Name: Absorpcja dawki ekspozycji na związki na bazie platyny i rutenu u danio pręgowanego za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie o szerszych zastosowaniach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę ilościowego oznaczania metali w tkankach danio pręgowanego za pomocą spektrometrii mas ICP-MS. Technika ta umożliwia precyzyjną walidację dawkowania w badaniach toksykologicznych i farmakologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Dodatkowo Brittany Karas jest wspierana przez T32NS115700 grantów szkoleniowych od NINDS, NIH. Autorzy uznają Andreię Valente i Portugalską Fundację na rzecz Nauki i Technologii (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) na dostawę PMC79.

Danio rerio szczepu AB (Danio rerio) były używane do wszystkich eksperymentów (zobacz Tabelę Materiałów), a protokół hodowli (#08-025) został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Obiektów Uniwersytetu Rutgers.
1. Hodowla danio pręgowanego
<ol>
	<li>Hoduj i utrzymuj danio pręgowanego w recyrkulacyjnym systemie siedlisk wodnych w cyklu 14 godzin światła: 10 godzin ciemności.
	<ol>
		<li>Oczyść miejską wodę z kranu za pomocą filtracji piaskowej i węglowej, aby uzyskać wodę z systemu rybnego. Utrzymuj wodę w systemie wodnym na poziomie 28 °C, <0,05 ppm azotynów, <0,2 ppm amoniaku i pH między 7,2 a 7,7.</li>
		<li>Nakarm danio pręgowanego dietą składającą się z wyklutych cyst artemii, krewetek solankowych i pokarmu w postaci płatków dietetycznych dla ryb.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Protokół dawka-odpowiedź danio pręgowanego (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór wodny z jaj danio pręgowanego, pożywkę E3 lub wodę jajeczną z soli morskiej o stężeniu 60 μg/ml rozpuszczoną w wodzie dejonizowanej18. Unikaj stosowania błękitu metylenowego. 
	UWAGA: Dzięki ICPMS zidentyfikowano interferencję izobaryczną wody z jaj danio pręgowanego dla tlenków strontu, które nakładały się na izotop rutenu. Staranne wypłukanie larw przed dalszą analizą rozwiązało ten problem. Pożywka E3 może być dla niektórych łatwiejszym wyborem ze względu na zastrzeżony skład komercyjnych soli morskich.</li>
	<li>Rozpuść metal lub związki na bazie metalu w E3 lub wodzie jajecznej. Wirować, aby rozbić materiał kruszywo i homogenizować roztwór. 
	UWAGA: W doświadczeniu opisanym poniżej PMC79 i cisplatyna rozpuszczono w maksymalnych stężeniach 12,4 mg/L i 60 mg/L przy maksymalnym stężeniu 0,5% dimetylosulfotlenku (DMSO), aby było odporne na wytrącanie.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć metale ciężkie lub związki na bazie metali, takie jak PMC79 i cisplatyna, E3 lub wodą jajeczną, przygotowując co najmniej 5 dawek skoncentrowanych.
		<ol>
			<li>Rozpocząć od niskich stężeń roztworów podstawowych w czystym podłożu (tj. DMSO), a następnie rozcieńczyć E3 lub wodą jajeczną. Należy dokładnie rozważyć końcowe stężenia w nośniku. 
			UWAGA: Niektóre związki na bazie metali, takie jak cisplatyna, szybko ulegają degradacji, a ich roztwory muszą być codziennie świeże. UWAGA: Z metalami ciężkimi i chemioterapeutykami należy obchodzić się ostrożnie. Zapoznaj się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) dla badanego metalu. Cisplatyna może powodować podrażnienie oczu i skóry, być śmiertelna w przypadku połknięcia i może powodować toksyczność w nerkach, krwi, narządach krwiotwórczych i tkankach płodu. Unikaj wdychania oparów i kontaktu z oczami, skórą i ubraniem. Nosić nieprzepuszczalne rękawice i odzież oraz okulary lub gogle ochronne19.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw zbiorniki hodowlane po południu przed eksperymentem w idealnym stosunku 2 samic do 1 samca z przegrodą między płciami20.
	<ol>
		<li>Pociągnij przegrodę, gdy zapalą się światła w cyklu porannym.</li>
		<li>Pozwól danio pręgowanemu się rozmnażać. 
		UWAGA: Czas hodowli zależy od wymaganego początkowego etapu ekspozycji. Na 3 godziny po zapłodnieniu pozostawić do hodowli przez około 2 godziny. Jaja osiągną 3 hpf po oczyszczeniu i segregacji jaj.</li>
		<li>Przenieś ryby hodowlane do czystego zbiornika.</li>
		<li>Zbierz jajka, przelewając wodę ze zbiornika przez sitko.</li>
		<li>Odwróć sitko na szalce Petriego i użyj butelki ze spryskiwaczem wypełnionej E3 lub wodą jajeczną, aby wypłukać jajka do naczynia.</li>
		<li>Oczyść naczynie z jedzenia i odpadów przed eksperymentalnym użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Losowo umieścić około dwudziestu 3 zarodków hpf w każdej dawce do indywidualnych szklanych fiolek za pomocą pipety transferowej i niewielkiej ilości wody.</li>
	<li>Po tym, jak wszystkie zarodki znajdą się w fiolkach, usuń całą wodę z jaj i zastąp ją wystarczającą ilością roztworu dozującego, tak aby około 1 cal roztworu znajdował się powyżej wysokości jaja. 
	UWAGA: Konieczność dechorionacji powinna być dokładnie przemyślana. Zobacz sekcję dyskusji, aby uzyskać więcej informacji.</li>
	<li>Codziennie obserwuj zarodki pod kątem zmian chorobowych lub śmiertelności. Ze względu na szybki rozwój embrionalnego danio pręgowanego, uzyskuj codzienne obrazy za pomocą dowolnego mikroskopu jasnego pola/kamery, aby zidentyfikować drobne zmiany między dniami.</li>
	<li>Po zakończeniu reakcji na dawkę (4-5 dni po zapłodnieniu [dpf], zgodnie z wytycznymi Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju [OECD]21), przed eutanazją należy połączyć 3-5 larw w celu pobrania próbki złożonej. Eutanazja przez szybkie chłodzenie przez szybkie zamrażanie w ciekłym azocie. 
	UWAGA: Eutanazja poprzez przedawkowanie MS-222 lub metanosulfonianu trikainy może potencjalnie zakłócać późniejszą analizę ICPMS. W przypadku tego protokołu zachęca się do stosowania metod eutanazji o szybkim schładzeniu, aby zmniejszyć możliwość ingerencji.</li>
	<li>Przeprowadź 3 płukania tkanki wodą o wysokiej czystości (taką jak odwrócona osmoza), aby usunąć nadmiar związku z zewnętrznej strony tkanki.</li>
	<li>Przenieś próbki do polipropylenowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml, które można używać w kwasach i kuchenkach mikrofalowych. Należy uważać, aby usunąć nadmiar wody, ponieważ pozostały płyn może rozcieńczyć kwas azotowy, a tym samym potencjał utleniający kwasu podczas degradacji tkanek. 
	UWAGA: W tym momencie tkanka może być przechowywana w temperaturze -20 °C do czasu dalszej analizy. W przypadku metali występujących w naturalnych ilościach czyszczenie rurek w kąpieli z 5% kwasem azotowym przed użyciem poprawi poziom tła otoczenia.</li>
</ol>
3. Trawienie tkanek i ocena ICPMS (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Dodaj około 0,25 ml do 15 ml polipropylenowych probówek wirówkowych na maksymalnie 10 larw (~100 μg) kwasu azotowego o wysokiej czystości (69%). Ultradźwięki przez 1 godzinę w celu wstępnego trawienia próbek przy użyciu następujących ustawień: moc kąpieli ultradźwiękowej: 85 W; 42 kHz ± 6%; zakres temperatur: 19-27 °C. 
	UWAGA: Nosić ochronniki słuchu podczas sonikacji. Kwas azotowy powoduje poważne oparzenia dróg oddechowych, oczu i skóry. Nosić pełne wyposażenie ochronne i pracować pod wyciągiem lub w miejscach o odpowiedniej wentylacji. Może być łatwopalny z innymi materiałami. Kwas azotowy należy stosować wyłącznie w dygestorium, aby zapobiec narażeniu na opary powstające podczas trawienia. Nie wdychać ani nie połykać.
	<ol>
		<li>Wykonuj krótkie cykle trawienia tkanek (odstępy 5 minut) w bezpiecznym dla kwasów mikrofalowym komorze fermentacyjnej, aż cała tkanka zostanie widocznie utleniona (tj. jednolity, klarowno-żółty roztwór). 
		UWAGA: Zaleca się, aby protokół mikrofalowy w Tabeli 1 został wykonany trzy razy i obejmuje 5-minutowy odstęp czasu między każdym etapem podgrzewania.</li>
