Name: Zastosowanie interferencji RNA w nicieni sosnowym, Bursaphelenchus xylophilus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Poznaj metodę namaczania w RNAi do badania funkcji genów u nicieni sosnowych Bursaphelenchus xylophilus. Technika ta umożliwia skuteczną inhibicję ekspresji genów i obserwację zmian fenotypowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały sfinansowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31870637 31200487) i wspólnie sfinansowane przez Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004).

Badanie zostało zatwierdzone przez radę ds. eksperymentów na zwierzętach Uniwersytetu Rolniczego i Leśnego Zhejiang. Izolat B. xylophilus NXY61 został pierwotnie wyodrębniony z chorego Pinus massoniana w rejonie Ningbo w prowincji Zhejiang, Chiny11.
1. Klonowanie genów
UWAGA: Szczegóły dotyczące podkładów używanych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów .
<ol>
	<li>Zbieraj nicienie.<ol>
		<li>Hodować szczep B. xylophilus na grzybni Botrytis cinerea na płytkach Potato Dextrose Agar (PDA) w temperaturze 25 °C przez 3-5 dni.</li>
		<li>Zbierz nicienie metodą lejkaBellmana 14.<ol>
			<li>Pod lejkiem umieść zaciskaną gumową rurkę i w otworze lejka umieść dwie warstwy papieru filtracyjnego. Przenieś kultury grzybowe do lejka i dodaj wodę, aby zanurzyć matę grzybową. Poczekaj 2 godziny, potem zbieraj nicienie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyodrębnić całkowite RNA z nicieni, używając odczynnika do ekstrakcji RNA (patrz Tabela Materiałów)11 zgodnie z następującymi krokami.<ol>
		<li>Dodaj 500 μL odczynnika ekstrakcyjnego i 100 μL kulek magnetycznych do rurki wirówki o pojemności 2 mL. Aspiruj 20 μL nicieni i przelej próbkę do młynka do mielenia w 9 000 × g przez 30 sekund. Inkubuj przez 5 minut, a następnie wiruj przez 10 minut w temperaturze 12 000 × g i 4 °C.</li>
		<li>Przelej supernatant do nowej rurki wirówki. Dodaj 100 μL chloroformu, zakręć probówkę i wymieszaj, odwracając ją kilkakrotnie. Inkubuj przez 3 minuty, a następnie wiruj przez 10 minut w temperaturze 12 000 × g w 4 °C.</li>
		<li>Przelej supernatant do nowej rurki wirówki. Dodaj 250 μL alkoholu izopropylowego i intensywnie zawiruj. Wirówka z 12 000 × g przez 10 minut.</li>
		<li>Usuń nadmiar. Dodaj 500 μL etanolu 75% do przemytu RNA, a następnie przeprowadź próbkę w wir. Wiruj przez 5 minut w temperaturze 12 000 × g i 4 °C.</li>
		<li>Susz na powietrzu pellet RNA przez 5 minut.</li>
		<li>Ponownie zawiesić pellet w 30 μL wody wolnej od RNazy.</li>
		<li>Oblicz stężenie RNA według wzoru: A260 × rozcieńczenia × 40 = μg RNA/mL. Oblicz stosunek A260/A280. UWAGA: Stosunek ~2 jest uważany za czysty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj odwrotną transkrypcję dobrej jakości RNA, aby uzyskać szablon cDNA.<ol>
		<li>Zaprojektować i użyć pary specyficznych primerów, ppm-1-F/R (patrz Tabela materiałów), aby amplifikować częściową sekwencję kodującą genu Bx-ppm-1 w B. xylophilus (numer przystąpienia GenBank QTZ96795).</li>
		<li>Sklonuj sekwencje genu ppm-1 do wektora pGEM-Teasy zawierającego promotor T7, stosując standardowy protokół klonowania11.<ol>
			<li>Ustaw reakcje PCR następująco: 2 μL cDNA, 25 μL 2x Ex Taq Polymerase Premix, 2 μL każdego podkładu (10 pmol/l) oraz sterylną wodę destylowaną do końcowej objętości 50 μL.</li>
			<li>Wykonaj zabieg wzmacniania w następujący sposób: 5 minut w 94 °C; następnie 35 cykli po 30 sekund przy 94 °C, 30 sekund przy 55 °C i 1 minutę w 72 °C; oraz ostatni krok przedłużania w temperaturze 72 °C przez 5 minut.</li>
			<li>Sklonuj amplifikowane produkty do wektora pGEM-T Easy do sekwencjonowania.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Synteza dsRNA
<ol>
	<li>Przygotuj szablon DNA do syntezy dsRNA za pomocą PCR z primerami zaprojektowanymi do dodawania miejsc promotorowych T7 na obu końcach. Dodaj sekwencję promotorów T7 do końca 5' spłonników.</li>
