próbce, aby uniknąć zakłóceń w analizie HRMS. Natychmiast zamrozić wyizolowane komórki, umieszczając fiolkę z próbką na suchym lodzie lub ciekłym azocie.Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy spektrometrii mas. W przypadku przetwarzania próbki pojedynczej komórki metodą CE należy zdenaturować białka, podgrzewając próbkę do 60 stopni Celsjusza przez około 15 minut. Następnie równoważyć próbkę do temperatury pokojowej przez pięć minut i dodawać trypsynę do próbek w celu roztrawienia.W celu analizy za pomocą NanoLC należy poddać lizie do pięciu wypreparowanych tkanek w 50 mikrolitrach buforu do lizy. Ułatw ten proces, pipetując próbkę w górę i w dół. Aby przetworzyć wypreparowane tkanki, inkubuj lizat w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Następnie osadzać resztki komórek i płytki krwi w żółtku w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez odcentrowanie w temperaturze 4 500 RCF. Przenieść supernatant do czystej fiolki z mikrowirówką i dodać 10% SDS, aby uzyskać końcowe stężenie 1% SDS w lizacie. W przypadku tkanek dodać 0,5 molowego ditiotreitolu do lizatu, aby uzyskać końcowe stężenie około 25 milimolów.Następnie inkubuj lizat przez 30 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby chemicznie zredukować wiązania dwusiarczkowe w białkach. Dodać 0,5 molowego jodoacetamidu, aby uzyskać końcowe stężenie około 75 milimolów w lizacie i inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Dodaj 0,5 molowego ditiotreitolu tyle samo, co objętość początkowa, aby schłodzić reagenty pozostałe po reakcji alkilacji.Wytrącić białka w acetonie przez noc, jak opisano w protokole tekstowym, i rozpuścić w 0,5 molowym wodorowęglanie amonu. Dodaj trypsynę do trawienia próbki i inkubuj fiolki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby oddzielić peptydy za pomocą CE, należy rozpuścić strawione białko w jednym do dwóch mikrolitrów rozpuszczalnika próbki.Wirować zmieszaną próbkę i centrować w temperaturze 10 000 RCF przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzać szczątki komórek. Zainicjuj instrument CE-ESI, przepłukując kapilarnę CE za pomocą BGE. Umieścić jeden mikrolitr próbki w fiolce z próbką i wstrzyknąć od jednego do 10 nanolitrów próbki do kapilary separacji CE przez wstrzyknięcie hydrodynamiczne.Przenieś końcówkę wlotową kapilary separacji CE do BGE. Rozpocznij separację elektroforetyczną od stopniowego zwiększania napięcia separacji CE od uziemienia. Potencjały od 20 do 28 kilowoltów przy prądzie poniżej 10 mikroamperów zapewniają stabilną i powtarzalną wydajność instrumentalną do analizy.Aby oddzielić za pomocą Nano LC, ponownie zawiesić próbkę peptydu w ruchomej fazie A. Stężenie próbki i objętość wstrzyknięcia zależą od dostępnego systemu LC i kolumny. Przenieść próbkę do fiolki LC. Załadować około 200 nanogramów do dwóch mikrogramów próbki peptydu do kolumny analitycznej C18 i rozdzielić peptydy z szybkością przepływu 300 nanolitrów na minutę za pomocą elucji gradientowej, jak opisano w manuskrypcie tekstowym.Za pomocą kamery sprawdź przepływ cieczy przez emiter elektronatrysku i wizualnie sprawdź konfigurację pod kątem ewentualnych wycieków. Zdobądź zdarzenia spektrometrii mas i sekwencjonuj peptydy zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Wykryto różnice w translacji genów między komórkami D11 wypreparowanymi z różnych zarodków za pomocą CE-ESI-HRMS.Wypreparowane klony komórek znakowane linią były analizowane za pomocą LC-HRMS. Analiza szlaku białek wykazała zwiększoną translację białek i metabolizm energetyczny w organizatorze Spemanna z neuroektodermą. Neuroectoderm prodeum został wzbogacony w białka związane z transportem jądrowym ładunku białkowego w komórce, co prawdopodobnie wskazuje na dalsze zdarzenia po sygnalizacji.Analiza wzbogacenia funkcji molekularnych wykazała regulację w górę w inicjacji translacji, wiązaniu RNA i wiązaniu kompleksu proteasomu, co sugeruje rolę dynamicznego obrotu białek w rozwoju organizatora Spemanna. Do tego protokołu należy wybrać tylko stereotypowe zarodki, aby poprawić odtwarzalność i interpretację wyników. Wypreparowaną tkankę należy przenieść do fiolki i natychmiast zamrozić, zawierając jak najmniejszą ilość buforu pożywki, aby zminimalizować zanieczyszczenie solami buforowymi.Takie podejście umożliwiło nam zbadanie dynamiki białek w zidentyfikowanych komórkach i liniach komórkowych w żywych zarodkach. Nowe informacje, które uzyskaliśmy na temat przestrzennej czasowej produkcji ważnych białek w rozwijających się tkankach, umożliwiły nam zaprojektowanie ukierunkowanych eksperymentów w celu oceny ich funkcji biologicznej.

