Name: Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj multimodalną nieliniową mikroskopię optyczną do obrazowania nanocząstek złota w komórkach nowotworowych. Ta metoda umożliwia badanie kontrastu biomolekularnego w strukturach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty EPSRC: Raman Nanotheranostics (EP/R020965/1) i CONTRAST facility (EP/S009957/1).

1. Włączanie systemu laserowego
<ol>
	<li>Włącz system blokad i wybierz laser ramienia przed uruchomieniem systemu.</li>
	<li>Włącz komputer z oprogramowaniem, aby sterować laserem femtosekundowym z podwójnym wyjściem.</li>
	<li>Załaduj oprogramowanie dla lasera femtosekundowego z podwójnym wyjściem; oprogramowanie to umożliwia włączanie i wyłączanie lasera oraz bezpośrednio kontroluje długość fali wiązki pompy.</li>
	<li>Włącz emisję lasera, przytrzymując ikonę zasilania, aby policzyć do 3.</li>
	<li>Poczekaj, aż laser się rozgrzeje, a kontrolka gotowości do pracy z laserem zaświeci się na zielono w oprogramowaniu.</li>
	<li>Długość fali wiązki pompy jest bezpośrednio kontrolowana przez oprogramowanie i może wynosić od 680 do 1 300 nm. Do obrazowania komórkowego w obszarze wibracyjnym Ramana C-H wybierz 802 nm.</li>
	<li>Otwórz żaluzje przestrajalnej wiązki pompy i wiązki Stokesa 1,045 nm, przytrzymując obrazy przysłony przez 3 s. 
	UWAGA: Wskazówki dotyczące bezpieczeństwa lasera Laser femtosekundowy z podwójnym wyjściem jest laserem impulsowym na podczerwień klasy IV i może spowodować trwałe uszkodzenie wzroku. Dlatego podczas wykonywania tej procedury należy przestrzegać wszystkich lokalnych przepisów dotyczących bezpieczeństwa lasera: (i) Tylko upoważnieni użytkownicy, którzy przeszli szkolenie w zakresie bezpieczeństwa lasera, mogą wykonywać tę procedurę. (ii) Wejście do laboratorium odbywa się za pomocą karty magnetycznej z zamkiem w drzwiach pomieszczenia. (iii) Przez większość operacji wiązki laserowe są całkowicie zamknięte. (iv) Gdy wiązka laserowa jest naświetlona, należy nosić laserowe okulary ochronne (użyj laserowych okularów ochronnych LG9, które blokują OD 7+ zarówno pompę, jak i wiązki Stokesa).</li>
</ol>
2. Włączanie jednostki rekombinacji i czasu ogniskowania spektralnego (SF-TRU)
<ol>
	<li>Załaduj oprogramowanie ATM na ten sam komputer co oprogramowanie laserowe, które steruje stopniami opóźnienia i tłumikami lasera w jednostce SF-TRU. 
	UWAGA: To urządzenie jest odpowiedzialne za upewnienie się, że pompa i belki Stokesa zachodzą przestrzennie na siebie, kontrolowanie dyspersji w pompie i belkach Stokesa oraz kontrolowanie opóźnienia czasowego między pompą a belkami Stokesa. Polaryzacja zarówno pompy, jak i belek Stokesa jest pionowa. Należy pamiętać, że każda wiązka jest wyposażona w płytkę półfalową, która niezależnie kontroluje polaryzację przed wyjściem z SF-TRU.</li>
	<li>Upewnij się, że zarówno pompa, jak i lasery Stokesa są osłabione do <10% (pompa) i <15% (wiązki Stokesa). Jeśli wiązki nie są tłumione, moc lasera może spowodować uszkodzenie systemu i spalenie próbek biologicznych.</li>
	<li>W przypadku obrazowania komórkowego ustaw optymalne ustawienia lasera na 6% (pompa) i 10% (Stokes), co odpowiada 12 mW i 30 mW na próbce.</li>
	<li>SF-TRU ma dwa ustawienia: tryb femtosekundowy (fs) i tryb pikosekundowy (ps).</li>
	<li>W trybie fs wciśnij pokrętła po obu stronach pudełka (spowoduje to usunięcie siatek dyspersyjnych ze ścieżki wiązki).</li>
	<li>W trybie ps wyciągnij pokrętła po obu stronach pudełka (spowoduje to umieszczenie siatek dyspersyjnych na ścieżce wiązki).</li>
	<li>W przypadku obrazowania hiperspektralnego wybierz tryb ps.</li>
	<li>Upewnij się, że stopień opóźniający znajduje się we właściwej pozycji, aby pompa i wiązki Stokesa czasowo zachodziły na siebie w celu obrazowania C-H w tym systemie.</li>
	<li>Upewnij się, że ustawienia dyspersji pompy i wiązki Stokesa są prawidłowe; dla pompy 802 nm jest to 5 mm dla belki pompy i 30 mm dla belki Stokesa.</li>
</ol>
3. Modulacja wiązki Stokesa do obrazowania SRS
<ol>
	<li>W celu wykrycia SRS moduluj intensywność wiązki Stokesa.</li>
	<li>Włączyć generator sygnału do modulacji wiązki.</li>
	<li>Przywołaj poprzednie ustawienia, które są następujące: 
	WYJŚCIE 1: Fala prostokątna: Częstotliwość = 19,5 MHz, Amplituda = 1,4 V. 
	WYJŚCIE 2: Fala prostokątna: Częstotliwość = 19,5 MHz, Amplituda = 300 mV.</li>
	<li>Włączyć wyjścia 1 i 2.</li>
	<li>Podłącz wyjście 1 do amplifier dla EOM w skrzynce SF-TRU za pomocą BNC.</li>
	<li>Podłącz wyjście 2 do wzmacniacza lock-in używanego do wykrywania SRS za pomocą BNC.</li>
	<li>Włączyć zasilanie wzmacniacza na suwnicy.</li>
</ol>
4. Włączanie wzmacniacza lock-in
<ol>
	<li>Do obrazowania SRS należy użyć modułu detekcji SRS, który składa się z fotodiody o dużej powierzchni i specjalnie zaprojektowanego wzmacniacza typu lock-in.</li>
	<li>Włączyć zasilanie do wzmacniacza lock-in na suwnicy.</li>
	<li>Załaduj oprogramowanie wzmacniacza typu lock-in "SRS detection Module" na komputer.</li>
	<li>W oprogramowaniu wybierz następujące ustawienia: Faza = 0°, Przesunięcie = -80 mW, Wzmocnienie = 58 dB.</li>
	<li>Wybierz stałą czasową integracji wzmacniacza typu lock-in w oprogramowaniu: w przypadku obrazowania komórek stała czasowa 2 μs zapewnia obrazy o dobrej jakości.</li>
</ol>
5. Operowanie na laserowym mikroskopie skaningowym
<ol>
	<li>Włącz wtyczki wszystkich urządzeń z wyjątkiem skrzynki pilota zdalnego sterowania. Poczekaj, aż zaświeci się tryb czuwania na skrzynce sterowniczej znajdującej się w górnej części suwnicy.</li>
	<li>Włącz skrzynkę zdalnego sterowania na suwnicy i włącz z tyłu skrzynki. Poczekaj, aż kontrolka pilota zmieni kolor na niebieski (na skrzynce sterowniczej) i naciśnij Rozpocznij operację.</li>
	<li>Włącz komputer laserowego mikroskopu skaningowego.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Sprawdź drogę światła mikroskopu za pomocą oprogramowania komputerowego. 
	UWAGA: W mikroskopie wprowadzono pewne modyfikacje, aby nadawał się do obrazowania SRS: (i) W ścieżce wiązki do koła filtrów dodano krótki przebieg 775 nm, w którym wiązki laserowe wchodzą do jednostki skanującej, można to wybrać w zakładce Lightpath w oprogramowaniu komputerowym. (ii) Zamiast używać wbudowanych w mikroskop konfokalny PMT do wykrywania, do ścieżki światła przechodzącego dodano specjalnie zaprojektowany detektor, który umożliwia wykrywanie zarówno SRS, jak i CARS. (iii) Wyjścia z tych detektorów są podłączone do skrzynki analogowej na suwnicy. Sygnał CARS z PMT podłączany jest BNC do CD1, a sygnał SRS ze wzmacniacza lock-in podłączany jest BNC do CD2.</li>
	<li>Steruj ostrością za pomocą ekranu dotykowego, pokręteł pilota zdalnego sterowania lub oprogramowania komputerowego.</li>
	<li>Wybierz żądane ustawienia obrazu w oprogramowaniu, w tym powiększenie, rozmiar obrazu w pikselach i czas przebywania pikseli.</li>