	<li>Użyj plazmidu zawierającego fragment genu ppm-1 (894 bp) jako szablonu do PCR i odzyskaj fragment zawierający promotor T711. Stosuj procedurę PCR i system opisany powyżej.</li>
	<li>Użyj zestawu transkrypcyjnego in vitro do syntezy dsRNA11.<ol>
		<li>Rozmroź zamrożone odczynniki na lodzie.</li>
		<li>Dodaj 2 μL buforu reakcji 10x, 2 μL mieszanki enzymów oraz 1 μg DNA do probówki wirówki. Dodaj wodę wolną od nukleazy, aby uzyskać standardową reakcję 4 μL. Następnie wymieszaj równe objętości czterech roztworów rybonukleotydowych (ATP, CTP, GTP i UTP) i dodaj 8 μL mieszaniny do probówki. Dokładnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.</li>
		<li>Dodaj 1 μL DNazy, dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję i dodaj 30 μL wody wolnej od nukleazy oraz 30 μL roztworu wydzielającego LiCl, aby wytrącić RNA. Wymieszaj dokładnie. Inkubować w temperaturze -20 °C przez noc.</li>
		<li>Wirówka przez 15 minut przy 12 000 × g i 4 °C. Usuń supernatant.</li>
		<li>Dodaj 1 ml 75% etanolu, aby przemyć RNA. Zrób próbkę w wirze i wiruj przez 10 minut w temperaturze 12 000 × g i 4 °C.</li>
		<li>Susz na powietrzu pellet RNA przez 3 minuty.</li>
		<li>Ponownie zawiesić pellet w 30 μL wody wolnej od RNazy.</li>
		<li>Przeanalizuj jakość dsRNA za pomocą spektrofotometru. Pipetą nałóż 1 μL próbki dsRNA na piedestał pomiarowy i ustaw długość fali na 340 nm. Wyobraź sobie produkty na żelu agarozowym o stężeniu 1,0%.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. RNAi przez moczenie
<ol>
	<li>Wymieszaj 4 μL 5x buforu moczenia (0,05% żelatyny, 5,5 mM KH2PO4, 2,1 mM NaCl, 4,7 mM NH4Cl, 3 mM spermydyny) z dsRNA i ddH2O, aby uzyskać całkowitą objętość 20 μL i końcowe stężenie RNA 0,8 μg/μL.</li>
	<li>Zdobyć larwy J2.<ol>
		<li>Zbierz nicienie z kultur grzybowych i przenieś je do szklanej miski Petriego o średnicy 6 cm. Dodaj 10 ml wody do naczynia, aby nicienie mogły swobodnie pływać. Zostawiaj nicienie w misce przez 30 minut i czekaj, aż jajka przyczepią się do dna.</li>
		<li>Ostrożnie usuwaj wodę i nicienie, uważając, by nie ruszyć jaj. Powtarzaj te kroki, aż wszystkie larwy i dorosłe zostaną usunięte, pozostawiając w misce tylko jaja.</li>
		<li>Wykluwaj zebrane jaja przez 24 godziny w ciemności w temperaturze 25 °C, aby uzyskać larwy J2. Zbierz larwy J2, umieść je w probówce i przemyj trzykrotnie ddH2O dla eksperymentu RNAi15.</li>
		<li>Przełóż larwy J2 do probówki 2 mL zawierającej roztwór dsRNA i dodaj roztwór resorcynolu (owinięty folią aluminiową i rozpuszczony w wodzie), aby uzyskać końcowe stężenie 1,0%. Inkubuj larwy w wirowaniu w 15 × g na stole do potrząsania przez 24 godziny w 25 °C, aby larwy skutecznie wchłaniały dsRNA.</li>
		<li>Mocz tę samą ilość nicieni w buforze mokającym bez sondy dsRNA lub z sondą dsRNA GFP jako kontrolą. Wykorzystaj gen GFP (gfp, M62653.1) jako nieendogenną kontrolę i syntetyzuj dsRNA gfp za pomocą genetycznie specyficznych primerów T7-GFP-F/R.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. wykrywanie qPCR
<ol>
	<li>Oczyść larwy J2 ddH2 O, w tym tez interferencją genów docelowych, interferencją genów GFP oraz niezakłóconą grupę kontrolną. Wyodrębnij całkowite RNA z każdej grupy za pomocą opisanej powyżej metody.</li>
	<li>Rozpocznij qPCR.<ol>
		<li>Zaprojektuj zapalniki q-ppm-1-F/R przy użyciu wybranego oprogramowania (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Ustawił reakcję qPCR w 12 μL zawierającej 1 μL cDNA, 6 μL fluorescencyjnego premixu, 0,4 μL każdego primeru (10 pmol/l) oraz sterylną wodę destylowaną.</li>
		<li>Wykonaj qPCR w następujący sposób: 2 minuty w 95 °C; następnie 40 cykli po 10 sekund przy 95 °C, 30 sekund przy 55 °C i 1 minutę w 72 °C.</li>
