Identyfikacja aktywności hemolitycznej i fosfolipazy w surowych ekstraktach z ukwiałów morskich za pomocą prostych testów biologicznych

Interakcja z toksyną ukwiałową musi wykorzystywać jak najmniejszą liczbę organizmów i skuteczne protokoły, aby uzyskać dużą różnorodność i obfitość toksyn oraz szybką identyfikację określonej toksyny. Połączyliśmy dwie skuteczne techniki, aby przygotować surowy ekstrakt z dużą ilością białka i opisać powtarzalne, specyficzne, szybkie i niedrogie testy w celu identyfikacji hemolizy i zasad fosfoliowych w jadzie ukwiałów. Metodę można zastosować w prawie każdym przykładzie, w którym decyduje się zidentyfikować jeden lub oba typy cytolizyny.

Skuteczność metody osiąga się poprzez dbanie o czas na każdym etapie przygotowania surowego ekstraktu. Kluczem do hemolizy jest ostrożne obchodzenie się z erytrocytami, aby uniknąć lizy mechanicznej, a w teście fosfolizy, dbanie o temperaturę podczas przygotowywania płytki. Procedurę zademonstrują dr Santos Ramirez-Carreto, biolog Sandra Salazar Garcia i biolog Giovanni Macias Martinez z mojego laboratorium.

Zacznij od ręcznego oczyszczenia zebranego ukwiału A.doi wodą destylowaną, aby usunąć duże cząsteczki podłoża przylegające do ciała. Natychmiast zamroź organizmy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w ultrazamrażarce na 72 godziny. Następnie umieść organizmy w specjalnych szklankach do liofilizacji w warunkach liofilizacji na 48 godzin.

W celu uwodnienia tkanek rozpuść 20 gramów suchej masy liofilizowanych organizmów w 60 mililitrach 50-milimolowego buforu fosforanu sodu i jednej tabletce koktajlu inhibitorów. W mieszadle magnetycznym ciągle mieszaj próbkę z prędkością około 800 obr./min i czterema stopniami Celsjusza przez 12 godzin. Po zamrożeniu próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 12 godzin w celu wywołania lizy komórek i wyładowania nematocyst, umieść pojemnik w wodzie o temperaturze pokojowej, aż rozmrozi się do 90%Powtórz tę procedurę trzy razy.

Aby sklarować ekstrakt, odwirować próbkę w temperaturze 25, 400 razy G przez 40 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odzyskać supernatant i ponownie go odwirować. Powtórz ten krok trzy do czterech razy i w końcu odzyskaj supernatant.

Odzyskany supernatant lub surowy ekstrakt zawiera składniki jadu i inne cząsteczki komórkowe, takie jak lipidy, węglowodany i kwasy nukleinowe. Określić stężenie białka w surowym ekstrakcie za pomocą komercyjnego zestawu do testów kolorymetrycznych Bradforda. Próbki należy inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania.

Następnie zmierz absorbancję przy 595 nanometrach. Wykreślić średnie absorbancje BSA próbki i wyznaczyć równanie wykresu, gdzie y jest absorbancją, m jest nachyleniem linii, x jest stężeniem białka, a b jest rzędną początku dostawy. Aby przeanalizować surowy ekstrakt, dodaj 30 mikrogramów surowego ekstraktu do pięciu mikrolitrów buforu ładującego białko w celu denaturacji białek.

Ostateczna objętość musi być mniejsza niż 50 mikrolitrów. Uruchom elektroforezę przy stałej 25 miliamperach przez jedną godzinę i 30 minut. Aby uniknąć dyfuzji białek żelu, dodać roztwór utrwalający do białek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut z wytrząsaniem z prędkością 80 obr./min.

Następnie zdekantować roztwór i dodać białkowy roztwór sieciujący. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 80 obr./min. Usuń roztwór i przemyj żel 100 mililitrami wody destylowanej przez pięć minut.

Następnie usuń wodę i powtórz tę procedurę cztery razy. Przeprowadzić barwienie białek za pomocą 50 mililitrów przefiltrowanego roztworu Coomassie Brilliant Blue R-250, mieszając z prędkością 60 obr./min w laboratoryjnym oscylatorze obrotowym w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Pobrać jeden mililitr krwi z żyły szyjnej owcy i wyjąć igłę ze strzykawki.

Natychmiast odcedzić krew do probówki z 50 mililitrami roztworu Alsevera i odwirować w temperaturze 804 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i dodać 30 mililitrów roztworu Alsever, przesuwając go wzdłuż wewnętrznych ścianek probówki. Powoli ponownie zawiesić osad za pomocą plastikowej pipety Pasteura i ponownie odwirować roztwór w temperaturze 804 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Powtarzać tę procedurę, aż sklarowany supernatant zostanie sklarowany. Utrzymać końcową objętość roztworu Alsever, aby osiągnąć stężenie około 2 milionów komórek na mililitr. Następnie użyj komory Neubauera lub hemocytometru, aby policzyć komórki.