		<li>Uważnie monitorować integralność probówek, aby uniknąć pęknięcia i przeprowadzać krótkie wirowania w wirówce (313 × g przez 1 min) między cyklami, aby przesunąć kondensację kwasu na dno probówki. 
		UWAGA: Jeśli tkanka jest trudna do strawienia (zwłaszcza kosmówka), po trawieniu kwasem można użyć 30% nadtlenku wodoru o wysokiej czystości. Użyj nadtlenku wodoru (6,75 ml), aby rozcieńczyć stężenie kwasu do 3,5% i pozostaw próbki na noc w dygestorium. Nadtlenek wodoru rozkłada się doH2Oi nadaje się do analizy ICPMS. Co więcej, metale alternatywne mogą lepiej rozpuszczać się w kwasie solnym lub mieszaninie kwasu solnego i kwasu azotowego (tj. w wodzie królewskiej). Nadtlenek wodoru jest szkodliwy w przypadku połknięcia i powoduje poważne uszkodzenie oczu. Nosić ochronę skóry i oczu22,23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy tkanka jest widocznie utleniona (tj. jednolity, klarowno-żółty roztwór), rozcieńczyć próbki w dygestorium do 3,5% kwasu azotowego, używając 6,75 ml wody o wysokiej czystości i dokładnie wymieszać. 
	UWAGA: W tym momencie próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej. Ten krok nie jest konieczny, jeśli nadtlenek wodoru został dodany w celu wspomagania trawienia w kroku 3.1.</li>
	<li>Przeprowadzić dopasowaną do matrycy, 7-punktową krzywą kalibracyjną (zakres stężeń 0,001-10 ppb) przy użyciu certyfikowanego wzorca pierwiastkowego (tj. Pt lub Ru, w zależności od testu) z metalem będącym przedmiotem zainteresowania i optymalnym izotopem (izotopami), aby uwzględnić wszelkie potencjalne zakłócenia izobaryczne.
	<ol>
		<li>Stosując stężenie podstawowe wodnego, certyfikowanego wzorca pierwiastkowego (Ru, Pt = 1000 ppb), pobrać 0,1 ml porcji i pipetować do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Rozcieńczyć 3,5% kwasem azotowym do końcowej objętości 10 ml w celu uzyskania roztworu wzorcowego o stężeniu 10 ppb.</li>
		<li>Używając zapasu 10 ppb, wykonaj następujące seryjne rozcieńczenia: 0,1, 1,0 i 5,0 ppb roztwory wzorcowe w 3,5% kwasie azotowym.</li>
		<li>Używając 0,1 podstawy, wykonaj następujące seryjne rozcieńczenia: 0,001, 0,005 i 0,01 ppb roztwory wzorcowe w 3,5% kwasie azotowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj przyrząd ICPMS (patrz Tabela materiałów) do analizy próbki w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Przed uruchomieniem przyrządu upewnij się, że zawór gazu argonowego jest otwarty, wszystkie rurki są dobrze podłączone, a czysty 5% kwas azotowy jest otwarty do płukania rurek i naczyń szklanych między analizami próbek.</li>
		<li>Sprawdź stan palnika i stożków oraz upewnij się, że skrzynka palnika jest dobrze zatrzaśnięta, a rurka drenażowa komory natryskowej jest prawidłowo podłączona do perypompy.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Sprawdź odczyty podciśnienia i upewnij się, że wszystkie pompy turbo pracują na 100%.</li>
		<li>Kliknij START w oknie Stan systemu sterowania plazmą, aby zainicjować sekwencję startową, włączyć pompę plazmową, schładzacz plazmowy, oczyścić nebulizator i zapalić plazmę. Poczekaj, aż plazma zaświeci się i ustabilizuje, gdy okno stanu wskaże, że sekwencja startowa została zakończona. W tym momencie zwróć uwagę na zielone kropki w oknie Stan systemu, które wskazują, że wszystkie zasilacze są włączone.</li>
		<li>Na pasku menu kliknij Control | autosampler w menu rozwijanym. Wprowadź pozycję stojaka automatycznego podajnika próbek dla probówki zawierającej 5% kwasu azotowego. Pozwól, aby kwas dostał się do osocza.</li>
		<li>Na pasku menu kliknij Skany | Magnes w menu rozwijanym. W oknie MagnetScan wpisz 115 w polu Pozycja masy znacznika i kliknij Enter. Pozwól magnesowi skanować w całym zakresie mas w poszukiwaniu 115cali (114.6083 do 115.3749) przez 30 minut, podczas gdy instrument się nagrzewa.</li>
		<li>Po 30 minutach użyj kontrolki automatycznego podajnika próbek, aby przejść do pozycji wieloelementowego roztworu strojenia 1 ppb. Zassać roztwór strojeniowy i dostroić instrument, aby zoptymalizować odczyt sygnału. Wyreguluj pozycję palnika (X, Y, Z) tak, aby palnik był wyrównany ze środkiem stożków i natężeniem przepływu nebulizatora (~ 30 psi) w oknie sterowania plazmą. Dokonaj niezbędnych zmian w oknie dostrajania optyki jonowej dla źródła, detektora i analizatora.</li>
		<li>Po zoptymalizowaniu odczytu sygnału (~1,2 × 106 zliczeń/s dla 1 ppb na 115In), kliknij Stop w oknie Magnet Scan.
		<ol>
			<li>Kliknij Kalibruj magnes i wybierz Niska rozdzielczość w wyskakującym okienku.</li>
			<li>Kliknij przycisk OK i otwórz plik "Mass Calibration (Low Resolution).smc", aby skalibrować Magnet. 
			UWAGA: Kalibracja magnesu zmierzy liczby/s i dopasuje krzywą w następującym zakresie masy: od 7Li do 238U.</li>
			<li>Kliknij Zapisz | Służy do stosowania bieżącej kalibracji magnesu do analiz. W przypadku pomiaru nieznanych próbek o szerokim zakresie stężeń należy wykonać kalibrację detektora, aby porównać sygnały liczby impulsów jonów przy niskich stężeniach z osłabionymi sygnałami jonowymi wytwarzanymi przy wyższych stężeniach. Przeanalizuj próbki po zakończeniu strojenia i kalibracji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Na pasku menu kliknij Pozyskiwanie danych.
		<ol>
			<li>Kliknij Konfiguracja metody w menu rozwijanym. Użyj istniejącej metody dostarczonej przez producenta lub utwórz metodę na podstawie interesujących Cię elementów. W razie potrzeby dostosuj tryb analizy, czas zatrzymania, opóźnienie przełączenia, liczbę przeciągnięć/cykli, rozdzielczość, tryb wykrywania i masę parkowania dla ustawień deflektora.</li>
			<li>Kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać ustawienia metody. Zoptymalizuj parametry dla każdego metalu i izotopu. W tabeli 2 przedstawiono konkretne parametry operacyjne zastosowane w tym badaniu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Na pasku menu kliknij Pozyskiwanie danych.
		<ol>
			<li>Kliknij Uruchamianie wsadowe w menu rozwijanym. Alternatywnie kliknij ikonę BATCH pod paskiem menu. Zaimportuj parametry wsadowe z arkusza kalkulacyjnego lub utwórz sekwencję w oknie Uruchamianie wsadowe. Wprowadź typ próbki, pozycję stojaka automatycznego podajnika próbek, czas transferu, czas mycia, powtórzenia, identyfikator próbki i plik metody.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ułóż serię partii w następującej kolejności: roztwory wzorcowe dla krzywej kalibracyjnej (0,001-10 ppb Pt lub Ru), następnie wzorzec kontroli jakości, a następnie nieznane próbki. 
		UWAGA: Roztwory wzorcowe są mierzone w liczbach/s w ICPMS, a regresja liniowa jest dopasowana do wzorców ze względnym odchyleniem standardowym (RSD) > 0,999. Niewiadome są również mierzone jako liczby/s i rozwiązywane dla stężenia w ppb przy użyciu regresji liniowej krzywej kalibracyjnej, y = mx + b. Przetwarzanie danych można również zakończyć za pomocą oprogramowania, do którego się odwołuje.</li>
		<li>Monitoruj dryft przyrządu i odtwarzalność próbki, uwzględniając standard kontroli jakości 0,5 ppb co 5-10 próbek. 
		UWAGA: Odpowiednie normy kontroli jakości powinny być certyfikowanym standardowym materiałem odniesienia, innym niż wzorzec stosowany w krzywej kalibracyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Watów</td>
			<td>moc</td>
			<td>protokół</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300</td> szt.
			<td>50%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300</td> szt.
			<td>75%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300</td> szt.
			<td>0%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300</td> szt.
			<td>75%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Protokół mikrofalowego trawienia masy tkanki larwalnej. Próbki larw danio pręgowanego trawiono w 0,25 ml kwasu azotowego. Ta tabela została zmodyfikowana z 24.

