Przygotowanie i charakterystyka biohybrydowego biotuszu hydrożelowego 3D na bazie grafenu do neuroinżynierii obwodowej

System komórek macierzystych znajduje się pod wpływem jego ważnych składników. Zachowanie i różnicowanie komórek macierzystych jest nie do pomyślenia bez obecności ich mikrośrodowiska. To mikrośrodowisko, zwane niszą komórek macierzystych, składa się z komórek i rusztowań.

Neuropatia obwodowa może być, a czasami mogą, takie jak uszkodzenie splotu ramiennego, różne urazy, guzy, anomalie autonomiczne, definicja immunologiczna i choroba metaboliczna. Opracowano różne metody hodowli 3D, aby zapewnić lepszą i bardziej naturalną niszę dla komórek macierzystych. Tworzenie sferoidów i biodruk 3D to stosunkowo nowe i obiecujące metody hodowli 3D.

Biodruk 3D może być również wykorzystywany w badaniach neuroinżynieryjnych. W związku z tym w ramach tego badania opracowano i zbadano biotusze na bazie grafenu i alginianu/żelatyny pod kątem ich właściwości regeneracyjnych. Na początek posaz mezenchymalnych komórek macierzystych Whartona lub WJMSC w pożywce DMEM F12 zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej lub FBS, 1% długopisu / paciorkowca i 1% L-glutaminy pod sterylnym przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej.

Gdy wyhodowane komórki zlewają się w 80% z kolbą, wlej pożywkę i umyj komórki pięcioma mililitrami PBS. Następnie dodaj pięć mililitrów 0,25% trypsyny i 2,21 milimolowego EDTA sodu i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach dodaj do komórek 10 mililitrów pożywki DMEM F12 zawierającej 10% FBS.

Zawieś komórki, zbierz pożywkę i przenieś ją do probówki wirówkowej. Następnie odwirować komórki i wyrzucić supernatant przed ponownym wysianiem komórek w nowej kolbie ze świeżą pożywką zawierającą 10% FBS. Aby przygotować biotusz grupy kontrolnej bez grafenu, odważ 4,5 miligrama alginianu i 1,5 miligrama żelatyny i przenieś je do probówki wirówkowej.

Następnie dodaj do probówki 50 mililitrów pożywki DMEM F12 zawierającej 10% FBS. Ponownie zważ 4,5 miligrama alginianu i 1,5 miligrama żelatyny i przenieś je do probówki wirówkowej. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 0,1% grafenu do probówki i zmniejsz objętość 50 mililitrów za pomocą pożywki DMEM F12 zawierającej 10% FBS.

Wymieszaj biotusze, pipetując i wirując, a następnie sterylizuj w autoklawie w temperaturze 121 stopni Celsjusza pod ciśnieniem atmosferycznym 1,5 przez 20 minut. Po autoklawowaniu odwirować roztwór, aby usunąć powstałe pęcherzyki i umieścić biotusze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki będą przygotowane.

Aby uzyskać interakcję biotuszu komórkowego, utwórz grupy biotuszu. Grupa pierwsza obejmuje 3D-B i 3D-G drukowane za pomocą biotuszu do biodruku. Grupa druga obejmuje biotusze 3D-BS i 3D-GS, na których sferoidy zostały uformowane po bioprintingu.

W przypadku grupy pierwszej policz komórki do jednego na 10 do siódmych komórek w 0,5 mililitra pożywki. Następnie dodaj 4,5 mililitra biotuszu. Przenieść mieszaninę do wkładów w sterylnej szafce za pomocą strzykawek.

Zainstaluj wkłady w odpowiedniej sekcji ekstrudera biodrukarki. W przypadku drugiej grupy weź pięć mililitrów biotuszu z każdej z grup biotuszu i przenieś je do sterylnych wkładów za pomocą wtryskiwacza. Używaj biodrukarki z dwiema współosiowymi głowicami drukującymi i technologią wytłaczania napędzanego pneumatycznie.

