Name: Identyfikacja aktywności hemolitycznej i fosfolipazy w surowych ekstraktach z ukwiałów morskich za pomocą prostych testów biologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji surowego jadu z ukwiałów morskich i identyfikacji aktywności hemolitycznej oraz fosfolipazowej. Protokół zapewnia szybkie i ekonomiczne badanie toksyn.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), z numerem grantu IT200819. Autorzy dziękują Tomowi Musselmanowi, Rock Paper Editing, LLC, za sprawdzenie angielskiej gramatyki tego manuskryptu; oraz pomoc techniczna ze strony Samanty Jiménez (CICESE, Ensenada) i Juana Manuela Barbosy Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Dziękujemy również dr Augusto Césarowi Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) za pozyskanie krwi owczej. Szczególne podziękowania kierujemy do dr José Sanigera Blesa z ICAT-UNAM za udostępnienie w jego laboratorium materiałów do nagrania wideo.

Aktinie zebrano zgodnie z wytycznymi Narodowej Komisji ds. Akwakultury, Rybołówstwa i Żywności Rządu Federalnego Meksyku (numer pozwolenia PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Komitet Bioetyki Instytutu Biotechnologii Narodowego Autonomicznego Uniwersytetu Meksyku zatwierdził wszystkie eksperymenty z udziałem aktinii. Próbka krwi owczej została zakupiona w Centrum Praktycznej Nauki i Badań nad Produkcją i Zdrowiem Zwierząt (CEPIPSA, Narodowy Autonomiczny Uniwersytet Meksyku).
1. Zbiór organizmów
<ol>
	<li>Zebrać ukwiały morskie A. dowii. 
	UWAGA: W tym przypadku organizmy zostały zebrane podczas odpływów w strefie międzyprzypływowej u wybrzeży Ensenada Baja w Kalifornii, Meksyk (Rysunek 1A,B).</li>
	<li>Przetransportować organizmy do laboratorium w pojemnikach z wodą morską (Rysunek 1C).</li>
	<li>W laboratorium ręcznie oczyścić organizmy wodą destylowaną, aby usunąć duże cząstki podłoża przylegające do ciała.</li>
	<li>Natychmiast zamrozić organizmy w temperaturze -80 °C w zamrażarce ultra niskotemperaturowej przez 72 h.</li>
	<li>Umieścić organizmy w specjalnych naczyniach do liofilizacji; warunki liofilizacji: -20 °C, 0,015 psi, przez 48 h.</li>
	<li>Przechowywać liofilizowane organizmy w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Nawadnianie tkanki
<ol>
	<li>Zrekonstytuować 20 g suchej masy liofilizowanych organizmów w 60 mL (1/3 m/v) 50 mM buforu fosforanowego sodu, pH 7.5, oraz 1 tabletce koktajlu inhibitorów (Tabela materiałów).</li>
	<li>W mieszalniku magnetycznym mieszać próbkę w sposób ciągły przy prędkości ~800 rpm, w temperaturze 4 °C przez 12 h.</li>
</ol>
3. Uwalnianie toksyny
<ol>
	<li>Aby wywołać lizę komórek i wyrzut nematocyst, zamrozić próbkę w temperaturze -20 °C przez 12 h, a następnie umieścić pojemnik w wodzie w temperaturze pokojowej (RT) aż do rozmrożenia w około 90%. Powtórzyć tę procedurę trzy razy. 
	UWAGA: Próbka nie powinna zostać rozmrożona w 100%; kluczowe jest utrzymanie próbki w temperaturze ~4 °C, aby zapobiec degradacji białek.</li>
	<li>Obserwować wyrzut nematocyst pod mikroskopem konfokalnym. Nanieść 10 µL próbki na szkiełko i przykryć szkiełkiem nakrywką. Obserwować pod mikroskopem konfokalnym przy powiększeniu 100x i 60x. W tym przypadku barwnik nie był konieczny.</li>
	<li>Przetworzyć obrazy zarejestrowane za pomocą mikroskopu konfokalnego w oprogramowaniu ImageJ (wersja 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).</li>
	<li>Jeśli rurka wewnątrz nematocysty rozwija się i znajduje się na zewnątrz, oznacza to, że nematocysty zostały wyrzucone; wówczas należy przejść do następnego kroku. W przeciwnym razie należy przeprowadzić jeszcze jeden cykl zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Aby oczyścić ekstrakt, wirować próbkę przy 25 400 x g przez 40 min w temperaturze 4 °C, zebrać nadsącz i ponownie go odwirować. Powtórzyć ten krok 3-4 razy.</li>
	<li>Zebrać nadsącz i odrzucić osad. Nadsącz lub ekstrakt surowy zawiera składniki jadu (toksyny) oraz inne cząsteczki komórkowe, takie jak lipidy, węglowodany i kwasy nukleinowe.</li>
</ol>
4. Oznaczenie całkowitej zawartości białka
<ol>
	<li>Oznaczyć stężenie białka w ekstrakcie surowym, wykorzystując komercyjny zestaw do kolorymetrycznego oznaczenia białek metodą Bradforda15 (Tabela materiałów).</li>
	<li>Rozcieńczyć odczynnik barwiący (jedna część barwnika na cztery części wody destylowanej).</li>
	<li>Przygotować roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA) Fraction V (Tabela materiałów) o stężeniu 1 mg/mL w buforze fosforanowym (50 mM fosforanu sodu, pH 7,5).</li>
	<li>Przygotować roztwory wymienione w Tabeli 1 w trzech powtórzeniach.</li>
	<li>Każdy roztwór energicznie wymieszać w wytrząsarce przez 4 s.</li>
	<li>Inkubować próbki przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT), bez wytrząsania.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję (AU) przy 595 nm.</li>
	<li>Wykreślić średnie wartości absorbancji próbek BSA (AU w funkcji stężenia białka) i wyznaczyć równanie prostej dla wykresu (Równanie 1). 
	<img alt="Wzór równania liniowego y=mx+b, pojęcie matematyczne." src="/files/ftp_upload/63630/63630eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">     Równanie 1 
