Badanie odporności dziedzicznej w modelu zakażenia mikrosporydiami Caenorhabditis elegans

Protokoły te umożliwiają badanie dziedzicznej odporności na mikrosporydia. Przedstawione tutaj techniki mogą pomóc nam zrozumieć, w jaki sposób odporność jest przekazywana z pokolenia na pokolenie i jakie cząsteczki decydują o odporności na mikrosporydia u potomstwa. C.elegans jest prostym i genetycznie wykonalnym modelem o krótkim czasie generowania do oznaczania dziedziczenia.

Wiele narzędzi dostępnych dla robaka może być wykorzystanych do odkrycia molekularnych mechanizmów odporności międzypokoleniowej. W przypadku zakażania zwierząt P0 należy stosować niską dawkę zarodników, która nie wpływa znacząco na zdolność rodzica do produkcji potomstwa. Gwarantuje to, że bielenie da wystarczającą ilość zwierząt F1 do dalszych eksperymentów Aby rozpocząć, przenieś wymaganą liczbę 10-centymetrowych płytek pożywki dla niewysiewanych nicieni z czterech stopni Celsjusza do temperatury pokojowej na dzień przed planowanymi infekcjami.

Tuż przed infekcją umieść około 2500 zsynchronizowanych robaków L1 w probówce z mikrodymką pod ciśnieniem 1400 razy G przez 30 sekund. Usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety, aby pozostawić robaki w 50 mikrolitrach pożywki M9. Dodaj jeden mililitr 10X szczepu Escherichia coli OP50 do 1-etapowych robaków, a zarodników N.parisii do pożądanego stężenia.

Jako niezakażoną kontrolę należy przygotować równoważną probówkę z L1 i OP50 o objętości pożywki M9 równoważnej objętości użytego preparatu przetrwalnikowego. Wymieszaj próbkę robaka L1, krótko wirując i płytkując powyżej jednego mililitra robaków na 10-centymetrowej pożywce wzrostowej bez nasion nicieni. Zamieszaj, aby płyn rozprowadził się po całej płycie.

Suszyć płytki w czystej szafce ze zdjętymi pokrywkami przez 10 do 20 minut lub do całkowitego wyschnięcia przed inkubacją w temperaturze 21 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Po 72 godzinach od zakażenia zbadaj płytki pod mikroskopem preparacyjnym. Płytka z zakażonymi robakami powinna zawierać mniej zarodków niż płytki z niezakażonymi robakami.

Następnie zmyj robaki z płytek do probówki mikrowirówkowej za pomocą jednego mililitrowego podłoża M9. Jeśli na płytkach pozostanie wiele robaków, osadzaj je przez odwirowanie w temperaturze 1400 razy G przez 30 sekund. Usunąć supernatant i przeprowadzić dodatkowe płukanie płytek.

Wirować przy 1400 razy G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej w celu osadzenia robaków i przemyć dwukrotnie jednym mililitrem pożywki M9 lub do momentu, gdy supernatant będzie klarowny. Zawiesić go ponownie w końcowej objętości jednomililitrowej pożywki M9 i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Przenieś 100 mikrolitrów zawieszonych robaków do świeżej probówki i wybiel pozostałe 900 mikrolitrów, aby rozbić dorosłe robaki i uwolnić zarodki F1 do testów.

Wykonaj infekcje z modyfikacjami. jak wspomniano w manuskrypcie. Po 72 godzinach od zakażenia zbadaj płytki pod mikroskopem preparacyjnym.

Płytka z naiwnymi robakami powinna być mniejsza i zawierać mniej zarodków niż płytki z zaszczepionymi robakami. Następnie rozpocznij proces barwienia i utrwalania robaków, zmywając je z płytek do probówki mikrowirówkowej za pomocą jednego mililitra 0,1%Tween 20 w pożywce M9. Jeśli na płytkach pozostało wiele robaków, należy je osadzać przez odwirowanie w temperaturze 1 400 razy G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety i wykonać dodatkowe płukanie płytki.