Mieszaniny roztworów inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania, a następnie odwirować płytkę w temperaturze 804 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odzyskać supernatant na innej 96-dołkowej płytce z płaskim dnem. Jeśli surowy ekstrakt zawiera cytolizyny, erytrocyty ulegną lizie i uwolnią hemoglobinę.

Odczytaj absorbancję przy 415 nanometrach i oblicz ilość ekstraktu, która powoduje hemolizę w 50% erytrocytów. Zwiększ ilość surowego ekstraktu z ukwiałów morskich i zaprojektuj działkę z korektami sigmoidalnymi za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Umyj jedno jajo kurze z 1% SDS w wodzie destylowanej i oddziel żółtko od białka jaja w sterylnych warunkach.

Przygotuj roztwory A, B, C i D. Dodaj 500 mikrolitrów roztworów A i C do roztworu B i 100 mikrolitrów roztworu D. Wymieszaj je i wlej 25 mililitrów do każdej szalki Petriego. Poczekaj, aż roztwór stężeje w sterylnych warunkach i zrób dołki o średnicy około dwóch do trzech milimetrów za pomocą cienkiej rurki. Dodać w sumie 20 mikrolitrów buforu fosforanowego jako kontrolę ujemną w jednym dołku i 20 mikrolitrów oznaczonej fosfolipazy jako kontrolę pozytywną w innym studzience.

Umieść różne ilości białka surowego ekstraktu 5, 15, 25, 35 i 45 mikrogramów w pozostałych studzienkach, każdy w końcowej objętości 20 mikrolitrów. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 godzin. Reprezentatywne wyniki protokołu zastosowanego do uzyskania surowego ekstraktu z ukwiałów wykazały, że połączenie dwóch technik, mieszania oraz cykli zamrażania i rozmrażania, spowodowało skuteczne wydzielanie nematocyst.

Pokazano tutaj nematocyty przed i po bodźcach. Kanalik nematocysty jest odsłonięty na tym obrazie, co wskazuje na uwalnianie toksyny. Profil elektroforetyczny surowego ekstraktu z ukwiałów morskich pokazano tutaj.

Surowy ekstrakt z ukwiału morskiego był analizowany przez SDS-PAGE 15% żel poliakrylamidowy i wykazał białko od 10 kilodaltonów do 250 kilodaltonów masy cząsteczkowej. Tutaj pas 1 to drabinka białkowa, a pas 2 to jad ukwiałów. Cytolizyny wykryto w strefie masy cząsteczkowej 15 kilodaltonów i 20 kilodaltonów.

Pokazano tutaj test hemolizy w erytrocytach owiec. Aktywność hemolityczna ekstraktu przed i podczas cykli zamrażania i rozmrażania wzrastała, aż do osiągnięcia 100% hemolizy przy 50 mikrogramach całkowitego surowego białka ekstraktu w ostatnich dwóch cyklach. Ilość potrzebna do lizy 50% erytrocytów owiec wynosi 11,1 0,3 mikrograma na mililitr.

Aktywność fosfolipazy wykryto poprzez tworzenie się przezroczystych halo w obszarach płytki agarowej, w których nałożono próbkę surowego ekstraktu. Wyniki wskazują na obecność aktywności fosfolipazy z 15 mikrogramów białka całkowitego. Średnica halo zwiększała się w sposób zależny od dawki; Oznacza to, że jeśli ilość surowego ekstraktu wzrosła, średnica halo wzrosła.

Próbując wykonać procedurę, upewnij się, że indukowałeś wydzielanie nematocyst, określ ilościowo całkowite białko, przeanalizuj surowy ekstrakt za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, oblicz ilość surowego białka ekstraktu, aby wytworzyć 50% hemolizy i użyj różnych ilości białka w teście fosfolipazy. Możemy przeanalizować surowy ekstrakt za pomocą techniki proteomicznej, aby zidentyfikować polipeptydy o dużym znaczeniu w biotechnologii i biomedycynie, a nawet profilować i charakteryzować unikalną cząsteczkę, a następnie produkować ją w laboratorium do zastosowania. Uzyskaliśmy część sekwencji działającego białka o działaniu przeciwnowotworowym w ludzkich komórkach nabłonka zatwardziałego raka płuca.

Podobnie identyfikujemy sekwencję fosfolipaz o znaczeniu biotechnologicznym.