	gdzie y to absorbancja, m to nachylenie prostej, x to stężenie białka, a b to punkt przecięcia z osią y. Aby obliczyć stężenie w ekstrakcie surowym, wyznaczyć wartość x w następujący sposób: 
	<img alt="Wzór równania liniowego \(x = (y-b)/m\), pojęcie algebraiczne, analiza matematyczna." src="/files/ftp_upload/63630/63630eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2">     Równanie 2</li>
</ol>
5. Określenie złożoności polipeptydowej jadu
<ol>
	<li>Złóż szklaną kasetę do pionowej elektroforezy żelowej zgodnie z instrukcją obsługi.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę akrylamidu (30%): 29,2 g akrylamidu, 0,8 g bis-akrylamidu, do końcowej objętości 100 mL. Przefiltruj roztwór przez membranę 0,45 µm. Przechowuj roztwór w ciemnej butelce w temperaturze 4 °C. Następnie przygotuj mieszaninę do żelu rozdzielczego (Tabela 2).</li>
	<li>Żel SDS-PAGE składa się z żelu rozdzielczego i żelu koncentrującego. Przygotuj żele zgodnie z objętościami roztworów określonymi w Tabeli 2. Podczas przygotowania należy utrzymywać każdą mieszaninę w temperaturze 4 °C, aby ograniczyć czas polimeryzacji. 
	UWAGA: Objętość każdej mieszaniny różni się w zależności od marki użytego sprzętu; w tym protokole objętości odpowiadają przygotowaniu żelu akrylamidowego 15%, o grubości 0,75 mm, do pionowej komory elektroforetycznej (Tabela materiałów).</li>
	<li>Po spolimeryzowaniu akrylamidu, po ok. 10 min, dodaj mieszaninę żelu koncentrującego.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę żelu koncentrującego, bezzwłocznie wlej ją na płyty szklane i umieść grzebień w celu uformowania studzienek do nakładania próbek.</li>
	<li>Po spolimeryzowaniu żelu koncentrującego (ok. 15 min) wyjmij grzebień i umieść szklaną kasetę w komorze do pionowej elektroforezy.</li>
	<li>Wlej 200 mL buforu elektrody (0,25 M Tris, 0,192 M glicyna, 0,1% SDS) do komory elektroforetycznej.</li>
	<li>Przeanalizuj ekstrakt surowy: zmieszaj 30 µg ekstraktu surowego z 5 µL buforu do nakładania białek (25% glicerolu, 15% dodecylosiarczanu sodu, 25% 2-merkaptoetanolu, 0,125 mM Tris pH 7, błękit bromofenolowy 0,1 mg/mL), aby zdenaturować białka. Końcowa objętość musi wynosić &lt;50 µL.</li>
	<li>Podgrzewaj w temperaturze 90 °C przez 5 min, wystudź i odwiruj przez 3 s przy 1 400 x g.</li>
	<li>Nanieś próbki do studzienek żelu koncentrującego. Nanieś standardowy marker masy cząsteczkowej.</li>
	<li>Prowadź elektroforezę przy stałym natężeniu 25 mA przez 1 h 30 min.</li>
	<li>Wyjmij szklane kasety z komory elektroforetycznej, aby przystąpić do barwienia białek w żelu.</li>
</ol>
6. Barwienie białek
<ol>
	<li>Przepłucz żel w 50 mL wody destylowanej, aby usunąć zanieczyszczenia z elektrody buforowej.</li>
	<li>Wodę wylej.</li>
	<li>Aby zapobiec dyfuzji białek z żelu, dodaj roztwór utrwalający (60 mL etanolu, 20 mL kwasu octowego i 20 mL wody destylowanej, objętość końcowa 100 mL). Inkubuj w temperaturze RT przez 40 min przy wstrząsaniu z prędkością 80 rpm. Odlej roztwór.</li>
	<li>Dodaj roztwór do sieciowania białek (15 mL etanolu, 0,25 mL glutaraldehydu, 50 mL wody destylowanej, objętość końcowa 65,25 mL) i inkubuj przez 30 min w temperaturze RT przy wstrząsaniu z prędkością 80 rpm. Usuń roztwór.</li>
	<li>Przemyj żel 100 mL wody destylowanej przez 5 min, a następnie usuń wodę. Powtórz tę procedurę cztery razy.</li>
	<li>Przeprowadź barwienie białek za pomocą 50 mL przefiltrowanego roztworu Coomassie brilliant blue R-250 (40% metanolu, 10% kwasu octowego, 50% wody destylowanej, 0,1% barwnika, objętość końcowa 100 mL), mieszając z prędkością 60 rpm w laboratoryjnym oscylatorze obrotowym w temperaturze RT przez 15 min.</li>
	<li>Odzyskaj roztwór, który można wykorzystać do barwienia innych żeli.</li>
	<li>Aby usunąć nadmiar barwnika, dodaj roztwór odbarwiający (40 mL metanolu, 10 mL kwasu octowego, 50 mL wody destylowanej). Kontynuuj mieszanie (80 rpm) w temperaturze RT, aż do momentu zwizualizowania prążków (zbarwionych białek).</li>
	<li>Przechowuj żel w 50 mL wody destylowanej i wykonaj skan obrazu w systemie dokumentacji żeli.</li>
</ol>
7. Przygotowanie zawiesiny erytrocytów
<ol>
	<li>Pobrać 1 mL krwi z żyły szyjnej owcy.</li>
	<li>Zdjąć igłę ze strzykawki i niezwłocznie przelać krew do probówki zawierającej 50 mL roztworu Alsevera (0,002 M kwasu cytrynowego, 0,07 M NaCl, 0,1 M dekstrozy oraz 0,027 M cytrynianu sodu jako antykoagulanta, pH 7,4).</li>
	<li>Powoli odwrócić probówkę z roztworem trzy razy.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu transportu do laboratorium.</li>
	<li>Wirować przy 804 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C i odrzucić nadsącz.</li>
	<li>Resuspender osad w 30 mL roztworu Alsevera. Dodać roztwór, spływając nim po wewnętrznych ściankach probówki, a następnie za pomocą plastikowej pipety Pasteura powoli resuspender komórki. Ponownie wirować przy 804 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Powtarzać tę procedurę do czasu uzyskania klarownego nadsączu.</li>
	<li>Dodać 15 mL roztworu Alsevera; powoli resuspender osad za pomocą plastikowej pipety Pasteura.</li>
