Izolacja, ekspansja i różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych z podrzepkowej poduszeczki tłuszczowej stawu kolanowego kozy

Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z podrzepelkowej poduszeczki tłuszczowej, w skrócie IFP-MSC, są stosunkowo mniej zbadanym typem komórek macierzystych. Protokół ten jest prostą, niezawodną i powtarzalną metodą demonstrującą izolację IFP-MSC od stawu kolanowego kóz. Główną zaletą tej techniki jest to, że można uzyskać dużą liczbę wysokiej jakości IFP-MSC.

Izolowane IFP-MSC mogą różnicować się w wiele linii i mają duży potencjał regeneracyjny. Ze względu na swoje anatomiczne położenie, IFP-MSC zyskały zainteresowanie naprawą ubytków chrząstki i łagodzeniem degradacji chrząstki w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Metoda ta ma implikacje dla terapii komórkowej w dziedzinie inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej.

Procedura izolacji, ekspansji i różnicowania IFP-MSC zostanie zademonstrowana przez dr Sugata Hazra i pana Amana Mahajana. Aby rozpocząć izolację mezenchymalnych komórek macierzystych poduszeczki tłuszczowej podrzepki (IFP-MSC), należy pobrać kozie stawy udowo-piszczelowe obejmujące około 15 centymetrów obszarów udowych i piszczelowych kończyn tylnych w wysterylizowanym pudełku na próbki. Próbkę należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu transportu do laboratorium w celu dalszego przetwarzania.

Umieścić próbkę na 150-milimetrowej szalce Petriego i upewnić się, że próbka jest przetwarzana w sposób aseptyczny i w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez cały czas trwania procedury. Dokładnie spłucz go autoklawowanym PBS uzupełnionym antybiotykami. Utrzymuj próbkę uwodnioną za pomocą PBS.

Dokładnie zbadaj obszary anatomiczne próbki. Aby uzyskać łatwy dostęp, całkowicie usuń dodatkowe tkanki z obu kości długich, przytrzymując jedną ręką końcową powierzchnię kości udowej i przecinając ją wzdłużnie w kierunku stawu za pomocą ostrych nożyczek. Następnie, nie naruszając tkanki otaczającej torebkę stawową, należy usunąć mięśnie i tkankę tłuszczową z kości.

Podobnie wykonaj kolejne nacięcie na piszczelowym końcu próbki i usuń mięśnie i tkankę tłuszczową z kości piszczelowej. Upewnij się, że obie kości długie są całkowicie odsłonięte, a torebka stawowa jest widoczna. Następnie wykonaj nacięcie z obu stron błony maziowej, aby rozciąć staw stawowy.

Odetnij rzepkę od błony maziowej i więzadeł rzepki za pomocą świeżych wysterylizowanych nożyczek i kleszczy. Natychmiast umieścić oddzieloną rzepkę na szalce Petriego zawierającej PBS. Z oddzielonej rzepki usuń całą poduszeczkę tłuszczową znajdującą się na wewnętrznej powierzchni za pomocą nożyczek i kleszczyków.

Zbierz go na innej świeżej szalce Petriego i zmiel za pomocą skalpela. Dołącz inne narzędzia chirurgiczne, aby uzyskać małe segmenty tłuszczu o wielkości około dwóch do trzech milimetrów. Za pomocą szpatułki przenieś zmieloną tkankę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i umyj ją trzykrotnie PBS uzupełnionym antybiotykami przez 15 minut w temperaturze pokojowej za pomocą mieszalnika do probówek.

W celu trawienia enzymatycznego inkubuj około pięciu gramów tkanki mielonej w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium lub DMEM firmy Dulbecco, pożywce o niskiej zawartości glukozy zawierającej 1,5 miligrama na mililitr kolagenazy typu II i 2% FBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin. Ostrożnie odessaj strawioną tkankę i przefiltruj ją przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów, aby usunąć wszelkie niestrawione części. Odwirować filtrat w 15-mililitrowej probówce wirówkowej o stężeniu 150 razy g przez pięć minut.

Usunąć supernatant przed dwukrotnym przemyciem osadu komórkowego DMEM o niskiej zawartości glukozy. Ponownie zawiesić osad w kompletnym DMEM, znanym również jako podłoże rozprężne. Zasiaj komórki na 150-milimetrowej szalce Petriego i hoduj je w pożywce ekspandacyjnej uzupełnionej pięcioma nanogramami na mililitr podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów lub BFGF i 50 mikrogramów na mililitr soli trisodowej kwasu 2-fosfo-L-askorbinowego.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla, aby komórki mogły przylegać i namnażać się. Codziennie monitoruj przyczepienie i wzrost komórek. W celu prawidłowej konserwacji i rozbudowy IFP-MSC należy wymieniać nośniki co trzy dni.