Po ogranulowaniu robaków przez odwirowanie przez 30 sekund w temperaturze 1 400 razy G w temperaturze pokojowej, przemyć dwukrotnie jednym mililitrem pożywki M9 zawierającej 0,1% Tween 20 lub do momentu, gdy supernatant będzie klarowny. Usuń supernatant, dodaj 700 mikrolitrów acetonu i pozostaw robaki do utrwalenia w temperaturze pokojowej na 10 minut. Osadzaj te stałe robaki przez 30 sekund w temperaturze 10 000 razy G w temperaturze pokojowej i popłucz dwa razy jednym mililitrowym buforem fosforanowym soli fizjologicznej zawierającym 0,1% Tween 20.

Przygotuj 50 mililitrów roztworu roboczego DY96, zawiń pojemnik w folię i przechowuj w szufladzie, aby zapobiec ekspozycji na światło. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu roboczego DY96 do osadu ślimaka i obracaj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Odwirować tę reakcję przez 30 sekund w temperaturze 10 000 razy G w temperaturze pokojowej, aby osadzać robaki i usunąć supernatant.

Następnie dodaj 15 mikrolitrów podłoża montażowego z DAPI lub bez. Odpipetuj 10 mikrolitrów tych poplamionych robaków na szkiełko mikroskopowe i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Aby przeanalizować robaki zabarwione DY96 zamontowane na szkiełkach, należy wykonać obrazowanie przy użyciu kanału GFP mikroskopu fluorescencyjnego.

Aby określić dopasowanie populacji robaków, użyj obiektywu 5X lub 10X, aby ocenić ciężarność ponad 100 robaków na stan. Po 72 godzinach od zakażenia zwierzęta F1 utrwalono i wybarwiono DY96 w celu oceny odporności na mikrosporydy. Zakażone populacje rodzicielskie i niezakażone grupy kontrolne utrwalono po 72 godzinach od zakażenia i wybarwiono DY96 w celu uwidocznienia zarodków robaków i zarodników mikrosporydiów.

Zakażone zwierzęta są małe, zawierają wiele zarodników mikrosporydiów i produkują mniej zarodków niż zdrowe, niezakażone zwierzęta z grupy kontrolnej. Ocena ciężaru robaków wykazała, że około 95% niezakażonych zwierząt wydało potomstwo, w porównaniu ze zwierzętami zakażonymi, które stanowiły mniej niż 80%Kwantyfikacje wykazały, że około 90% populacji leczonej mikrosporydiami było zakażonych, jak określono na podstawie liczby robaków zawierających zarodniki barwione DY96. Ilościowe badania tych utrwalonych zwierząt ujawniły, że zaszczepione robaki zawierały znacznie więcej zarodków niż ich naiwne odpowiedniki, co wskazuje na większą przydatność w obliczu infekcji.

Fiji ImageJ został użyty do określenia obciążenia pasożytami poszczególnych naiwnych i odpornych robaków, czyli odsetka ciała wypełnionego fluorescencyjnymi zarodnikami N.parisii. Analizy ilościowe wykazały radykalne zmniejszenie obciążenia pasożytami robaków pochodzących od zakażonych rodziców. Co więcej, obliczenia wielkości poszczególnych robaków wykazały, że zaszczepione robaki miały znaczną przewagę wzrostu nad naiwnymi zwierzętami w obliczu infekcji N. parisii.

Badania obrazowe wykazały, że podczas gdy naiwne zwierzęta zazwyczaj zawierały wiele zarodników i kilka zainfekowanych komórek, zwierzęta zaszczepione miały znacznie mniej zarodników lub nie miały ich wcale i zazwyczaj nie miały sporoplazm. Jeśli populacje F1 niezaszczepione i zaszczepione mają podobną liczbę zwierząt ciężarnych i zakażonych, policz liczbę jaj na zwierzę i przeanalizuj zakażoną tkankę za pomocą ImageJ, aby znaleźć bardziej subtelne różnice. Podczas gdy bezpośrednia żółć 96 barwi dojrzałe zarodniki, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ może ujawnić sporoplazmy w komórkach.

Może to pokazać liczbę zainfekowanych komórek w zaszczepionych i niezaszczepionych robakach. Techniki te wykazały, że rodzicielska odpowiedź transkrypcyjna może odgrywać zasadniczą rolę w indukowaniu dziedzicznej odporności u potomstwa. Naukowcy badają teraz naturę tej odporności u potomstwa.