	<li>Upewnij się, że szybkość obrazowania (czas przebywania piksela) jest większa niż czas integracji ustawiony w oprogramowaniu wzmacniacza lock-in. 
	UWAGA: Do obrazowania użyto obiektywu zanurzonego w wodzie NA 1.2.</li>
</ol>
6. Montaż próbki w stoliku mikroskopu
<ol>
	<li>Przygotuj próbki komórek do obrazowania w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Hodowla komórek raka sutka myszy 4T1 w RPMI-1640 uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Zmieniaj pożywkę co 2 dni i przechodź komórki w tempie 70%–80% konfluencji. 
		UWAGA: Pasaże 8-10 były używane przez cały czas trwania opisanych tutaj eksperymentów.</li>
		<li>W przypadku eksperymentów obrazowych inkubować 1 x 105 komórek na kwadratowych szkiełkach nakrywkowych przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Następnie przemyć komórki wstępnie podgrzanym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować z nanocząstkami złota (rozcieńczenie 1:100 w pożywce do hodowli komórkowych, stężenie podstawowe: 2,3 x10 10 cząstek/ml, średnica: 60 nm) przez 4 godziny.</li>
		<li>Przed obrazowaniem umyj komórki lodowatym PBS i utrwal je 4% paraformaldehydem w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT). Umyj komórki PBS 3x, a następnie zamontuj między dwoma szkiełkami nakrywkowymi w celu obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść kroplę wody destylowanej na obiektywie zanurzenia w wodzie, który skupia wiązki laserowe na próbce między obiektywem a próbką. Następnie umieść próbkę na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Kondensator z NA 1.4 zbiera światło rozchodzące się do przodu. Umieścić kroplę wody między skraplaczem a próbką do obrazowania. Ustawić wysokość kondensatora na około 1 mm nad próbką, aby zebrać maksymalną ilość światła.</li>
	<li>Detektor SRS znajduje się na ruchomym uchwycie, co pozwala na jego wsunięcie i wysunięcie z toru optycznego odbioru. W celu skupienia ostrości na próbce za pomocą światła białego, należy przesunąć detektor SRS poza tor wiązki.</li>
	<li>Umieść detektor z powrotem na ścieżce wiązki, gotowy do obrazowania SRS.</li>
</ol>
7. Zmiana przesunięcia Ramana i zbieranie danych hiperspektralnych
UWAGA: Przesunięcie Ramana, przy którym odbywa się obrazowanie, zależy od pozycji stopnia opóźniającego w skrzynce SF-TRU i długości fali wiązki pompy z systemu laserowego.
<ol>
	<li>W przypadku dużych zmian w przesunięciu Ramana należy zmienić długość fali lasera. Na przykład, aby obrazować drgania CO w zakresie 2,800–3,100 cm-1, wybierz 802 nm, natomiast w przypadku obrazowania około 1,600 cm-1 dla piku amidu I, wybierz wiązkę pompy przy 898 nm. Dostosuj to za pomocą oprogramowania.</li>
	<li>Aby uzyskać niewielkie korekty w przesunięciu Ramana, zeskanuj stopień opóźniający w jednostce SF-TRU.</li>
	<li>SF-TRU podaje pozycje stopnia opóźniającego w milimetrach (mm). Aby przeliczyć pozycję stopnia opóźniającego z mm na cm-1, wykonaj kalibrację skanowania hiperspektralnego przy użyciu próbki kulek polistyrenowych i porównaj pozycje pików znalezione w skanie kalibracyjnym z tymi wykonanymi w spontanicznym układzie Ramana. W ten sposób otrzymamy równanie liniowe, które przeliczy pozycję stopnia opóźniającego w mm na przesunięcie Ramana w cm-1.</li>
	<li>Aby wygenerować skan hiperspektralny, należy wykonać serię zdjęć w różnych pozycjach etapu opóźnienia.</li>
	<li>Aby zsynchronizować akwizycję obrazu i ruch stopnia opóźniającego, użyj jednostki analogowej do wysyłania i odbierania sygnałów TTL do iz systemu SF-TRU. 
	UWAGA: Aby to zrobić, skrzynka analogowa ma następujące połączenia: (i) TRIG OUT VD1 - jest podłączony do SF-TRU za pomocą BNC i wysyła sygnał TTL, aby powiedzieć opóźnieniu stage, aby przesunął się o krok +1. (ii) TRIG In 1 - w tym przypadku sygnał jest odbierany przez BNC, gdy stopień opóźniający zakończy swój ruch, i jest on używany do wyzwolenia następnego obrazu w szeregu czasowym.</li>
	<li>Dla zestawu danych hiperspektralnych wybierz następujące ustawienia w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego:
	<ol>
		<li>Na karcie Trigger (Wyzwalacz) wybierz opcję Start by TTL trigger (ON) i Trigger (every frame).</li>
		<li>Na karcie Serie ustaw szeregi czasowe WŁĄCZONE i szeregi z WYŁĄCZONE.</li>
		<li>Ustaw liczbę klatek w szeregach czasowych tak, aby odpowiadała liczbie kroków w oprogramowaniu ATM (w tym miejscu jest używana liczba 101 kroków).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W oprogramowaniu bankomatu przejdź do zakładki Uruchom.
	<ol>
		<li>Ustaw pozycje stopnia opóźnienia w milimetrach dla rozpoczęcia i zakończenia skanowania hiperspektralnego. W przypadku obszaru o wysokiej liczbie falowej CH użyj pozycji początkowej = 90.25 mm i pozycji końcowej = 92.25 mm.</li>
		<li>Upewnij się, że liczba kroków odpowiada liczbie ramek w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po sprawdzeniu prawidłowych ustawień należy najpierw uruchomić stos hiperspektralny w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego. Przejdź do Acquire i kliknij Rozpocznij skanowanie. Następnie w oprogramowaniu bankomatu kliknij Start. Inicjuje to zbieranie serii obrazów, z przyrostowym wzrostem pozycji stopnia opóźnienia między wybranymi pozycjami początkowymi i końcowymi</li>
	<li>Wyeksportuj serię obrazów hiperspektralnych jako plik .tif wieloklatkowy i użyj odpowiedniego pakietu oprogramowania do przeprowadzenia kalibracji.</li>
	<li>Po zakończeniu kalibracji użyj równania kalibracji liniowej, aby przekonwertować pozycję stopnia opóźnienia na przesunięcia Ramana.</li>
	<li>Aby przełączać się między obrazowaniem w obszarze wibracyjnym CH (2,800–3,100 cm-1) a obszarem wibracyjnym amidu I 1,500–1,700 cm-1), wykonaj następujące czynności.
	<ol>
		<li>Zmień długość fali pompy w oprogramowaniu lasera z 802 nm na 898 nm.</li>
		<li>Zmień ustawienie dyspersji Stokesa w oprogramowaniu ATM z 30 mm na 5 mm.</li>
		<li>Dokonaj niewielkiej regulacji lustra w ścieżce dyspersji wiązki pompy wewnątrz skrzynki SF-TRU. Odbywa się to poprzez regulację dolnego pokrętła na uchwycie lusterka, które zmienia kąt lustra o wartość przyrostową.</li>
		<li>Wykonując skan hiperspektralny nad regionem amidu I, ustaw pozycje start i stop w oprogramowaniu ATM odpowiednio na 89 i 91 mm 
		UWAGA: Na tym etapie należy nosić okulary ochronne do lasera, ponieważ wiązka lasera będzie odsłonięta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tabish, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+gold+nanostructures+for+light+mediated+cancer+theranostics%3A+Combining+optical+diagnostics+with+photothermal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy.</a> Advanced Science. 7 (15), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1903441(2020).</li>