<ol><li>Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+exposure+of+heavy+metals+and+their+impact+on+health+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).</li>
<li>Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy+metal+mixture+exposure+and+effects+in+developing+nations%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Toxics%22%5BJournal%5D)">Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update.</a> Toxics. 6 (4), 65(2018).</li>
<li>Doherty, C. L., Buckley, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+analytical+techniques+in+geochemistry+to+environmental+health%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health.</a> Molecules. 26 (9), 2821(2021).</li>
<li>Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+metal-based+drugs+according+to+their+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Chem%22%5BJournal%5D)">Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action.</a> Chem. 6 (1), 41-60 (2020).</li>
<li>Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+medicines+for+cancer%3A+WHO+recommendations+and+national+priorities%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities.</a> Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).</li>
<li>Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+status+of+platinum+anticancer+drugs+in+the+clinic+and+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials.</a> Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).</li>
<li>Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-based+chemotherapy+of+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Science+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-based chemotherapy of human cancers.</a> Journal of Cancer Science & Therapy. 11 (4), 97(2019).</li>
<li>Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin%3A+The+first+metal+based+anticancer+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+Chem%22%5BJournal%5D)">Cisplatin: The first metal based anticancer drug.</a> Bioorganic Chem. 88, 102925(2019).</li>
<li>Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruthenium+complexes%3A+an+emerging+ground+to+the+development+of+metallopharmaceuticals+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mini+Reviews+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).</li>
<li>Alessio, E., Messori, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAMI-A+and+KP1019%2F1339%2C+two+iconic+ruthenium+anticancer+drug+candidates+face-to-face%3A+a+case+story+in+medicinal+inorganic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry.</a> Molecules. 24 (10), 1995(2019).</li>
<li>Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruthenium+antimetastatic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ruthenium antimetastatic agents.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 4 (15), 1525-1535 (2004).</li>
<li>Lin, K., Zhao, Z. -Z., Bo, H. -B., Hao, X. -J., Wang, J. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+ruthenium+complex+in+tumor+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1323(2018).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+in+zebrafish+for+novel+biological+and+therapeutic+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery.</a> Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).</li>
<li>Bambino, K., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+toxicology+and+environmental+health%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in toxicology and environmental health.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).</li>
<li>Rubinstein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+assays+for+drug+toxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish assays for drug toxicity screening.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).</li>
<li>Cassar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+in+drug+discovery+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish in drug discovery toxicology.</a> Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29.+4th+edition%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Pfizer. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf">https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf</a> (2011).</li>
<li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).</li>
<li>OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en">https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en</a> (2013).</li>
<li>EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EMD+Millipore+Corporation%22">EMD Millipore Corporation</a>. , (2013).</li>
<li>Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298">https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298</a> (2014).</li>
<li>Karas, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+screening+method+for+transition+metal-based+anticancer+compounds+using+zebrafish+embryo-larval+assay+and+inductively+coupled+plasma-mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).</li>
<li>Henn, K., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dechorionation+as+a+tool+to+improve+the+fish+embryo+toxicity+test+%28FET%29+with+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Toxicology+%26+Pharmacology%3A+CBP%22%5BJournal%5D)">Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio).</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).</li>
<li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement%3A+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).</li>
<li>Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+alkylating+activity+in+zebrafish+causes+resistance+to+chorionic+degradation+and+inhibition+of+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis.</a> Aquatic Toxicology. 229, 105656(2020).</li>
</ol>

