Szybkie genotypowanie tkanek mysich z wykorzystaniem zestawu Sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Witam, nazywam się Linda i pracuję w laboratorium dr. Edwina Nikiego na University of California Irvine. Dzisiaj pokażę Państwu, jak wykorzystuję zestaw Sigma's Cygreen Extracting Tissue PCR do szybkiego genotypowania myszy transgenicznych. Zazwyczaj używam tego zestawu do genotypowania myszy w stadium embrionalnym podczas przygotowywania ostrych kultur komórek dysocjowanych, gdy muszę w krótkim czasie ustalić genotyp danej myszy.

Jednak na potrzeby dzisiejszego pokazu wykorzystamy ogony dorosłych myszy, aby zaprezentować sposób użycia tego zestawu. Protokół ten obejmuje szybką trawienie alkaliczne i ekstrakcję DNA, a następnie szybki etap neutralizacji. Wyekstrahowane DNA wykorzystujemy w reakcji real-time PCR, w której możemy monitorować nasze amplikony PCR.

Jeśli są Państwo gotowi, zacznijmy. Przed rozpoczęciem pracy należy upewnić się, że blok grzejny jest ustawiony na 95 °C, barwnik Sybr Green jest rozmrożony i przechowywany w lodzie do momentu użycia, a pozostałe odczynniki rozmrażają się w temperaturze pokojowej. W moim pojemniku z lodem znajdują się dwa primery, których użyjemy do genotypowania; zostały one zaprojektowane specjalnie dla badanego genu i zwalidowane do qPCR.

Posiadam również kontrolę pozytywną dla badanego genu, kontrolę negatywną oraz próbkę tkanki pobraną wcześniej od dorosłej myszy. Podczas pobierania próbek tkanki niezwykle ważne jest zachowanie rygorystycznych zasad. Pobierając ogony embrionów myszy, zawsze płuczemy pęsetę 70% ethanol przed rozpoczęciem oraz przed każdym kolejnym pobraniem tkanki.

Próbki ogonów zawsze najpierw płuczemy w TBS. Następnie należy przygotować mieszaninę główną (master mix) do przygotowania tkanki i ekstrakcji DNA dla każdego ogona; będzie potrzebne 100 µL roztworu do ekstrakcji oraz 25 µL roztworu do przygotowania tkanki. Użyję pipety P 200 i końcówek z filtrem, aby odmierzyć 100 µL roztworu do ekstrakcji oraz 25 µL roztworu do przygotowania tkanki do nowej probówki typu Eppendorf. Mieszaninę główną należy wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół.

Następnie należy dodać 125 µL master mixu do próbki badanego obiektu, upewniając się, że w przypadku ogona dorosłej myszy odcięty koniec jest całkowicie zanurzony w roztworze master mixu; można go wymieszać poprzez delikatne potrząsanie palcem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Podczas 10-minutowej inkubacji przygotuję preferowany zielony master mix, który składa się z zielonego master mixu do powszechnego użycia dołączonego do zestawu, wody Milli-Q lub wody klasy PCR oraz naszych starterów przedniej i odwrotnej sekwencji. To wszystko.

Po zakończeniu 10 minutowej inkubacji należy podgrzać i aktywować reakcję w temperaturze 95°C przez trzy minuty. Po upływie trzech minut inaktywacji dodajemy do każdej reakcji 100 µL dołączonego do zestawu roztworu neutralizującego, a następnie mieszamy próbki za pomocą wirówka wortexowej. Po dodaniu buforu neutralizującego próbki DNA można przechowywać w temperaturze 4°C do momentu ich wykorzystania.

Chcemy otrzymać genotyp niezwłocznie, dlatego przechodzimy bezpośrednio do qPCR; moje próbki z ogonów zostały zneutralizowane i są gotowe. Master mix PCR z barwnikiem Cyber Green jest przygotowany, a probówki PCR znajdują się w bloku chłodzącym.

Teraz dodam 16 µL master mixu do każdego dołka, a następnie dodam 4 µL zneutralizowanego ekstraktu lub 4 µL kontroli pozytywnej bądź negatywnej do każdego z nich. Do każdego dołka dodaję zatem 16 µL master mixu. Następnie do 16 µL master mixu w dołku dodam 4 µL zneutralizowanego ekstraktu, tak aby całkowita objętość reakcji wyniosła 20 µL.

