Name: Analiza dynamiki mikrobioty kałowej u myszy podatnych na toczeń przy użyciu prostej, opłacalnej metody izolacji DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Poznaj prostą i opłacalną metodę izolacji DNA z próbek kałowych myszy do analizy dynamiki mikrobioty jelitowej w modelach chorób autoimmunologicznych. Ta technika umożliwia badanie zmian mikrobioty w przebiegu toczenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy pomoc ze strony Argonne National Laboratory i współpracujących z nami bioinformatyków. Praca ta jest wspierana przez różne granty NIH i wewnętrzne.

Locus Cx3cr1gfp/gfp myszy B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J był krzyżowany wstecznie z MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) przez 10 pokoleń, aby wygenerować myszy MRL/lpr-CX3CR1 gfp/gfp. Badania przesiewowe genomu przy użyciu paneli polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) potwierdziły, że tło genetyczne nowo wygenerowanych myszy było w ponad 97% identyczne z tłem MRL/lpr. Następnie myszy były hodowane i utrzymywane w określonym środowisku wolnym od patogenów, zgodnie ze specyficznymi wymaganiami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Virginia Tech. Próbki pobrano, gdy myszy miały 13, 14 i 15 tygodni.
1. Pobieranie próbek mikrobioty od myszy
<ol>
	<li>Wyjmij każdą mysz z klatki z osobna. Zebrać granulki kału bezpośrednio z odbytu i przechowywać je w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia. Próbki należy przetwarzać za pomocą sterylnych i czystych kleszczy, probówek i rękawiczek. 
	UWAGA: Pojemnik (np. zlewka) może być użyty do umieszczenia myszy w oczekiwaniu na próbkę kału. Wyczyść pojemnik etanolem przed i po każdej myszy.</li>
	<li>Dodaj zamrożony granulat do wstępnie zważonej probówki z nakrętką o pojemności 2 ml. Zapisz masę kału w gramach, która powinna wynosić od 0,02 do 0,05 g na granulkę kału.</li>
	<li>Dodaj do granulatu cienką warstwę kulek szklanych o średnicy 0,1 mm, 500 μl buforu do lizy (50 mM NaCl, 5 mM Tris i 50 mM EDTA) i 200 μl 20% SDS.</li>
	<li>Ubijaj rurkę przez 4 minuty w homogenizatorze (przy maksymalnej mocy), a następnie 3-5 minut wirowania.</li>
	<li>Wirować przez krótki czas, aby usunąć pęcherzyki i pianę (naciśnij przycisk na wirówce, aż osiągnie 1,000-1,200 x g, a następnie zwolnij).</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA
<ol>
	<li>Przenieść 350 μl supernatantu otrzymanego w kroku 1.5 (uważając, aby nie przenosić żadnych zanieczyszczeń) do nowej probówki z zatrzaskiem o pojemności 1,5 ml. Dodać 500 μl mieszaniny fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego (PCI; 25:24:1, v/v) i wirować przez 1 min. 
	UWAGA: Od teraz próbki muszą być przenoszone wewnątrz okapu chemicznego. PCI jest toksyczny.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 6 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Przenieść 180 μl fazy wodnej (górna warstwa) do nowej probówki z zatrzaskiem o pojemności 1,5 ml. Dodać 180 μl (1:1) chloroformu, odwrócić i wymieszać. 
	UWAGA: Zminimalizuj zanieczyszczenie z dolnej warstwy podczas przenoszenia górnej warstwy.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 18 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Przenieść 180 μl fazy wodnej do nowej probówki z zatrzaskiem. 
	UWAGA: Po odrzuceniu PCI i chloroformu, w komorze bezpieczeństwa biologicznego można wykonać następujące czynności.</li>
	<li>Dodaj 180 μl zimnego izopropanolu i 36 μl 5M NH4Ac. Odwróć kilka razy do wymieszania i umieść probówkę na lodzie na 20 minut.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 18 400 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Wlać do odrzucenia supernatantu. Umyj granulat kilkakrotnie 500 μl zimnego 70% etanolu podczas odwracania. 
	UWAGA: Etanol należy rozcieńczyć podwójnie dejonizowaną sterylną wodą.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 18 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant w celu usunięcia pozostałości etanolu.</li>
	<li>Wysuszyć probówkę do góry nogami na bibułce przez 20 minut, aż granulka stanie się przezroczysta. Zawiesić osad w 50 μl wody molekularnej. Podgrzewać ciecz w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby całkowicie rozpuścić duże granulki DNA.</li>
	<li>Po podgrzaniu zakręć rurkami, aby odzyskać kropelki kondensatu na pokrywie (3 400 x g przez 1 min).</li>
	<li>Zmierzyć stężenie i uzyskać stosunek 260/280 za pomocą spektrofotometru. Użyj wody molekularnej jako ślepego miejsca. Dobrej jakości DNA powinno mieć proporcje 260/280 w zakresie od 1,8 do 2, 