	<li>Dostosować końcową objętość roztworu Alsevera tak, aby uzyskać stężenie wynoszące około 2 x 106 komórek/mL. Następnie użyć komory Neubauera lub hemocytometru do policzenia komórek. 
	UWAGA: Erytrocyty należy liczyć na szkiełku hemocytometru (udoskonalony Neubauer). Szkiełko ma wymiary 30 mm x 70 mm x 4 mm. W centrum znajdują się dwie srebrne podstawki (Rysunek 2A) (jedna siatka górna i jedna dolna), każda o wymiarach 3 mm x 3 mm, oraz dwa kanały po bokach siatki. Liczenie komórek odbywa się w kwadratach narożnych i środkowym (czerwone kwadraty na Rysunku 2B). Optymalne stężenie komórek do liczenia powinno być rzędu 106 komórek. Pole powierzchni środkowego kwadratu wynosi 0,1 cm2, co odpowiada 0,0001 mL.</li>
	<li>Nałożyć na szkiełko dewizorkę.</li>
	<li>Nanieść 10 µL próbki pomiędzy szkiełko a dewizorkę i odczekać, aż próbka się rozprowadzi.</li>
	<li>W mikroskopie optycznym (powiększenie 60x) przeprowadzić liczenie w pierwszym kwadracie. Liczyć tylko komórki w środkowej siatce oraz te, które dotykają górnej lub lewej krawędzi kwadratu.</li>
	<li>Wyznaczyć stężenie komórek, korzystając z poniższego równania: 
	<img alt="Wzór na obliczenie stężenia, liczba komórek, równanie matematyczne, schemat edukacyjny." src="/files/ftp_upload/63630/63630eq03v4.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3"> Równanie 3 
	Jeśli próbka jest bardzo skoncentrowana i wymagane jest rozcieńczenie, należy użyć następującego równania: 
	<img alt="Wzór na stężenie komórek: (liczba komórek x 10 000)/(liczba kwadratów x rozcieńczenie); równanie." src="/files/ftp_upload/63630/63630eq04v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 4"> Równanie 4 
	UWAGA: Pobierając roztwór erytrocytów do testu hemolizy, należy powoli uhomogenizować roztwór za pomocą plastikowej pipety Pasteura.</li>
	<li>Wykonać kroki w trzech powtórzeniach, aby zminimalizować błąd.</li>
</ol>
8. Test hemolizy
<ol>
	<li>Przygotować mieszaniny roztworów (w trzech powtórzeniach) wskazane w Tabeli 3 w stożkowych płytkach 96-dołkowych. 
	UWAGA: Erytrocyty mieszać powoli, aby utrzymać jednorodną zawiesinę.</li>
	<li>Inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C, bez wytrząsania.</li>
	<li>Wirować płytkę z prędkością 804 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść nadsącz do drugiej płytki 96-dołkowej z płaskim dnem.</li>
	<li>Jeśli ekstrakt surowy zawiera cytolizyny, erytrocyty ulegną lizie i uwolnią hemoglobinę. Odczytać absorbancję przy 415 nm.</li>
	<li>Obliczyć procent hemolizy, korzystając z następującego równania: 
	% Hemolysis = ((Acrude extract-AAlsever buffer) / (AH2O-AAlsever)) x 100 
	UWAGA: Acrude extract, AAlsever buffer oraz AH2O odpowiadają odpowiednio absorbancji erytrocytów z ekstraktem surowym, absorbancji roztworu Alsevera oraz absorbancji wody destylowanej.</li>
	<li>Wykonując test hemolizy przed i po każdym cyklu zamrażania i rozmrażania, użyć 50 µg całkowitego białka z ekstraktu surowego.</li>
	<li>Określić liczbę cykli zamrażania i rozmrażania niezbędnych do osiągnięcia 100% aktywności hemolitycznej.</li>
	<li>Obliczyć ilość ekstraktu wywołującą hemolizę u 50% erytrocytów (HU50); postępować zgodnie z protokołem opisanym w Tabeli 3, zwiększając ilość surowego ekstraktu z ukwiału morskiego, a następnie wykreślić wykres z dopasowaniem sigmoidalnym przy użyciu odpowiedniego oprogramowania (np. Origin, Tabela materiałów).</li>
</ol>
9. Analiza aktywności fosfolipazy
<ol>
	<li>Umyć jedno jajo kurze 1% SDS w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Oddzielić żółtko od białka jaja w warunkach sterylnych.</li>
	<li>Przygotować 50 mL 0,86% roztworu NaCl i przefiltrować go przez filtr 0,22 µm. Następnie przygotować Roztwór A: dodać 12 mL żółtka jaja i 36 mL 0,86% roztworu NaCl.</li>
	<li>Przygotować Roztwór B: wymieszać 300 mg agarozy w 50 mL buforu (50 mM Tris, pH 7,5) i przefiltrować przez filtr 0,22 µm. Podgrzewać roztwór w mikrofalówce do wrzenia. Schłodzić w ciepłej wodzie do osiągnięcia temperatury 43-45°C.</li>
	<li>Przygotować Roztwór C: przygotować 10 mM CaCl2 i przefiltrować go przez filtr 0,22 µm.</li>
	<li>Przygotować Roztwór D: 10 mg rodaminy 6G w 1 mL wody destylowanej.</li>
	<li>W warunkach sterylnych (w komorze z laminarnym przepływem powietrza) dodać 500 µL roztworów A i C do roztworu B oraz 100 µL roztworu D, wymieszać i wlać po 25 mL do każdej szalki Petriego (90 x 15 mm).</li>
	<li>Odczekać do zastygnięcia roztworu w warunkach sterylnych (30 min).</li>
	<li>Wyciąć dołki (~2-3 mm średnicy) za pomocą cienkiej rurki.</li>
	<li>Wprowadzić łącznie 20 µL buforu fosforanowego (kontrola negatywna) do jednego dołka oraz 20 µL określonej fosfolipazy (kontrola pozytywna) do innego dołka.</li>
	<li>Wprowadzić różne ilości białka z ekstraktu surowego: 5, 15, 25, 35, 45 µg do pozostałych dołków, w końcowej objętości 20 µL dla każdego.</li>
	<li>Odczekać, aż agar zaadsorbuje wszystkie próbki (30 min).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 h.</li>
	<li>Powstanie halo wokół dołka wskazuje na aktywność fosfolipazy. Zmierzyć średnicę powstałego halo za pomocą suwmiarki. 
	UWAGA: Przeprowadzić eksperyment w trzech powtórzeniach (kroki od 9.1 do 9.14).</li>
</ol>

