Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej
16 maja 2022
Ten artykuł przedstawia integrację modułu spektralnego ogniskowania i lasera impulsowego o podwójnym wyjściu, umożliwiającego szybkie obrazowanie hiperspektralne nanocząsteczek złota i komórek rakowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów multimodalnych nieliniowych technik optycznych na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym.
Nasz protokół przedstawia multimodalną, nieliniową mikroskopię optyczną i stosuje ją do wykonywania specyficznego chemicznie obrazowania nanocząstek złota w komórkach nowotworowych. Główną zaletą naszego systemu obrazowania jest to, że można go wykorzystać do przeglądu kontrastu biomolekularnego struktur komórkowych i nanocząstek złota w sposób multimodalny. Aby rozpocząć, włącz wtyczki wszystkich urządzeń, z wyjątkiem skrzynki pilota.
Następnie włącz tylną część skrzynki i naciśnij Rozpocznij operację, gdy kontrolka pilota na skrzynce sterowniczej zmieni kolor na niebieski. Następnie włącz komputer laserowego mikroskopu skaningowego i uruchom oprogramowanie mikroskopu konfokalnego. Następnie sprawdź drogę światła mikroskopu za pomocą oprogramowania komputerowego i kontroluj ostrość za pomocą ekranu dotykowego lub pokręteł pilota zdalnego sterowania lub oprogramowania komputerowego.
Wybierz żądane ustawienia obrazu w oprogramowaniu, w tym powiększenie, rozmiar obrazu w pikselach i czas zatrzymania piksela, upewniając się, że czas przebywania piksela jest dłuższy niż czas integracji. Umieść kroplę wody destylowanej na obiektywie zanurzenia w wodzie, który skupia wiązki laserowe w próbce i między skraplaczem a próbką w celu obrazowania. Następnie dostosuj wysokość kondensatora do około jednego milimetra nad próbką, aby zebrać maksymalną ilość światła i przesuń detektor SRS umieszczony na ruchomym uchwycie poza ścieżkę wiązki, aby skupić się na próbce za pomocą światła białego.
Korzystając z ustawień oprogramowania, wybierz wiązkę pompy i zmień długość fali lasera na 802 nanometry dla drgań CO i 898 nanometrów dla piku amidu I, uwzględniając duże zmiany w przesunięciu Ramana. Aby uzyskać niewielkie korekty w przesunięciu Ramana, zeskanuj stopień opóźnienia w jednostce SFTRU zgodnie z opisem w manuskrypcie. Dla zestawu danych hiperspektralnych wybierz kartę Wyzwalacz, kliknij pozycję Rozpocznij od wyzwalacza ttl włączone, a następnie wybierz opcję Wyzwalaj co klatkę.
Następnie na karcie Serie ustaw szereg czasowy włączony i wyłączony szereg Z. Ponadto należy ustawić liczbę ramek w szeregach czasowych tak, aby odpowiadała liczbie kroków w oprogramowaniu ATM. Następnie przejdź do zakładki Uruchom w oprogramowaniu ATM i ustaw pozycje stopnia opóźnienia dla CH na 90,25 i 92,25, natomiast dla obszaru amidu I na 89 i 91 w milimetrach, odpowiadające pozycji początkowej i końcowej skanowania hiperspektralnego, upewniając się, że liczba kroków odpowiada liczbie klatek w oprogramowaniu komputerowym.
Po sprawdzeniu poprawnych ustawień uruchom stos hiperspektralny w oprogramowaniu komputerowym, przechodząc najpierw do Pobierz, a następnie klikając Rozpocznij skanowanie. Następnie w oprogramowaniu ATM kliknij przycisk Start, który inicjuje zbieranie serii obrazów z przyrostowymi wzrostami pozycji stopnia opóźnienia między wybranymi pozycjami startu i zatrzymania. Następnie wykonaj serię zdjęć w różnych pozycjach etapu opóźnienia, aby wygenerować skan hiperspektralny.
Korzystając z jednostki analogowej, wysyłaj i odbieraj sygnały ttl do iz systemu SFTRU w celu synchronizacji akwizycji obrazu i ruchu stopnia opóźniającego. Aby przełączać się między obrazowaniem w obszarze wibracyjnym CH a obszarem wibracyjnym amidu I, zmień długość fali pompy w oprogramowaniu lasera z 802 nanometrów na 898 nanometrów. Ponadto zmień ustawienie dyspersji Stokesa w oprogramowaniu ATM z 30 milimetrów na 5 milimetrów.
Wyreguluj dolne pokrętło na uchwycie lusterka, aby dokonać niewielkiej regulacji lustra w ścieżce dyspersji wiązki pompy wewnątrz skrzynki SFTRU, zmieniając kąt lustra o przyrostową wartość. Aby potwierdzić selektywność chemiczną mikrosfer polistyrenu, zarejestrowano hiperspektralne rozpraszanie Ramana i spontaniczne widma Ramana. Widma były identyczne, z wyjątkiem różnicy zaobserwowanej we względnym natężeniu.