<li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanostars+for+efficient+in+vitro+and+in+vivo+real-time+SERS+detection+and+drug+delivery+via+plasmonic-tunable+Raman%2FFTIR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging.</a> Biomaterials. 106, 87-97 (2016).</li>
<li>Jenkins, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+photothermal+treatment+efficacy+and+normal+tissue+protection+via+vascular+targeted+gold+nanocages%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotheranostics%22%5BJournal%5D)">Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages.</a> Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+and+synthesis+of+gammaFe2+O3+%40Au+magnetic+gold+nanoflowers+for+efficient+cancer+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics.</a> Advanced Materials. 27 (34), Deerfield Beach, Fla. 5049-5056 (2015).</li>
<li>Dilipkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multiphoton+endomicroscopy+for+minimally+invasive+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+science%22%5BJournal%5D)">Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging.</a> Advanced science. 6 (8), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1801735(2019).</li>
<li>Wang, C. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+normal+and+cancerous+lung+tissues+by+multiphoton+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034(2009).</li>
<li>Chrabaszcz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+and+HD+FT-IR+with+multimodal+CARS%2FTPEF%2FSHG%2FFLIMS+imaging+in+the+detection+of+the+early+stage+of+pulmonary+metastasis+of+murine+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer.</a> The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).</li>
<li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+radiofrequency-skin+interaction+using+multiphoton+microscopy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo.</a> Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).</li>
<li>Wang, C. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+cutaneous+cancer+revealed+by+intravital+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy.</a> Applied Physics Letters. 97 (11), 113702(2010).</li>
<li>Li, F. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+skin+fold+chamber+for+high+resolution+multiphoton+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+and+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging.</a> Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).</li>
<li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+semiconducting+and+metallic+carbon+nanotubes+in+cells+and+mice+using+transient+absorption+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).</li>
<li>Chong, S., Min, W., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ground-state+depletion+microscopy%3A+Detection+sensitivity+of+single-molecule+optical+absorption+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+absorption+microscopy+of+gold+nanorods+as+spectrally+orthogonal+labels+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells.</a> Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).</li>
<li>Liu, J., Irudayaraj, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fluorescent+quantification+of+single+mRNA+with+transient+absorption+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy.</a> Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).</li>
<li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li>
<li>Wang, C. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+chemically+specific+mapping+of+agrochemical+seed+coatings+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108(2018).</li>
<li>Wang, C. -C., Yoong, F. -Y., Penfield, S., Moger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+active+ingredients+uptake+in+seed+coats+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+SPIE+10069%2C+Multiphoton+Microscopy+the+Biomedical+Sciences+XVII%22%5BJournal%5D)">Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928(2017).</li>
<li>Hu, F., Shi, L., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+of+chemical+bonds+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).</li>
<li>Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Module+for+multiphoton+high-resolution+hyperspectral+imaging+and+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+SPIE+10498%2C+Multiphoton+Microscopy+in+the+Biomedical+Sciences+XVIII%22%5BJournal%5D)">Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy.</a> Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980(2018).</li>
<li>Wang, C. -C., Wu, R. -J., Lin, S. -J., Chen, Y. -F., Dong, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+discrimination+of+normal+and+pulmonary+cancer+tissues+using+multiphoton+fluorescence+ratiometric+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy.</a> Applied Physics Letters. 97 (4), 043706(2010).</li>
<li>Wang, C. -C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lipid+accumulation+in+the+green+microalga+botryococcus+braunii+with+frequency-modulated+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+SPIE+9329%2C+Multiphoton+Microscopy+in+the+Biomedical+Sciences+XV%22%5BJournal%5D)">Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering.</a> Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329(2015).</li>
<li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li>
<li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+plasmon-enhanced+CARS+and+TPEF+for+Gram+staining+identification+of+non-fluorescent+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochimica+Acta+Part+A%3A+Molecular+and+Biomolecular+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria.</a> Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283(2022).</li>
<li>Ma, J., Sun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+microscopies+%28NOMs%29+and+plasmon-enhanced+NOMs+for+biology+and+2D+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nanophotonics%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials.</a> Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).</li>
<li>Sun, L., Chen, Y., Sun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+nonemissive+excited-state+intramolecular+proton+transfer+by+plasmon-enhanced+hyper-Raman+scattering+and+two-photon+excitation+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W pracy zaprezentowano połączenie modułu SF-TRU z ultraszybkim systemem laserowym o podwójnym wyjściu, demonstrując swoje zastosowania w mikrospektroskopii multimodalnej. Dzięki możliwości badania wychwytu nanocząstek złota (AuNPs) przez komórki nowotworowe, multimodalna platforma obrazowania może wizualizować reakcje komórkowe na leczenie raka w hipertermii, gdy wiązki laserowe są pochłaniane przez AuNPs.
Co więcej, szybkie obrazowanie specyficzne chemicznie i wysoka rozdzielczość spektralna ...