<ol><li>Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+anemone+%28Cnidaria%2C+Anthozoa%2C+Actiniaria%29+toxins%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview.</a> Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).</li>
<li>Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cnidarian+toxins%3A+recent+evidences+for+potential+therapeutic+uses%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Zoological+Journal%22%5BJournal%5D)">Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses.</a> The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).</li>
<li>Ramírez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodríguez-Almazán, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinoporins%3A+From+the+structure+and+function+to+the+generation+of+biotechnological+and+therapeutic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools.</a> Biomolecules. 10 (4), 539(2020).</li>
<li>Fautin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+diversity%2C+systematics%2C+and+evolution+of+cnidae.+Toxicon%5BTitle%5D)+AND+%22Official+Journal+of+the+International+Society+on+Toxinology%22%5BJournal%5D)">Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon.</a> Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).</li>
<li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+soluble+protein+contents+from+the+nematocysts+of+a+model+sea+anemone+sheds+light+on+venom+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution.</a> Marine Biotechnology. 15 (3), New York, N.Y. 329-339 (2013).</li>
<li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxin+localization+to+ectodermal+gland+cells+uncovers+an+alternative+mechanism+of+venom+delivery+in+sea+anemones%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).</li>
<li>Grabski, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+preparation+of+biological+extracts+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Advances in preparation of biological extracts for protein purification.</a> Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).</li>
<li>Bulati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+purified+extracts+of+sea+anemone+Anemonia+viridis+affect+the+growth+and+viability+of+selected+tumour+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines.</a> BioMed Research International. 2016, 3849897(2016).</li>
<li>Orts, D. J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+electrophysiological+characterization+of+two+sea+anemone+type+1+potassium+toxins+from+a+geographically+distant+population+of+Bunodosoma+caissarum%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum.</a> Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).</li>
<li>Hader, D., Erzinger, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHader%2C+D+%22Bioassays%3A+Advanced+Methods+and+Applications%22">Bioassays: Advanced Methods and Applications</a>. , Elsevier Science. (2017).</li>
<li>Anderluh, G., Macek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytolytic+peptide+and+protein+toxins+from+sea+anemones+%28Anthozoa%3A+Actiniaria%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+on+Toxinology%22%5BJournal%5D)">Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria).</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).</li>
<li>Nevalainen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+A2+in+cnidaria%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Part+B%2C+Biochemistry+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipase A2 in cnidaria.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).</li>
<li>Razpotnik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+phospholipase+A2+isolated+from+the+sea+anemone+Urticina+crassicornis+-+its+primary+structure+and+phylogenetic+classification%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis - its primary structure and phylogenetic classification.</a> The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).</li>
<li>Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -H., Magrioti, V., Kokotos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+A2+enzymes%3A+Physical+structure%2C+biological+function%2C+disease+implication%2C+chemical+inhibition%2C+and+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention.</a> Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663(2015).</li>
<li>Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+a+venom+extract+from+the+sea+anemone%2C+Bunodosoma+cavernata%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+on+Toxinology%22%5BJournal%5D)">Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).</li>
<li>Morales-Landa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial%2C+antiprotozoal%2C+and+toxic+activities+of+Cnidarian+extracts+from+the+Mexican+Caribbean+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Biology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea.</a> Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).</li>
<li>Sánchez-Rodríguez, J., Cruz-Vazquez, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+biological+characterization+of+neurotoxic+compounds+from+the+sea+anemone+Lebrunia+danae+%28Duchassaing+and+Michelotti%2C+1860%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860).</a> Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).</li>
<li>de Oliveira, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caissarolysin+I+%28Bcs+I%29%2C+a+new+hemolytic+toxin+from+the+Brazilian+sea+anemone+Bunodosoma+caissarum%3A+purification+and+biological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).</li>
<li>Norton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterisation+of+proteins+with+cardiac+stimulatory+and+haemolytic+activity+from+the+anemone+Actinia+tenebrosa%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+on+Toxinology%22%5BJournal%5D)">Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).</li>
<li>Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crude+extract+from+the+sea+anemone%2C+Bunodosoma+caissarum+elicits+convulsions+in+mice%3A+possible+involvement+of+the+glutamatergic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+on+Toxinology%22%5BJournal%5D)">The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).</li>
<li>Dion, A. S., Pomenti, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammoniacal+silver+staining+of+proteins%3A+mechanism+of+glutaraldehyde+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement.</a> Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).</li>
<li>Ramírez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pore-forming+protein+from+sea+anemone+Anthopleura+dowii+Verrill+%281869%29+venom+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Venomous+Animals+and+Toxins+Including+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry.</a> The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418(2019).</li>
<li>Nelson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+lipids+of+sheep+red+blood+cells.+I.+Lipid+composition+in+low+and+high+potassium+red+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells.</a> Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).</li>
<li>Ramírez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+and+proteomic+analysis+of+the+tentacles+and+mucus+of+Anthopleura+dowii+Verrill%2C+1869%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869.</a> Marine Drugs. 17 (8), 436(2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu w związku z publikacją niniejszego artykułu.