	UWAGA: Oczekiwany plon DNA wynosi co najmniej 0,03 g na osad kału.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki do sekwencjonowania genu 16S rRNA
<ol>
	<li>Wyślij próbki DNA do Argonne National Laboratory, gdzie są one poddawane przygotowaniu biblioteki i sekwencjonowane na Illumina Miseq.
	<ol>
		<li>Próbki należy wysyłać w 96-dołkowych płytkach z pełną listwą dolną, z próbkami ułożonymi w rzędach (A1-A12, B1-B12 itd.) i uszczelnionymi uszczelkami z płytek foliowych.</li>
		<li>Wyślij końcową objętość 20 μl na próbkę na studzienkę, w stężeniu od 1-50 ng / μL. 
		UWAGA: Rozcieńczenia należy wykonywać wodą molekularną.</li>
		<li>Po przygotowaniu próbek wirować w temperaturze 600 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie zamrażać próbki w temperaturze -80 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Wyślij w nocy na suchym lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Has+the+microbiota+played+a+critical+role+in+the+evolution+of+the+adaptive+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system.</a> Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).</li>
<li>Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+T-cell+responses+to+gut+microbiota+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).</li>
<li>Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+microbiome+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Rheumatology+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of the microbiome in rheumatic diseases.</a> Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314(2013).</li>
<li>Larsen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+in+human+adults+with+type+2+diabetes+differs+from+non-diabetic+adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults.</a> PLoS One. 5 (2), 9085(2010).</li>
<li>Alam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+imbalance+in+inflammatory+bowel+disease+patients+at+different+taxonomic+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels.</a> Gut Pathogens. 12 (1), (2020).</li>
<li>Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet%2C+microbiota+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">Diet, microbiota and autoimmune diseases.</a> Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).</li>
<li>Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLE%3A+another+autoimmune+disorder+influenced+by+microbes+and+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet.</a> Frontiers of Immunology. 6, 608(2015).</li>
<li>Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+serious+infections+in+adults+with+systemic+lupus+erythematosus%3A+a+national+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Care+%26+Research%22%5BJournal%5D)">Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study.</a> Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).</li>
<li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73(2017).</li>
<li>Panek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+challenges+in+studying+human+gut+microbiota+-+effects+of+collection%2C+storage%2C+DNA+extraction+and+next+generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5143(2018).</li>
<li>Fiedorová, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+dna+extraction+methods+on+stool+bacterial+and+fungal+microbiota+community+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 821(2019).</li>
<li>Gerasimidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+DNA+extraction+methodology+on+gut+microbiota+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications.</a> BMC Research Notes. 9, 365(2016).</li>
<li>Bukin, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6 (1), 190007(2019).</li>
<li>Galloway-Peña, J., Hanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+analysis+of+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tools for analysis of the microbiome.</a> Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).</li>
<li>Sharpton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+analysis+of+shotgun+metagenomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 209(2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Zrównoważona mikrobiota jelitowa może chronić organizm ludzki przed chorobami. Gdy ta równowaga zostanie zakłócona przez zewnętrzne lub wewnętrzne wyzwalacze, konsekwencje mogą być katastrofalne. Metoda ta przedstawia sposób analizy dynamiki mikrobioty jelitowej w modelach mysich. Metoda ta nadaje się nie tylko do porównań między grupami, ale także do śledzenia mikrobioty jelitowej w czasie, aby lepiej identyfikować czynniki zależne od czasu, które zaburzają mikrobiotę jelitową.
Wszystkie mysz...