Nanocząstki złota (AuNPs) wykazały duży potencjał jako biokompatybilne sondy obrazowania, na przykład jako skuteczne podłoża spektroskopii Ramana (SERS) w różnych zastosowaniach biomedycznych. Główne zastosowania obejmują takie dziedziny, jak biodetekcja, bioobrazowanie, spektroskopia wzmocniona powierzchniowo i terapia fototermiczna w leczeniu raka1. Co więcej, badanie AuNP w organizmach żywych ma kluczowe znaczenie dla oceny i zrozumienia interakcji między AuNP a systemami biologicznymi. Istnieją różne techniki analityczne, w tym spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR)2, spektrometria mas z indukcyjnie sprzężoną ablacją laserową (LA-ICP-MS)3 oraz obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI)4, które zostały z powodzeniem wykorzystane do zbadania rozmieszczenia AuNP w tkankach. Niemniej jednak metody te mają kilka wad, takich jak czasochłonność i skomplikowane przygotowanie próbki3, wymagające długiego czasu akwizycji, lub brak submikronowej rozdzielczości przestrzennej2,4.
W porównaniu z konwencjonalnymi technikami obrazowania, nieliniowa mikroskopia optyczna oferuje kilka zalet do badania żywych komórek i AuNPs: Nieliniowa mikroskopia optyczna osiąga większą głębokość obrazowania i zapewnia wewnętrzną zdolność do optycznego cięcia 3D przy użyciu ultraszybkich laserów bliskiej podczerwieni. Dzięki znacznej poprawie szybkości obrazowania i czułości wykrywania, dwufotonowa fluorescencja wzbudzona (TPEF)5,6,7 i generacja drugiej harmonicznej (SHG)8,9,10 Wykazano, że mikroskopia jeszcze bardziej usprawnia nieinwazyjne obrazowanie endogennych biomolekuł w żywych komórkach i tkankach. Ponadto, wykorzystując nowatorskie nieliniowe techniki optyczne z pompą i sondą, takie jak absorpcja przejściowa (TA)11,12,13,14 i stymulowane rozpraszanie Ramana (SRS)15,16,17,18możliwe jest wyprowadzenie bezznacznikowego kontrastu biochemicznego struktur komórkowych i AuNPs. Wizualizacja AuNP bez użycia znaczników zewnętrznych ma ogromne znaczenie, ponieważ zaburzenia chemiczne nanocząstek modyfikują ich właściwości fizyczne, a tym samym ich absorpcję w komórkach.
Ten protokół przedstawia implementację modułu SF-TRU (Spectral Focusing Timing and Recombination Unit) dla lasera impulsowego o podwójnej długości fali, umożliwiając szybkie multimodalne obrazowanie AuNP i komórek nowotworowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów zintegrowanych technik TPEF, TA i SRS w laserowym mikroskopie skaningowym.

