Analiza ilościowa właściwości lepkosprężystych krwinek czerwonych przy użyciu pęsety optycznej i mikroskopii defoksyjnej
25 marca 2022
Tutaj opisany jest zintegrowany protokół oparty na pęsetach optycznych i mikroskopii defoksyjnej do pomiaru właściwości reologicznych komórek. Protokół ten ma szerokie zastosowanie w badaniu właściwości lepkosprężystych erytrocytów w zmiennych warunkach fizjopatologicznych.
Metodologia ta pozwala na zbadanie mechanicznego zachowania erytrocytów, scharakteryzowanie ich parametrów lepkosprężystych i miękkich szklistych cech w kilku stanach fizjologicznych i patologicznych. Nasza metoda oparta na pojedynczych komórkach weryfikuje referencje wideo, wykorzystując wartości metalu dla współczynnika kształtu, który odnosi się do sił i przemieszczeń, naprężeń i zadrapań na powierzchni erytrocytów. Zacznij od wylania smaru silikonowego na powierzchnię gumowego pierścienia w taki sposób, aby pokryć cały obwód.
Następnie umieść gumowy pierścień na szkiełku nakrywkowym stroną smarowaną w stronę szkiełka nakrywkowego. Odczekaj pięć minut na prawidłowe przymocowanie, a posiadacze próbek są gotowi do przyjęcia kultury komórkowej. Następnie, roztworem komórek przygotowanych wcześniej zgodnie z pisemnym protokołem, wysiewaj komórki w uchwycie na próbki.
Dodać 0,2 mikrolitra roztworu kuli polistyrenowej o stężeniu 10% objętości do próbki. Umieść drugie szkiełko nakrywkowe nad gumowym pierścieniem. Zamknij konfigurację i zakończ przygotowanie próbki.
Na koniec przenieś całą próbkę do mikroskopu. Aby rozpocząć eksperymenty, użyj systemu OT, uwięzij kulę za pomocą lasera OT, a następnie przymocuj ją do szkiełka nakrywkowego, blisko komórki. Następnie uwięzić kolejną kulę i powtórzyć tę samą procedurę mocowania, dociskając kulę do powierzchni komórki, w pobliżu górnej powierzchni i blisko krawędzi komórki.
Dodaj sinusoidalną funkcję amplitudy i zmiennych częstotliwości. Następnie naciśnij przycisk start", używając stopnia piezoelektrycznego, aby umożliwić przemieszczenie piezoelektryczne. Utrzymać sferę RBC w pułapce i poddać próbkę cyklowi ruchów z wykorzystaniem wcześniej ustawionej funkcji sinusoidalnej.
W celu analizy otwórz oprogramowanie ImageJ i zaimportuj cały film uzyskany podczas ruchów sinusoidalnych. Kliknij dostosuj, a następnie wybierz próg opcji. Dostosuj próg za pomocą obu pasków przewijania i wybierz sferę odniesienia, klikając plik, a następnie prostokąt.
Następnie w zakładce analiza kliknij na ustaw pomiary" i wybierz środek masy"opcja. Kliknij ponownie zakładkę Analizuj i wybierz opcję Analizuj cząstki. Pojawi się nowe okno zawierające tabelę ze współrzędnymi xy dla środka bryły.
Powtórz procedurę dla drugiej kuli przymocowanej do powierzchni RBC. Otwórz oprogramowanie analityczne i zaimportuj wcześniej uzyskane pliki txt. Wygeneruj wykres ze środkami masy na osi y i czasem na osi x.
Wykreśl wyniki na wykresie, używając osi x dla stałej straty, oznaczonej przez K podwójnej liczby pierwszej, i osi y dla stałej przechowywania, oznaczonej przez K liczby pierwszej. Najpierw, w celu akwizycji wideo, przesuń stolik piezoelektryczny w kierunku xy, używając oprogramowania do wyszukania izolowanej komórki przymocowanej do szkiełka nakrywkowego. Złap i przymocuj kulę polistyrenową o znanej średnicy do powierzchni RBC.
