Absorpcja dawki ekspozycji na związki na bazie platyny i rutenu u danio pręgowanego za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie o szerszych zastosowaniach

Danio pręgowany jest atrakcyjnym modelem, ale naukowcy nie wiedzą, ile organizm pobiera po podaniu wody. Opracowaliśmy technikę trawienia tkanek po ekspozycji i ilościowego oznaczania metali za pomocą ICPMS. Technika ta pozwala nam na dokładne ilościowe określenie i walidację odpowiedzi na dawkę za pomocą ICPMS.

Ta metoda ma duży potencjał. Ekspozycja na metale farmakologiczne lub środowiskowe może być stosowana od poziomu komórkowego aż do całych układów narządów w modelach zwierzęcych. Dodaj około 0,25 mililitra kwasu azotowego o wysokiej czystości do 15-mililitrowych probówek wirówek polipropylenowych na maksymalnie 10 larw.

Ultradźwięki przez godzinę w celu wstępnego trawienia próbek. W przypadku ultradźwięków należy wykonywać krótkie cykle trawienia tkanek w pięciominutowych odstępach w bezpiecznym dla kwasów komorze fermentacyjnej mikrofalowej, aż cała tkanka zostanie widocznie utleniona, wytwarzając jednolity, klarowny żółty roztwór. Uważnie monitoruj integralność probówek, aby uniknąć pęknięcia i przeprowadzaj krótkie wirowania w wirówce między cyklami.

Gdy tkanka jest widocznie utleniona, rozcieńczyć próbki w dygestorium do 3,5% kwasu azotowego, używając 6,75 mililitra wody o wysokiej czystości i dokładnie wymieszać. Następnie należy przeprowadzić dopasowaną do matrycy, 7-punktową krzywą kalibracyjną, aby uwzględnić wszelkie potencjalne zakłócenia izobaryczne. Używając stężenia podstawowego wodnego certyfikowanego wzorca pierwiastkowego, pobrać podwielokrotność 0,1 mililitra i pipetować do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Rozcieńczyć 3,5% kwasem azotowym do końcowej objętości 10 mililitrów, aby uzyskać 10 części na miliard roztworów wzorcowych. Używając 10 części na miliard zapasu, wykonaj seryjne rozcieńczenia 0,1, 1,0 i 5,0 części na miliard roztworów wzorcowych w 3,5% kwasie azotowym. Używając zapasu 0,1, wykonaj seryjne rozcieńczenia 0,001, 0,005 i 0,01 części na miliard roztworów wzorcowych w 3,5% kwasie azotowym.

Następnie przed przygotowaniem przyrządu ICPMS do analizy próbki upewnij się, że zawór argonu jest otwarty, wszystkie rurki są bezpiecznie podłączone i czyste, 5% kwas azotowy jest otwarty do płukania rurek i naczyń szklanych między analizami próbek. Sprawdź stan palnika i stożków oraz upewnij się, że skrzynka palnika jest dobrze zatrzaśnięta. Rura drenażowa komory natryskowej jest prawidłowo podłączona do perypompy.

Otwórz oprogramowanie, sprawdź odczyty podciśnienia i upewnij się, że wszystkie pompy turbo pracują z prędkością 100%Kliknij START w oknie stanu systemu Plasma Control, aby zainicjować sekwencję startową. Włącz pompę plazmową i chłodziarkę plazmową, usiądź na nebulizatorze i zapal plazmę. Poczekaj, aż plazma zaświeci się i ustabilizuje, gdy okno Status wskaże, że sekwencja startowa została zakończona.

W tym momencie zwróć uwagę na zielone kropki w oknie stanu systemu, które wskazują, że wszystkie zasilacze są włączone. Na pasku menu kliknij Kontrola, Autosampler w menu rozwijanym. Wprowadź pozycję stojaka automatycznego podajnika próbek dla probówki zawierającej 5% kwasu azotowego, pozwól kwasowi dostać się do osocza.

Na pasku menu kliknij Skany, Magnes w menu rozwijanym. W oknie MagnetScan wpisz 115 w polu Pozycja masy znacznika i kliknij Enter. Pozwól magnesowi skanować w całym zakresie mas przez 30 minut, podczas gdy instrument się rozgrzeje.

Po 30 minutach użyj kontrolki automatycznego podajnika próbek, aby przejść do pozycji wieloelementowego roztworu strojenia jednej części na miliard. Zassać roztwór strojeniowy i dostroić instrument, aby zoptymalizować odczyt sygnału. Dostosuj pozycję palnika dla współrzędnych X, Y, Z, tak aby palnik był wyrównany ze środkiem stożków i natężeniem przepływu nebulizatora w oknie Plasma Control.