To samo wykonam dla kontroli pozytywnej i negatywnej. Dodam 4 µL do 16 µL master mixu PPR. Po dodaniu wszystkich składników probówki można zamknąć optycznie przejrzystym paskiem ośmiu zakrętek.

Należy uważać, aby nie dotykać optycznie przezroczystej części nakrętek znajdujących się nad próbkami. Dlatego używam chusteczki Kimwipe, aby docisnąć nakrętki i upewnić się, że są szczelnie zamknięte. Delikatnie wymieszałem w wirówce PCR i mieszankę DNA, a następnie odwirowałem je na dno probówek; teraz jesteśmy gotowi, aby umieścić je w urządzeniu do qPCR.

W pierwszej kolejności umieścimy próbki w urządzeniu do PCR Opticon i skonfiguruję nowy układ płytki, w którym pierwsza studnia będzie zawierać próbkę, druga studnia kontrolę pozytywną, a trzecia studnię kontrolę negatywną; należy określić, że całkowita objętość reakcji wynosi 20 µL. Następnie załaduję protokół zaprojektowany do szybkiego genotypowania.

Protokół ten obejmuje trzy minutowy etap denaturacji, a następnie cykl składający się z 15 sekund denaturacji, 15 sekund pierwszego przyłączania oraz 20 sekund pierwszej elongacji. Czas pierwszej elongacji może zostać skrócony do około 10 sekund, co zredukuje całkowity czas cyklu do 40 sekund. Te trzy etapy są powtarzane w około 40 cyklach, analogicznie do standardowej reakcji PCR, a na koniec przeprowadzana jest analiza krzywej topnienia.

Płytka jest przygotowana, a protokół został załadowany. Teraz musimy jedynie uruchomić qPCR, który rozpoczyna się od trzyminutowej denaturacji. Z mojego doświadczenia wynika, że przy użyciu stosowanych przeze mnie starterów oraz próbek z ogonów, poszukując genów, których dotyczy moja analiza, próbki dodatnie zaczną pojawiać się około 25 cyklu, przekraczając istotny próg cyklu (Ct).

Moment przekroczenia progu jest w dużym stopniu zależny od próbki tkanki, poszukiwanego celu oraz początkowej ilości obecnego DNA. Możemy już zauważyć, że kontrola pozytywna zareagowała, a nasza próbka również wydaje się być pozytywna. Jak widać, sygnał zaczyna narastać nieco później niż w przypadku kontroli pozytywnej.

Nadal musimy poczekać, ponieważ osiągnięto dopiero 27 cykli, ale miejmy nadzieję, że za kilka kolejnych cykli będziemy mogli mieć pewność, że nasza próbka jest dodatnia, i wtedy będę mógł kontynuować eksperyment. W tym momencie widać, że kontrola negatywna właśnie zaczyna rosnąć, co wynika z faktu, że użyłem nadmiaru ogona. Pozwala to mieć pewność, że wszystko, co pojawi się przed tym nadmiarowym ujemnym ogonem, będzie wynikiem dodatnim.

Zatem na tym etapie wszystko, co pojawi się przed próbką negatywną, uznałbym za wynik pozytywny i kontynuował eksperyment. Po zakończeniu cykli PCR urządzenie przeprowadza analizę krzywej topnienia. Pomoże to określić skład oraz czystość otrzymanego produktu.

Dzięki temu można stwierdzić, czy próbki dodatnie i ujemne zostały wybrane prawidłowo. Na przykład próbka dodatnia będzie charakteryzować się specyficznym, ostrym pikiem temperatury topnienia, który odpowiada amplifikacji konkretnego produktu PCR. Wszelkie próbki ujemne będą wykazywać nieswoisty, szeroki pik temperatury topnienia, odpowiadający nieswoistemu DNA, który uległ amplifikacji podczas reakcji PCR.

Właśnie zaprezentowałem sposób wykorzystania zestawu do ekstrakcji Cyber Green firmy Sigma do szybkiego genotypowania ogonów dorosłych myszy. Zestaw ten można jednak stosować do różnych tkanek zwierzęcych, włosów, śliny, a ja wykorzystuję go do genotypowania embrionalnych ogonów myszy. Wybieramy ten zestaw ze względu na szybkość przeprowadzania analizy.

Wynik mojego genotypu mogę otrzymać już w ciągu godziny, co jest bardzo wygodne i proste. Dziękuję za oglądanie i powodzenia.