Duże zapotrzebowanie na nowe związki mające zastosowanie w różnych dziedzinach nauki i przemysłu doprowadziło do badań nad jadem. Jad stanowi bogate źródło cząsteczek, które służy jako matryca do generowania nowych narzędzi molekularnych. Jednak złożoność tych jadów wymaga wdrożenia i połączenia różnych metod ich pozyskiwania i badania.
Tutaj pokazujemy metodę pozyskiwania i analizy jadu ukwiałów Anthopleura dowii, Verrill 1869, którą można wykorzystać do zbadania jadu innych gatunków...

Zwierzęta morskie są bogatym źródłem biologicznie aktywnych związków. W ostatnich dziesięcioleciach skład jadu ukwiałów przyciągnął uwagę naukowców, ponieważ obejmuje on różnorodność polipeptydów o działaniu hemolitycznym, cytotoksycznym, enzymatycznym (fosfolipaza, proteaza, chitynaza) i neurotoksycznym oraz hamującym wpływ na aktywność proteolityczną1. Ponadto polipeptydy te są potencjalnymi źródłami rozwoju narzędzi molekularnych w zastosowaniach biotechnologicznych i terapeutycznych2,3.
Istnieje niewiele doniesień na temat jadu ukwiałów i jego składników molekularnych ze względu na złożoność pozyskiwania jadu, nawet izolacji i charakterystyki toksyn. Metody ekstrakcji użyte w raportach obejmowały lizę i opróżnianie zawartości komórek, które są związane i niezwiązane z produkcją jadu1.
Szczególną cechą wszystkich parzydełkowców jest brak systemu produkcji i uwalniania jadu skoncentrowanego w jednym obszarze anatomicznym. Zamiast tego nematocysty są strukturami, które utrzymują klasę Venom<sup="xref">4,5. Inne typy komórek, zwane komórkami gruczołów naskórka, również wydzielają toksyny i są również rozmieszczone w całym ciele ukwiałów6.
Pierwszym i najważniejszym wyzwaniem w uzyskaniu jadu jest wytworzenie ekstraktu z wystarczającą manipulacją w kolejnych procesach, bez inaktywacji lub degradacji labilnych białek. Następnie komórki muszą zostać poddane lizie, a składniki - w tym przypadku polipeptydy muszą być skutecznie i szybko wyekstrahowane, unikając proteolizy i hydrolizy, jednocześnie eliminując inne składniki komórkowe7.
Różne metody są używane do uzyskania surowego ekstraktu z ukwiału; niektóre polegają na poświęceniu organizmu, podczas gdy inne pozwalają na utrzymanie go przy życiu. Metody, które zakładają użycie całego organizmu organizmu, pozwalają na uwolnienie większości toksyn z venom8, w porównaniu z metodami utrzymującymi organizmy przy życiu, które ekstrahują tylko niektóre składniki venom9. Przygotowanie ekstraktu wymaga oceny obecności i siły działania substancji będącej przedmiotem zainteresowania za pomocą specjalnego testu biologicznego, który obejmuje strategie obserwacji efektów farmakologicznych metodami in vivo lub in vitro10.
Jad ukwiału zawiera cytolityczne polipeptydy, toksyny tworzące pory (PFT)11, oraz fosfolipazy12; te cząsteczki są modelami w badaniach interakcji białko-lipid, narzędziami molekularnymi w terapii nowotworów oraz biosensorami opartymi na nanoporach3. Klasyfikację ukwiałów przeprowadza się według ich wielkości lub masy cząsteczkowej, od 5 kDa do 80 kDa. PFT o masie 20 kDa, najczęściej badane i znane jako aktynoporyny<klasa sup="xref">11, jest szczególnie interesujący ze względu na swój potencjał biomedyczny w rozwoju narzędzi molekularnych do możliwych zastosowań jako biosensory przeciwnowotworowe, przeciwdrobnoustrojowe i oparte na nanoporach. Inna cytolizyna, w tym fosfolipazy, a konkretnie fosfolipaza A2 (PLA2)13, uwalnia należny kwas tłuszczowy i hydrolizuje fosfolipidy, destabilizując błonę komórkową. Ze względu na ten mechanizm działania, PLA2 zapowiada się na niezbędny model do badań i zastosowań w chorobach zapalnych. Może służyć jako model do badań zachowania lipidów w błonie komórkowej14.
Tutaj opisujemy skuteczny protokół uzyskiwania surowego ekstraktu z ukwiału Anthopleura dowii Verrill, 1869, oraz wykrywania hemolizyn i fosfolipaz. Obie są istotnymi toksynami, które można wykorzystać jako szablon do projektowania nowych narzędzi molekularnych.