<table><tbody><tr><td>Jednostka detekcyjna APE SRS APE</td><td>(Angewandte Physik & Elektronik GmbH)</td><td>APE Lock-in Module</td><td>Połączony system zawierający fotodiodę Si o dużej powierzchni do wykrywania wiązki pompy wraz ze wzmacniaczem Lock-In do wykrywania modulacji wiązki</td></tr><tr><td>Konfokalna jednostka skanująca</td><td>Olympus</td><td>FV 3000</td><td>Konfokalna jednostka skanująca służąca do obrazowania</td></tr><tr><td>kulek lateksowych CML, 4% w/v, 1,0 i mikro; m</td><td>Invitrogen</td><td>C37483</td><td>Mikrosfery polistyrenowe</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Thorlabs</td><td>CG15CH2</td><td>Szkiełka nakrywkowe 22 mm x 22 mm do komórek wysiewających</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>Surowica bydlęca płodu (inaktywowana termicznie)</td></tr><tr><td>Flouview</td><td>Olympus</td><td>FV31S-SW</td><td>Oprogramowanie sterujące laserowym mikroskopem skaningowym</td></tr><tr><td>Generator funkcyjny</td><td>BX precyzyjny</td><td>40543</td><td>Służy do generowania funkcji fali prostokątnej, która jest podawana do EOM w SF-TRU w celu wytworzenia modulacji w wiązce stokesa</td></tr><tr><td>Nanocząstki złota</td><td>Nanopartz</td><td>A11-60</td><td>Sferyczne nanocząstki złota, średnica 60 nm</td></tr><tr><td>Interfejs wejściowo-wyjściowy</td><td>Olympus</td><td>FV30 ANALOG</td><td>To urządzenie umożliwia wprowadzanie odczytów napięcia z PMT i LockIn do oprogramowania skanowania konfokalnego i umożliwia przesyłanie impulsów czasowych między mikroskopem Olympus a SF-TRU jednostka.</td></tr><tr><td>InSight X3</td><td>Newport</td><td>Spectra-Physics</td><td>Femtosekundowy laser impulsowy o podwójnym wyjściu. Przestrajany (680&ndash; 1300 nm) i stałe (1045 nm) wyjścia laserowe z częstotliwością powtarzania 80 MHz.</td></tr><tr><td>Rama mikroskopu</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td>Mikroskop odwrócony</td></tr><tr><td>Mysz 4T1 komórki</td><td></td><td>ATCC CRL-2539</td><td>Mysie komórki raka piersi</td></tr><tr><td>NA 1.2 Cel zanurzenia w wodzie</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60XW/IR</td><td>Wielofotonowy obiektyw 60x ma odległość roboczą 0,28 mm. Można zastosować inne podobne cele.</td></tr><tr><td>Kondensator NA 1.4</td><td>Nikon</td><td>CSC1003</td><td>Można również stosować inne kondensatory z NA wyższym niż obiektyw wzbudzenia.</td></tr><tr><td>PMT</td><td>Hamamatsu</td><td>R3896</td><td>PMT służy do wykrywania zdjęć anty-stokes dla CARS micrsocopy</td></tr><tr><td>PMT Connector</td><td>Hamamatsu</td><td>C13654-01-Y002</td><td>Connector for PMT</td></tr><tr><td>Power Supply</td><td>RS</td><td>RSPD-3303 C</td><td>Programowalny zasilacz, który służy do dostarczania prawidłowego napięcia do PMT</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>A10491-01</td><td>Od tego czasu stwierdzono, że pożywka 1640 z Roswell Park Memorial Institute (RPMI) jest odpowiednia dla różnych komórek ssaków.</td></tr><tr><td>SF-TRU</td><td>Newport Spectra Physics</td><td>System SF-TRU</td><td>przeznaczony do kontrolowania opóźnienia czasowego i dyspersji 2 wyjść laserowych oraz do wykonywania modulacji wiązki wymaganych dla SRS</td></tr></tbody></table>

obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej

Biomolecular Imaging of Cellular Uptake of Nanoparticles using Multimodal Nonlinear Optical Microscopy

Badanie nanocząsteczek złota (AuNPs) w żywych systemach jest niezbędne do odkrycia interakcji między AuNPs a tkankami biologicznymi. Co więcej, dzięki integracji nieliniowych sygnałów optycznych, takich jak wymuszone rozpraszanie Ramana (SRS), fluorescencja wzbudzona dwoma fotonami (TPEF) i absorpcja przejściowa (TA) w platformę obrazowania, można ją wykorzystać do ujawnienia kontrastu biomolekularnego struktur komórkowych i AuNP w sposób multimodalny. W artykule przedstawiono multimodalną nieliniową mikroskopię optyczną i zastosowano ją do wykonywania specyficznego chemicznie obrazowania AuNP w komórkach nowotworowych. Ta platforma obrazowania zapewnia nowatorskie podejście do opracowywania bardziej wydajnych funkcjonalizowanych AuNP i określania, czy znajdują się one w naczyniach krwionośnych otaczających guz, przestrzeniach okołokomórkowych lub komórkowych.

Moduł jednostki czasowego skupiania widmowego i rekombinacji (SF-TRU) jest umieszczony pomiędzy femtosekundowym laserem o podwójnym wyjściu a zmodyfikowanym mikroskopem skaningowym. Zastosowany w tej badaniu regulowany system ultrafastych laserów posiada dwa porty wyjściowe dostarczające jedną wiązkę o stałej długości fali 1 045 nm oraz drugą wiązkę regulowaną w zakresie 680–1 300 nm. Szczegółowy schemat modułu SF-TRU oraz multimodalnej platformy obrazowania przedstawiono na Rysunku 1. SF-TR...

Ten artykuł przedstawia integrację modułu spektralnego ogniskowania i lasera impulsowego o podwójnym wyjściu, umożliwiającego szybkie obrazowanie hiperspektralne nanocząsteczek złota i komórek rakowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów multimodalnych nieliniowych technik optycznych na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym.

Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej

Probing gold nanoparticles (AuNPs) in living systems is essential to reveal the interaction between AuNPs and biological tissues. Moreover, by integrating ...