Ludzie i bakterie współistnieją od dawna. Ustalili współzależny związek z wzajemnymi korzystnymi efektami, który wpływa na odpowiedź immunologiczną gospodarza w sposób ilościowy i jakościowy1. Ostatnie badania sugerują związek między składem mikrobioty jelitowej a patogenezą chorób autoimmunologicznych, do których należą stwardnienie rozsiane2, reumatoidalne zapalenie stawów3, cukrzyca typu 24, Nieswoiste zapalenie jelit5 i toczeń rumieniowaty układowy (SLE)6. Jednak to, czy mikrobiota jelitowa jest główną przyczyną, czy wtórnym skutkiem tych chorób autoimmunologicznych, jest nadal niejasne7. Potencjalnie mikrobiota jelitowa może zaostrzyć chorobę w fazie efektorowej zaburzeń autoimmunologicznych lub odgrywać rolę w regulacji indukcji tych chorób8.
U samic myszy MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) stwierdzono dysbiozę jelitową i zaobserwowano zmiany mikroflory jelitowej ze znacznym niedoborem pałeczek kwasu mlekowego9. Kiedy mieszanina pięciu szczepów Lactobacillus została podana doustnie, objawy podobne do tocznia były znacznie osłabione u tych myszy, co sugeruje istotną rolę mikrobioty w regulacji patogenezy TRU.
Następująca technika ekstrakcji DNA pozwala śledzić fluktuacje mikrobioty i analizować je jakościowo i ilościowo w trakcie mysiej choroby podobnej do SLE u myszy podatnych na toczeń. Niezależnie od tego, czy chodzi o zbadanie zdrowej mikrobioty jelitowej, czy zdefiniowanie dysbiozy, ważne jest, aby krytycznie przeanalizować, w jaki sposób dane są gromadzone oraz czy są one dokładne i powtarzalne10. Każdy krok ma kluczowe znaczenie w tym procesie. Do ekstrakcji DNA drobnoustrojów należy zastosować odpowiednią metodologię, ponieważ wszelkie możliwe problemy wprowadzające błędy systematyczne podczas procesu ekstrakcji DNA mogą skutkować niedokładną reprezentacją drobnoustrojów. Chociaż metoda fenolowo-chloroformowa jest opisana tutaj, istnieją komercyjnie dostępne zestawy do ekstrakcji DNA z bakterii, które sprawdzają się w określonych przypadkach11. Ich użyteczność jest jednak ograniczona kosztem i wymaganą ilością próbki.
Przedstawiony tutaj protokół jest opłacalny i wymaga tylko niewielkiej ilości próbki. Działa dobrze z każdym rodzajem próbki kału i jest przydatny w badaniu dynamiki mikrobioty jelitowej w czasie, a także w porównaniach między grupami. DNA izoluje się metodą oczyszczania alkoholowego, w której wykorzystuje się fenol, chloroform i alkohol izoamylowy. Ekstrakcja na bazie alkoholu pomaga oczyścić i usunąć próbkę białek i lipidów, w której na ostatnim etapie wytrąca się DNA. Proponowana metoda charakteryzuje się znacznie wysoką skutecznością i jakością oraz udowodniono, że jest dokładna w identyfikacji populacji bakterii. Jedną z krytycznych uwag podczas procedury jest to, że może dojść do zanieczyszczenia DNA, a zatem wymagane jest odpowiednie obchodzenie się z próbką12.
DNA jest następnie analizowane przez platformy sekwencjonowania nowej generacji dla genu 16S rRNA, takie jak Illumina MiSeq. W szczególności analizowany jest region hiperzmienny V4 w celu zapewnienia lepszej kwantyfikacji taksonów o wysokiej randze13. Późniejsza analiza bioinformatyczna jest zlecana na zewnątrz, a następnie przeprowadzana jest analiza wewnętrzna przy użyciu standardowych metod statystycznych. Dostępnych jest wiele programów bioinformatycznych typu open source do sekwencjonowania na dalszych etapach, a rodzaj wykonywanych analiz zależy w dużej mierze od konkretnego pytania biologicznego będącego przedmiotem zainteresowania14. Protokół ten koncentruje się w szczególności na etapach eksperymentalnych poprzedzających sekwencjonowanie i zapewnia bardziej wszechstronną, opłacalną, porównywalną i wydajną metodę uzyskiwania DNA z próbek kału.