<table><tbody><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa 15 ml</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>2-bromofenol niebieski</td><td>Sigma</td><td>B75808</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy Lacjatowy</td><td>J.T. Baker</td><td>9515-03</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Promega</td><td>V3115</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>Bizakryloamid</td><td>Promega</td><td>V3143</td><td></td></tr><tr><td>Frakcja albuminy w surowicy bydlęcej V</td><td>Sigma</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>Testy białek Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych 96 dołków, V-dolna</td><td>Corning</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>Corning</td><td>CLS430829</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP system</td><td>Bio-Rad</td><td>1708280</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste płaskie płytki 96-dołkowe z płaskim dnem</td><td>Thermo Scientific</td><td>3855</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610406</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant blue R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610400</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>J.T. Baker</td><td>1916-01</td><td></td></tr><tr><td>Obudowa bezkanałowa</td><td>Labconco</td><td>Vertical</td><td>https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ</td><td>Bio Rad.</td><td></td><td>System dokumentacji żelu</td></tr><tr><td>Hemocytometr Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-4L</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Marienfeld</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (oprogramowanie)</td> <td>NIH, USA</td><td>Wersja 1.53c</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator 211</td><td>Labnet</td><td>I5211 DS</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T. Baker</td><td>9049-03</td><td></td></tr><tr><td>Komórka tetra</td> <td>Mini-PROTEANBio-Rad</td><td>1658000EDU</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3824-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-01</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>J.T. Baker</td><td>3818-05</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td> Origin <td>w wersji 9</td><td>Do projektowania działki z korektami sigmoidalnymi</td></tr> Zestaw <tr><td>Petridish</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>Prefabrykowany mini żel</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Test białka Koncentrat odczynnika barwnika</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252433</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu dwuwodny</td><td>JT Baker</td><td>3646-01</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>G10S UV-VIS</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Volt Zasilacz</td><td>Hoefer</td><td>PS300B</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja aktywności hemolitycznej i fosfolipazy w surowych ekstraktach z ukwiałów morskich za pomocą prostych testów biologicznych

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Skład jadu ukwiału zawiera cząsteczki polipeptydowe i niebiałkowe. Komponenty cytolityczne mają duży potencjał biotechnologiczny i biomedyczny do projektowania nowych narzędzi molekularnych. Jad ukwiałów lokalizuje się w komórkach gruczołowych z ektodermy i struktur subkomórkowych zwanych nematocystami, które są rozmieszczone w całym ciele ukwiału. Ta cecha wiąże się z wyzwaniami, ponieważ komórki i nematocysty muszą być poddawane lizie, aby uwolnić składniki jadu z innymi nietoksycznymi cząsteczkami. Dlatego po pierwsze, jad pochodzi z surowego ekstraktu (mieszaniny różnych i różnorodnych cząsteczek i szczątków tkankowych). Kolejnym krokiem jest wykrycie polipeptydów o określonej bioaktywności. W tym miejscu opisujemy skuteczną strategię uzyskiwania surowego ekstraktu z ukwiału morskiego i testu biologicznego w celu zidentyfikowania obecności cytolizyn. Pierwszy krok obejmuje niedrogie i proste techniki (mieszanie i cykl zamrażania-rozmrażania) w celu uwolnienia cytolizyny. Uzyskaliśmy najwyższą aktywność cytolityczną i białko (~500 mg białka z 20 g suchej masy). Następnie złożoność polipeptydowa ekstraktu analizowano za pomocą żelu SDS-PAGE, wykrywając białka o masie cząsteczkowej od 10 kDa do 250 kDa. W teście hemolitycznym wykorzystaliśmy czerwone krwinki owcze i oznaczyliśmy HU50 (11,1 ± 0,3 μg/ml). Natomiast obecność fosfolipaz w surowym ekstrakcie oznaczono przy użyciu żółtka jaja jako substratu w stałym podłożu z agarozą. Ogólnie rzecz biorąc, w badaniu tym wykorzystano wydajny i niedrogi protokół do przygotowania surowego ekstraktu i zastosowano powtarzalne testy biologiczne w celu identyfikacji cytolizyny, cząsteczek o znaczeniu biotechnologicznym i biomedycznym.

Reprezentatywne wyniki protokołu zastosowanego do otrzymania surowego ekstraktu z ukwiału morskiego wykazały, że połączenie dwóch technik (mieszania oraz cykli zamrażania i rozmrażania) doprowadziło do wydajnego opróżnienia nematocyst, a całkowita ilość białka wyniosła 500 mg (8 mg/mL) (Rycina 3).
Złożoność białkową ekstraktu surowego można było zaobserwować w zakresie od 10 kDa do ponad 250 kDa za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Ponadto wykryto cytolizyny w strefa...

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania surowego ekstraktu z jadu z ukwiału morskiego i wykrywania jego aktywności hemolitycznej i fosfolipazy.

Identyfikacja aktywności hemolitycznej i fosfolipazy w surowych ekstraktach z ukwiałów morskich za pomocą prostych testów biologicznych

