Name: Izolacja, ekspansja i różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych z podrzepkowej poduszeczki tłuszczowej stawu kolanowego kozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Poznaj metodę izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z podrzepkowej poduszeczki tłuszczowej stawu kolanowego kozy. Technika umożliwia uzyskanie wysokiej jakości komórek o potencjale różnicowania i zastosowaniu w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SH dziękuje za wsparcie ze strony Instytutu Stypendium Podoktorskiego IIT Kanpur oraz grantu SYST od DST (SEED Division) (SP/YO/618/2018). AM dziękuje Indyjskiemu Instytutowi Technologii w Kanpur (IIT-Kanpur) za stypendium Instytutu. DSK dziękuje Gireesh Jankinath Chair Professorship and Department of Biotechnology (Indie) za dofinansowanie (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH i DSK dziękują The Mehta Family Centre for Engineering in Medicine w IIT-Kanpur za hojne wsparcie.

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

W niniejszym protokole przedstawiono prostą, wiarygodną i powtarzalną metodę izolacji MSCs z koziego IFP. Komórki wyizolowane tą metodą zostały z powodzeniem wykorzystane w naszych dotychczasowych badaniach do regeneracji tkanek in vitro. Zaobserwowano, że izolowane komórki były proliferacyjne, reagowały na różne czynniki wzrostu i zachowywały swoją aktywność biologiczną po wysianiu na elektroprzędzonych włóknach i rusztowaniach25,26. Ponadto zaobserwowa...

