Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Oddzielenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od płynów, takich jak pożywki do hodowli komórkowych, może pozwolić naukowcom scharakteryzować ładunek pęcherzykowy i zbadać ich mechanizmy komunikacji wewnątrzkomórkowej. Technika ta pozwala na wystarczające oddzielenie EV i białek zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych, co jest proste i przyjazne dla użytkownika. Na początek umieść PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Obserwować kolby do hodowli komórkowych pod mikroskopem złożonym z soczewką obiektywową 10 x i 100 x obserwować kolby kontrolne i kolby do hodowli komórkowej poddane działaniu tunikamycyny. Zanotuj wszelkie różnice między kolbami. Usunąć pożywkę z kolby i umieścić ją w probówce o pojemności 50 mililitrów.

Następnie odwirować probówkę o sile 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść nadosad do nowej probówki. Odwirować probówkę o stężeniu 2000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś super natant do nowej probówki i umieść probówkę na lodzie.

Weź cztery 15-mililitrowe i trzy kilodaltony odcinające ultra filtracyjne jednostki i dodaj pięć mililitrów PBS do każdej probówki. Zalać filtry, odwirowując je w temperaturze 4 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu PBS z jednostek, podziel supernatant z warunków kontrolnych i uzdatnionych na dwie jednostki ultrafiltracji, z których każda zawiera około 12,5 mililitra pożywki w każdej.

Odwirować probówki o stężeniu 4 000 G przez jedną godzinę i 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub do momentu, gdy skoncentrowane podłoże lub retentat w każdej jednostce zostanie zagęszczony do 250 mikrolitrów lub mniej. Przenieś retentat z obu jednostek kontrolnych do oznakowanej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra, a następnie z jednostek poddanych działaniu substancji do innej probówki. Zmierzyć całkowitą objętość retentatu w każdej probówce do mikrowirówki.

Jeśli objętość jest mniejsza niż 500 mikrolitrów, dodaj 0,22 mikrona przefiltrowanego PBS, aż ostateczna objętość wyniesie 500 mikrolitrów. Umieść probówki w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Włącz automatyczny kolektor frakcji lub AFC.

Usuń kolumnę z czterech stopni Celsjusza i pozwól jej rozgrzać się do temperatury pokojowej. Wyjmij próbki retentatu z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i umieść je na lodzie do rozmrożenia, czekając, ustaw osiem oznaczonych 1,5 mililitrowych probówek w karuzeli AFC z pokrywkami skierowanymi do wewnątrz. Włóż kolumnę do AFC z kodem kreskowym skierowanym w stronę czytnika i dostosuj ustawienia, aby zebrać osiem frakcji po 500 mikrolitrów każda i głośność bufora do domyślnych.

Następnie sprawdź instrukcje wyświetlane na ekranie, aby rozpocząć zbieranie. Po przechowywaniu bufor jest całkowicie wchłonięty przez górną część matrycy kolumny. Rozpocznij płukanie kolumny, dodając do niej 15 mililitrów PBS.

Nie należy dodawać PBS zbyt wcześnie, ponieważ spowoduje to rozcieńczenie bufora pamięci masowej i uniemożliwi odpowiednie spłukiwanie. Tuż przed wchłonięciem wszystkich 15 mililitrów PBS przez matrycę, kliknij w porządku, aby zatrzymać spłukiwanie i usunąć wszelkie resztki PBS z górnej części matrycy kolumny za pomocą mikropipety. Nie dotykaj matrycy.

Dodaj 500 mikrolitrów próbki do środka kolumny i kliknij OK, aby rozpocząć bieg. Po całkowitym wchłonięciu próbki przez matrycę natychmiast dodaj osiem mililitrów PBS do kolumny. AFC automatycznie rozprasza pustą objętość do środka karuzeli przed zebraniem wszystkich ośmiu frakcji po 500 mikrolitrów każda.

Po biegu usuń frakcje z karuzeli i umieść je na lodzie. Następnie usuń pustą objętość ze środka karuzeli. Następnie dodaj 10 mililitrów PBS do kolumny, aby zmyć pozostałą próbkę z kolumny.

A gdy skruszona próbka zostanie całkowicie przepłukana, dodaj 15 mililitrów PBS do kolumny. Ponieważ końcowy PBS jest wchłaniany przez matrycę, dodaj 500 mikrolitrów 0,5 molowego wodorotlenku sodu do środka matrycy kolumny. Następnie, gdy wodorotlenek sodu zostanie wchłonięty, dodaj 30 mililitrów PBS do kolumny i pozwól mu przepłukać.

