Analiza dynamiki mikrobioty kałowej u myszy podatnych na toczeń przy użyciu prostej, opłacalnej metody izolacji DNA
2 maja 2022
Ten protokół zapewnia prostą, opłacalną metodę izolacji DNA do analizy zmian mikroflory jelitowej myszy podczas rozwoju choroby autoimmunologicznej.
Proponowana metoda izolacji DNA może służyć do badania dynamiki mikroflory jelitowej w mysich modelach chorób autoimmunologicznych. Zaproponowano bardziej wszechstronną, opłacalną i wydajną metodę uzyskiwania DNA z próbek kału, które są porównywalne z dostępnymi na rynku zestawami. Na początek wyjmij każdą mysz z klatki z osobna, zbierz granulkę kału bezpośrednio z odbytu i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu przetworzenia.
Przetwarzaj próbki za pomocą sterylnych i czystych kleszczy, probówek i rękawiczek. Dodaj zamrożony granulat do wstępnie zważonej, dwumililitrowej probówki z nakrętką i zapisz masę kału w gramach, która powinna wynosić od 0,02 do 0,05 grama na granulkę kału. Dodaj do granulatu cienką warstwę 0,1 milimetra szklanych kulek, 500 mikrolitrów buforu do lizy i 200 mikrolitrów 20% dodecylosiarczanu sodu.
Koralik ubijał rurkę przez cztery minuty w homogenizatorze, a następnie od trzech do pięciu minut wirowania. Odwiruj probówki przez krótki czas, aby usunąć pęcherzyki i pianę. Aby wyekstrahować DNA z próbek mikrobioty, przenieś 350 mikrolitrów supernatantu próbki do nowej probówki z zatrzaskiem o pojemności 1,5 mililitra, bez żadnych zanieczyszczeń.
Dodać 500 mikrolitrów alkoholu fenolo-chloroformowego:izoamylowego w stosunku 25:24:1 i wirować przez jedną minutę. Po odwirowaniu przenieś 180 mikrolitrów górnej fazy wodnej do nowej, 1,5-mililitrowej probówki z zatrzaskiem. Dodaj 180 mikrolitrów chloroformu, odwróć i wymieszaj.
Z tego przenieś 180 mikrolitrów fazy wodnej do nowej probówki z zatrzaskiem. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 180 mikrolitrów zimnego izopropanolu i 36 mikrolitrów pięciomolowego octanu amonu. Odwróć go kilka razy, aby wymieszać i umieść rurkę na lodzie na 20 minut.
Wyrzucić supernatant, a następnie kilkakrotnie przemyć granulki 500 mikrolitrami zimnego 70% etanolu. Wyrzuć supernatant i wysusz probówkę do góry nogami na bibułce przez 20 minut, aż granulka stanie się przezroczysta. Zawieś pastylkę w 50 mikrolitrach wody molekularnej i podgrzej ciecz w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby całkowicie rozpuścić duże granulki DNA.
Po podgrzaniu odwirować te probówki z prędkością 3 400 razy G przez jedną minutę, aby odzyskać kropelki kondensatu z pokrywki. Zmierzyć stężenie i uzyskać stosunek 260/280 za pomocą spektrofotometru. Stosunek dobrej jakości DNA wynosi zwykle od 1,8 do dwóch.
Odwirować przygotowane próbki w temperaturze 600 razy G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie wyślij 20 mikrolitrów próbek o stężeniach od jednego do 50 nanogramów na mikrolitr do Argonne National Laboratory w celu sekwencjonowania. Szczep myszy pozbawiony receptora CX3CR1 ma inny skład mikrobioty jelitowej w porównaniu z myszami typu dzikiego MRL/lpr, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, wykazuje znaczące różnice w niektórych rodzajach, istotnych dla bakterii potencjalnie chorobotwórczych, takich jak te z gromady Proteobacteria.
Zachowaj ostrożność z zanieczyszczeniem próbki. Musi być sterylny. Ważne jest również, aby pipetować z dużą dokładnością podczas przenoszenia supernatantu do nowej probówki.
Ta metoda jest odpowiednia do analiz molekularnych, takich jak PCR, trawienie enzymami restrykcyjnymi lub budowa biblioteki genomowej. W toczniu udowodniliśmy silny związek między mikrobiotą jelitową a progresją tocznia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia prostą i kosztowo efektywną metodę izolacji DNA do analizy zmian w mikrobiocie jelitowej myszy podczas rozwoju choroby autoimmunologicznej. Metoda ta została opracowana w celu badania dynamiki mikrobioty jelitowej w modelach mysich chorób autoimmunologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Mikrobiologia
- Autoimmunologia
Wstęp
- Zrozumienie mikrobioty jelitowej jest kluczowe w badaniach nad chorobami autoimmunologicznymi.
- Obecne metody izolacji DNA mogą być kosztowne i skomplikowane.
