Name: Szybkie genotypowanie tkanek myszy przy użyciu zestawu Extract-N-Amp Tissue PCR firmy Sigma (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-22T18:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Poznaj szybką metodę genotypowania tkanek myszy przy użyciu zestawu Extract-N-Amp Tissue PCR z detekcją SYBR Green. Protokół umożliwia uzyskanie wyników w około półtorej godziny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Proszę <a href="http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/dna-and-rna-purification/sybr-green-extractnamp-tissue.html?cm_mmc=JoVE-_-video-_-extract-_-video">kliknąć tutaj</a>, aby wyświetlić protokół.

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

<table><tbody><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=XNATG%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Zestaw SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit&lt;/a&gt;</td><td>Zestaw odczynników</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=XNATG%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">XNATG&lt;/a&gt;</td><td>Zawiera: roztwór do ekstrakcji, roztwór neutralizujący B, roztwór do przygotowania tkanki, Extract-N-Amp SYBR Green PCR ReadyMix</td></tr></tbody></table>

szybkie genotypowanie tkanek mysich z wykorzystaniem zestawu sigma extract-n-amp tissue pcr kit

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomowa detekcja DNA poprzez amplifikację PCR i analizę na żelu elektroforetycznym jest standardową metodą określania genotypu próbki tkanki. Konwencjonalne przygotowanie tkanek do izolacji DNA do PCR często trwa od kilku godzin do kilku dni, w zależności od rodzaju próbki tkankowej. W konsekwencji ustalenie genotypu próbki może zostać opóźnione o kilka dni, co w wielu rodzajach eksperymentów jest niedopuszczalne. W niniejszym materiale demonstrujemy kompletne genotypowanie próbki ogona myszy, obejmujące trawienie tkanki i odczyt wyników PCR, w czasie półtorej godziny przy użyciu zestawu Sigma SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. Najpierw przedstawiamy piętnastominutową ekstrakcję DNA z próbki tkanki. Następnie demonstrujemy odczyt amplifikacji PCR próbki w czasie rzeczywistym, co umożliwia identyfikację próbki pozytywnej w trakcie procesu amplifikacji. Połączenie szybkiej ekstrakcji i odczytu w czasie rzeczywistym pozwala na bezzwłoczną identyfikację genotypu wielu różnych rodzajów tkanek za pomocą niezawodnej metody PCR.

Pełne genotypowanie próbki ogona myszy, obejmujące trawienie tkanki i odczyt PCR, wykonuje się w półtorej godziny przy użyciu zestawu Sigma SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR.

Szybkie genotypowanie tkanek mysich z wykorzystaniem zestawu Sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomowa detekcja DNA poprzez amplifikację PCR i analizę w elektroforezie żelowej jest standardową metodą określania genotypu próbki tkanki...