Po zakończeniu ze wszystkimi próbkami zachowaj kolumnę do późniejszego wykorzystania, dodając 15 mililitrów 0,05% azydku sodu do kolumny. Pozostaw około pięciu mililitrów azydku sodu na wierzchu matrycy kolumny. Wyjmij kolumnę z AFC i załóż górną i dolną zaślepkę przed umieszczeniem kolumny w temperaturze czterech stopni Celsjusza do przechowywania.

Zbuduj jednostkę ultrafiltracji. Uzyskaj dwie mililitry, trzy kilodaltonowe jednostki ultrafiltracji odcięcia na próbkę. Każda jednostka składa się z trzech części, stożka, filtra i przepływu przez cylinder.

Odpowiednio oznacz każdą część. Dodaj jeden mililitr PBS do porcji filtra i przykryj stożkiem. Odwirować stożek jednostki ultrafiltracji do góry przy sile 3 500 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć przefiltrowany PBS z cylindra przepływowego.

Odwróć jednostkę ultrafiltracji do góry nogami i wiruj przez dwie minuty w temperaturze 1000 G w czterech stopniach Celsjusza, aby usunąć pozostały PBS. Połącz cztery 500 mikrolitrów każdej frakcji i dodaj je do jednostki ultrafiltracji. Następnie kolumny wirówkowe zbiegają się na godzinę, 45 minut w temperaturze 3, 500 G w czterech stopniach Celsjusza lub do momentu, gdy poziom retentatu osiągnie 100 mikrolitrów.

Usuń przepływ przez cylinder i wyrzuć przepływ. Odwróć jednostkę ultrafiltracji do góry nogami i odwiruj przez dwie minuty w temperaturze 1000 XG w czterech stopniach Celsjusza. Przenieś retentat w stożku do probówki o pojemności 1,5 mililitra i zwiększ objętość próbki do 150 mikrolitrów za pomocą przefiltrowanego PBS o grubości 0,22 mikrona przed umieszczeniem probówek w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Reprezentatywny zachodni blok poszczególnych frakcji wykazywał silną ekspresję CD9, CD63 i CD81. Wykroczenia od pierwszego do czwartego z niewielkim lub zerowym wykroczeniem od pięciu do ośmiu. Nie zaobserwowano ekspresji GM130 ani kalneksyny w żadnej frakcji.

Albumina była obecna tylko we frakcjach od szóstej do ósmej. Oceniono również skuteczność koncentracji frakcji EV i białkowej. Ekspresję CD9 i CD63 obserwowano w lizatach komórkowych.

Wszystkie trzy białka CD były obecne we frakcjach EV próbek kontrolnych i próbek traktowanych tunikamycyną, ale nie we frakcjach białkowych. Gen podatności guza 101 był obecny w lizatach komórkowych, ale nie we frakcjach EV ani białkowych. GM130 i kalneksynę obserwowano tylko w lizatach komórkowych.

W western blot pożywki do hodowli komórkowych zubożonych w egzosomy markery EV były obecne w lizatach komórkowych, ale nie w próbkach pożywki. Ekspresję albumin obserwowano we frakcjach białkowych i minimalną ekspresję w lizatach komórkowych. Obserwacje TEM wykazały kuliste struktury we frakcjach EV próbek kontrolnych i próbek traktowanych tunikamicyną.

Struktur tych nie zaobserwowano w żadnej z frakcji białkowych typu próbki. Analiza śledzenia nanocząstek ujawnia różnice w stężeniach cząstek frakcji kontrolnej i traktowanej we frakcjach EV w porównaniu z kontrolą, nieco więcej cząstek było obecnych w leczeniu tunikamycyną. Jednak we frakcjach białkowych wykryto mniej cząstek w stosunku do EV.

Ważne jest, aby mieć taką samą objętość próbki dla warunków kontrolnych i leczonych, co pozwala na łatwe porównanie EV z różnych zabiegów. Po oddzieleniu EV od pożywki do hodowli komórkowej możemy scharakteryzować zawartość białka, RNA i lipidów w pęcherzykach za pomocą proteomiki, sekwencjonowania RNA i lipidomiki.