Zmieniając pożywkę, dodaj świeże pięć nanogramów na mililitr BFGF i 50 mikrogramów na milimetr soli trisodowej kwasu 2-fosfo-L-askorbinowego bezpośrednio do szalki Petriego. Gdy komórki staną się zlewające się w 80% do 90%, należy je subkulturować, usuwając pożywkę ekspansywną z szalki Petriego i myjąc komórki 1X PBS. Następnie dodaj cztery mililitry 0,25% trypsyny-EDTA do naczynia i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.

Po czterech minutach postukaj w płytkę na boku, aby usunąć komórki. Potwierdź całkowite oderwanie wszystkich komórek pod mikroskopem. Po potwierdzeniu dodaj równą objętość pożywki ekspandowej, aby zneutralizować trypsynę.

Za pomocą pipety zbierz te zdysocjowane komórki w świeżej 15-mililitrowej probówce polipropylenowej i odwiruj je z prędkością 150 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w żądanej objętości pożywki eksplatacyjnej. Policz komórki przy użyciu standardowej metody liczenia komórek i zahoduj je w celu dalszej ekspansji przy gęstości wysiewu 10 000 komórek na centymetr kwadratowy na 150-mililitrowej szalce Petriego.

Do wszystkich testów należy użyć zlewającej się monowarstwy komórek o numerze pasażu od P2 do P5. Gdy rozszerzone komórki osiągną zbieżność od 80% do 90%, oddziel komórki za pomocą roztworu trypsyny-EDTA przed umieszczeniem ich w 15-mililitrowej probówce wirówkowej o wadze 150 razy g przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś osad w osocza koziej o gęstości 2 milionów komórek na 50 mikrolitrów. Dodaj 50 mikrolitrów osocza zawierającego komórki na wysterylizowaną 90-milimetrową szalkę Petriego, a następnie dodaj chlorek wapnia o końcowym stężeniu 0,3%. Dobrze wymieszaj, aby wytworzyć usieciowany hydrożel plazmowy.

Po inkubacji wytworzonego hydrożelu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut, należy przenieść hydrożele na 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych zawierające pożywki chondrogenne. Zmieniaj nośnik co trzy dni przez 14 dni. Hydrożele hodowane w kompletnych pożywkach DMEM bez TGF-beta 1 są uważane za kontrole nieindukowane.

Po 14 dniach chondrogennego różnicowania komórek w hydrożelu osocza, przemyj hydrożele trzykrotnie PBS przez pięć minut każdy i utrwal próbki w obojętnej buforowanej formalinie przez trzy godziny. Wyizolowane IFP-MSC były jednorodnie przylegające i osiągnęły wydłużoną morfologię w ciągu 24 godzin od hodowli in vitro. Komórki skutecznie proliferowały od 80% do 90% konfluencji w ciągu sześciu dni od ekspansji i wykazywały zdolność klonogenną, co wskazuje na skuteczne zdolności proliferacyjne i samoodnawiające.

Po potraktowaniu w celu różnicowania się w linię adipogenną, izolowane komórki wytwarzały kropelki lipidów, co zostało potwierdzone przez barwienie czerwienią olejową O w dniach 14 i 21. Takie kropelki oleju nie były widoczne w komórkach bez czynników indukujących adipogen. Wyizolowane komórki zamknięte w hydrożelu osocza wykazywały tworzenie się białej i błyszczącej tkanki nowotworowej po 14 dniach w grupie indukowanej wykazywały potencjał chondrogeniczny.

Grupa nieindukowana miała bladą białą tkankę o obniżonym połysku. Dodatkowo, dodatnie barwienie histologiczne dla Alcian Blue i Safranin O w grupie indukowanej wskazywało, że komórki mogą wydzielać siarczanowane glikozaminoglikany, jeden z głównych składników macierzy chrząstki. Natomiast skrawki hydrożelu z grup nieindukowanych były ujemne dla barwienia Safraniną O i błękitem Alcian, potwierdzając chondrogeniczny potencjał różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych tylko w obecności bodźców chondrogennych.

Izolowane komórki indukowane pożywką osteogenną wykazywały dodatnie barwienie fosfatazy alkalicznej, potwierdzając mineralizację pod koniec 14 dni. Po 28 dniach indukcji osteogennej zaobserwowano zwapniałe osady z barwieniem czerwienią S alizaryny. Wyniki podkreśliły potencjał różnicowania indukowanych komórek w linie adipogenne, chondrogeniczne i osteogenne.

Konieczne jest przetwarzanie próbki w warunkach aseptycznych, aby uniknąć zanieczyszczenia. Ważne jest również, aby określić prawidłową lokalizację rzepki. Procedura ta otwiera drogę do izolacji różnych typów komórek, takich jak chondrocyty stawowe, fibroblasty więzadeł i komórki macierzyste z błony maziowej i płynu maziowego, co ma szerokie zastosowanie w medycynie regeneracyjnej.

Po wyizolowaniu IFP-MSC przy użyciu tej techniki, jego skuteczność została szczególnie zbadana w zakresie regeneracji tkanek mięśniowo-szkieletowych, takich jak chrząstki, kości i więzadła, przy użyciu metod wolnych od rusztowań i rusztowań.