Dokonaj niezbędnych zmian w oknie dostrajania optyki jonowej dla źródła, detektora i analizatora. Po zoptymalizowaniu odczytu sygnału kliknij Stop w oknie Magnet Scan, kliknij Kalibruj magnes i wybierz niską rozdzielczość w wyskakującym okienku. Kliknij przycisk OK i otwórz plik smc do kalibracji masy, aby skalibrować magnes.

Kliknij przycisk Zapisz, Użyj, aby zastosować bieżącą kalibrację magnesu do analiz. Podczas pomiaru nieznanych próbek o szerokim zakresie stężeń należy wykonać kalibrację detektora, aby porównać sygnały liczby impulsów jonowych przy niskich stężeniach z osłabionymi sygnałami jonowymi wytwarzanymi przy wyższych stężeniach. Rozpocznij analizę próbki, klikając Data Acquisition, a następnie kliknij Method Setup (Ustawienia metody) w menu rozwijanym.

Skorzystaj z istniejącej metody dostarczonej przez producenta lub stwórz metodę na podstawie interesujących Cię elementów. W razie potrzeby dostosuj tryb analizy, czas przebywania, opóźnienie przełączania, liczbę przebiegów i cykli, rozdzielczość, tryb wykrywania i masę parkowania dla ustawień deflektora. Kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać ustawienia metody.

Zoptymalizuj parametry dla każdego metalu i izotypu. Na pasku menu kliknij Pozyskiwanie danych. Kliknij Uruchamianie wsadowe w menu rozwijanym.

Możesz też kliknąć ikonę WSADU pod paskiem menu, zaimportować parametry wsadowe z arkusza kalkulacyjnego lub utworzyć sekwencję w oknie Przebieg wsadowy. Wprowadź typ próbki, pozycję stojaka automatycznego podajnika próbek, czas transferu, czas mycia, powtórzenia, identyfikator próbki i plik metody. Zorganizuj serię prób dla roztworów wzorcowych dla krzywej kalibracyjnej, następnie wzorca kontroli jakości, a następnie nieznanych próbek.

Monitoruj dryft urządzenia i odtwarzalność próbki, uwzględniając normę kontroli jakości 0,5 części na miliard co 5 do 10 próbek. Badania wychwytu tkankowego przeprowadzono z ekspozycją na cisplatynę i nowy związek przeciwnowotworowy PMC79 na bazie rutenu. Śmiertelność i opóźnione wylęg oceniano pod kątem nominalnych stężeń cisplatyny.

0, 3,75, 7,5, 15, 30 i 60 miligramów na litr cisplatyny. Akumulację platyny w tkance organizmu określono za pomocą analizy ICPMS, a tkanka organizmu zawierała odpowiednie dawki 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 i 461,9 nanogramów na organizm. Opóźnione wylęganie obserwowano przy wszystkich stężeniach cisplatyny.

Po dechorionacji kosmówkę pobrano i przeanalizowano osobno pod kątem platyny. Nieśmiertelne dawki cisplatyny stosowane w badaniach dekorionacji wykazały, że 93 do 96% całkowitej dostarczonej dawki cisplatyny nagromadziło się w kosmówce, a pozostała dawka w tkance larwalnej. Larwy danio pręgowanego wystawiono na działanie 0, 3,1, 6,2, 9,2 i 12,4 miligramów na litr PMC79.

Stężenia te określono analitycznie jako zawierające 0, 0,17, 0,44, 0,66 i 0,76 miligrama na litr rutenu. W przeciwieństwie do tej cisplatyny, u larw narażonych na PMC79 nie zaobserwowano opóźnionego wylęgu. Choriony nie zostały uwzględnione w analizie rutenu, ponieważ naturalnie uległy degradacji przed pobraniem larw.

Masywny metal w tkankach larwalnych analizowanych przy każdym stężeniu wynosił 0,19, 0,41 i 0,68 nanograma rutenu na larwę. Każdy z odczynników dodanych do protokołu narażenia stwarza możliwość wystąpienia zakłóceń izobarycznych. Jeśli to możliwe, rozważ alternatywy, takie jak szybkie chłodzenie w porównaniu z tricainą.

Metoda ta pozwala na ilościowe określenie dawki metalu pod kątem toksyczności, skuteczności, eksperymentów na wyższych kręgowcach. Szczególnie ucieszył nas fakt, że nasza dawka progowa mieściła się w rzędzie wielkości podawanej pacjentom.