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które mogłyby zostać ujawnione przez któregokolwiek z autorów.

Opisany tutaj protokół został wdrożony w celu określenia dostarczania i wchłaniania leków przeciwnowotworowych na bazie metali zawierających Pt lub Ru. Chociaż metody te zostały już opublikowane, w niniejszym protokole omówiono ważne kwestie i szczegóły dotyczące dostosowania tej metodologii do szeregu związków. Protokół OECD w połączeniu z trawieniem tkanek i analizą ICPMS pozwolił nam ustalić, że PMC79 był silniejszy niż cisplatyna i powodował rozproszoną akumulację w tkankach, co sugeruje odrębne mechanizmy. Ponadto, ...

Metale i związki na bazie metali nadal mają znaczenie farmakologiczne i toksykologiczne. Rozpowszechnienie narażenia na metale ciężkie i jego wpływ na zdrowie wykładniczo zwiększyło badania naukowe od lat 60. XX wieku i osiągnęło rekordowy poziom w 2021 roku. Stężenia metali ciężkich w wodzie pitnej, zanieczyszczenie powietrza i narażenie zawodowe przekraczają limity regulacyjne na całym świecie i pozostają problemem dla arsenu, kadmu, rtęci, chromu, ołowiu i innych metali. Nowatorskie metody ilościowego określania narażenia środowiskowego i analizy rozwoju patologicznego nadal cieszą się dużym zainteresowaniem1,2,3.
Z drugiej strony, medycyna wykorzystała właściwości fizykochemiczne różnych metali do leczenia klinicznego. Leki na bazie metali lub metaloleki mają bogatą historię zastosowań leczniczych i wykazały działanie przeciwko wielu chorobom, odnosząc największe sukcesy jako chemioterapeutyki4. Najsłynniejszy z metaloleków, cisplatyna, jest lekiem przeciwnowotworowym opartym na Pt, uznanym przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) za jeden z podstawowych leków na świecie5. W 2010 roku cisplatyna i jej pochodne Pt miały do 90% skuteczności w kilku nowotworach i były stosowane w około 50% schematów chemioterapii6,7,8. Chociaż chemioterapeutyki oparte na Pt odniosły niepodważalny sukces, toksyczność ograniczająca dawkę uruchomiła badania nad alternatywnymi lekami na bazie metali o wyrafinowanym dostarczaniu i aktywności biologicznej. Spośród tych alternatyw, związki na bazie Ru stały się najbardziej popularne9,10,11,12.
Potrzebne są nowatorskie modele i metodologia, aby nadążyć za zapotrzebowaniem na badania farmako- i toksykokinetyczne metali. Model danio pręgowanego leży na przecięciu złożoności i przepustowości, będąc kręgowcem o wysokiej płodności z 70% zachowaną homologią genów13. Model ten okazał się atutem w farmakologii i toksykologii, z obszernymi badaniami przesiewowymi dla różnych związków w celu odkrywania ołowiu, identyfikacji celu i aktywności mechanistycznej14,15,16,17. Jednak wysokoprzepustowe badania przesiewowe chemikaliów zazwyczaj opierają się na narażeniu na działanie wody. Biorąc pod uwagę, że wychwyt może być zmienny w zależności od właściwości fizykochemicznych związku w roztworze (tj. fotodegradacji, rozpuszczalności), może to stanowić główne ograniczenie korelacji w podawaniu dawki i odpowiedzi.
Aby przezwyciężyć to ograniczenie do porównania dawki z wyższymi kręgowcami, zaprojektowano metodologię analizy stężeń metali śladowych w tkance larwalnej danio pręgowanego. W tym przypadku oceniono krzywe dawka-odpowiedź śmiertelnych i subletalnych punktów końcowych dla cisplatyny i nowych związków przeciwnowotworowych na bazie Ru. Śmiertelność i opóźnione wylęganie oceniano dla nominalnych stężeń cisplatyny 0, 3,75, 7,5, 15, 30 i 60 mg/l. Akumulację Pt w tkance organizmu określono za pomocą analizy ICPMS, a wychwyt odpowiednich dawek przez organizm wynosił 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 i 461,9 ng (Pt) na organizm. Dodatkowo larwy danio pręgowanego były narażone na 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg/L PMC79. Stężenia te określono analitycznie jako zawierające 0, 0,17, 0,44, 0,66 i 0,76 mg/l Ru. Protokół ten pozwolił również na rozróżnienie stężeń Pt sekwestrowanych w kosmówce larw w porównaniu z tkanką danio pręgowanego. Metodologia ta była w stanie dostarczyć wiarygodnych, solidnych danych do porównań aktywności farmakologicznej i toksykokinetycznej między dobrze znaną chemioterapeutykiem a nowym związkiem. Metoda ta może być stosowana do szerokiej gamy metali i związków na bazie metali.