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są atrakcyjnym kandydatem do terapii komórkowych w medycynie regeneracyjnej1,2. Można je pobierać z różnych źródeł tkanek, takich jak szpik kostny, pępowina, łożysko, miazga zębowa i podskórna tkanka tłuszczowa3. Ponieważ jednak dostępność komórek macierzystych u dorosłych jest ograniczona, a procedura ich izolacji jest często inwazyjna (co skutkuje chorobowością w miejscu dawczym), pożądane jest posiadanie alternatywnego źródła komórek macierzystych, które mogłoby obejść te wyzwania.
Staw kolanowy to magazyn różnych typów komórek, takich jak MSC pochodzące z poduszek tłuszczowych podrzepkowych, MSC pochodzące z błony maziowej, MSC pochodzące z płynu maziowego, fibroblasty więzadeł, chondrocyty stawowe, itd4,5,6. Komórki te mają potencjał, aby być szeroko badane w badaniach opartych na inżynierii tkanki mięśniowo-szkieletowej. W związku z tym staw kolanowy może być możliwym i wiarygodnym źródłem wielu rodzajów MSC. Magazyn tłuszczu znajdujący się w stawie kolanowym, znany jako poduszeczka tłuszczowa podrzepkowa (IFP) lub poduszeczka tłuszczowa Hoffy, jest obiecującym i alternatywnym wyborem MSC depot. IFP jest stosunkowo łatwo dostępnym i klinicznie dostępnym źródłem MSC, ponieważ jest rutynowo wycinany i wyrzucany jako odpad chirurgiczny podczas artroskopii kolana lub operacji otwartego kolana. Usunięcie IFP wiąże się z minimalną chorobowością w miejscu dawczym, co również czyni go atrakcyjnym źródłem tkanek. Mając podobny profil fenotypowy, MSC z IFP (IFP-MSC) mają zwiększony potencjał klonogenny w porównaniu z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi ze szpiku kostnego (BM-MSCs)6 i lepszą zdolność proliferacyjną w porównaniu z podskórnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej (ADSC)7. Co ciekawe, w porównaniu z MSC POCHODZĄCYMI Z MAZI STAWOWEJ (SF-MSC), IFP-MSC nie tracą swojej zdolności proliferacyjnej w późnych pasażach, ani nie wydłużają się w późnych pasażach. Sugeruje to, że podczas ekspansji komórek IFP-MSC mogą osiągnąć wystarczająco dużą liczbę komórek do zastosowań w inżynierii tkankowej in vitro bez uszczerbku dla ich szybkości proliferacji8. Ostatnie badania sugerują również, że IFP-MSCs mają lepszy potencjał różnicowania chondrogennego w porównaniu z MSCs pochodzącymi ze szpiku kostnego (BMSC) i MSCs pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC), prawdopodobnie ze względu na ich anatomiczną bliskość do chrząstki stawowej, co wskazuje na ich przydatność do inżynierii tkanki chrzęstnej6,7,9,10. Co więcej, posiadają również niezależny od wieku potencjał różnicowania osteogennego11. Wykazano, że dostawowe wstrzyknięcie IFP-MSCs zmniejsza ból i poprawia funkcje stawu kolanowego u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów (OA)12,13. Ponadto odnotowano również silne odpowiedzi immunosupresyjne i ulepszone właściwości immunomodulacyjne IFP-MSCs w obecności cytokin zapalnych w stanach patologicznych6.
IFP-MSCs są obiecującym i alternatywnym źródłem MSC; jednak ich korzyści terapeutyczne w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej są stosunkowo mniej zbadane. Istniejące badania nad IFP-MSC wykorzystywały głównie komórki pochodzące od dawców ludzkich. Wśród nich w kilku ostatnich badaniach analizowano IFP-MSC od zdrowych dawców ludzkich (pacjenci bez artretyzmu, w wieku 17-60 lat)6,14, podczas gdy w większości badań stosowano IFP-MSC od starszych pacjentów poddawanych operacji całkowitej wymiany stawu kolanowego (pacjenci chorzy, w wieku 70-80 lat). Ponieważ wiadomo, że zarówno wiek, jak i choroba zmieniają normalne funkcjonowanie komórek macierzystych (zmniejszona liczba i utrata potencjału funkcjonalnego), może to potencjalnie prowadzić do niespójności w wynikach badań opartych na MSC7,15,16,17. Ponadto stosowanie IFP-MSC od pacjentów ze schorzeniami patofizjologicznymi (np. zapalenie stawów i otyłość) również stwarza trudności w zrozumieniu podstawowych cech zdrowych komórek in vitro, działając tym samym jako czynnik ograniczający w rozwoju terapii opartych na MSCs. Aby przezwyciężyć te problemy, niezbędne jest wykorzystanie IFP-MSC od zdrowych dawców. Ponieważ dostęp do zdrowego ludzkiego dawcy jest trudny, lepszą alternatywą mogą być modele zwierzęce. W związku z tym istnieje kilka badań, w których IFP został wyizolowany od myszy18. Jednak ze względu na mały rozmiar poduszeczki tłuszczowej u normalnych myszy, tkanki tłuszczowe pochodzące od wielu zwierząt zostały połączone, aby uzyskać wystarczającą ilość tkanki do przeprowadzenia skomplikowanych procedur eksperymentalnych19. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na duży model zwierzęcy, który mógłby spełnić wymóg większej liczby komórek i jednocześnie spełniać zasady 3R (udoskonalić, zastąpić i zmniejszyć) w badaniach na zwierzętach20. Wykorzystanie dużych zwierząt ma znaczące implikacje w badaniach translacyjnych. W szczególności w inżynierii tkanki mięśniowo-szkieletowej badano szereg dużych zwierząt, takich jak psy, świnie, owce, kozy i konie21. Koza (Capra aegagrus hircus) jest doskonałym wyborem dla dużych zwierząt, ponieważ jej staw kolanowy ma anatomię najbliższą anatomii ludzkiego stawu kolanowego22,23,24. Struktura beleczkowa kości podchrzęstnej i grubość kości podchrzęstnej kóz są podobne do ludzkich, a proporcja chrząstki do kości jest również zbliżona do ludzkiej21. Ponadto kozy zostały szeroko udomowione na całym świecie, dzięki czemu są łatwo dostępne, gdy są dojrzałe kostnie. Co więcej, niskie koszty utrzymania i łatwa obsługa sprawiły, że są one atrakcyjnym modelem zwierzęcym do badań22.
W niniejszym badaniu pokazano prosty protokół izolacji IFP-MSC ze stawu kolanowego Capra aegagrus hircus (kozy) oraz warunki hodowli in vitro dla ich ekspansji i różnicowania. Wyizolowane komórki są przylegające, mają morfologię podobną do MSC, tworzą kolonie CFU-F (fibroblasty tworzące kolonie) i posiadają potencjał różnicowania adipogennego, chondrogenicznego i osteogennego. W związku z tym IFP-MSC wykazują potencjał jako alternatywne źródło MSC do zastosowań biomedycznych.

