Name: Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj metodę chromatografii wykluczającej wielkość do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z kondycjonowanych pożywek. Technika ta umożliwia skuteczną separację EV i analizę ich ładunku molekularnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Penn State Behrend i Hamot Health Foundation za finansowanie, a także Penn State Microscopy Facility w University Park, PA.

<ol><li>Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+externalization+of+the+transferrin+receptor+in+vesicular+form+in+sheep+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).</li>
<li>Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+transferrin+and+recycling+of+the+transferrin+receptor+in+rat+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Rontogianni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+allows+for+human+breast+cancer+subtyping%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping.</a> Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).</li>
<li>Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+circulating+cancer+biomarkers%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14(2018).</li>
<li>Thompson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+neurodegenerative+disease-pathogenesis+to+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).</li>
<li>O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake%2C+functionality%2C+and+re-release+of+extracellular+vesicle-encapsulated+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo.</a> Cell Reports. 39 (2), 110651(2022).</li>
<li>Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+extracellular+vesicles+and+release+of+their+cargo+from+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).</li>
<li>Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+heterogeneity%3A+Subpopulations%2C+isolation+techniques%2C+and+diverse+functions+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 738(2018).</li>
<li>Tzaridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+separation+techniques+impact+results+from+human+blood+samples%3A+Considerations+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211(2021).</li>
<li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> Journal of Chromatography A. 1636, 461773(2021).</li>
<li>Gámez-Valero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography-based+isolation+minimally+alters+extracellular+vesicles%27+characteristics+compared+to+precipitating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li>
<li>Campos-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+detection+of+extracellular+vesicles+immune-captured+from+urine+by+conventional+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2042(2019).</li>
<li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1CAM+is+not+associated+with+extracellular+vesicles+in+human+cerebrospinal+fluid+or+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma.</a> Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Mathieu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+exosome+versus+small+ectosome+secretion+revealed+by+live+intracellular+tracking+of+CD63+and+CD9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+simplified+dichotomic+size-exclusion+chromatography+for+isolating+extracellular+vesicles+toward+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145(2021).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).</li>
<li>Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+macromolecular+complexes+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3239(2007).</li>
<li>Williams, R. L., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+shape+of+the+ESCRT+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The emerging shape of the ESCRT machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).</li>
<li>Willms, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+release+subpopulations+of+exosomes+with+distinct+molecular+and+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).</li>
<li>Böing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
<li>Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three+step+protocol+to+isolate+extracellular+vesicles+from+plasma+or+cell+culture+medium+with+both+high+yield+and+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450(2020).</li>
<li>Guerreiro, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+extracellular+vesicle+isolation+by+combining+cell+media+modifications%2C+ultrafiltration%2C+and+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography.</a> PLoS ONE. 13 (9), 02024276(2018).</li>
<li>Onódi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-purity+extracellular+vesicles+by+the+combination+of+iodixanol+density+gradient+ultracentrifugation+and+bind-elute+chromatography+from+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1479(2018).</li>
<li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

SEC to przyjazna dla użytkownika metoda odpowiedniego oddzielania pojazdów elektrycznych od kondycjonowanego CCM. W celu specyficznego wyizolowania EV pochodzących z komórek należy wziąć pod uwagę staranne rozważenie rodzaju CCM i jego dodatków. Wiele pożywek do hodowli komórkowych musi być uzupełnionych FBS, który zawiera EV pochodzące od zwierzęcia, u którego zebrano surowicę. Te EV w surowicy mogą nasycać i maskować każdy sygnał wytwarzany przez EV pochodzące z komórek w hodowli26. W związku z ...