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

Interakcja z toksyną ukwiałową musi wykorzystywać jak najmniejszą liczbę organizmów i skuteczne protokoły, aby uzyskać dużą różnorodność i obfitość toksyn oraz szybką identyfikację określonej toksyny. Połączyliśmy dwie skuteczne techniki, aby przygotować surowy ekstrakt z dużą ilością białka i opisać powtarzalne, specyficzne, szybkie i niedrogie testy w celu identyfikacji hemolizy i zasad fosfoliowych w jadzie ukwiałów. Metodę można zastosować w prawie każdym przykładzie, w którym decyduje się zidentyfikować jeden lub oba typy cytolizyny.Skuteczność metody osiąga się poprzez dbanie o czas na każdym etapie przygotowania surowego ekstraktu. Kluczem do hemolizy jest ostrożne obchodzenie się z erytrocytami, aby uniknąć lizy mechanicznej, a w teście fosfolizy, dbanie o temperaturę podczas przygotowywania płytki. Procedurę zademonstrują dr Santos Ramirez-Carreto, biolog Sandra Salazar Garcia i biolog Giovanni Macias Martinez z mojego laboratorium.Zacznij od ręcznego oczyszczenia zebranego ukwiału A.doi wodą destylowaną, aby usunąć duże cząsteczki podłoża przylegające do ciała. Natychmiast zamroź organizmy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w ultrazamrażarce na 72 godziny. Następnie umieść organizmy w specjalnych szklankach do liofilizacji w warunkach liofilizacji na 48 godzin.W celu uwodnienia tkanek rozpuść 20 gramów suchej masy liofilizowanych organizmów w 60 mililitrach 50-milimolowego buforu fosforanu sodu i jednej tabletce koktajlu inhibitorów. W mieszadle magnetycznym ciągle mieszaj próbkę z prędkością około 800 obr./min i czterema stopniami Celsjusza przez 12 godzin. Po zamrożeniu próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 12 godzin w celu wywołania lizy komórek i wyładowania nematocyst, umieść pojemnik w wodzie o temperaturze pokojowej, aż rozmrozi się do 90%Powtórz tę procedurę trzy razy.Aby sklarować ekstrakt, odwirować próbkę w temperaturze 25, 400 razy G przez 40 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odzyskać supernatant i ponownie go odwirować. Powtórz ten krok trzy do czterech razy i w końcu odzyskaj supernatant.Odzyskany supernatant lub surowy ekstrakt zawiera składniki jadu i inne cząsteczki komórkowe, takie jak lipidy, węglowodany i kwasy nukleinowe. Określić stężenie białka w surowym ekstrakcie za pomocą komercyjnego zestawu do testów kolorymetrycznych Bradforda. Próbki należy inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania.Następnie zmierz absorbancję przy 595 nanometrach. Wykreślić średnie absorbancje BSA próbki i wyznaczyć równanie wykresu, gdzie y jest absorbancją, m jest nachyleniem linii, x jest stężeniem białka, a b jest rzędną początku dostawy. Aby przeanalizować surowy ekstrakt, dodaj 30 mikrogramów surowego ekstraktu do pięciu mikrolitrów buforu ładującego białko w celu denaturacji białek.Ostateczna objętość musi być mniejsza niż 50 mikrolitrów. Uruchom elektroforezę przy stałej 25 miliamperach przez jedną godzinę i 30 minut. Aby uniknąć dyfuzji białek żelu, dodać roztwór utrwalający do białek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut z wytrząsaniem z prędkością 80 obr./min.Następnie zdekantować roztwór i dodać białkowy roztwór sieciujący. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 80 obr./min. Usuń roztwór i przemyj żel 100 mililitrami wody destylowanej przez pięć minut.Następnie usuń wodę i powtórz tę procedurę cztery razy. Przeprowadzić barwienie białek za pomocą 50 mililitrów przefiltrowanego roztworu Coomassie Brilliant Blue R-250, mieszając z prędkością 60 obr./min w laboratoryjnym oscylatorze obrotowym w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Pobrać jeden mililitr krwi z żyły szyjnej owcy i wyjąć igłę ze strzykawki.Natychmiast odcedzić krew do probówki z 50 mililitrami roztworu Alsevera i odwirować w temperaturze 804 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i dodać 30 mililitrów roztworu Alsever, przesuwając go wzdłuż wewnętrznych ścianek probówki. Powoli ponownie zawiesić osad za pomocą plastikowej pipety Pasteura i ponownie odwirować roztwór w temperaturze 804 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Powtarzać tę procedurę, aż sklarowany supernatant zostanie sklarowany. Utrzymać końcową objętość roztworu Alsever, aby osiągnąć stężenie około 2 milionów komórek na mililitr. Następnie użyj komory Neubauera lub hemocytometru, aby policzyć komórki.Mieszaniny roztworów inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania, a następnie odwirować płytkę w temperaturze 804 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odzyskać supernatant na innej 96-dołkowej płytce z płaskim dnem. Jeśli surowy ekstrakt zawiera cytolizyny, erytrocyty ulegną lizie i uwolnią hemoglobinę.Odczytaj absorbancję przy 415 nanometrach i oblicz ilość ekstraktu, która powoduje hemolizę w 50% erytrocytów. Zwiększ ilość surowego ekstraktu z ukwiałów morskich i zaprojektuj działkę z korektami sigmoidalnymi za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Umyj jedno jajo kurze z 1% SDS w wodzie destylowanej i oddziel żółtko od białka jaja w sterylnych warunkach.Przygotuj roztwory A, B, C i D. Dodaj 500 mikrolitrów roztworów A i C do roztworu B i 100 mikrolitrów roztworu D. Wymieszaj je i wlej 25 mililitrów do każdej szalki Petriego. Poczekaj, aż roztwór stężeje w sterylnych warunkach i zrób dołki o średnicy około dwóch do trzech milimetrów za pomocą cienkiej rurki. Dodać w sumie 20 mikrolitrów buforu fosforanowego jako kontrolę ujemną w jednym dołku i 20 mikrolitrów oznaczonej fosfolipazy jako kontrolę pozytywną w innym studzience.Umieść różne ilości białka surowego ekstraktu 5, 15, 25, 35 i 45 mikrogramów w pozostałych studzienkach, każdy w końcowej objętości 20 mikrolitrów. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 godzin. Reprezentatywne wyniki protokołu zastosowanego do uzyskania surowego ekstraktu z ukwiałów wykazały, że połączenie dwóch technik, mieszania oraz cykli zamrażania i rozmrażania, spowodowało skuteczne wydzielanie nematocyst.Pokazano tutaj nematocyty przed i po bodźcach. Kanalik nematocysty jest odsłonięty na tym obrazie, co wskazuje na uwalnianie toksyny. Profil elektroforetyczny surowego ekstraktu z ukwiałów morskich pokazano tutaj.Surowy ekstrakt z ukwiału morskiego był analizowany przez SDS-PAGE 15% żel poliakrylamidowy i wykazał białko od 10 kilodaltonów do 250 kilodaltonów masy cząsteczkowej. Tutaj pas 1 to drabinka białkowa, a pas 2 to jad ukwiałów. Cytolizyny wykryto w strefie masy cząsteczkowej 15 kilodaltonów i 20 kilodaltonów.Pokazano tutaj test hemolizy w erytrocytach owiec. Aktywność hemolityczna ekstraktu przed i podczas cykli zamrażania i rozmrażania wzrastała, aż do osiągnięcia 100% hemolizy przy 50 mikrogramach całkowitego surowego białka ekstraktu w ostatnich dwóch cyklach. Ilość potrzebna do lizy 50% erytrocytów owiec wynosi 11,1 0,3 mikrograma na mililitr.Aktywność fosfolipazy wykryto poprzez tworzenie się przezroczystych halo w obszarach płytki agarowej, w których nałożono próbkę surowego ekstraktu. Wyniki wskazują na obecność aktywności fosfolipazy z 15 mikrogramów białka całkowitego. Średnica halo zwiększała się w sposób zależny od dawki; Oznacza to, że jeśli ilość surowego ekstraktu wzrosła, średnica halo wzrosła.Próbując wykonać procedurę, upewnij się, że indukowałeś wydzielanie nematocyst, określ ilościowo całkowite białko, przeanalizuj surowy ekstrakt za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, oblicz ilość surowego białka ekstraktu, aby wytworzyć 50% hemolizy i użyj różnych ilości białka w teście fosfolipazy. Możemy przeanalizować surowy ekstrakt za pomocą techniki proteomicznej, aby zidentyfikować polipeptydy o dużym znaczeniu w biotechnologii i biomedycynie, a nawet profilować i charakteryzować unikalną cząsteczkę, a następnie produkować ją w laboratorium do zastosowania. Uzyskaliśmy część sekwencji działającego białka o działaniu przeciwnowotworowym w ludzkich komórkach nabłonka zatwardziałego raka płuca.Podobnie identyfikujemy sekwencję fosfolipaz o znaczeniu biotechnologicznym.