<table><tbody><tr><td>&beta;-glicerofosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422-10G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna- 0,02% EDTA</td><td>Hi-Media</td><td>TCL049</td><td></td></tr><tr><td>15-mL probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-fosfo-L-askorbinowy sól trisodowa</td><td>Sigma</td><td>49752-10G</td><td>50 &micro; g / ml</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)</td><td>HiMedia</td><td>TCL021-50ml</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>50-mL probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>Hi-Media</td><td>RM471</td><td>Do barwienia sufowanych gykozaminoglikany</td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>S D Fine-Chem Limited</td><td>26048-25G</td><td>Do osadzania wapnia</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>HiMedia</td><td>A011</td><td>2,5 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)</td> <td>Sino Biologicals</td><td>10014-HNAE</td><td>5 ng / mL</td></tr><tr><td>BCIP / NBT Podłoże ALP</td><td>Sigma</td><td>B5655-5TAB</td><td>Do barwienia ALP</td></tr><tr>Szafa <td></td><td></td><td></td><td>bezpieczeństwa biologicznego</td></tr><tr><td>BSA</td><td>HiMedia</td><td>MB-083</td><td>Długa nazwa: Albumina surowicy bydlęcej (1,25 mg / ml )</td></tr> <tr><td>Sitko do komórek</td><td>HiMedia</td><td>TCP-182</td><td>70 &mikro; m</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>REMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloksacyna</td><td>RANBAXY LAB. Limitowany</td><td>B17407T1</td><td>2.5 i mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>S D Fine-Chem Limited</td><td>42555</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glukoza</td><td>Merck</td><td>1.94925.0521</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915</td><td>1 &mikro; M</td></tr><tr><td>DMEM LG</td><td>SIGMA</td><td>D5523</td><td>Długa nazwa: Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Media Etanol o niskiej zawartości glukozy</td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Długa nazwa: Roztwór formaldehydu w surowicy bydlęcej płodu</td></tr><tr><td>37%-41%</td><td>Merck</td><td>61780805001730</td><td></td></tr><tr><td>Indometacyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>100 i mikro; M</td></tr><tr><td></td><td>Insulina Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td>10 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon Eclipse TS 100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ITS + 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2521-5mL</td><td>Długa nazwa: insulina, transferyna, selenin sodu + linol-BSA</td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>HiMedia</td><td>TO-109-25G</td><td>1</td></tr><tr><td>mM Chlorek magnezu</td><td>Merck</td><td>61751605001730</td><td>Do lizy bufor</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Meck</td><td>1.07018.2521</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety i sterylne końcówki (20 i mikro; L, 200 i mikro; L, 1000 i mikro; L)</td> <td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MUSE Analizator komórek</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>Do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Związek OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Długa nazwa: Optymalna temperatura skrawania</td></tr><tr><td>Olej Red O dye</td><td>S D Fine-Chem Limited</td><td>54304</td><td>Do barwienia wakuoli lipidowej</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>HiMedia</td><td>A007</td><td>100 U / ml</td></tr><tr><td>Petri szalki (150 mm i 90 mm)</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Safranin</td><td>O S D Fine-Chem Limited</td><td>50240</td><td>Do barwienia suflowanych gykozaminoglikany</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3434</td><td>3,4 % (w/v)</td></tr><tr><td>Sterylne nożyczki, kleszcze i skalpele</td><td></td><td></td><td>Do izolacji IFP-MSC</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Merck</td><td>1.94953.0521</td><td>35 % (w/v)</td></tr><tr><td>TGF- &beta; 1</td><td>Sino Biologicals</td><td></td><td>Długa nazwa: Transformujący czynnik wzrostu- &beta; 1 (10 ng/ml)</td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli tkankowych 37 &deg; C, 5% CO2</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td>Tris Merck</td><td>61771405001730</td><td>Do lizy bufor</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>S D Fine-Chem Limited</td><td>40632</td><td>Do buforu do lizy</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Gibco</td><td>17101015</td><td>1,5 mg / ml</td></tr><tr><td>Witamina D3</td><td>Sigma</td><td>C9756-1G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Płytki dołkowe (6 -WP i 24-WP)</td><td>gniazdo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, ekspansja i różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych z podrzepkowej poduszeczki tłuszczowej stawu kolanowego kozy