Witam, nazywam się Linda i pracuję w laboratorium dr. Edwina Nikiego na University of California Irvine. Dzisiaj pokażę Państwu, jak wykorzystuję zestaw Sigma's Cygreen Extracting Tissue PCR do szybkiego genotypowania myszy transgenicznych. Zazwyczaj używam tego zestawu do genotypowania myszy w stadium embrionalnym podczas przygotowywania ostrych kultur komórek dysocjowanych, gdy muszę w krótkim czasie ustalić genotyp danej myszy.Jednak na potrzeby dzisiejszego pokazu wykorzystamy ogony dorosłych myszy, aby zaprezentować sposób użycia tego zestawu. Protokół ten obejmuje szybką trawienie alkaliczne i ekstrakcję DNA, a następnie szybki etap neutralizacji. Wyekstrahowane DNA wykorzystujemy w reakcji real-time PCR, w której możemy monitorować nasze amplikony PCR.Jeśli są Państwo gotowi, zacznijmy. Przed rozpoczęciem pracy należy upewnić się, że blok grzejny jest ustawiony na 95 °C, barwnik Sybr Green jest rozmrożony i przechowywany w lodzie do momentu użycia, a pozostałe odczynniki rozmrażają się w temperaturze pokojowej. W moim pojemniku z lodem znajdują się dwa primery, których użyjemy do genotypowania; zostały one zaprojektowane specjalnie dla badanego genu i zwalidowane do qPCR.Posiadam również kontrolę pozytywną dla badanego genu, kontrolę negatywną oraz próbkę tkanki pobraną wcześniej od dorosłej myszy. Podczas pobierania próbek tkanki niezwykle ważne jest zachowanie rygorystycznych zasad. Pobierając ogony embrionów myszy, zawsze płuczemy pęsetę 70% ethanol przed rozpoczęciem oraz przed każdym kolejnym pobraniem tkanki.Próbki ogonów zawsze najpierw płuczemy w TBS. Następnie należy przygotować mieszaninę główną (master mix) do przygotowania tkanki i ekstrakcji DNA dla każdego ogona; będzie potrzebne 100 µL roztworu do ekstrakcji oraz 25 µL roztworu do przygotowania tkanki. Użyję pipety P 200 i końcówek z filtrem, aby odmierzyć 100 µL roztworu do ekstrakcji oraz 25 µL roztworu do przygotowania tkanki do nowej probówki typu Eppendorf. Mieszaninę główną należy wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół.Następnie należy dodać 125 µL master mixu do próbki badanego obiektu, upewniając się, że w przypadku ogona dorosłej myszy odcięty koniec jest całkowicie zanurzony w roztworze master mixu; można go wymieszać poprzez delikatne potrząsanie palcem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Podczas 10-minutowej inkubacji przygotuję preferowany zielony master mix, który składa się z zielonego master mixu do powszechnego użycia dołączonego do zestawu, wody Milli-Q lub wody klasy PCR oraz naszych starterów przedniej i odwrotnej sekwencji. To wszystko.Po zakończeniu 10 minutowej inkubacji należy podgrzać i aktywować reakcję w temperaturze 95°C przez trzy minuty. Po upływie trzech minut inaktywacji dodajemy do każdej reakcji 100 µL dołączonego do zestawu roztworu neutralizującego, a następnie mieszamy próbki za pomocą wirówka wortexowej. Po dodaniu buforu neutralizującego próbki DNA można przechowywać w temperaturze 4°C do momentu ich wykorzystania.Chcemy otrzymać genotyp niezwłocznie, dlatego przechodzimy bezpośrednio do qPCR; moje próbki z ogonów zostały zneutralizowane i są gotowe. Master mix PCR z barwnikiem Cyber Green jest przygotowany, a probówki PCR znajdują się w bloku chłodzącym.Teraz dodam 16 µL master mixu do każdego dołka, a następnie dodam 4 µL zneutralizowanego ekstraktu lub 4 µL kontroli pozytywnej bądź negatywnej do każdego z nich. Do każdego dołka dodaję zatem 16 µL master mixu. Następnie do 16 µL master mixu w dołku dodam 4 µL zneutralizowanego ekstraktu, tak aby całkowita objętość reakcji wyniosła 20 µL.To samo wykonam dla kontroli pozytywnej i negatywnej. Dodam 4 µL do 16 µL master mixu PPR. Po dodaniu wszystkich składników probówki można zamknąć optycznie przejrzystym paskiem ośmiu zakrętek.Należy uważać, aby nie dotykać optycznie przezroczystej części nakrętek znajdujących się nad próbkami. Dlatego używam chusteczki Kimwipe, aby docisnąć nakrętki i upewnić się, że są szczelnie zamknięte. Delikatnie wymieszałem w wirówce PCR i mieszankę DNA, a następnie odwirowałem je na dno probówek; teraz jesteśmy gotowi, aby umieścić je w urządzeniu do qPCR.W pierwszej kolejności umieścimy próbki w urządzeniu do PCR Opticon i skonfiguruję nowy układ płytki, w którym pierwsza studnia będzie zawierać próbkę, druga studnia kontrolę pozytywną, a trzecia studnię kontrolę negatywną; należy określić, że całkowita objętość reakcji wynosi 20 µL. Następnie załaduję protokół zaprojektowany do szybkiego genotypowania.Protokół ten obejmuje trzy minutowy etap denaturacji, a następnie cykl składający się z 15 sekund denaturacji, 15 sekund pierwszego przyłączania oraz 20 sekund pierwszej elongacji. Czas pierwszej elongacji może zostać skrócony do około 10 sekund, co zredukuje całkowity czas cyklu do 40 sekund. Te trzy etapy są powtarzane w około 40 cyklach, analogicznie do standardowej reakcji PCR, a na koniec przeprowadzana jest analiza krzywej topnienia.Płytka jest przygotowana, a protokół został załadowany. Teraz musimy jedynie uruchomić qPCR, który rozpoczyna się od trzyminutowej denaturacji. Z mojego doświadczenia wynika, że przy użyciu stosowanych przeze mnie starterów oraz próbek z ogonów, poszukując genów, których dotyczy moja analiza, próbki dodatnie zaczną pojawiać się około 25 cyklu, przekraczając istotny próg cyklu (Ct).Moment przekroczenia progu jest w dużym stopniu zależny od próbki tkanki, poszukiwanego celu oraz początkowej ilości obecnego DNA. Możemy już zauważyć, że kontrola pozytywna zareagowała, a nasza próbka również wydaje się być pozytywna. Jak widać, sygnał zaczyna narastać nieco później niż w przypadku kontroli pozytywnej.Nadal musimy poczekać, ponieważ osiągnięto dopiero 27 cykli, ale miejmy nadzieję, że za kilka kolejnych cykli będziemy mogli mieć pewność, że nasza próbka jest dodatnia, i wtedy będę mógł kontynuować eksperyment. W tym momencie widać, że kontrola negatywna właśnie zaczyna rosnąć, co wynika z faktu, że użyłem nadmiaru ogona. Pozwala to mieć pewność, że wszystko, co pojawi się przed tym nadmiarowym ujemnym ogonem, będzie wynikiem dodatnim.Zatem na tym etapie wszystko, co pojawi się przed próbką negatywną, uznałbym za wynik pozytywny i kontynuował eksperyment. Po zakończeniu cykli PCR urządzenie przeprowadza analizę krzywej topnienia. Pomoże to określić skład oraz czystość otrzymanego produktu.Dzięki temu można stwierdzić, czy próbki dodatnie i ujemne zostały wybrane prawidłowo. Na przykład próbka dodatnia będzie charakteryzować się specyficznym, ostrym pikiem temperatury topnienia, który odpowiada amplifikacji konkretnego produktu PCR. Wszelkie próbki ujemne będą wykazywać nieswoisty, szeroki pik temperatury topnienia, odpowiadający nieswoistemu DNA, który uległ amplifikacji podczas reakcji PCR.Właśnie zaprezentowałem sposób wykorzystania zestawu do ekstrakcji Cyber Green firmy Sigma do szybkiego genotypowania ogonów dorosłych myszy. Zestaw ten można jednak stosować do różnych tkanek zwierzęcych, włosów, śliny, a ja wykorzystuję go do genotypowania embrionalnych ogonów myszy. Wybieramy ten zestaw ze względu na szybkość przeprowadzania analizy.Wynik mojego genotypu mogę otrzymać już w ciągu godziny, co jest bardzo wygodne i proste. Dziękuję za oglądanie i powodzenia.