		<li>Użyj genu actb (numer przystąpienia GenBank EU100952) i genu tbb-2 (numer przystąpienia GenBank MT769316) lub innych genów jako wewnętrznych genów referencyjnych do oceny zmian poziomu ekspresji genów po RNAi15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zgodnie z wartością progu cyklu (Ct) i krzywej rozpuszczania zastosowano metodę 2-ΔΔCt do oszacowania względnego poziomu ekspresji docelowego genu i weryfikacji efektywności interferencyjnej.<ol>
		<li>Aby uzyskać wartość ΔCt, odejmij wartość Ct wewnętrznego genu referencyjnego każdej próbki od wartości Ct genu docelowego. Następnie odejmij wartość ΔCt grupy interferencyjnej od wartości ΔCt grupy kontrolnej, aby uzyskać wartość ΔΔCt. UWAGA: Wartość ΔΔCt większa niż 0 wskazuje, że zakłócenie jest skuteczne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ocena długości ciała dorosłych nicieni według RNAi
<ol>
	<li>Po RNAi hodować larwy J2 do dorosłości na trawnikach B. cinerea w płytkach PDA przez 60 godzin w temperaturze 25 °C15.</li>
	<li>Zbierz dorosłe osobniki metodą lejka Bellmana (patrz krok 1.1.2.1)14.</li>
	<li>Zrób zdjęcia dorosłych nicieni pod mikroskopem i użyj oprogramowania ImageJ (lub innego oprogramowania pomiarowego) do pomiaru długości ciała.<ol>
		<li>Zmierz długość za pomocą ImageJ, wybierając Analizuj | Ustaw skalę. Jeśli odległość jest znana, wpisz wartość długości narysowanej prostej. Wprowadzamy jednostkę długości.</li>
		<li>Zaznacz pole Global (użyj tego standardu dla wszystkich zdjęć) i kliknij OK , aby wybrać długość do pomiaru z linią prostą na obrazie, który ma być mierzony.</li>
		<li>Użyj polecenia Ctrl+M (pomiar), aby wyświetlić wyniki i zarejestrować je w oknie wyników .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierzyć 50 samców i 50 samic nicieni do analizy statystycznej12.</li>
	<li>Analizuj dane, obliczając średnią i odchylenie standardowe dla każdej próbki. Porównaj średnie próbek z różnych grup za pomocą testu Student t-test.</li>
</ol>

<ol><li>Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicol%2C+JM+%22Genomics+and+Molecular+Genetics+of+Plant-Nematode+Interactions%22">Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions</a>. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).</li>
<li>Jones, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant-parasitic+nematodes+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).</li>
<li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+insights+into+the+origin+of+parasitism+in+the+emerging+plant+pathogen+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219(2011).</li>
<li>Megen, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phylogenetic+tree+of+nematodes+based+on+about+1200+full-length+small+subunit+ribosomal+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences.</a> Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).</li>
<li>Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+technology+extends+its+reach%3A+Engineering+plant+resistance+against+harmful+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes.</a> African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+novel+traits+in+plants+through+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Engineering novel traits in plants through RNA interference.</a> Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).</li>
<li>Marmonier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+acquisition+of+specific+small+interfering+RNAs+inhibits+the+expression+of+some+target+genes+in+the+plant+ectoparasite+Xiphinema+index%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266(2019).</li>
<li>Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attempt+to+silence+genes+of+the+RNAi+pathways+of+the+root-knot+nematode%2C+Meloidogyne+incognita+results+in+diverse+responses+including+increase+and+no+change+in+expression+of+some+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 328(2020).</li>
<li>Zhou, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+akt-1+in+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Forest+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Forest Pathology. 51 (1), 12647(2021).</li>