<table><tbody><tr><td>Koraliki szklane 0,1 mm</td><td>Produkty BioSpec</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>Rurki z nakrętką 2 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3488</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS</td><td>FisherScientific</td><td>BP1311-1</td><td>SDS 20%</td></tr><tr><td>96% Etanol, klasa biologii molekularnej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T032021000CS</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu (5 m)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9071</td><td>NH4AC 5M</td></tr><tr><td>B6.129P2(CG)-Cx3cr1tm1Litt/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005582</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender burza 24</td><td>Next Advance</td><td>4116-BBY24M</td><td>Homogenizator</td></tr><tr><td>chloroform</td><td>FisherScientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Woda uzdatniona DEPC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Kwas</td> <td>tetraoctowy etylenodiaminyFisherScientific</td><td>BP118-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Uszczelka foliowa</td><td>FisherScientific</td><td>NC0302491</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes-Kimtech 34256</td><td>FisherScientific</td><td>06-666C</td><td></td></tr><tr><td>MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) myszy</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000485</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotomer Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: chloroform: izoamylalchohol (25:24:1)</td><td>FisherScientific</td><td>BP1752I-400</td><td>Skala PCI</td></tr><tr><td>z 4 miejscami po przecinku</td><td>Mettler Toledo</td><td>MS205DU</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki z osłoną</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0800</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>FisherScientific</td><td>15528154</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Tris Chlorowodorek</td><td>FisherScientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza dynamiki mikrobioty kałowej u myszy podatnych na toczeń przy użyciu prostej, opłacalnej metody izolacji dna

Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

Mikrobiota jelitowa odgrywa ważną rolę w kształceniu układu odpornościowego. Zależność ta jest niezwykle ważna dla zrozumienia chorób autoimmunologicznych, które są napędzane nie tylko przez czynniki genetyczne, ale także czynniki środowiskowe, które mogą wywołać początek i/lub pogorszyć przebieg choroby. Wcześniej opublikowane badanie dotyczące dynamiki mikrobioty jelitowej u samic myszy MRL/lpr podatnych na toczeń wykazało, w jaki sposób zmiany mikrobioty jelitowej mogą wpływać na postęp choroby. W tym miejscu opisano protokół ekstrakcji reprezentatywnych próbek z mikrobioty jelitowej do badań autoimmunizacji. Próbki mikrobioty są pobierane z odbytu i poddawane obróbce, z której DNA ekstrahuje się metodą fenolowo-chloroformową i oczyszcza przez wytrącanie alkoholu. Po wykonaniu PCR oczyszczone amplikony są sekwencjonowane przy użyciu platformy sekwencjonowania nowej generacji w Argonne National Laboratory. Na koniec analizowane są dane sekwencjonowania genu rybosomalnego RNA 16S. Jako przykład przedstawiono dane uzyskane z porównań mikrobioty jelitowej myszy MRL/lpr z lub bez CX3CR1. Wyniki wykazały znaczące różnice w rodzajach zawierających bakterie chorobotwórcze, takie jak bakterie z gromady Proteobacteria, a także z rodzaju Bifidobacterium, który jest uważany za część zdrowej mikrobioty komensalnej. Podsumowując, ta prosta i opłacalna metoda izolacji DNA jest niezawodna i może pomóc w badaniu zmian mikrobioty jelitowej związanych z chorobami autoimmunologicznymi.

Wyniki z Argonne National Laboratory są analizowane przez wykwalifikowanego bioinformatyka, a następnie dane poddawane są analizie wewnętrznej z wykorzystaniem standardowych metod statystycznych. Typowe analizy mikrobiomu obejmują grupowanie podobnych sekwencji w jednostki taksonomiczne (OTUs) lub warianty sekwencji amplikonów (ASVs), które służą jako wskaźniki różnych mikroorganizmów w próbce. Liczba OTUs lub ASVs w poszczególnych próbkach może być następnie wykorzystana do badania zmian w różnorodności wewnątrzpróbkowe...