rapid-genotyping-mouse-tissue-using-sigma-s-extract-n-amp-tissue-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybkie genotypowanie tkanek myszy przy użyciu zestawu Extract-N-Amp Tissue PCR firmy Sigma

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do identyfikacji oddziaływań czynników przy genach specyficznych tkankowo podczas lub po rozpoczęciu ekspresji genów specyficznych tkankowo w tkance embrionalnej myszy. Protokół ten powinien znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad aktywacją genów specyficznych tkankowo zachodzącą podczas prawidłowego rozwoju embrionalnego.

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

Profilowanie ekspresji pojedynczych komórek umożliwia szczegółową analizę ekspresji genów w poszczególnych komórkach. Opisujemy metody izolacji kardiomiocytów oraz przygotowania otrzymanych lizatów do analizy całego transkryptomu za pomocą mikromacierzy lub qPCR specyficznych celów.

Profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłej myszy

Przedstawiona tutaj metoda Direct PCR umożliwia amplifikację PCR bezpośrednio z niewielkich ilości nieoczyszczonych tkanek roślinnych i zwierzęcych.

Genotypowanie próbek roślinnych i zwierzęcych bez uprzedniego oczyszczania DNA

Opisujemy procedury znakowania i genotypowania nowonarodzonych myszy oraz generowania z nich pierwotnych kultur neuronalnych. Genotypowanie jest szybkie, wydajne i niezawodne oraz pozwala na automatyczną ekstrakcję kwasów nukleinowych. Jest to szczególnie przydatne w przypadku myszy ze śmiertelnością noworodków i ich hodowli, które wymagają wcześniejszego zakończenia genotypowania.

Szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych

Ten protokół opisuje kluczowe kroki i środki ostrożności wymagane do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w pojedynczej komórce po patch-clamp. Technika ta jest prostą i skuteczną metodą analizy profilu ekspresji z góry określonego zestawu genów z pojedynczej komórki, charakteryzującego się zapisami patch-clamp.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

Tutaj prezentujemy protokół eCLIP do określania głównych celów RNA kandydatów na RBP w jądrach.

Metoda ulepszonego sieciowania immunoprecypitacyjnego (eCLIP) do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

Obecny protokół opisuje pojedynczą mutację M213L w Gja1, która zachowuje pełną generację Connexin43, ale uniemożliwia translację mniejszej wewnętrznie translowanej izoformy GJA1-20k.

Usunięcie wewnętrznego translacyjnego miejsca startowego z mRNA przy zachowaniu ekspresji białka o pełnej długości

Efektywność metody Improved Genome Editing za pomocą dostarczania kwasów nukleinowych w jajowódku (I-GONAD) jest porównywalna z tradycyjną mikroiniekcją, która wymaga pobrania zygot od samic dawców i przekazania ich do kobiet pseudo-ciężarnych. Protokół ten wykazuje swoją skuteczność, wprowadzając mutacje indukowane przez CRISPR/Cas9 do locus ROSA26 na chromosomie 6.

Ulepszona edycja genomu za pomocą techniki dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych oparta na elektroporacji in vivo dla generowania myszy knockout

Poznaj szybką metodę genotypowania tkanek myszy przy użyciu zestawu Extract-N-Amp Tissue PCR z detekcją SYBR Green. Protokół umożliwia uzyskanie wyników w około półtorej godziny.

Szybkie genotypowanie tkanek mysich z wykorzystaniem zestawu Sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Przeglądaj więcej filmów