<li>Zhou, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mab-3+in+spermatogenesis+and+ontogenesis+of+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bxy-fuca+encoding+%CE%B1-L-fucosidase+plays+crucial+roles+in+development+and+reproduction+of+the+pathogenic+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Bxy-fuca encoding α-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).</li>
<li>Wang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+daf-8+in+the+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forestry+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Journal of Forestry Research. , (2021).</li>
<li>Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+methodology+of+nematode+extraction+from+field+samples%3A+Baermann+funnel+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nematology%22%5BJournal%5D)">On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications.</a> Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).</li>
<li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+and+quantification+of+mating+behavior+in+the+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842(2016).</li>
<li>Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+reliable+reference+genes+for+RT-qPCR+analysis+of+Bursaphelenchus+mucronatus+gene+expression+from+different+habitats+and+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages.</a> Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA-mediated+interference+of+dumpy+genes+in+Bursaphelenchus+xylophilus+by+feeding+on+filamentous+fungal+transformants%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants.</a> International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).</li>
<li>Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+cellulose+gene+of+the+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%2C+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%3A+GMR%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference.</a> Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).</li>
<li>Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cellulase+gene+knock+down+by+dsRNA+interference+on+the+development+and+reproduction+of+the+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).</li>
<li>Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+L-like+cysteine+proteinase+genes+are+associated+with+the+development+and+pathogenicity+of+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215(2019).</li>
<li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+C.+elegans%3A+Soaking+in+the+genome+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence.</a> Science. 282 (5388), 430-431 (1998).</li>
<li>Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+double-stranded+RNA+by+pre+parasitic+juvenile+cyst+nematodes+leads+to+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).</li>
<li>Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+of+dual+oxidase+in+the+plant+nematode+Meloidogyne+incognita%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).</li>
<li>Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+RNA+interference+to+root-knot+nematode+genes+encoding+esophageal+gland+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).</li>
<li>Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+pathogenicity+proteins+of+the+potato+cyst+nematode+Globodera+rostochiensis+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).</li>
<li>Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+clone+and+its+RNAi+interference+effect+analysis+of+mapk+gene+in+Bursaphelenchus+xylophilus+%28+in+Chinese%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Phytopathologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese).</a> Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).</li>
<li>Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Bxpel1+gene+silencing+by+dsRNA+interference+on+the+development+and+pathogenicity+of+the+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125(2016).</li>