Eksplozji zainteresowania badaniem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) towarzyszył znaczny postęp w technologiach i technikach używanych do separacji i badania tych nano-rozmiarowych, heterogenicznych cząstek. W czasie, który upłynął od ich odkrycia prawie cztery dekady temu1,2, odkryto, że te małe błoniaste struktury zawierają bioaktywne lipidy, kwasy nukleinowe i białka i odgrywają główną rolę w komunikacji międzykomórkowej3,4. EV są uwalniane ze wszystkich typów komórek i dlatego są obecne we wszystkich płynach biologicznych, w tym w osoczu krwi i surowicy, ślinie i moczu. EV w tych płynach są bardzo obiecujące, aby służyć jako nieinwazyjne biomarkery różnych chorób, w tym chorób neurozapalnych i neurodegeneracyjnych, nowotworów i zaburzeń autoimmunologicznych5,6,7. Co więcej, badania mechanistyczne in vitro można przeprowadzić za pomocą technik hodowli komórkowych poprzez oddzielenie EV uwolnionych do pożywki hodowlanej3,8,9.
Aby zrozumieć rolę EV w patofizjologii choroby, niezbędne jest odpowiednie oddzielenie od płynu, w którym się znajdują. Złotym standardem separacji EV od dawna jest ultrawirowanie różnicowe (dUC)10, jednak pojawiły się bardziej wyrafinowane techniki w celu osiągnięcia lepszej separacji EV od innych składników zewnątrzkomórkowych. Niektóre z tych technik obejmują gradienty gęstości, frakcję przepływu pola asymetrycznego przepływu (A4F), cytometrię przepływu, wychwytywanie immunologiczne, wytrącanie glikolu polietylenowego i chromatografię wykluczania wielkości (SEC)11,12,13. Każda technika ma swój własny zestaw zalet i wad; Wykazano jednak, że SEC dość skutecznie oddziela EV zarówno od płynów biologicznych, jak i supernatantów z hodowli komórkowych8,14,15. SEC ma również dodatkową zaletę polegającą na tym, że jest stosunkowo prosty i przyjazny dla użytkownika.
SEC to metoda, która rozdziela składniki płynu na podstawie rozmiaru. Dzięki tej technice do frakcjonowania próbki używa się kolumny żywicy (wyprodukowanej we własnym zakresie lub zakupionej komercyjnie). Małe cząstki w próbce zostają uwięzione między kulkami w żywicy, podczas gdy większe cząstki są w stanie swobodniej przechodzić przez żywicę, a tym samym eluować się na wcześniejszym etapie procesu. Ponieważ EV są większe niż wiele białek zewnątrzkomórkowych i agregatów białkowych, EV przechodzą przez kolumnę szybciej i eluują we wcześniejszych frakcjach niż białka zewnątrzkomórkowe14.
W tym artykule o metodach przedstawiono użycie SEC do separacji EV od pożywek do hodowli komórkowych (CCM) od ludzkich oligodendrocytów zarówno w warunkach kontrolnych, jak i stresu retikulum endoplazmatycznego (ER). Korzystając z tego protokołu, wykazano, że EV oddzielone tą techniką znajdują się w określonych frakcjach, które można połączyć i skoncentrować w celu dalszej charakterystyki, oraz że oddzielone EV pochodzą z komórek, a nie z egzogennego źródła, takiego jak płodowa surowica bydlęca (FBS) stosowana do uzupełnienia CCM. Obecność kanonicznych markerów EV, CD63, CD81 i CD916,17,18,19 we frakcjach EV, a ich brak we frakcjach białkowych jest wykazywany za pomocą western blotting. Za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) EV są wizualizowane i wyświetlają oczekiwaną morfologię i są obserwowane tylko we frakcji EV. Cząstki są również liczone we frakcjach EV i białkowych zarówno w warunkach stresu kontrolnego, jak i ER, a w próbkach EV obserwuje się dużą liczbę cząstek w oczekiwanym zakresie wielkości 50-200 nm średnicy. Łącznie dane te potwierdzają pogląd, że SEC jest wydajną i skuteczną metodą oddzielania EV od pożywek do hodowli komórkowych.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>VWR</td><td>97064-588</td><td></td></tr><tr><td>4X Laemmli Bufor do próbek</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15, Ultracel, 3 KDa, 15mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC900308</td><td>odcięcie 3 kDa</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-2 z membraną Ultracel-3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC200324</td><td>3 kDa odcięcie</td></tr><tr><td>Amon Nadsiarczan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>Anty królik IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężona z HRP</td><td></td><td>7074V</td><td>1:1000 Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-kalnexinowe</td><td>Abcam</td><td>&nbsp; ab22595</td><td>1:500 Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-CD9</td><td>BioLegend</td><td>312102</td><td>1:500 Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>przeciwciała anty-GM130 [EP892Y] - Marker cis-Golgiego</td><td>Abcam</td><td>ab52649</td><td>1:500 Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Anty-mysie IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężonych z HRP</td><td></td><td>7076V</td><td>1:1000 Rozcieńczony</td></tr><tr><td>automatyczny kolektor frakcji</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do testów BCA</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Gatan Orius SC200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cd63 Mysz anty ludzka</td><td>556019 BD</td> 1<td></td><td>:1000 Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>CD81 Przeciwciało</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23962</td><td>1:1000 Rozcieńczanie</td></tr><tr><td>Cellstar Filter Cap Kolby do hodowli komórkowych</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Imager</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>BioRad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>deoksycholan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-10G</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol</td><td>Sigma</td><td>3483-12-3</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Wysoka glukoza z L-glutaminą; bez sodu</td><td>Cytiva</td><td>SH300022. </td><td></td>FS</tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca Klasa premium</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, zubożona w egzosomy</td><td>Thermo Scientific</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>BioRad</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>Świetna wartość Beztłuszczowe mleko w proszku</td><td>Amazon</td><td>B076NRD2TZ</td><td></td></tr><tr><td>HOG Ludzka linia komórkowa oligodendroglioma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC163</td><td></td></tr><tr><td>Izon Science Usa Ltd qev Rozmiar Kolumny wykluczające 5pk</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol >99,8% ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Płytki szklane</td><td>BioRad</td><td>1653310</td><td>z przekładkami 0,75 mm</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Krótkie płytki</td><td>BioRad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>soli fizjologicznej buforowanej fosforanami PBS</td><td>Fisher Scientific BP66150</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce Zestawy do oznaczania białek BCA i odczynniki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Membrany transferowe Pierce PVDF</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Pierce Western Blotting</td><td>Thermo Scientific</td><td>84783</td><td></td></tr><tr><td>Polioksyetylen-20 (TWEEN 20), 500 ml</td><td>Bio Basic</td><td>TB0560</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy/fosfatazy (100X)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>5872S</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane przeciwciało anty-TSG101 [EPR7130(B)]</td><td>ABCam</td><td>ab125011</td><td>1:1000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Wodorotlenek slodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SX0603</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu,&ge; 99,0% (GC), bezpyłowe granulki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>TGX Zestaw do usuwania plam z akrylamidu FastCast, 10%</td><td>BioRad</td><td>1610183</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>FEI Tecnai 12 Biotwin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioRad</td><td>1610716</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25% proteaza z trypiną wieprzową, HBSS, EDTA; bez wapnia, magnezu</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Tunicamycin</td><td>Tocris</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Zeta View oprogramowanie</td><td>Analytik</td><td></td><td>NTA</td></tr></tbody></table>

chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to nanowymiarowe struktury związane z błoną lipidową, które są uwalniane ze wszystkich komórek, są obecne we wszystkich płynach biologicznych i zawierają białka, kwasy nukleinowe i lipidy, które odzwierciedlają komórkę macierzystą, z której pochodzą. Właściwe oddzielenie EV od innych składników w próbce pozwala na scharakteryzowanie związanego z nimi ładunku i daje wgląd w ich potencjał jako komunikatorów międzykomórkowych i nieinwazyjnych biomarkerów wielu chorób. W obecnym badaniu EV pochodzące z oligodendrocytów wyizolowano z pożywek do hodowli komórkowych przy użyciu kombinacji najnowocześniejszych technik, w tym ultrafiltracji i chromatografii wykluczania wielkości (SEC) w celu oddzielenia EV od innych białek zewnątrzkomórkowych i kompleksów białkowych. Korzystając z dostępnych na rynku kolumn SEC, EV oddzielono od białek zewnątrzkomórkowych uwalnianych z ludzkich komórek skąpodrzewiaka zarówno w warunkach stresu kontrolnego, jak i retikulum endoplazmatycznego (ER). Kanoniczne markery EV CD9, CD63 i CD81 obserwowano we frakcjach 1-4, ale nie we frakcjach 5-8. GM130, białko aparatu Golgiego, i kalneksyna, integralne białko ER, zostały użyte jako ujemne markery EV i nie zaobserwowano ich w żadnej frakcji. Ponadto, podczas łączenia i koncentracji frakcji 1-4 jako frakcji EV i frakcji 5-8 jako frakcji białkowej, zaobserwowano ekspresję CD63, CD81 i CD9 we frakcji EV. Ekspresji GM130 ani kalneksyny nie zaobserwowano w żadnym z typów frakcji. Zebrane frakcje zarówno z warunków stresu kontrolnego, jak i ER uwidoczniono za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, a pęcherzyki zaobserwowano we frakcjach EV, ale nie we frakcjach białkowych. Cząstki w EV i frakcje białkowe z obu warunków zostały również oznaczone ilościowo za pomocą analizy śledzenia nanocząstek. Łącznie dane te pokazują, że SEC jest skuteczną metodą oddzielania EV od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych.