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

IFP, obecny w stawie kolanowym, służy jako obiecujące źródło MSC. IFP jest łatwo dostępną tkanką, ponieważ jest rutynowo wycinana i odrzucana podczas zabiegów artroskopowych i operacji wymiany stawu kolanowego. Dodatkowo jego usunięcie wiąże się z minimalną chorobowością miejsca dawczego. Ostatnie badania wykazały, że IFP-MSC nie tracą swojej zdolności do proliferacji podczas ekspansji in vitro i mają niezależny od wieku potencjał różnicowania osteogennego. IFP-MSC mają wyższy potencjał różnicowania chondrogennego w porównaniu z MSC pochodzącymi ze szpiku kostnego (BMSC) i komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej (ADSC). Chociaż komórki te są łatwo dostępne od starszych i chorych pacjentów, ich skuteczność jest ograniczona. W związku z tym stosowanie IFP-MSC od zdrowych dawców jest ważne dla określenia ich skuteczności w zastosowaniach biomedycznych. Ponieważ dostęp do zdrowego ludzkiego dawcy jest utrudniony, modele zwierzęce mogą być lepszą alternatywą, która umożliwi podstawowe zrozumienie. Duże zwierzęta, takie jak psy, konie, owce i kozy, odgrywają kluczową rolę w badaniach translacyjnych. Wśród nich koza może być preferowanym modelem, ponieważ staw kolanowy kozy ma anatomię najbliższą anatomii ludzkiego stawu kolanowego. Co więcej, kozi IFP może spełniać wyższe liczby MSC potrzebne do zastosowań związanych z regeneracją tkanek. Co więcej, niski koszt, dostępność i zgodność z zasadami 3R w badaniach na zwierzętach sprawiają, że są one atrakcyjnym modelem. W badaniu tym przedstawiono prosty protokół izolacji IFP-MSC ze stawu kolanowego kóz oraz warunki hodowli in vitro dla ich ekspansji i różnicowania. Aseptyczne izolowanie IFP od kozy zostało umyte, zmielone i strawione enzymatycznie. Po filtracji i odwirowaniu pobrane komórki poddano hodowli. Komórki te były przylegające, miały morfologię podobną do MSCs i wykazywały niezwykłą zdolność klonogenną. Co więcej, różnicowały się one w linie adipogenne, chondrogeniczne i osteogenne, co świadczy o ich wielosilnej mocy. Podsumowując, badanie wykazało izolację i ekspansję MSC, które wykazują potencjał w zastosowaniach inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej.

Izolacja IFP-MSCs z stawu udowo-piszczelowego kozy 
Kroki procesu izolacji IFP-MSCs ze stawu kolanowego kozy przedstawiono na Rysunku 1. Tkankę tłuszczową znajdującą się na wewnętrznej powierzchni niestawowej rzepki usunięto, posiekano i poddano trawieniu enzymatycznemu. IFP-MSCs zostały pomyślnie wyizolowane i hodowlane in vitro (Rysunek 2A).
Ekspansja i zdolność klonogenna MSC-IFP 
Wy...

Mezenchymalne komórki macierzyste poduszeczki tłuszczowej (IFP-MSC) można łatwo wyizolować z podrzepkowej poduszki tłuszczowej stawu kolanowego. Dobrze rozmnażają się in vitro, tworzą kolonie CFU-F i różnicują się w linie adipogenne, chondrogeniczne i osteogenne. W niniejszym artykule przedstawiono metodologię izolacji, rozszerzania i różnicowania IFP-MSC od stawu kolanowego kóz.

Izolacja, ekspansja i różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych z podrzepkowej poduszeczki tłuszczowej stawu kolanowego kozy