<li>Dulovic, A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+knockdown+of+daf-12+in+the+model+parasitic+nematode+Strongyloides+ratti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti.</a> PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705(2019).</li>
<li>Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+of+gene+editing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Research%22%5BJournal%5D)">Research progress of gene editing technology.</a> Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).</li>
<li>Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-generated+double+stranded+RNA+induces+RNAi+in+plant-parasitic+nematodes+and+protects+the+host+from+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).</li>
<li>Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+insect-resistant+plants%3A+RNAi-mediated+crop+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection.</a> Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Chociaż cykl życia i środowisko pasożytnicze B. xylophilus różnią się od innych nicieni, badania nad molekularną patogenezą tego patogenu roślinnego są ograniczone. Pomimo znacznych postępów w zastosowaniu technologii edycji genomu CRISPR/Cas9 u C. elegans i innych nicieni,do tej pory opublikowano jedynie technologię RNAi zastosowaną na B. xylophilus. RNAi jest jednym z najpotężniejszych narzędzi dostępnych do badania funkcji genów nicieni i jest szeroko wykorzystywane w...

<a href="https://app.jove.com/t/6669">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/63645-v">10.3791/63645-v</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63645">Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus</a>. The Abstract and Protocol section was updated.

Erratum: Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Nicienie pasożytnicze roślinne (PPN) stanowią stałe zagrożenie dla bezpieczeństwa żywnościowego i ekosystemów leśnych. Powodują szacunkowo 100 miliardów USD strat ekonomicznychrocznie, z których najbardziej problematyczne są głównie nicienie węzłowe korzeniowe, nicienie torbielowe i nicienie sosnowe. Nicień sosnowy, Bursaphelenchus xylophilus, to migrujący, endopasożytniczy nicieni, będący patogenem przyczynowym choroby więdnięcia sosnytypu 2. Wyrządziło to ogromne szkody lasom sosnowym na całym świecie3. Używając terminologii Van Megena i in.4, B. xylophilus należy do Parasitaphelenchidae i należy do kladu 10, podczas gdy większość innych głównych pasożytów roślinnych należy do kladu 12.
Jako niezależny i niedawno wyewoluowany pasożyt roślinny, B. xylophilus jest atrakcyjnym modelem do badań porównawczych. Do tej pory przeprowadzono obszerne badania nad nicieniem węzłowym korzeniowym i torbielowymi należącymi do kladu 12, które są obligatoryjnymi, osiadłymi endopasożytami i należą do najbardziej intensywnie badanych nicieni. Jednak prowadzenie dalszych badań w tym ważnym obszarze wiąże się z poważnym wyzwaniem: funkcja genów pasożytniczych stanowi wąskie gardło badawcze. Badania funkcjonalne zazwyczaj obejmują eksperymenty ekspresji pozamacicznej oraz knockdown/out, ale opierają się na skutecznych protokołach transformacji genetycznych nicienia. W rezultacie genetyka odwrotna w PPN niemal wyłącznie opiera się na wyciszaniu genów przez RNAi.
RNAi, mechanizm szeroko obecny w komórkach eukariotycznych, tłumi ekspresję genów poprzez wprowadzenie podwójnego DNA (dsRNA)5. Do tej pory mechanizm wyciszania genów po transkrypcji indukowany przez dsRNA został odkryty u wszystkich badanych eukariontów, a technologia RNAi, jako narzędzie badań genomiki funkcjonalnej i innych zastosowań, szybko rozwijała się w wielu organizmach. Od czasu odkrycia mechanizmu RNAi u Caenorhabditis elegans w 1998roku, techniki RNAi stały się skutecznymi metodami identyfikacji funkcji genu nicieni i są proponowane jako nowy sposób skutecznej kontroli patogennych nicieni7.