identification-hemolytic-phospholipase-activity-crude-extracts-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy test pozwalający ustalić obecność fosfolipazy w surowym ekstrakcie z jadu Anthopleura dowii - morskiego ukwiału. Test wykorzystuje technikę dyfuzji żelu agarozowego, w której enzym fosfolipaza dyfunduje i rozkłada fosfolipidy zawarte w pożywce stałej w sposób promienisty.

Test aktywności fosfolipazy: Test dyfuzji żelu w celu określenia aktywności fosfolipazy w surowym ekstrakcie jadu z Anthopleura dowii

Ten test biologiczny wykorzystuje model drapieżnej ryby do oceny obecności metabolitów odstraszających od karmienia z organicznych ekstraktów tkanek organizmów morskich w naturalnych stężeniach przy użyciu porównywalnej pod względem odżywczym matrycy pokarmowej.

Laboratoryjny test biologiczny żywiący się rybami w celu oceny aktywności przeciwdrapieżnej metabolitów wtórnych z tkanek organizmów morskich

Niniejszy raport opisuje test enzymatyczny in vitro do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy przy użyciu ekstraktów z komórek Leishmania. Test ten opiera się na przeniesieniu radioaktywnej grupy metylowej z S-[metylo-3] H]adenozylo-L-metioniny do endogennej fosfatydyloetanoloaminy.

In vitro Test do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy

Wiele przewidywanych (fosfo)lipaz jest słabo scharakteryzowanych pod względem specyficzności substratowej i funkcji fizjologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół optymalizacji aktywności enzymów, poszukiwania naturalnych substratów i proponowania funkcji fizjologicznych tych enzymów.

Definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę

Opisujemy test oparty na fluorescencji do pomiaru mieszania fosfolipidów w dużych liposomach jednowarstwowych odtworzonych za pomocą opsyny.

Test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej

Tutaj prezentujemy protokół do izolacji i charakterystyki struktury, siły węchowej i reakcji behawioralnej domniemanych związków feromonów minogów morskich.

Identyfikacja feromonów minoga morskiego za pomocą frakcjonowania pod kontrolą testów biologicznych

Niniejszym przedstawiamy protokół do pomiaru przy łóżku pacjenta aktywności endotoksyn w próbkach ludzkiej krwi pełnej. Test aktywności endotoksyn jest prostym do wykonania testem i może być użytecznym biomarkerem u krytycznie chorych pacjentów z sepsą.

Test aktywności endotoksyn w celu wykrycia endotoksemii krwi pełnej u pacjentów w stanie krytycznym

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Ta praca ma na celu ocenę i przegląd procedury biologicznego testu śmiertelności Artemia salina, również identyfikowanej jako test śmiertelności krewetek solankowych. Ta prosta i tania metoda dostarcza informacji na temat ogólnej toksyczności (traktowanej jako wstępna ocena toksyczności) próbek, a mianowicie produktów naturalnych.

Test biologiczny śmiertelności przy użyciu Artemia salina L.

Ludzki patogen grzybiczy Cryptococcus neoformans wytwarza różne czynniki wirulencji (np. peptydazy), aby ułatwić sobie przetrwanie w organizmie gospodarza. Nisze środowiskowe stanowią obiecujące źródło nowych naturalnych inhibitorów peptydazy. Protokół ten określa przygotowanie ekstraktów z i ocenę ich wpływu na produkcję czynników wirulencji grzybów.

Ocena przypuszczalnych właściwości antykryptokokowych surowych i klarowanych ekstraktów z

Przedstawiamy opłacalną metodę oceny przepuszczalności błony liposomalnej, z wyższą czułością i rozdzielczością w porównaniu do tradycyjnych technik. Stosując nowatorską reakcję podstawiania ligandów w kapsule, technika ta wykrywa zmiany w błonach modelowych wywołane fosfolipaząA2. Łatwo zintegrowane ze standardowymi analizami, to dostępne podejście zwiększa rozdzielczość w badaniu biofizyki błon i interakcji toksyn.

Badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu PLA2

Poznaj metodę ekstrakcji surowego jadu z ukwiałów morskich i identyfikacji aktywności hemolitycznej oraz fosfolipazowej. Protokół zapewnia szybkie i ekonomiczne badanie toksyn.

Identyfikacja aktywności hemolitycznej i fosfolipazy w surowych ekstraktach z ukwiałów morskich za pomocą prostych testów biologicznych (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja aktywności hemolitycznej i fosfolipazy w surowych ekstraktach z ukwiałów morskich za pomocą prostych testów biologicznych

Przeglądaj więcej filmów