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z podrzepelkowej poduszeczki tłuszczowej, w skrócie IFP-MSC, są stosunkowo mniej zbadanym typem komórek macierzystych. Protokół ten jest prostą, niezawodną i powtarzalną metodą demonstrującą izolację IFP-MSC od stawu kolanowego kóz. Główną zaletą tej techniki jest to, że można uzyskać dużą liczbę wysokiej jakości IFP-MSC.Izolowane IFP-MSC mogą różnicować się w wiele linii i mają duży potencjał regeneracyjny. Ze względu na swoje anatomiczne położenie, IFP-MSC zyskały zainteresowanie naprawą ubytków chrząstki i łagodzeniem degradacji chrząstki w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Metoda ta ma implikacje dla terapii komórkowej w dziedzinie inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej.Procedura izolacji, ekspansji i różnicowania IFP-MSC zostanie zademonstrowana przez dr Sugata Hazra i pana Amana Mahajana. Aby rozpocząć izolację mezenchymalnych komórek macierzystych poduszeczki tłuszczowej podrzepki (IFP-MSC), należy pobrać kozie stawy udowo-piszczelowe obejmujące około 15 centymetrów obszarów udowych i piszczelowych kończyn tylnych w wysterylizowanym pudełku na próbki. Próbkę należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu transportu do laboratorium w celu dalszego przetwarzania.Umieścić próbkę na 150-milimetrowej szalce Petriego i upewnić się, że próbka jest przetwarzana w sposób aseptyczny i w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez cały czas trwania procedury. Dokładnie spłucz go autoklawowanym PBS uzupełnionym antybiotykami. Utrzymuj próbkę uwodnioną za pomocą PBS.Dokładnie zbadaj obszary anatomiczne próbki. Aby uzyskać łatwy dostęp, całkowicie usuń dodatkowe tkanki z obu kości długich, przytrzymując jedną ręką końcową powierzchnię kości udowej i przecinając ją wzdłużnie w kierunku stawu za pomocą ostrych nożyczek. Następnie, nie naruszając tkanki otaczającej torebkę stawową, należy usunąć mięśnie i tkankę tłuszczową z kości.Podobnie wykonaj kolejne nacięcie na piszczelowym końcu próbki i usuń mięśnie i tkankę tłuszczową z kości piszczelowej. Upewnij się, że obie kości długie są całkowicie odsłonięte, a torebka stawowa jest widoczna. Następnie wykonaj nacięcie z obu stron błony maziowej, aby rozciąć staw stawowy.Odetnij rzepkę od błony maziowej i więzadeł rzepki za pomocą świeżych wysterylizowanych nożyczek i kleszczy. Natychmiast umieścić oddzieloną rzepkę na szalce Petriego zawierającej PBS. Z oddzielonej rzepki usuń całą poduszeczkę tłuszczową znajdującą się na wewnętrznej powierzchni za pomocą nożyczek i kleszczyków.Zbierz go na innej świeżej szalce Petriego i zmiel za pomocą skalpela. Dołącz inne narzędzia chirurgiczne, aby uzyskać małe segmenty tłuszczu o wielkości około dwóch do trzech milimetrów. Za pomocą szpatułki przenieś zmieloną tkankę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i umyj ją trzykrotnie PBS uzupełnionym antybiotykami przez 15 minut w temperaturze pokojowej za pomocą mieszalnika do probówek.W celu trawienia enzymatycznego inkubuj około pięciu gramów tkanki mielonej w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium lub DMEM firmy Dulbecco, pożywce o niskiej zawartości glukozy zawierającej 1,5 miligrama na mililitr kolagenazy typu II i 2% FBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin. Ostrożnie odessaj strawioną tkankę i przefiltruj ją przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów, aby usunąć wszelkie niestrawione części. Odwirować filtrat w 15-mililitrowej probówce wirówkowej o stężeniu 150 razy g przez pięć minut.Usunąć supernatant przed dwukrotnym przemyciem osadu komórkowego DMEM o niskiej zawartości glukozy. Ponownie zawiesić osad w kompletnym DMEM, znanym również jako podłoże rozprężne. Zasiaj komórki na 150-milimetrowej szalce Petriego i hoduj je w pożywce ekspandacyjnej uzupełnionej pięcioma nanogramami na mililitr podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów lub BFGF i 50 mikrogramów na mililitr soli trisodowej kwasu 2-fosfo-L-askorbinowego.