Nasz protokół przedstawia multimodalną, nieliniową mikroskopię optyczną i stosuje ją do wykonywania specyficznego chemicznie obrazowania nanocząstek złota w komórkach nowotworowych. Główną zaletą naszego systemu obrazowania jest to, że można go wykorzystać do przeglądu kontrastu biomolekularnego struktur komórkowych i nanocząstek złota w sposób multimodalny. Aby rozpocząć, włącz wtyczki wszystkich urządzeń, z wyjątkiem skrzynki pilota.Następnie włącz tylną część skrzynki i naciśnij Rozpocznij operację, gdy kontrolka pilota na skrzynce sterowniczej zmieni kolor na niebieski. Następnie włącz komputer laserowego mikroskopu skaningowego i uruchom oprogramowanie mikroskopu konfokalnego. Następnie sprawdź drogę światła mikroskopu za pomocą oprogramowania komputerowego i kontroluj ostrość za pomocą ekranu dotykowego lub pokręteł pilota zdalnego sterowania lub oprogramowania komputerowego.Wybierz żądane ustawienia obrazu w oprogramowaniu, w tym powiększenie, rozmiar obrazu w pikselach i czas zatrzymania piksela, upewniając się, że czas przebywania piksela jest dłuższy niż czas integracji. Umieść kroplę wody destylowanej na obiektywie zanurzenia w wodzie, który skupia wiązki laserowe w próbce i między skraplaczem a próbką w celu obrazowania. Następnie dostosuj wysokość kondensatora do około jednego milimetra nad próbką, aby zebrać maksymalną ilość światła i przesuń detektor SRS umieszczony na ruchomym uchwycie poza ścieżkę wiązki, aby skupić się na próbce za pomocą światła białego.Korzystając z ustawień oprogramowania, wybierz wiązkę pompy i zmień długość fali lasera na 802 nanometry dla drgań CO i 898 nanometrów dla piku amidu I, uwzględniając duże zmiany w przesunięciu Ramana. Aby uzyskać niewielkie korekty w przesunięciu Ramana, zeskanuj stopień opóźnienia w jednostce SFTRU zgodnie z opisem w manuskrypcie. Dla zestawu danych hiperspektralnych wybierz kartę Wyzwalacz, kliknij pozycję Rozpocznij od wyzwalacza ttl włączone, a następnie wybierz opcję Wyzwalaj co klatkę.Następnie na karcie Serie ustaw szereg czasowy włączony i wyłączony szereg Z. Ponadto należy ustawić liczbę ramek w szeregach czasowych tak, aby odpowiadała liczbie kroków w oprogramowaniu ATM. Następnie przejdź do zakładki Uruchom w oprogramowaniu ATM i ustaw pozycje stopnia opóźnienia dla CH na 90,25 i 92,25, natomiast dla obszaru amidu I na 89 i 91 w milimetrach, odpowiadające pozycji początkowej i końcowej skanowania hiperspektralnego, upewniając się, że liczba kroków odpowiada liczbie klatek w oprogramowaniu komputerowym.Po sprawdzeniu poprawnych ustawień uruchom stos hiperspektralny w oprogramowaniu komputerowym, przechodząc najpierw do Pobierz, a następnie klikając Rozpocznij skanowanie. Następnie w oprogramowaniu ATM kliknij przycisk Start, który inicjuje zbieranie serii obrazów z przyrostowymi wzrostami pozycji stopnia opóźnienia między wybranymi pozycjami startu i zatrzymania. Następnie wykonaj serię zdjęć w różnych pozycjach etapu opóźnienia, aby wygenerować skan hiperspektralny.Korzystając z jednostki analogowej, wysyłaj i odbieraj sygnały ttl do iz systemu SFTRU w celu synchronizacji akwizycji obrazu i ruchu stopnia opóźniającego. Aby przełączać się między obrazowaniem w obszarze wibracyjnym CH a obszarem wibracyjnym amidu I, zmień długość fali pompy w oprogramowaniu lasera z 802 nanometrów na 898 nanometrów. Ponadto zmień ustawienie dyspersji Stokesa w oprogramowaniu ATM z 30 milimetrów na 5 milimetrów.Wyreguluj dolne pokrętło na uchwycie lusterka, aby dokonać niewielkiej regulacji lustra w ścieżce dyspersji wiązki pompy wewnątrz skrzynki SFTRU, zmieniając kąt lustra o przyrostową wartość. Aby potwierdzić selektywność chemiczną mikrosfer polistyrenu, zarejestrowano hiperspektralne rozpraszanie Ramana i spontaniczne widma Ramana. Widma były identyczne, z wyjątkiem różnicy zaobserwowanej we względnym natężeniu.Obrazowanie stymulowanego rozpraszania Ramana komórek nowotworowych 4T1 przeprowadzono przy 2 852, 2 930 i 2 968 liczbach falowych, odpowiadających zakresowi oscylacyjnemu węgiel-wodór rozciągającego biomolekuły lipidów, białek i DNA. Przeprowadzono multimodalne obrazowanie komórek nowotworowych 4T1, którym podawano nanocząstki złota, w celu zbadania rozmieszczenia nanocząstek w komórkach nowotworowych. Uzyskane obrazy wymuszonego rozpraszania Ramana uzyskano dla kanału CH2 i CH3, sond fluorescencyjnych LysoTracker oraz kanału rozpraszania Ramanowskiego stymulowanego rezonansem.Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest zmiana obszaru wibracji, odniesienia pompy, w oprogramowaniu lasera, a także ustawienia dyspersji Stokesa podczas protokołu. System ten można łatwo przełączać z obszaru femtosekundowego na pikosekundowy bez wpływu na wyrównanie optyczne. Ta zdolność pozwala nam na wykonywanie wielofotonowego, koherentnego rozpraszania Ramana i spektroskopii z sondą pompową oraz ich zastosowania.Ta multimodalna platforma obrazowania dostarcza nowych informacji na temat nanomedycyny i toruje drogę do obrazowania molekularnego komórek, tkanek i nanocząstek złota.