<table><tbody><tr><td>Szczep AB Danio pręgowany (Danio reri)Danio</td> <td>pręgowany Międzynarodowe Centrum Zasobów Danio pręgowany</td><td>Dziki typ AB</td><td>Dziki typ AB Danio pręgowany</td></tr><tr><td>klasy ACS Kwas azotowy</td><td>VWR BDH Chemicals</td><td>BDH3130-2,5LP</td><td>Kwas azotowy (68-70%); służy do wytwarzania 10% roztworu do kąpieli kwasowej HNO3 do namaczania/wstępnego celanowania probówek wirówkowych</td></tr><tr><td>Aquatox Dieta rybna (płatek)</td><td>Zeigler Bros, Inc.</td><td></td><td>Pokarm w płatkach należy mieszać w proporcji 1:4 diety Aquatox Fish do płatków tropikalnych TetraMin i stosować jako</td></tr><tr><td>paszę Cysty artemii, krewetki solankowe</td><td>PentairAES</td><td>BS90</td><td>Jaja krewetek solankowych sprzedawane w 15-uncjowych, pakowanych próżniowo puszkach do wyklucia i wykorzystania jako pasza</td></tr><tr><td>ASX-510 Autosampler dla ICPMS</td><td>Teledyne CETAC</td><td></td><td>Automatyczny próbnik z regulowanym ruchem XYZ, przepływową stacją płukania i sondą o wymiarach wewnętrznych 0,3 mm. Kompatybilny z oprogramowaniem Nu AttoLab do programowalnych analiz wsadowych.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>CL 2</td><td>Thermo Scientific CL 2 kompaktowa wirówka stołowa o zmiennym zakresie prędkości do 5200 obr./min; służy do doprowadzania próbki i kondensatu kwaśnego na dno probówki wirówkowej między odstępami między mikrofalowymi roztwarzaczami; pomaga w zatrzymywaniu próbek</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>VWR</td><td>21008-105</td><td>Ultra wysokowydajne polipropylenowe probówki wirówkowe z płaską nakrętką; objętość 15 ml; szczelne ze stożkowym dnem</td></tr><tr><td>Fiolki z gwintem z przezroczystego szkła klasy A</td><td>Fisherbrand</td><td>03-339-25B</td><td>Pojedyncze szklane fiolki do ograniczania narażenia</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8418</td><td>Rozpuszczalnik lub nośnik do związków hydrofobowych</td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy o stałej prędkości</td><td>VWR</td><td>10153-834</td><td>Mieszalnik wirowy; służy do homogenizacji próbki po roztwarzaniu i rozcieńczaniu w kwasie</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru o wysokiej czystości</td><td>Merk KGaA, EDM Millipore</td><td>1.07298.0250</td><td>Suprapur Nadtlenek wodoru (30%); używany do mineralizacji</td></tr><tr><td>próbek Kwas azotowy EDM o wysokiej czystości</td><td>Kwas azotowy Millipore</td><td>NX0408-2</td><td>Omni Trace Ultra Kwas azotowy (69%); używany do trawienia próbki</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Spectrum Brands, Inc.</td><td>Natychmiastowy ocean&reg; Sól morska</td><td>Roztwór wodny jaj zawiera sól morską oceaniczną o końcowym stężeniu 60 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Mars X Mikrofalowy system mineralizacji</td><td>CEM, Matthews, NC</td><td></td><td>Mikrofalowy system trawienia kwasem stosowany do trawienia i homogenizacji próbek w jednolitych warunkach. W przypadku tej metodologii metodę trawienia w otwartym naczyniu przeprowadzono przy użyciu jednorazowych probówek wirówkowych z polipropylenu o małej mocy (300 W).&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór wielopierwiastkowy 3</td><td>SPEX CertiPREP</td><td>CLMS-3</td><td>Zawiera 10 mg/l Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn w 10% HCl/1% HNO3; stosowany jako standard kontroli jakości dla analiz Pt i Ru</td></tr><tr><td>Nu Instruments AttoM Spektrometr masowy z plazmą sprzężoną indukcyjnie o wysokiej rozdzielczości (HR-ICP-MS)</td><td>nu Instruments/Amatek</td><td></td><td>Spektrometr masowy z podwójnie ogniskowanym sektorem magnetycznym sprzężonym indukcyjnie z sektorem magnetycznym z elastycznym systemem szczelinowym o niskiej i wysokiej rozdzielczości oraz systemem detektora zakresu dynamicznego. Przetwarzanie danych i kwantyfikacja odbywa się za pomocą oprogramowania towarzyszącego NuQuant.</td></tr><tr><td>Roztwór wzorcowy platyny (Pt), NIST 3140</td><td>Narodowy Instytut Standaryzacji i Technologii</td><td>3140</td><td>Przygotowany z ampułki zawierającej 9,996 mg/g Pt w 10% HCl; ; stosowany jako wzorzec kontroli jakości do analiz Pt</td></tr><tr><td>Roztwór wzorcowy platyny (Pt), jednopierwiastkowy</td><td>Wysokie standardy czystości</td><td>100040-2</td><td>Zawiera 1000 mg/l Pt w 5% roztworze</td></tr><tr><td>wzorcowym HCl Ruten (Ru), jednopierwiastkowy</td><td>Wysokie standardy</td> <td>czystości100046-2</td><td>Zawiera 1000 mg/L Ru w 2% HCl</td></tr><tr><td>TetraMin Tropical Flakes</td><td>Tetra</td><td>77101</td><td>Płatki do zmieszania w stosunku 1:4 Aquatox Fish Diet do TetraMin Tropical Flakes i stosowania jako pasza</td></tr><tr><td>Kwas azotowy klasy metali śladowych VWR</td><td>BDH Chemicals</td><td>87003-261</td><td>Aristar Plus Kwas azotowy (67-70%); stosowany do roztworu do płukania w ASX-510 Autosampler</td></tr><tr><td>Ultradźwiękowa łaźnia wodna</td><td>VWR</td><td>B2500A-DTH</td><td>Ultradźwiękowa kąpiel wodna stosowana w celu wspomagania trawienia kwasami przed mineralizacją mikrofalową</td></tr></tbody></table>