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla, aby komórki mogły przylegać i namnażać się. Codziennie monitoruj przyczepienie i wzrost komórek. W celu prawidłowej konserwacji i rozbudowy IFP-MSC należy wymieniać nośniki co trzy dni.Zmieniając pożywkę, dodaj świeże pięć nanogramów na mililitr BFGF i 50 mikrogramów na milimetr soli trisodowej kwasu 2-fosfo-L-askorbinowego bezpośrednio do szalki Petriego. Gdy komórki staną się zlewające się w 80% do 90%, należy je subkulturować, usuwając pożywkę ekspansywną z szalki Petriego i myjąc komórki 1X PBS. Następnie dodaj cztery mililitry 0,25% trypsyny-EDTA do naczynia i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.Po czterech minutach postukaj w płytkę na boku, aby usunąć komórki. Potwierdź całkowite oderwanie wszystkich komórek pod mikroskopem. Po potwierdzeniu dodaj równą objętość pożywki ekspandowej, aby zneutralizować trypsynę.Za pomocą pipety zbierz te zdysocjowane komórki w świeżej 15-mililitrowej probówce polipropylenowej i odwiruj je z prędkością 150 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w żądanej objętości pożywki eksplatacyjnej. Policz komórki przy użyciu standardowej metody liczenia komórek i zahoduj je w celu dalszej ekspansji przy gęstości wysiewu 10 000 komórek na centymetr kwadratowy na 150-mililitrowej szalce Petriego.Do wszystkich testów należy użyć zlewającej się monowarstwy komórek o numerze pasażu od P2 do P5. Gdy rozszerzone komórki osiągną zbieżność od 80% do 90%, oddziel komórki za pomocą roztworu trypsyny-EDTA przed umieszczeniem ich w 15-mililitrowej probówce wirówkowej o wadze 150 razy g przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś osad w osocza koziej o gęstości 2 milionów komórek na 50 mikrolitrów. Dodaj 50 mikrolitrów osocza zawierającego komórki na wysterylizowaną 90-milimetrową szalkę Petriego, a następnie dodaj chlorek wapnia o końcowym stężeniu 0,3%. Dobrze wymieszaj, aby wytworzyć usieciowany hydrożel plazmowy.Po inkubacji wytworzonego hydrożelu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut, należy przenieść hydrożele na 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych zawierające pożywki chondrogenne. Zmieniaj nośnik co trzy dni przez 14 dni. Hydrożele hodowane w kompletnych pożywkach DMEM bez TGF-beta 1 są uważane za kontrole nieindukowane.Po 14 dniach chondrogennego różnicowania komórek w hydrożelu osocza, przemyj hydrożele trzykrotnie PBS przez pięć minut każdy i utrwal próbki w obojętnej buforowanej formalinie przez trzy godziny. Wyizolowane IFP-MSC były jednorodnie przylegające i osiągnęły wydłużoną morfologię w ciągu 24 godzin od hodowli in vitro. Komórki skutecznie proliferowały od 80% do 90% konfluencji w ciągu sześciu dni od ekspansji i wykazywały zdolność klonogenną, co wskazuje na skuteczne zdolności proliferacyjne i samoodnawiające.Po potraktowaniu w celu różnicowania się w linię adipogenną, izolowane komórki wytwarzały kropelki lipidów, co zostało potwierdzone przez barwienie czerwienią olejową O w dniach 14 i 21. Takie kropelki oleju nie były widoczne w komórkach bez czynników indukujących adipogen. Wyizolowane komórki zamknięte w hydrożelu osocza wykazywały tworzenie się białej i błyszczącej tkanki nowotworowej po 14 dniach w grupie indukowanej wykazywały potencjał chondrogeniczny.Grupa nieindukowana miała bladą białą tkankę o obniżonym połysku. Dodatkowo, dodatnie barwienie histologiczne dla Alcian Blue i Safranin O w grupie indukowanej wskazywało, że komórki mogą wydzielać siarczanowane glikozaminoglikany, jeden z głównych składników macierzy chrząstki. Natomiast skrawki hydrożelu z grup nieindukowanych były ujemne dla barwienia Safraniną O i błękitem Alcian, potwierdzając chondrogeniczny potencjał różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych tylko w obecności bodźców chondrogennych.Izolowane komórki indukowane pożywką osteogenną wykazywały dodatnie barwienie fosfatazy alkalicznej, potwierdzając mineralizację pod koniec 14 dni. Po 28 dniach indukcji osteogennej zaobserwowano zwapniałe osady z barwieniem czerwienią S alizaryny. Wyniki podkreśliły potencjał różnicowania indukowanych komórek w linie adipogenne, chondrogeniczne i osteogenne.Konieczne jest przetwarzanie próbki w warunkach aseptycznych, aby uniknąć zanieczyszczenia. Ważne jest również, aby określić prawidłową lokalizację rzepki. Procedura ta otwiera drogę do izolacji różnych typów komórek, takich jak chondrocyty stawowe, fibroblasty więzadeł i komórki macierzyste z błony maziowej i płynu maziowego, co ma szerokie zastosowanie w medycynie regeneracyjnej.Po wyizolowaniu IFP-MSC przy użyciu tej techniki, jego skuteczność została szczególnie zbadana w zakresie regeneracji tkanek mięśniowo-szkieletowych, takich jak chrząstki, kości i więzadła, przy użyciu metod wolnych od rusztowań i rusztowań.