Następnie, za pomocą stopnia piezoelektrycznego, przesuń uwięziony koralik przymocowany do powierzchni RBC, aby zdeformować komórkę, a następnie przymocuj koralik do pokrywy. Teraz zmień położenie osi z, aby znaleźć skoncentrowany obraz. Po ustaleniu pozycji użyj oprogramowania kamery, aby utworzyć film całej komórki.
Następnie przesuń pozycję osi z o dwa mikrometry w dół lub w górę, aby uzyskać rozmyty obraz dla wybranej komórki. Na koniec, bez zmiany położenia osi z, wyszukaj region bez komórek, aby powtórzyć tę samą procedurę i utwórz film z tłem obrazu. Aby uzyskać obraz kontrastowy, najpierw znajdź wartość N zero, kliknij ikonę wyboru wielokąta, a następnie kliknij kartę analizy i wybierz miarę.
Następnie użyj równania kontrastu, aby określić N obrazu minus N zero i wykonaj to, wybierając math"w procesie, a następnie odejmij. Później podziel wynik przez N zero minus B. Na koniec znajdź kontrast dla ostrych i rozmytych obrazów. Teraz użyj transformaty Hartleya, aby uzyskać grubość RBC.
W ImageJ kliknij proces, a następnie FFT"i opcje FFT, a następnie wybierz FHT. Następnie wykonaj transformację odwrotną FHT, wybierając proces, a następnie FFT"i FFT. Użyj wynikowego obrazu, aby uzyskać profil wysokości.
Po znalezieniu obrazu, który zawiera profil wysokości RBC, użyj dwóch mikrometrów rozmytego kontrastu, aby utworzyć zestaw dwóch obrazów w ImageJ. Aby znaleźć współczynnik kształtu, użyj makra dostosowanego do ImageJ do przeanalizowania stosu. Makro wyświetli tabelę z położeniem krawędzi, obwodem, odwrotnością obwodu i obrazem analizowanej komórki.
Sprawdź, czy krawędzie tego obrazu są podobne do krawędzi rysunku referencyjnego. W przeciwnym razie powtórz procedurę i użyj sumy odwrotności obwodu, aby znaleźć współczynnik kształtu. Zacznij od uporządkowania danych eksperymentalnych w tabeli.
Utwórz nową tabelę w oprogramowaniu analitycznym, klikając zakładkę Plik. Określ 10 różnych kolumn dla parametrów. Aby wykreślić krzywą G pierwszą i G podwójną pierwszą w oprogramowaniu analitycznym, użyj danych z poprzedniej tabeli i kliknij przycisk wykresu.
Aby uzyskać parametry Gamma i GM, kliknij zakładkę dopasowania krzywej i wybierz dopasowanie1", aby otworzyć nowe okno. Wybierz kwadrat, kliknij przycisk definiowania i wpisz równanie. Kliknij w porządku"przycisk w obu oknach, a pojawi się dopasowanie.
Następnie utwórz dwa inne wykresy, a mianowicie G prime i G double prime jako funkcję omega. Słupki błędów należy umieszczać tylko na osi y, jak pokazano wcześniej. Powtórz procedurę dopasowania krzywej, wybierz G"opcja.
Kliknij definicję krzywej"w obszarze dopasowania ogólnego, a następnie napisz odpowiednie równanie. Na koniec kliknij OK, a pojawi się dopasowanie krzywej wraz z wartościami Alpha i G zero. Ponownie wykonaj kolejną procedurę dopasowania krzywej.
Wybierz G"opcja, kliknij definicję krzywej"w obszarze dopasowania ogólnego, a następnie napisz odpowiednie równanie. Na koniec kliknij w porządku, a pojawi się dopasowanie krzywej. Rysunek przedstawia stałą sprężystości magazynowania w funkcji stałej sprężystości straty.