Western blotting wykazuje odpowiednią separację EV z CCM 
Aby ocenić skuteczność SEC w separowaniu EV od pożywek hodowlanych, wykonano western blot z wykorzystaniem każdej poszczególnej frakcji z próbek kontrolnych w celu zbadania ekspresji trzech kanonicznych markerów EV: CD9, CD63 i CD81, a także GM130 i kalneksyny18, które posłużyły jako kontrole negatywne (Rysunek 3). Zbadano również ekspresję albuminy18, aby upewnić się...

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain ...

Oddzielenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od płynów, takich jak pożywki do hodowli komórkowych, może pozwolić naukowcom scharakteryzować ładunek pęcherzykowy i zbadać ich mechanizmy komunikacji wewnątrzkomórkowej. Technika ta pozwala na wystarczające oddzielenie EV i białek zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych, co jest proste i przyjazne dla użytkownika. Na początek umieść PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Obserwować kolby do hodowli komórkowych pod mikroskopem złożonym z soczewką obiektywową 10 x i 100 x obserwować kolby kontrolne i kolby do hodowli komórkowej poddane działaniu tunikamycyny. Zanotuj wszelkie różnice między kolbami. Usunąć pożywkę z kolby i umieścić ją w probówce o pojemności 50 mililitrów.Następnie odwirować probówkę o sile 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść nadosad do nowej probówki. Odwirować probówkę o stężeniu 2000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś super natant do nowej probówki i umieść probówkę na lodzie.Weź cztery 15-mililitrowe i trzy kilodaltony odcinające ultra filtracyjne jednostki i dodaj pięć mililitrów PBS do każdej probówki. Zalać filtry, odwirowując je w temperaturze 4 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu PBS z jednostek, podziel supernatant z warunków kontrolnych i uzdatnionych na dwie jednostki ultrafiltracji, z których każda zawiera około 12,5 mililitra pożywki w każdej.Odwirować probówki o stężeniu 4 000 G przez jedną godzinę i 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub do momentu, gdy skoncentrowane podłoże lub retentat w każdej jednostce zostanie zagęszczony do 250 mikrolitrów lub mniej. Przenieś retentat z obu jednostek kontrolnych do oznakowanej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra, a następnie z jednostek poddanych działaniu substancji do innej probówki. Zmierzyć całkowitą objętość retentatu w każdej probówce do mikrowirówki.Jeśli objętość jest mniejsza niż 500 mikrolitrów, dodaj 0,22 mikrona przefiltrowanego PBS, aż ostateczna objętość wyniesie 500 mikrolitrów. Umieść probówki w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Włącz automatyczny kolektor frakcji lub AFC.Usuń kolumnę z czterech stopni Celsjusza i pozwól jej rozgrzać się do temperatury pokojowej. Wyjmij próbki retentatu z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i umieść je na lodzie do rozmrożenia, czekając, ustaw osiem oznaczonych 1,5 mililitrowych probówek w karuzeli AFC z pokrywkami skierowanymi do wewnątrz. Włóż kolumnę do AFC z kodem kreskowym skierowanym w stronę czytnika i dostosuj ustawienia, aby zebrać osiem frakcji po 500 mikrolitrów każda i głośność bufora do domyślnych.Następnie sprawdź instrukcje wyświetlane na ekranie, aby rozpocząć zbieranie. Po przechowywaniu bufor jest całkowicie wchłonięty przez górną część matrycy kolumny. Rozpocznij płukanie kolumny, dodając do niej 15 mililitrów PBS.Nie należy dodawać PBS zbyt wcześnie, ponieważ spowoduje to rozcieńczenie bufora pamięci masowej i uniemożliwi odpowiednie spłukiwanie. Tuż przed wchłonięciem wszystkich 15 mililitrów PBS przez matrycę, kliknij w porządku, aby zatrzymać spłukiwanie i usunąć wszelkie resztki PBS z górnej części matrycy kolumny za pomocą mikropipety. Nie dotykaj matrycy.Dodaj 500 mikrolitrów próbki do środka kolumny i kliknij OK, aby rozpocząć bieg. Po całkowitym wchłonięciu próbki przez matrycę natychmiast dodaj osiem mililitrów PBS do kolumny. AFC automatycznie rozprasza pustą objętość do środka karuzeli