absorpcja dawki ekspozycji na związki na bazie platyny i rutenu u danio pręgowanego za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie o szerszych zastosowaniach

Dose Uptake of Platinum- and Ruthenium-based Compound Exposure in Zebrafish by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry with Broader Applications

Metale i związki na bazie metali obejmują różnorodne farmakologicznie i toksykologiczne ksenobiotyki. Od toksyczności metali ciężkich po chemioterapeutyki, toksykokinetyka tych związków ma znaczenie zarówno historyczne, jak i współczesne. Danio pręgowany stał się atrakcyjnym organizmem modelowym w wyjaśnianiu farmako- i toksykokinetyki w badaniach środowiskowych i klinicznych badaniach translacyjnych. Chociaż badania nad danio pręgowanym mają tę zaletę, że są bardziej przepustowe niż modele gryzoni, istnieje kilka istotnych ograniczeń modelu.
Jedno z takich ograniczeń jest nieodłącznie związane ze schematem dawkowania na bazie wody. Stężenia wody z tych badań nie mogą być ekstrapolowane w celu zapewnienia wiarygodnych dawek wewnętrznych. Bezpośrednie pomiary związków na bazie metali pozwalają na lepszą korelację z odpowiedziami molekularnymi i biologicznymi związanymi ze związkami. Aby przezwyciężyć to ograniczenie w przypadku metali i związków na bazie metali, opracowano technikę trawienia tkanek larwalnych danio pręgowanego po ekspozycji i ilościowego określania stężeń metali w próbkach tkanek za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICPMS).
Metody ICPMS zostały użyte do określenia stężenia metali platyny (Pt) z cisplatyny i rutenu (Ru) z kilku nowych chemioterapeutyków opartych na Ru w tkance danio pręgowanego. Ponadto w protokole tym rozróżniono stężenia Pt, które zostały sekwestrowane w kosmówce larwy w porównaniu z tkanką danio pręgowanego. Wyniki te wskazują, że metoda ta może być stosowana do ilościowego oznaczania dawki metalu obecnego w tkankach larwalnych. Co więcej, metoda ta może być dostosowana w celu identyfikacji określonych metali lub związków na bazie metali w szerokim zakresie badań narażenia i dawkowania.

Wyniki te zostały wcześniej opublikowane24. Badania nad poborem przez tkanki przeprowadzono przy ekspozycjach wodnych na cisplatynę oraz nowy związek przeciwnowotworowy na bazie Ru, PMC79. Śmiertelność oraz opóźnienie wyklucia oceniano dla nominalnych stężeń cisplatyny wynoszących 0, 3.75, 7.5, 15, 30 i 60 mg/L. Akumulację Pt w tkankach organizmów określono za pomocą analizy ICPMS; w tkankach organizmów stwierdzono odpowiednio dawki 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2 i 461.9 ng (Pt) na organizm ...

Zwiększona częstotliwość analiz farmakologicznych i toksykokinetycznych metali i związków na bazie metali u danio pręgowanego może być korzystna dla środowiskowych i klinicznych badań tłumaczeniowych. Ograniczenie związane z nieznaną ekspozycją na wodę zostało przezwyciężone poprzez przeprowadzenie analizy metali śladowych na strawionej tkance danio pręgowanego przy użyciu spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie.

Absorpcja dawki ekspozycji na związki na bazie platyny i rutenu u danio pręgowanego za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie o szerszych zastosowaniach

Metals and metal-based compounds comprise multifarious pharmaco-active and toxicological xenobiotics. From heavy metal toxicity to chemotherapeutics, the ...