isolation-expansion-differentiation-mesenchymal-stem-cells-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano eksperymentalną technikę leczenia ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika. Implantacja allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w ubytki chrzęstno-kostne stanowi obiecujący kierunek rozwoju w dziedzinie inżynierii tkankowej. Przygotowanie skrzepów fibrynowo-komórkowych in vitro oferuje zestandaryzowaną metodę implantacji.

Leczenie ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika poprzez implantację allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibrynowych

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał różnicowania w kierunku linii osteoblastycznej, gdy są stymulowane przez rozpuszczalne czynniki lub określone biomateriały. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską opcję dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSC), która wykorzystuje macierz kostną bydła Nukbone (NKB) jako rusztowanie.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ich hodowla na porowatej macierzy kostnej

Przedstawiono protokół ustanawiający mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wyizolowane z mazi stawowej i szpiku kostnego świnek miniaturowych i pobrane nieinwazyjnie za pomocą aspiracji strzykawki. Fenotypowanie komórkowe przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej po izolacji komórek oraz hodowli in vitro szpiku kostnego i płynów maziowych pochodzących z MSCs.

Izolacja i fenotypowanie komórkowe mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego i szpiku kostnego świnek miniaturowych

Tutaj opisujemy metody preparowania tkanek płodowych i matczynych z ludzkiego łożyska, a następnie izolacji i ekspansji mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) z tych tkanek.

Izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska

Ten artykuł opisuje przygotowanie i ocenę sferoidów mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z macierzy pępowiny z obustronnym modelem ubytku ścięgna rzepki u szczura. Model ten był związany z akceptowalną chorobowością i stwierdzono, że wykrywa różnice między nieleczonymi i leczonymi ścięgnami oraz między dwoma testowanymi terapiami.

Ocena terapii komórkami macierzystymi w obustronnym modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów

Ten artykuł przedstawia prosty i ekonomiczny protokół prostej izolacji i oczyszczania mezenchymalnych komórek macierzystych z płynu maziowego białego królika z Nowej Zelandii.

Strategie sortowania komórek aktywowanych magnetycznie w celu izolacji i oczyszczenia mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego z modelu królika

Tutaj opisujemy metodę izolacji, ekspansji i różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki jajnika psów.

Wyprowadzanie i różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych jajnika psów

Ten protokół opisuje metodologię izolowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (MSC) od szczurów Sprague Dawley.

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley

Tkanka tłuszczowa jest doskonałym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych. Tutaj przedstawiamy krok po kroku ekstrakcję, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) z tkanki tłuszczowej najądrza szwajcarskich myszy.

Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Izolacja MSC o wysokimMFGE8 BAMBI, jednej z trzech głównych podgrup tworzących heterogeniczne ludzkie UC-MSC, jest pomocna dla pełnego zrozumienia cech i funkcji tego podtypu dla jego przyszłego zastosowania w celu poprawy skuteczności klinicznej w określonych chorobach. W tym miejscu przedstawiamy metodę sortowania BAMBIhighMFGE8high UC-MSC.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny owysokim poziomieMFGE8

Poznaj metodę izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z podrzepkowej poduszeczki tłuszczowej stawu kolanowego kozy. Technika umożliwia uzyskanie wysokiej jakości komórek o potencjale różnicowania i zastosowaniu w inżynierii tkankowej.

Izolacja, ekspansja i różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych z podrzepkowej poduszeczki tłuszczowej stawu kolanowego kozy (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja, ekspansja i różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych z podrzepkowej poduszeczki tłuszczowej stawu kolanowego kozy

Przeglądaj więcej filmów