przed zebraniem wszystkich ośmiu frakcji po 500 mikrolitrów każda.Po biegu usuń frakcje z karuzeli i umieść je na lodzie. Następnie usuń pustą objętość ze środka karuzeli. Następnie dodaj 10 mililitrów PBS do kolumny, aby zmyć pozostałą próbkę z kolumny.A gdy skruszona próbka zostanie całkowicie przepłukana, dodaj 15 mililitrów PBS do kolumny. Ponieważ końcowy PBS jest wchłaniany przez matrycę, dodaj 500 mikrolitrów 0,5 molowego wodorotlenku sodu do środka matrycy kolumny. Następnie, gdy wodorotlenek sodu zostanie wchłonięty, dodaj 30 mililitrów PBS do kolumny i pozwól mu przepłukać.Po zakończeniu ze wszystkimi próbkami zachowaj kolumnę do późniejszego wykorzystania, dodając 15 mililitrów 0,05% azydku sodu do kolumny. Pozostaw około pięciu mililitrów azydku sodu na wierzchu matrycy kolumny. Wyjmij kolumnę z AFC i załóż górną i dolną zaślepkę przed umieszczeniem kolumny w temperaturze czterech stopni Celsjusza do przechowywania.Zbuduj jednostkę ultrafiltracji. Uzyskaj dwie mililitry, trzy kilodaltonowe jednostki ultrafiltracji odcięcia na próbkę. Każda jednostka składa się z trzech części, stożka, filtra i przepływu przez cylinder.Odpowiednio oznacz każdą część. Dodaj jeden mililitr PBS do porcji filtra i przykryj stożkiem. Odwirować stożek jednostki ultrafiltracji do góry przy sile 3 500 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć przefiltrowany PBS z cylindra przepływowego.Odwróć jednostkę ultrafiltracji do góry nogami i wiruj przez dwie minuty w temperaturze 1000 G w czterech stopniach Celsjusza, aby usunąć pozostały PBS. Połącz cztery 500 mikrolitrów każdej frakcji i dodaj je do jednostki ultrafiltracji. Następnie kolumny wirówkowe zbiegają się na godzinę, 45 minut w temperaturze 3, 500 G w czterech stopniach Celsjusza lub do momentu, gdy poziom retentatu osiągnie 100 mikrolitrów.Usuń przepływ przez cylinder i wyrzuć przepływ. Odwróć jednostkę ultrafiltracji do góry nogami i odwiruj przez dwie minuty w temperaturze 1000 XG w czterech stopniach Celsjusza. Przenieś retentat w stożku do probówki o pojemności 1,5 mililitra i zwiększ objętość próbki do 150 mikrolitrów za pomocą przefiltrowanego PBS o grubości 0,22 mikrona przed umieszczeniem probówek w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Reprezentatywny zachodni blok poszczególnych frakcji wykazywał silną ekspresję CD9, CD63 i CD81. Wykroczenia od pierwszego do czwartego z niewielkim lub zerowym wykroczeniem od pięciu do ośmiu. Nie zaobserwowano ekspresji GM130 ani kalneksyny w żadnej frakcji.Albumina była obecna tylko we frakcjach od szóstej do ósmej. Oceniono również skuteczność koncentracji frakcji EV i białkowej. Ekspresję CD9 i CD63 obserwowano w lizatach komórkowych.Wszystkie trzy białka CD były obecne we frakcjach EV próbek kontrolnych i próbek traktowanych tunikamycyną, ale nie we frakcjach białkowych. Gen podatności guza 101 był obecny w lizatach komórkowych, ale nie we frakcjach EV ani białkowych. GM130 i kalneksynę obserwowano tylko w lizatach komórkowych.W western blot pożywki do hodowli komórkowych zubożonych w egzosomy markery EV były obecne w lizatach komórkowych, ale nie w próbkach pożywki. Ekspresję albumin obserwowano we frakcjach białkowych i minimalną ekspresję w lizatach komórkowych. Obserwacje TEM wykazały kuliste struktury we frakcjach EV próbek kontrolnych i próbek traktowanych tunikamicyną.Struktur tych nie zaobserwowano w żadnej z frakcji białkowych typu próbki. Analiza śledzenia nanocząstek ujawnia różnice w stężeniach cząstek frakcji kontrolnej i traktowanej we frakcjach EV w porównaniu z kontrolą, nieco więcej cząstek było obecnych w leczeniu tunikamycyną. Jednak we frakcjach białkowych wykryto mniej cząstek w stosunku do EV.Ważne jest, aby mieć taką samą objętość próbki dla warunków kontrolnych i leczonych, co pozwala na łatwe porównanie EV z różnych zabiegów. Po oddzieleniu EV od pożywki do hodowli komórkowej możemy scharakteryzować zawartość białka, RNA i lipidów w pęcherzykach za pomocą proteomiki, sekwencjonowania RNA i lipidomiki.