Danio pręgowany jest atrakcyjnym modelem, ale naukowcy nie wiedzą, ile organizm pobiera po podaniu wody. Opracowaliśmy technikę trawienia tkanek po ekspozycji i ilościowego oznaczania metali za pomocą ICPMS. Technika ta pozwala nam na dokładne ilościowe określenie i walidację odpowiedzi na dawkę za pomocą ICPMS.Ta metoda ma duży potencjał. Ekspozycja na metale farmakologiczne lub środowiskowe może być stosowana od poziomu komórkowego aż do całych układów narządów w modelach zwierzęcych. Dodaj około 0,25 mililitra kwasu azotowego o wysokiej czystości do 15-mililitrowych probówek wirówek polipropylenowych na maksymalnie 10 larw.Ultradźwięki przez godzinę w celu wstępnego trawienia próbek. W przypadku ultradźwięków należy wykonywać krótkie cykle trawienia tkanek w pięciominutowych odstępach w bezpiecznym dla kwasów komorze fermentacyjnej mikrofalowej, aż cała tkanka zostanie widocznie utleniona, wytwarzając jednolity, klarowny żółty roztwór. Uważnie monitoruj integralność probówek, aby uniknąć pęknięcia i przeprowadzaj krótkie wirowania w wirówce między cyklami.Gdy tkanka jest widocznie utleniona, rozcieńczyć próbki w dygestorium do 3,5% kwasu azotowego, używając 6,75 mililitra wody o wysokiej czystości i dokładnie wymieszać. Następnie należy przeprowadzić dopasowaną do matrycy, 7-punktową krzywą kalibracyjną, aby uwzględnić wszelkie potencjalne zakłócenia izobaryczne. Używając stężenia podstawowego wodnego certyfikowanego wzorca pierwiastkowego, pobrać podwielokrotność 0,1 mililitra i pipetować do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Rozcieńczyć 3,5% kwasem azotowym do końcowej objętości 10 mililitrów, aby uzyskać 10 części na miliard roztworów wzorcowych. Używając 10 części na miliard zapasu, wykonaj seryjne rozcieńczenia 0,1, 1,0 i 5,0 części na miliard roztworów wzorcowych w 3,5% kwasie azotowym. Używając zapasu 0,1, wykonaj seryjne rozcieńczenia 0,001, 0,005 i 0,01 części na miliard roztworów wzorcowych w 3,5% kwasie azotowym.Następnie przed przygotowaniem przyrządu ICPMS do analizy próbki upewnij się, że zawór argonu jest otwarty, wszystkie rurki są bezpiecznie podłączone i czyste, 5% kwas azotowy jest otwarty do płukania rurek i naczyń szklanych między analizami próbek. Sprawdź stan palnika i stożków oraz upewnij się, że skrzynka palnika jest dobrze zatrzaśnięta. Rura drenażowa komory natryskowej jest prawidłowo podłączona do perypompy.Otwórz oprogramowanie, sprawdź odczyty podciśnienia i upewnij się, że wszystkie pompy turbo pracują z prędkością 100%Kliknij START w oknie stanu systemu Plasma Control, aby zainicjować sekwencję startową. Włącz pompę plazmową i chłodziarkę plazmową, usiądź na nebulizatorze i zapal plazmę. Poczekaj, aż plazma zaświeci się i ustabilizuje, gdy okno Status wskaże, że sekwencja startowa została zakończona.W tym momencie zwróć uwagę na zielone kropki w oknie stanu systemu, które wskazują, że wszystkie zasilacze są włączone. Na pasku menu kliknij Kontrola, Autosampler w menu rozwijanym. Wprowadź pozycję stojaka automatycznego podajnika próbek dla probówki zawierającej 5% kwasu azotowego, pozwól kwasowi dostać się do osocza.Na pasku menu kliknij Skany, Magnes w menu rozwijanym. W oknie MagnetScan wpisz 115 w polu Pozycja masy znacznika i kliknij Enter. Pozwól magnesowi skanować w całym zakresie mas przez 30 minut, podczas gdy instrument się rozgrzeje.Po 30 minutach użyj kontrolki automatycznego podajnika próbek, aby przejść do pozycji wieloelementowego roztworu strojenia jednej części na miliard. Zassać roztwór strojeniowy i dostroić instrument, aby zoptymalizować odczyt sygnału. Dostosuj pozycję palnika dla współrzędnych X, Y, Z, tak aby palnik był wyrównany ze środkiem stożków i natężeniem przepływu nebulizatora w oknie Plasma Control.Dokonaj niezbędnych zmian w oknie dostrajania optyki jonowej dla źródła, detektora i analizatora. Po zoptymalizowaniu odczytu sygnału kliknij Stop w oknie Magnet Scan, kliknij Kalibruj magnes i wybierz niską rozdzielczość w wyskakującym okienku. Kliknij przycisk OK i otwórz plik smc do kalibracji masy, aby skalibrować magnes.Kliknij przycisk Zapisz, Użyj, aby zastosować bieżącą kalibrację magnesu do analiz. Podczas pomiaru nieznanych próbek o szerokim zakresie stężeń należy wykonać kalibrację detektora, aby porównać sygnały liczby impulsów jonowych przy niskich stężeniach z osłabionymi sygnałami jonowymi wytwarzanymi przy wyższych stężeniach. Rozpocznij analizę próbki, klikając Data Acquisition, a następnie kliknij Method Setup (Ustawienia metody) w menu rozwijanym.Skorzystaj z istniejącej metody dostarczonej przez producenta lub stwórz metodę na podstawie interesujących Cię elementów. W razie potrzeby dostosuj tryb analizy, czas przebywania, opóźnienie przełączania, liczbę przebiegów i cykli, rozdzielczość, tryb wykrywania i masę parkowania dla ustawień deflektora. Kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać ustawienia metody.Zoptymalizuj parametry dla każdego metalu i izotypu. Na pasku menu kliknij Pozyskiwanie danych. Kliknij Uruchamianie wsadowe w menu rozwijanym.Możesz też kliknąć ikonę WSADU pod paskiem menu, zaimportować parametry wsadowe z arkusza kalkulacyjnego lub utworzyć sekwencję w oknie Przebieg wsadowy. Wprowadź typ próbki, pozycję stojaka automatycznego podajnika próbek, czas transferu, czas mycia, powtórzenia, identyfikator próbki i plik metody. Zorganizuj serię prób dla roztworów wzorcowych dla krzywej kalibracyjnej, następnie wzorca kontroli jakości, a następnie nieznanych próbek.Monitoruj dryft urządzenia i odtwarzalność próbki, uwzględniając normę kontroli jakości 0,5 części na miliard co 5 do 10 próbek. Badania wychwytu tkankowego przeprowadzono z ekspozycją na cisplatynę i nowy związek przeciwnowotworowy PMC79 na bazie rutenu. Śmiertelność i opóźnione wylęg oceniano pod kątem nominalnych stężeń cisplatyny.0, 3,75, 7,5, 15, 30 i 60 miligramów na litr cisplatyny. Akumulację platyny w tkance organizmu określono za pomocą analizy ICPMS, a tkanka organizmu zawierała odpowiednie dawki 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 i 461,9 nanogramów na organizm. Opóźnione wylęganie obserwowano przy wszystkich stężeniach cisplatyny.Po dechorionacji kosmówkę pobrano i przeanalizowano osobno pod kątem platyny. Nieśmiertelne dawki cisplatyny stosowane w badaniach dekorionacji wykazały, że 93 do 96% całkowitej dostarczonej dawki cisplatyny nagromadziło się w kosmówce, a pozostała dawka w tkance larwalnej. Larwy danio pręgowanego wystawiono na działanie 0, 3,1, 6,2, 9,2 i 12,4 miligramów na litr PMC79.Stężenia te określono analitycznie jako zawierające 0, 0,17, 0,44, 0,66 i 0,76 miligrama na litr rutenu. W przeciwieństwie do tej cisplatyny, u larw narażonych na PMC79 nie zaobserwowano opóźnionego wylęgu. Choriony nie zostały uwzględnione w analizie rutenu, ponieważ naturalnie uległy degradacji przed pobraniem larw.Masywny metal w tkankach larwalnych analizowanych przy każdym stężeniu wynosił 0,19, 0,41 i 0,68 nanograma rutenu na larwę. Każdy z odczynników dodanych do protokołu narażenia stwarza możliwość wystąpienia zakłóceń izobarycznych. Jeśli to możliwe, rozważ alternatywy, takie jak szybkie chłodzenie w porównaniu z tricainą.Metoda ta pozwala na ilościowe określenie dawki metalu pod kątem toksyczności, skuteczności, eksperymentów na wyższych kręgowcach. Szczególnie ucieszył nas fakt, że nasza dawka progowa mieściła się w rzędzie wielkości podawanej pacjentom.