- Niniejsze badanie proponuje bardziej wydajną i opłacalną alternatywę.
- Próbki kału są wykorzystywane do analizy zmian w mikrobiocie.
Cel badania
- Zapewnienie niezawodnej metody ekstrakcji DNA z próbek kału.
- Umożliwienie badania mikrobioty jelitowej w modelach chorób autoimmunologicznych.
- Porównanie wydajności nowej metody z dostępnymi komercyjnie zestawami.
Zastosowane metody
- Indywidualne zbieranie kulek kału od myszy.
- Przechowywanie próbek w temperaturze -80 °C.
- Stosowanie sterylnych narzędzi do obróbki próbek.
- Przygotowanie próbek z użyciem buforu lizującego i szklanych kulek.
Główne wyniki
- Proponowana metoda pozwala uzyskać jakość DNA porównywalną z zestawami komercyjnymi.
- Jest ona kosztowo efektywna i wydajna w analizie mikrobioty.
- Ułatwia dalsze badania nad mechanizmami chorób autoimmunologicznych.
Wnioski
- Ta metoda izolacji DNA jest cennym narzędziem dla badaczy.
- Wspiera ona badanie mikrobioty jelitowej w kontekście chorób.
- Ułatwia prowadzenie bardziej dostępnych badań w dziedzinie autoimmunologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna analiza dynamiki mikrobioty jelitowej w modelach chorób autoimmunologicznych jest kluczowa dla zrozumienia wpływu czynników środowiskowych i genetycznych na progresję choroby. Niniejszy kosztowo efektywny protokół izolacji DNA umożliwia skalowalną i powtarzalną ekstrakcję bakteryjnego DNA z próbek kału myszy, wspierając wysokoprzepustowe badania mikrobiomu w badaniach przedklinicznych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w wiązaniu zmian w mikrobiocie z fenotypami autoimmunologicznymi, co wspomaga wczesne etapy odkryć i strategie translacyjne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie interakcji między mikrobiotą a układem odpornościowym w modelach mysich istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera walidację funkcjonalną potencjalnych szlaków pod wpływem składu mikrobioty jelitowej.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez łączenie zmian w mikrobiocie z progresją chorób autoimmunizacyjnych.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia standaryzowane, powtarzalne próbki DNA do późniejszego sekwencjonowania oraz analiz molekularnych.
- Gwarantuje uzyskanie ilościowego, wysokiej jakości DNA, odpowiedniego do procedur PCR oraz przepływów pracy w sekwencjonowaniu nowej generacji.
- Umożliwia skalowalne przetwarzanie próbek do porównawczych badań mikrobiomu w różnych kohortach eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie przedklinicznego profilowania mikrobioty z progresją choroby oraz działaniami w zakresie odkrywania biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość między wynikami uzyskanymi na etapie odkryć a walidacją translacyjną w modelach autoimmunologicznych.
- Zmniejsza niejednoznaczność biologiczną w łączeniu czynników środowiskowych z fenotypami chorób.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół izolacji DNA wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkryć po badania przedkliniczne, umożliwiając rzetelną analizę mikrobiomu w modelach mysich z predyspozycją do tocznia oraz wspierając identyfikację głównych kandydatów terapeutycznych i badania mechanistyczne.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących modulacji odporności napędzanej przez mikrobiotę w autoimmunizacji.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki DNA do profilowania mikrobiomu w oparciu o sekwencjonowanie.
- Analityka: Zapewnia wysokiej jakości dane wejściowe do statystycznego porównania zmian w społecznościach mikrobiologicznych pomiędzy genotypami lub wariantami leczenia.
- Badania translacyjne: Łączy przedkliniczne odkrycia w zakresie mikrobiomu z potencjalnym opracowaniem biomarkerów w chorobach autoimmunologicznych.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalny, kosztowo efektywny protokół, który można dostosować do różnych modeli mysich i projektów eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie powiązań między mikrobiotą a chorobami oraz walidację celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ekstrakcję DNA, poprawiając powtarzalność i skalowalność w różnych badaniach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji typu go/no-go poprzez wyjaśnienie roli mikrobiomu w mechanizmach chorobowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację interwencji modulujących mikrobiom w potokach badawczych nad chorobami autoimmunologicznymi z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy technicznej w zakresie sterylnego obchodzenia się z próbkami i przepływów pracy w biologii molekularnej.
- Wymaga dostępu do homogenizatorów, wirówek i spektrofotometrów w celu kontroli jakości.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji międzyzespołowej w celu zminimalizowania zanieczyszczeń i zmienności.
- Metoda jest adaptowalna do różnych modeli mysich, ale może wymagać optymalizacji dla różnych typów próbek.
- Zależna od precyzyjnego pipetowania i techniki sterylnej w celu zapewnienia integralności danych.