Ten protokół zapewnia prostą, opłacalną metodę izolacji DNA do analizy zmian mikroflory jelitowej myszy podczas rozwoju choroby autoimmunologicznej.

Analiza dynamiki mikrobioty kałowej u myszy podatnych na toczeń przy użyciu prostej, opłacalnej metody izolacji DNA

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...

Proponowana metoda izolacji DNA może służyć do badania dynamiki mikroflory jelitowej w mysich modelach chorób autoimmunologicznych. Zaproponowano bardziej wszechstronną, opłacalną i wydajną metodę uzyskiwania DNA z próbek kału, które są porównywalne z dostępnymi na rynku zestawami. Na początek wyjmij każdą mysz z klatki z osobna, zbierz granulkę kału bezpośrednio z odbytu i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu przetworzenia.Przetwarzaj próbki za pomocą sterylnych i czystych kleszczy, probówek i rękawiczek. Dodaj zamrożony granulat do wstępnie zważonej, dwumililitrowej probówki z nakrętką i zapisz masę kału w gramach, która powinna wynosić od 0,02 do 0,05 grama na granulkę kału. Dodaj do granulatu cienką warstwę 0,1 milimetra szklanych kulek, 500 mikrolitrów buforu do lizy i 200 mikrolitrów 20% dodecylosiarczanu sodu.Koralik ubijał rurkę przez cztery minuty w homogenizatorze, a następnie od trzech do pięciu minut wirowania. Odwiruj probówki przez krótki czas, aby usunąć pęcherzyki i pianę. Aby wyekstrahować DNA z próbek mikrobioty, przenieś 350 mikrolitrów supernatantu próbki do nowej probówki z zatrzaskiem o pojemności 1,5 mililitra, bez żadnych zanieczyszczeń.Dodać 500 mikrolitrów alkoholu fenolo-chloroformowego:izoamylowego w stosunku 25:24:1 i wirować przez jedną minutę. Po odwirowaniu przenieś 180 mikrolitrów górnej fazy wodnej do nowej, 1,5-mililitrowej probówki z zatrzaskiem. Dodaj 180 mikrolitrów chloroformu, odwróć i wymieszaj.Z tego przenieś 180 mikrolitrów fazy wodnej do nowej probówki z zatrzaskiem. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 180 mikrolitrów zimnego izopropanolu i 36 mikrolitrów pięciomolowego octanu amonu. Odwróć go kilka razy, aby wymieszać i umieść rurkę na lodzie na 20 minut.Wyrzucić supernatant, a następnie kilkakrotnie przemyć granulki 500 mikrolitrami zimnego 70% etanolu. Wyrzuć supernatant i wysusz probówkę do góry nogami na bibułce przez 20 minut, aż granulka stanie się przezroczysta. Zawieś pastylkę w 50 mikrolitrach wody molekularnej i podgrzej ciecz w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby całkowicie rozpuścić duże granulki DNA.Po podgrzaniu odwirować te probówki z prędkością 3 400 razy G przez jedną minutę, aby odzyskać kropelki kondensatu z pokrywki. Zmierzyć stężenie i uzyskać stosunek 260/280 za pomocą spektrofotometru. Stosunek dobrej jakości DNA wynosi zwykle od 1,8 do dwóch.Odwirować przygotowane próbki w temperaturze 600 razy G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie wyślij 20 mikrolitrów próbek o stężeniach od jednego do 50 nanogramów na mikrolitr do Argonne National Laboratory w celu sekwencjonowania. Szczep myszy pozbawiony receptora CX3CR1 ma inny skład mikrobioty jelitowej w porównaniu z myszami typu dzikiego MRL/lpr, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, wykazuje znaczące różnice w niektórych rodzajach, istotnych dla bakterii potencjalnie chorobotwórczych, takich jak te z gromady Proteobacteria.Zachowaj ostrożność z zanieczyszczeniem próbki. Musi być sterylny. Ważne jest również, aby pipetować z dużą dokładnością podczas przenoszenia supernatantu do nowej probówki.Ta metoda jest odpowiednia do analiz molekularnych, takich jak PCR, trawienie enzymami restrykcyjnymi lub budowa biblioteki genomowej. W toczniu udowodniliśmy silny związek między mikrobiotą jelitową a progresją tocznia.

analysis-fecal-microbiota-dynamics-lupus-prone-mice-using-simple-cost

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje protokół izolacji DNA z próbek kału myszy z guzem jelita grubego. Wyekstrahowane DNA jest amplifikowane za pomocą PCR, a produkt jest dalej czyszczony przy użyciu podejścia opartego na kulkach magnetycznych. Metodę tę można wykorzystać do określenia wpływu wzbogacenia środowiska na mikrobiotę jelita grubego i śmiertelność zwierząt.