cell-lineage-guided-mass-spectrometry-proteomics-developing-frog

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Los pojedynczej komórki embrionalnej może być determinowany przez cząsteczki dziedziczne i/lub sygnały pochodzące od sąsiednich komórek. Wykorzystując mapy losów embrionu Xenopus w stadium podziałów, można zidentyfikować pojedyncze blastomery w celu ich izolowanej hodowli, aby ocenić wpływ cząsteczek dziedzicznych w stosunku do oddziaływań międzykomórkowych.

Eksplanty blastomerów do badania determinacji losów komórek podczas rozwoju embrionalnego

Pytanie o to, jak regulatory chromatyny i stany chromatyny wpływają na genom in vivo, jest kluczowe dla naszego zrozumienia, jak wcześnie podejmowane są decyzje dotyczące losu komórki w rozwijającym się zarodku. ChIP-Seq – najpopularniejsze podejście do badania cech chromatyny na poziomie globalnym – zostało przedstawione tutaj dla zarodków Xenopus.

Migawka całego genomu regulatorów i stanów chromatyny w zarodkach Xenopus za pomocą ChIP-Seq

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Opisujemy kroki, które umożliwiają szybkie pobieranie próbek in situ małej części pojedynczej komórki z dużą precyzją i minimalną inwazją, przy użyciu mikropróbkowania opartego na kapilarach, aby ułatwić chemiczną charakterystykę migawki aktywności metabolicznej w żywych zarodkach przy użyciu specjalnie zbudowanej platformy do elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas z pojedynczą komórką.

Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis)

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Danio pręgowany celujący w reaktywne elektrofile i utleniacze (Z-REX) to oparta na biologii chemicznej metoda badania reaktywnej sygnalizacji małocząsteczkowej. Technikę tę można zastosować do żywych ryb na różnych etapach rozwoju. Tutaj łączymy standardowe testy u danio pręgowanego z Z-REX do analizy szlaku sygnałowego.

Monitorowanie docelowych reakcji sygnalizacyjnych u larw danio pręgowanego - Z-REX demaskuje precyzyjne mechanizmy działania leków elektrofilowych i metabolitów

Prezentowany tutaj jest skuteczny protokół szybkiej perfuzji krwi do przygotowania próbek tkanek od afrykańskich żab szponiastych do badań transkryptomicznych i proteomicznych.

Skuteczna szybka perfuzja krwi w Xenopus

Poznaj proteomikę opartą na spektrometrii mas sterowaną linią komórkową w rozwijającym się zarodku Xenopus laevis. Ta metoda pozwala na analizę białek z rozdzielczością przestrzenną i czasową, ułatwiając badanie mechanizmów rozwoju tkanek oraz determinacji losu komórek.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Przeglądaj więcej filmów