size-exclusion-chromatography-for-separating-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Watson, D. C., et al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości z porowatymi kulkami żywicy do izolowania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu kultury bakteryjnej. Większe EV eluują się wcześnie, omijając pory żywicy, podczas gdy mniejsze białka dostają się do porów i wymywają później.

Izolacja bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość 

Ten film opisuje metodę opartą na chromatografii wykluczania wielkości (SEC) do izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV pochodzących z komórek odpornościowych mózgu - mikrogleju. EV działają jak ładunek molekularny, dostarczając mediatory, które regulują odpowiedź immunologiczną. W związku z tym wyizolowane EV mogą być wykorzystane jako model in vitro do badania wzajemnych oddziaływań mikrogleju i neuronów podczas neuronalnej odpowiedzi immunologicznej.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z mikrogleju oparta na SEC: technika izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek hodowlanych kondycjonowanych mikroglejem

Ten film demonstruje metodę oczyszczania opartą na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości w celu wyizolowania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych nadających się do badań charakteryzacyjnych.

Oczyszczanie subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika oczyszczania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą ultrawirowania w gradimencie gęstości

W tym filmie demonstrujemy technikę - chromatografię wykluczania wielkości - do oddzielania heterogenicznej populacji pęcherzyków błony zewnętrznej lub OMV pochodzących od bakterii. Pęcherzyki te są sferycznymi strukturami o rozmiarach nano i są dzielone na duże i małe subpopulacje na podstawie ich wielkości za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.

Chromatografia wykluczania wielkości Separacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych bakterii: technika oddzielania heterogenicznej populacji pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych na podstawie ich wielkości

Ten film demonstruje technikę chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) do oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu hodowlanego Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Technika ta wykorzystuje porowatą kolumnę wypełnioną żywicą w celu uzyskania oczyszczonych frakcji EV. Porowate cząsteczki selektywnie pozwalają mniejszym białkom wnikać do porów, co skutkuje wolniejszą elucją. Jednocześnie pojazdy elektryczne są wykluczone z wnikania do porów ze względu na ich większy...

Technika chromatografii wykluczającej wielkość do oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Ten artykuł przedstawia metody generowania, oczyszczania i ilościowego oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans.

Oczyszczanie i analiza pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans

Pęcherzyki bakteryjne odgrywają ważną rolę w patogenezie i mają obiecujące zastosowania biotechnologiczne. Niejednorodność pęcherzyków komplikuje analizę i użytkowanie; Dlatego konieczna jest prosta, powtarzalna metoda oddzielania pęcherzyków o różnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości do oddzielania heterogenicznych pęcherzyków wytwarzanych przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Ten protokół zawiera szczegółowy opis sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez mezenchymalne komórki zrębu. W szczególności koncentruje się na ustawieniu urządzeń i optymalizacji warunków sortowania. Celem jest sortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu ich cech.

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Poznaj metodę chromatografii wykluczającej wielkość do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z kondycjonowanych pożywek. Technika ta umożliwia skuteczną separację EV i analizę ich ładunku molekularnego.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych (Wideo) | JoVE Journal

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Przeglądaj więcej filmów