Izolacja DNA drobnoustrojów kału: badanie wpływu wzbogacenia środowiska na różnorodność mikrobiomu w mysim modelu guza

Transfer limfocytów bm12 do biorcy C57BL/6 jest ustalonym modelem tocznia rumieniowatego układowego. Tutaj opisujemy, jak zainicjować chorobę za pomocą tego modelu i jak scharakteryzować komórki pomocnicze pęcherzyków T, komórki B centrum rozrodczego i komórki plazmatyczne za pomocą cytometrii przepływowej.

Indukowany model tocznia rumieniowatego układowego (SLE) bm12 u myszy C57BL/6

Rośnie zainteresowanie ilościową charakterystyką limfocytów jelitowych ze względu na coraz większą świadomość, że komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych chorobach jelitowych i ogólnoustrojowych. W tym protokole opisujemy, jak izolować populacje pojedynczych komórek z różnych przedziałów jelita cienkiego w celu późniejszej charakterystyki cytometrii przepływowej.

Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Wzbogacenie środowiska (EE) to środowisko przetrzymywania zwierząt, które służy do ujawniania mechanizmów leżących u podstaw powiązań między stylem życia, stresem i chorobami. Protokół ten opisuje procedurę, która wykorzystuje mysi model nowotworzenia jelita grubego i EE w celu szczegółowego zdefiniowania zmian w różnorodności biologicznej mikrobioty, które mogą mieć wpływ na śmiertelność zwierząt.

Metoda określania wpływu wzbogacania środowiska na bioróżnorodność biomu mikrobiomu jelita grubego w mysim modelu guza jelita grubego

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły doustnego podawania antybiotyków myszom, pobierania próbek kału, ekstrakcji DNA i kwantyfikacji bakterii kałowych metodą qPCR.

Ilościowe analizy mikrobioty jelitowej myszy po doustnym leczeniu antybiotykami oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Obecny protokół opisuje metodę śledzenia postępu tocznia u myszy. Przedstawiono dwie dodatkowe procedury w celu scharakteryzowania toczniowego zapalenia nerek w oparciu o naciek komórek i odkładanie się białek w nerkach.

Analizy białkomoczu, naciekania leukocytów przez nerki i odkładania się białek przez nerki u myszy MRL/lpr podatnych na toczeń

Celem jest tutaj nakreślenie protokołu do badania mechanizmów dysbiozy w chorobach sercowo-naczyniowych. W artykule omówiono, jak aseptycznie pobierać i przeszczepiać próbki kału myszy, izolować jelita i stosować metodę "Swiss-roll", a następnie techniki barwienia immunologicznego w celu zbadania zmian w przewodzie pokarmowym.

Izolacja kału myszy i przeszczep mikrobioty

Ten protokół opisuje najlepsze praktyki transferu myszy wolnych od zarazków do eksperymentalnych izolatorów jednoklatkowych (izoklatek) przy zachowaniu sterylnych warunków. Omówiono metody przeszczepu kału myszom wolnym od zarazków i pobierania żywych bakterii od tych "humanizowanych" myszy jelitowych w celu dalszych zastosowań.

Przygotowanie i utrzymanie eksperymentu z izododatnią klatką z wykluczeniem biologicznym do przeszczepu kału u myszy wolnych od zarazków

Poznaj prostą i opłacalną metodę izolacji DNA z próbek kałowych myszy do analizy dynamiki mikrobioty jelitowej w modelach chorób autoimmunologicznych. Ta technika umożliwia badanie zmian mikrobioty w przebiegu toczenia.

Analiza dynamiki mikrobioty kałowej u myszy podatnych na toczeń przy użyciu prostej, opłacalnej metody izolacji DNA

Przeglądaj więcej filmów