Obrazowanie stymulowanego rozpraszania Ramana komórek nowotworowych 4T1 przeprowadzono przy 2 852, 2 930 i 2 968 liczbach falowych, odpowiadających zakresowi oscylacyjnemu węgiel-wodór rozciągającego biomolekuły lipidów, białek i DNA. Przeprowadzono multimodalne obrazowanie komórek nowotworowych 4T1, którym podawano nanocząstki złota, w celu zbadania rozmieszczenia nanocząstek w komórkach nowotworowych. Uzyskane obrazy wymuszonego rozpraszania Ramana uzyskano dla kanału CH2 i CH3, sond fluorescencyjnych LysoTracker oraz kanału rozpraszania Ramanowskiego stymulowanego rezonansem.
Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest zmiana obszaru wibracji, odniesienia pompy, w oprogramowaniu lasera, a także ustawienia dyspersji Stokesa podczas protokołu. System ten można łatwo przełączać z obszaru femtosekundowego na pikosekundowy bez wpływu na wyrównanie optyczne. Ta zdolność pozwala nam na wykonywanie wielofotonowego, koherentnego rozpraszania Ramana i spektroskopii z sondą pompową oraz ich zastosowania.
Ta multimodalna platforma obrazowania dostarcza nowych informacji na temat nanomedycyny i toruje drogę do obrazowania molekularnego komórek, tkanek i nanocząstek złota.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia multimodalną, nieliniową technikę mikroskopii optycznej do chemicznie specyficznego obrazowania nanocząstek złota w komórkach rakowych. System obrazowania umożliwia przegląd kontrastu biomolekularnego w strukturach komórkowych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biofizyka
- Biomedyczne Obrazowanie
Tło
- Nanocząstki złota są używane w badaniach nad rakiem do obrazowania i zastosowań terapeutycznych.
- Nieliniowe techniki optyczne poprawiają zdolności obrazowania.
- Multimodalne obrazowanie zapewnia szczegółowe wgląd w struktury komórkowe.
- Standardowe mikroskopy skaningowe z laserem mogą być przystosowane do zaawansowanych technik obrazowania.
Cel badania
- Zintegrować moduł koncentracji spektralnej z dwukierunkowym laserem impulsowym.
- Włączyć szybkie hiperspektralne obrazowanie nanocząstek złota i komórek rakowych.
- Przedstawić zastosowanie multimodalnych nieliniowych technik optycznych.
Zastosowane metody
- Włączenie sprzętu i skrzynki sterującej.
- Użycie oprogramowania mikroskopu konfokalnego do obrazowania.
- Kontrola ścieżki światła i foku przez różne interfejsy.
- Przeprowadzanie obrazowania w celu oceny kontrastu biomolekularnego.
Główne wyniki
- System obrazowania z powodzeniem rejestruje szczegółowe obrazy nanocząstek złota w komórkach rakowych.
- Multimodalne obrazowanie ujawnia znaczący kontrast biomolekularny.
- Szybkie hiperspektralne obrazowanie jest osiągane z zintegrowanym systemem.
- Badanie wykazuje skuteczność nieliniowych technik optycznych w mikroskopii.
Wnioski
- Integracja zaawansowanych technik obrazowania poprawia badania komórek rakowych.
- To podejście może prowadzić do lepszego zrozumienia struktur komórkowych.
- Przyszłe zastosowania mogą rozszerzyć się na inne dziedziny badań biomedycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Multimodal nonlinear optical microscopy enables chemically specific imaging of gold nanoparticles within cancer cells, providing high-resolution biomolecular contrast critical for nanomedicine R&D. This platform supports the precise localization and characterization of nanoparticle uptake, informing the design and optimization of functionalized nanomaterials for targeted delivery. Integrating multiple nonlinear optical signals enhances predictive confidence at the interface of discovery biology and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of nanoparticle-cell interactions for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of nanoparticle targeting and uptake in relevant cellular contexts.
- Provides spatial and chemical mapping to clarify biological pathways of nanoparticle distribution.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated imaging assays for nanoparticle localization and trafficking.
- Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative evaluation of nanoparticle formulations.
- Supports assay standardization and scalability for high-content screening of nanomaterial candidates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Enables assessment of nanoparticle biodistribution in pericellular and intracellular compartments.
- Provides molecular imaging data to inform preclinical advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This multimodal imaging method bridges early discovery and preclinical research by enabling high-content, chemically specific visualization of nanoparticle uptake and distribution in cancer cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on nanoparticle-cell interactions and pathway engagement.
- Screening: Provides quantitative, reproducible imaging data for candidate comparison.
- Analytics: Generates hyperspectral and multimodal readouts for robust statistical analysis.
- Translational Research: Connects in vitro imaging to preclinical model validation of nanomedicine candidates.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for ongoing nanomaterial and cellular imaging studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in nanoparticle targeting and uptake mechanisms.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable imaging workflows for cross-project application.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for nanomedicine candidates by reducing mechanistic ambiguity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of nanoparticle formulations for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nonlinear optical microscopy and hyperspectral imaging.
- Demands advanced instrumentation, including tunable lasers and synchronized detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis workflows.
- Adaptation may be needed for different cell types or nanomaterial systems.
- Imaging throughput and sample preparation must be balanced with analytical depth.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Operating on the Laser Scanning Microscope
1:30
Mounting a Sample in the Microscope Stage
2:05
Changing the Raman Shift and Collecting a Hyperspectral Data Stack
5:01
Results: Hyperspectral Imaging of Gold Nanoparticles and Cancer Cells
6:16
Conclusion