Zaobserwowana zależność liniowa pokazuje, że powierzchnię RBC można uznać za miękki szklisty materiał. Stosując wartości całkowitego współczynnika kształtu komórki i grubości powierzchni RBC, można określić wartości wykładnika alfa. Technika ta może stanowić podstawę dla nowych metod diagnostycznych, które korelują zmiany właściwości lepkosprężystych erytrocytów z modyfikacjami przepływu krwi u osób z różnymi patologiami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia zintegrowany protokół, który wykorzystuje optyczne pincety i mikroskopię z odchyleniem ogniskową w celu zbadania właściwości reologicznych erytrocytów. Metoda jest zaprojektowana do pomiaru właściwości viscoelasticznych czerwonych krwinek w zmieniających się warunkach fizjologicznych i patologicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Reologia komórek
- Właściwości viscoelasticzne
- Patofizjologiczne warunki
Tło
- Mechanika erytrocytów
- Miękkie szkliste materiały
- Znaczenie analizy pojedynczych komórek
Wykorzystane metody
- Optyczne pincety do wychwytywania i manipulowania komórkami
- Mikroskopia z odchyleniem ogniskową do obrazowania
- Oprogramowanie analityczne do przetwarzania danych
Główne wyniki
- Charakteryzacja parametrów viscoelasticznych erytrocytów
- Wykazano zachowanie szkliste w czerwonych krwinkach
- Zweryfikowano za pomocą odniesień wideo i analizy współczynnika kształtu
Wnioski
- Protokół skutecznie mierzy właściwości mechaniczne erytrocytów.
- Niniejsze badanie dostarcza informacji na temat złożonego zachowania czerwonych krwinek w różnych warunkach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative viscoelastic profiling of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy enables precise mechanical characterization under defined conditions. This approach supports predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for blood-related pathologies. Integrating rheological measurements into discovery workflows enhances portfolio decision-making for disease-relevant model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of erythrocyte mechanical properties across physiological and pathological states.
- Supports functional target validation by quantifying cell surface viscoelasticity and soft glassy behavior.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct measurement of storage and loss moduli.
- Improves predictive confidence for blood flow and cell deformability models.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized, reproducible protocols for single-cell mechanical assays.
- Delivers quantitative outputs such as elastic constants, shear modulus, and scaling exponents.
- Prepares validated systems for downstream compound screening targeting erythrocyte mechanics.
- Enables platform reuse for comparative studies across disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns viscoelastic parameters with disease-relevant biomarkers for translational studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in hematological disorders.
- Provides risk-adjusted data for advancing candidates affecting red blood cell mechanics.
- Offers predictive de-risking for interventions modulating cell deformability.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing robust mechanical phenotyping of erythrocytes.
- Discovery Biology: Quantitative hypothesis testing of cell mechanics and pathway involvement in disease.
- Screening: Standardized assay outputs enable reproducible comparison of mechanical interventions.
- Analytics: Delivers storage and loss moduli, form factor, and scaling exponents for statistical analysis.
- Translational Research: Connects mechanical phenotypes to disease biomarkers and preclinical endpoints.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted for other cell types or disease models requiring viscoelastic profiling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in erythrocyte-targeted programs.
- Operational Value: Promotes assay standardization, reproducibility, and scalability for high-throughput studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust mechanical data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates affecting red blood cell mechanics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical tweezers, defocusing microscopy, and single-cell analysis.
- Demands access to advanced imaging and piezoelectric instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of data analysis workflows using ImageJ and custom macros.
- Adaptation to other cell types may require protocol optimization for cell-specific properties.
- Practical limitations include throughput constraints and the need for precise environmental control.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Preparation of Sample Holders and Cell Cultures
1:30
OT‐Based Rheology Experiment and Analysis
3:12
Video and Contrast Image Acquisition
5:40
Soft Glassy Rheology Model and Experimental Analysis
7:03
Results: Characterizing RBC Surface from Values of K' (ω), K'' (ω), G', and G''
7:30
Conclusion