Ustaw rozdzielczość XYZ na mikro krok na 1,25 mikrometra, szerokość wytłaczania na 400 mikrometrów, a wysokość wytłaczania na 200 mikrometrów. Użyj siatki o wymiarach 20 na 20 na 5 milimetrów, aby tworzyć modele 3D. Twórz modele 3D za pomocą internetowych programów CAD typu open source.

W przypadku procesu biodruku 3D ustaw średnie ciśnienie drukarki na 7.5 psi. Następnie ustaw temperaturę wkładu i stołu na 37 stopni Celsjusza i prędkość na 60%Ustaw system w pozycji wyjściowej podczas fazy pisania. Ustaw osie automatycznie, a następnie wybierz i ustaw ekstruder przed rozpoczęciem procesu biodruku.

Po wydrukowaniu wyjmij próbkę i umieść ją w komorze z przepływem laminarnym. Następnie spryskaj biotusze 0,1 normalnym roztworem chlorku wapnia lub dodaj jeden mililitr roztworu pipetą w temperaturze pokojowej i odczekaj 10 do 20 sekund. Następnie przemyj wydrukowane wzory dwukrotnie PBS zawierającym wapń i magnez.

Dodaj dwa mililitry pożywki DMEM F12 z 10% FBS na wierzchu każdej komórki zawierającej grupę biotuszu i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 30 minut. Następnie dodać dwa mililitry pożywki zawiesinowej zawierającej 1 na 10 do szóstych komórek do każdej grupy i inkubować płytki. Po 24 godzinach obserwuj i fotografuj wszystkie partie biotuszu do tworzenia sferoidów pod odwróconym mikroskopem w celu różnicowania WJMSC do komórek podobnych do neuronów, z wyjątkiem grupy kontrolnej.

Dodaj dwa mililitry pożywki do różnicowania neurogennego na studzienkę i odświeżaj co dwa dni. Obserwuj przez siedem dni, aby zaobserwować różnicowanie neuronalne. Następnie, korzystając z obrazowania poklatkowego, zbadaj wpływ grafenu na komórki macierzyste i monitoruj interakcje komórkowe w biotuszu.

Wykazano tutaj wpływ stężenia grafenu na proliferację komórek. W porównaniu z grupą kontrolną zaobserwowano istotny spadek stężenia grafenu na poziomie 0,001%. Nie stwierdzono istotnych różnic między pozostałymi grupami a grupą kontrolną.

Interakcje grafenu komórkowego wykazały, że grafen był tolerowany w systemie 2D i był pobierany przez komórki przez endocytozę. Obrazowanie poklatkowe wykazało, że komórki, które przetrwały w pożywce grafenowej 3D, zachowały swoją witalność dzięki jasności GFP do końca inkubacji. Obrazy SEM i analiza FIIR grup biotuszu 3D-B i 3D-G są pokazane tutaj.

Interakcje między komórkami biotuszu wykazano zarówno na powierzchni, jak i wewnętrznie. Komórki były morfologicznie okrągłe i przyczepione do materiału. W różnicowaniu neuronalnym 3D uznano, że granice komórek sferoidalnych w obu grupach były przezroczyste i żywe, a sferoidy w grupie grafenu były stosunkowo większe i uwięziły grafen wewnątrz komórki.

Immunobarwienie komórek 2D i 3D pokazano tutaj. Zielone obrazy reprezentują struktury podobne do neuronów. Próbka kontroli pozytywnej 2D wyrażała mniej markerów struktury neuronalnej niż próbki 3D.

Odkryliśmy, że biotusze na bazie grafenu były bardziej skuteczne pod względem różnicowania komórek macierzystych w komórki podobne do neuronów. Proponujemy, że biotusze na bazie grafenu byłyby doskonałymi narzędziami do leczenia zaburzeń nerwów obwodowych w dalszych badaniach. Obecnie system komórek macierzystych może być tworzony przez inżynierię tkankową z naturalnymi i syntetycznymi biomateriałami Tworzenie sztucznych tkanek, które mogą zastąpić żywe tkanki, które mogą być wykorzystane do regeneracji tych tkanek, usuwania uszkodzeń i zapewniania funkcji, zapewnia inżynieria tkankowa.