dose-uptake-platinum-ruthenium-based-compound-exposure-zebrafish

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Ten film opisuje technikę tworzenia modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z danio pręgowanego. W protokole próbki oceniamy skuteczność leków Gemcytabina i Navitoclax na modelu ksenoprzeszczepu guza trzustki.

Ksenoprzeszczep danio pręgowanego od pacjenta (zPDX): model raka

Ten protokół opisuje użycie reakcji sprzęgania amidowego kwasu izonikotynowego i diaminoalkanów do tworzenia ligandów mostkowych odpowiednich do użycia w syntezie wielojądrowych kompleksów platynowych, które łączą aspekty leków przeciwnowotworowych BBR3464 i pikoplatyny.

Reakcja sprzęgania amidowego do syntezy ligandów na bazie bispirydyny i ich kompleksowania do platyny jako dwujądrowych środków przeciwnowotworowych

Technika gradientów dyfuzyjnych w cienkich warstwach (DGT) jest proponowana do badań specjacyjnych plutonu. Protokół ten opisuje eksperymenty dyfuzyjne badające zachowanie Pu(IV) i Pu(V) w obecności materii organicznej. DGT rozmieszczone w źródle krasowym pozwalają na ocenę biodostępności Pu.

Pomiary specjacji i biodostępności plutonu środowiskowego z wykorzystaniem dyfuzji w cienkich warstwach

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Ten protokół opisuje procedury wywoływania ostrego uszkodzenia nerek (AKI) u dorosłych ryb pręgowanych przy użyciu cisplatyny jako środka nefrotoksycznego. Szczegółowo opisaliśmy etapy oceny odtwarzalności techniki oraz dwie techniki analizy stanu zapalnego i śmierci komórek w tkance nerkowej, odpowiednio cytometrię przepływową i TUNEL.

Model ostrego uszkodzenia nerek wywołanego cisplatyną u dorosłych danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje protokół szybkiego i efektywnego czasoprzestrzennego monitorowania normalnej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego.

Szybkie i skuteczne czasoprzestrzenne monitorowanie prawidłowej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego

Danio pręgowany został ostatnio wykorzystany jako model do walidacji potencjalnych modyfikatorów promieniowania. Niniejszy protokół opisuje szczegółowe kroki w celu wykorzystania zarodków danio pręgowanego do eksperymentów przesiewowych opartych na promieniowaniu oraz niektóre podejścia obserwacyjne do oceny wpływu różnych metod leczenia i promieniowania.

Larwy danio pręgowanego jako model do oceny potencjalnych radiosensybilizatorów lub obrońców

Danio pręgowany celujący w reaktywne elektrofile i utleniacze (Z-REX) to oparta na biologii chemicznej metoda badania reaktywnej sygnalizacji małocząsteczkowej. Technikę tę można zastosować do żywych ryb na różnych etapach rozwoju. Tutaj łączymy standardowe testy u danio pręgowanego z Z-REX do analizy szlaku sygnałowego.

Monitorowanie docelowych reakcji sygnalizacyjnych u larw danio pręgowanego - Z-REX demaskuje precyzyjne mechanizmy działania leków elektrofilowych i metabolitów

Opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę QuEChERS-HPLC do oceny wewnętrznych poziomów 16 WWA w zarodkach danio pręgowanego.

Zmodyfikowana metoda QuEChERS-HPLC do wykrywania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w zarodkach danio pręgowanego narażonych na działanie drobnych cząstek stałych

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Poznaj metodę ilościowego oznaczania metali w tkankach danio pręgowanego za pomocą spektrometrii mas ICP-MS. Technika ta umożliwia precyzyjną walidację dawkowania w badaniach toksykologicznych i farmakologicznych.

Absorpcja dawki ekspozycji na związki na bazie platyny i rutenu u danio pręgowanego za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie o szerszych zastosowaniach (Wideo) | JoVE Journal

Absorpcja dawki ekspozycji na związki na bazie platyny i rutenu u danio pręgowanego za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie o szerszych zastosowaniach

Przeglądaj więcej filmów