Zastosowanie interferencji RNA w nicieni sosnowym, Bursaphelenchus xylophilus

RNAi stało się skuteczną metodą identyfikacji funkcji genów u nicieni i jest proponowane jako nowy sposób skutecznej kontroli nicieni patogennych. RNAi polega na moczeniu nicieni w dsRNA, co może wystarczyć do zabiegu. Na początek zbierz nicienie metodą lejka Baermanna.

W tym celu umieść zaciskaną gumową rurkę pod lejkiem i umieść dwie warstwy papieru filtrującego w otworze lejka. Przenieś kultury grzybów Botrytis cinerea do lejka i dodaj wodę, aby zanurzyć matę grzybową. Po zebraniu nicieni należy dodać 500 mikrolitrów odczynnika ekstrakcyjnego i 100 mikrolitrów kulek magnetycznych do dwumililitrowej rurki wirówki.

Aspiruj 20 mikrolitrów nicieni i zmiel próbki w ilości 9 000 x g przez 30 sekund. Inkubuj przez pięć minut i wiruj w 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przelej supernatant do nowej rurki wirówki.

Dodaj 100 mikrolitrów chloroformu i wymieszaj, odwracając rurkę kilkakrotnie. Inkubuj przez trzy minuty, a następnie wiruj w 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie przelej supernatant do nowej rurki wirówki.

Dodaj 250 mikrolitrów alkoholu izopropylowego i intensywnie zacznij wirowanie. Wiruj w 12 000 x g przez 10 minut i wiruj. Usuń supernatant i dodaj 500 mikrolitrów 75% etanolu, aby przemyć RNA.

Wykonaj próbkę w wirze, a następnie wiruj w temperaturze 12 000 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Susz na powietrzu pellet RNA przez pięć minut, a następnie ponownie zawiesij go w 30 mikrolitrach wody wolnej od RNazy. Oblicz stężenie RNA według tego wzoru i oblicz stosunek A260 do A280.

Następnie użyj pary starterów, aby amplifikować częściową sekwencję kodującą genu BX ppm-1 z B. xylophilus. Następnie sklonuj sekwencje genu ppm-1 do wektora pGEM-T Easy zawierającego promotor T7. Odzyskaj fragment genu ppm-1 o długości 894 pary zasad, używając sklonowanego plazmidu jako szablonu dla PCR.

Następnie użyj zestawu transkrypcyjnego in vitro do syntezy dsRNA. Przeanalizuj jakość dsRNA za pomocą spektrofotometru i zwizualizuj produkty na żelu o wartości 1% agarozy. Dodaj cztery mikrolitry buforu moczącego 5X i zwiększ objętość do 20 mikrolitrów podwójnie destylowaną wodą, aby uzyskać końcowe stężenie RNA 0,8 mikrograma na mililitr.

Następnie umieść nicienie w naczyniu na 30 minut i czekaj, aż jajka przykleją się do dna. Ostrożnie usuwaj wodę i nicienie, nie mieszając jaj, aż w misce pozostaną tylko jaja. Wykluwaj zebrane jaja w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny, aby uzyskać larwy J2.

Zbieraj larwy do rurki i myj je trzy razy podwójnie destylowaną wodą. Następnie przeniesiono larwy do probówki zawierającej roztwór dsRNA. Do tego dodaj roztwór resorcynolu, aby uzyskać roztwór 1%.

Umieść larwy na stole do trzęsania, aby zapewnić wystarczające wchłanianie dsRNA do larw. W przypadku grup kontrolnych nasącz tę samą ilość nicieni w buforze mokającym bez sondy dsRNA lub sondą dsRNA GFP. Wykonaj qPCR z wykorzystaniem genów actB i tbb-2 jako wewnętrznych odniesień do oceny zmian w poziomie ekspresji genów.

Do oszacowania względnego poziomu ekspresji genów na podstawie krzywej rozpuszczenia i wartości Ct użyj metody delta delta Ct. Po RNAi hodować larwy J2 do dorosłości na trawnikach Botrytis cinerea na płytkach PDA. Zbieraj dorosłe osobniki metodą lejka Baermanna, jak pokazano w sekcji pierwszej.

Zrób zdjęcia dorosłych nicieni pod mikroskopem i użyj oprogramowania ImageJ, aby zmierzyć długość ciała 50 samiców i 50 samic. Analizuj dane, obliczając średnią i odchylenie standardowe dla każdej próbki. Zastosuj test Student T, aby porównać wyniki próbek z różnych grup.

Analiza względnej ekspresji genów po RNAi wykazała, że ppm-1 dsRNA może skutecznie hamować ekspresję jednego genu ppm-1 B. Xylophilus. Natomiast egzogenne dsRNA GFP nie miało wpływu na ekspresję ppm-1. Po RNAi rozmiar dorosłych osobników wyraźnie się zmniejszył mimo osiągnięcia dojrzałości płciowej, co skutkowało fenotypem mutanta o małym rozmiarze ciała.

Średnia długość ciała samic i samców mutantów wynosiła 544 i 526 mikrometrów, w porównaniu do 971 i 912 mikrometrów dla grupy kontrolnej. Najważniejsze jest przeniesienie nicieni do roztworu podwójnego RNA i dodanie kolejnego odczynnika, aby pobudzić nicienie do żerowania. Metoda ta nadaje się do badań genowych na dużą skalę i jest powszechnie stosowana w badaniach komórkowych. Badanie funkcji genów B. Xylophilus tą metodą ma wartość przewodnią dla biologicznej kontroli B. Xylophilus.