Formułowanie i charakterystyka systemu nośników dopaminy opartego na egzosomach

Egzosomy mogą reagować na pęcherzyki wydzielane przez komórkę o wielkości od 14 do 200 nanometrów i rozdzielane w ładunku wewnątrzkomórkowym i komunikacji, co stanowi najmniejszą podgrupę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Egzosomy, które powstają w wyniku różnicowania endosomu, pochodzą z błony komórkowej. Komórki macierzyste mogą być izolowane z różnych źródeł, takich jak szpik kostny lub tkanka tłuszczowa.

ale dorosłe wysuszone komórki macierzyste mają wyższy potencjał immunogenny Minusy wyrastając wielkości egzosomów, mówi się, że odgrywają ważną rolę w chorobach ośrodkowego układu nerwowego, ponieważ mogą przenikać do bariery krew-mózg. Na początek umyj mezenchymalne komórki macierzyste z galaretką Whartona za pomocą pięciu mililitrów PBS. Następnie dodaj pięć mililitrów roztworu EDTA trypsyny przed umieszczeniem kolby w inkubatorze.

Po inkubacji zebrać komórki i odwirować przy stężeniu 1,500 G przez pięć minut. Następnie usuń supernatant i dodaj do probówki jeden mililitr DMEM-F12 zawierający 10% FBS. Przemyć wyhodowane komórki PBS.

Po umyciu dodaj do komórek pożywkę DMEM-F12 wolną od surowicy i umieść ją w inkubatorze. Aby wyizolować egzosomy, zbierz pożywkę wolną od surowicy i odwiruj w temperaturze 300 G w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Przenieść supernatant do innej probówki i przetworzyć go przez szeregowe wirowanie z wyższymi prędkościami.

Po końcowym odwirowaniu powoli usunąć supernatant i rozpuścić osad w jednym mililitrze PBS. Wymieszać przez wirowanie i kontynuować ultrawirowanie w temperaturze 110 000 G przez 70 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj trzy mililitry PBS do zawiesiny egzosomów zebranej wcześniej przez ultrawirowanie i wysterylizuj rozcieńczoną zawiesinę przez filtrację za pomocą filtra 0,22 mikrona.

Następnie przenieś 500 mikrolitrów wysterylizowanej zawiesiny egzosomu do innej probówki. Następnie kolejno dodaj 500 mikrolitrów 0,5 miligrama na mililitr roztworu dopaminy i saponiny do wysterylizowanej zawiesiny. Po inkubacji ultraodwirować zawiesinę.

Próbka może być wykorzystana do analizy NTA i DLS w celu scharakteryzowania egzosomów naładowanych dopaminą lub przechowywana w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu dalszego wykorzystania. W analizie NTA średni rozmiar egzosomów pochodzących z galaretki Whartona określono na 98 nanometrów, a egzosomów naładowanych dopaminą na 110 nanometrów. Liczby nanocząstek ujawnione w analizach NTA i DLS były ze sobą zgodne.

Potencjał zeta egzosomów pochodzących z galaretki Whartona mierzono jako minus 15,7, a egzosomów naładowanych dopaminą jako minus 17,6 miliwoltów. Analiza HPLC egzosomów naładowanych dopaminą wykryła szczyt dopaminy po 6,45 minuty. Skumulowany profil uwalniania leku ujawnił, że 74,8% kapsułkowanej dopaminy zostało uwolnione z egzosomów w ciągu pierwszych ośmiu godzin.

Badano cytotoksyczność egzosomów naładowanych dopaminą i wolnych egzosomów na fibroblastach. Chociaż egzosomy naładowane dopaminą nie wykazywały żadnych efektów cytotoksycznych, saponina zmniejszała żywotność fibroblastów. Test MTT wykazał zwiększoną żywotność komórek, gdy fibroblasty były traktowane egzosomami naładowanymi dopaminą.

Istotność statystyczną wyników oceniono, wykonując jednoczynnikową analizę. Dodatkowo badano cytotoksyczne działanie różnych stężeń wolnych egzosomów na fibroblasty. Żywotność fibroblastów była wyższa w przypadku wolnych egzosomów w stężeniu 25 mikrolitrów na mililitr.

Jest to bardzo ważne dla ośrodkowego układu nerwowego, rozmiar pacjenta, rola w procesach takich jak plastyczność, reakcja neurologiczna, komunikacja boczna i neurogeneza w mózgu. Ponadto, dzięki powierzchni egzosomów, zaobserwowano, że mogą one wchodzić w interakcje z lekiem komórki docelowej i aktywnością dostarczaną podczas leku jest zakończeniem. Po raz pierwszy w badaniu opracowaliśmy nową formułę leku poprzez kapsułkowanie dopaminy w egzosomach pochodzących z komórek macierzystych.

Zasugerował, że ten preparat będzie tak obiecujący w leczeniu choroby Parkinsona.