biomolecular-imaging-cellular-uptake-nanoparticles-using-multimodal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

Ten protokół opisuje syntezę biofunkcjonalizowanych pruskich niebieskich nanocząstek i ich zastosowanie jako multimodalnych, molekularnych środków obrazowania. Nanocząstki mają konstrukcję rdzeń-powłoka, w której jony gadolinu lub manganu w rdzeniu nanocząstki generują kontrast MRI. Otoczka biofunkcjonalna zawiera fluorofory do obrazowania fluorescencyjnego i ligandy celujące do celowania molekularnego.

Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego do zastosowań w multimodalnym obrazowaniu molekularnym

Nasycone i odwrócone saturable rozpraszanie zostały odkryte w izolowanych cząstkach plazmonicznych i przyjęte jako nowatorska metoda kontrastu bez wybielania w mikroskopii superrozdzielczej. Tutaj szczegółowo wyjaśniono eksperymentalne procedury wykrywania i ekstrakcji rozpraszania nieliniowego, a także sposoby zwiększenia rozdzielczości za pomocą nasyconej mikroskopii wzbudzenia.

Pomiar nieliniowości rozpraszania od pojedynczej nanocząstki plazmonicznej

Tutaj pokazujemy użycie tradycyjnej mikroskopii ciemnego pola do monitorowania dynamiki nanoprętów złota (AuNR) na błonie komórkowej. Lokalizacja i orientacja pojedynczych AuNR są wykrywane za pomocą ImageJ i MATLAB, a stany dyfuzyjne AuNR są charakteryzowane przez analizę śledzenia pojedynczych cząstek.

Wizualizacja dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonie komórkowej przy użyciu mikroskopii ciemnego pola pojedynczych nanocząstek

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie biomolekuł na podstawie ich wewnętrznej wibracji określonych wiązań chemicznych. W tym protokole opisano instrumentalną konfigurację zintegrowanego mikroskopu SRS i dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego w celu wizualizacji struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym żywych myszy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

To badanie przedstawia metodę korelacyjnego obrazowania leków w tkankach miękkich za pomocą nieliniowej spektroskopii optycznej i obrazowania spektrometrii mas. Połączenie obrazowania skóry w wysokiej rozdzielczości z czułym wykrywaniem leków stanowi cenne podejście do badania dystrybucji leków w skórze, co ma kluczowe znaczenie dla opracowania doskonałych produktów do stosowania miejscowego.

Korelacyjne metodologie obrazowania spektroskopii optycznej i spektrometrii mas w celu wizualizacji dystrybucji leku w skrawku tkanek miękkich

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Protokół ten przedstawia multimodalne podejście łączące spektroskopię Ramana i tomograficzną mikroskopię fazową w celu bezznacznikowego, nieinwazyjnego fenotypowania żywych ludzkich komórek raka piersi. Zawiera przyjazny dla użytkownika, wolny od uprzedzeń człowieka potok analityczny do szybkiej, ilościowej analizy morfochemicznej, dostarczając szczegółowych informacji molekularnych i strukturalnych z zastosowaniami w badaniach nad rakiem i biologii komórki.

Ramy obrazowania multimodalnego w celu przyspieszenia fenotypowania żywych, bezznacznikowych komórek raka piersi

Protokół ten przedstawia przewodnik krok po kroku dotyczący techniki mikroskopowej SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), w tym szczegółowe informacje na temat generowania laserowego źródła światła, przygotowania próbki tkanki, przeprowadzania obrazowania i analizowania danych. SLAM rozwija mikroskopię nieliniową, mierząc cztery komplementarne kontrasty bez znaczników w celu zbadania mikrośrodowiska tkankowego.

Jednoczesna autofluorescencyjna mikroskopia wieloharmoniczna bez znaczników

Poznaj multimodalną nieliniową mikroskopię optyczną do obrazowania nanocząstek złota w komórkach nowotworowych. Ta metoda umożliwia badanie kontrastu biomolekularnego w strukturach komórkowych.

Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej

Przeglądaj więcej filmów