RNAi technicznie ułatwia nasączenie młodych w dsRNA; jednak skuteczność i powtarzalność tego podejścia znacznie różnią się w zależności od gatunku nicieni i docelowego genu8. Badanie wyciszania 20 genów zaangażowanych w szlaki RNAi nicienia węzła korzeniowego, Meloidogyne incognita, z użyciem długich dsRNA jako czynników wyzwalających, co skutkowało różnorodnymi odpowiedziami, w tym wzrostem i brakiem zmian ekspresji niektórych genów9. Wyniki te pokazują, że geny docelowe mogą inaczej reagować na knockdown RNAi, co wymaga dokładnej oceny ich przydatności jako celów do zwalczania nicieni za pomocą RNAi. Jednak obecnie brakuje badań nad biologią rozwoju i rozrodczości B. xylophilus.
W kontynuacji wcześniejszych badań 10,11,12,13, opisujemy tutaj protokół zastosowania RNAi do badania funkcji genu ppm-1 B. xylophilus, w tym syntezę dsRNA, syntetyczne moczenie w neurostymulantach oraz ilościowe wykrywanie reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR). Wiedza zdobyta dzięki temu eksperymentalnemu podejściu prawdopodobnie znacząco przyczyni się do zrozumienia podstawowych systemów biologicznych i zapobiegania chorobie więdnięcia sosny.

<table><tbody><tr><td>Lejek Baermanna</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>do izolacji nicieni</td></tr><tr><td>Beacon Designer 7.9</td><td>Shanghai Kangyusheng Information Technology Co.</td><td>Nie ma</td><td>do projektowania zapalników qPCR</td></tr><tr><td>Botrytis cinerea</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>jako pożywienie dla nicieni</td></tr><tr><td>Bursaphelenchus xylophilus</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>jego numer to NXY61 i pierwotnie został wyekstrahowany z chorego Pinus massoniana w Ningbo, prowincja Zhejiang, Chiny.</td></tr><tr><td>Inkubator o stałej temperaturze</td><td>Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.</td><td>H1703544</td><td>do hodowli nicieni</td></tr><tr><td>Aparat elektroforezy</td><td>Laboratoria Bio-Rad</td><td>1704466</td><td>Aby uzyskać analizę elektroforetyczną</td></tr><tr><td>Etanol, 75%</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>80176961</td><td>do wyodrębniania RNA</td></tr><tr><td>Ex Taq Polymerase Premix</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR030A</td><td>dla PCR</td></tr><tr><td>Ex Taq Polymerase Premix</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR390A</td><td>dla PCR</td></tr><tr><td>Obrazownik żelowy</td><td>LongGene Scientific Instruments Co.</td><td>LG2020</td><td>aby uczynić pasmami kwasów nukleinowych widocznymi</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Prism</td><td>Nie ma</td><td>analizować dane i tworzyć liczby</td></tr><tr><td>Wirówka o dużych prędkościach</td><td>Hangzhou Allsheng Instruments Co.</td><td>AS0813000</td><td>Wirówka</td></tr><tr><td>Młynek do tkanek o wysokim strumieniu</td><td>Bertin</td><td></td><td>do wyodrębniania RNA</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia</td><td>Nie ma</td><td>do pomiaru długości korpusu</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.</td><td>L1909022</td><td>do wyodrębniania RNA</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica DM4B</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td>obserwować nicienie</td></tr><tr><td>Magnetyczne koraliki</td><td>Aoran Science & Technology Co.</td><td>150010C</td><td>do wyodrębniania RNA</td></tr><tr><td>Zestaw transkrypcji MEGAscript T7 High Yield</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>AM1333</td><td>syntezować dsRNA in vitro</td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop ND-2000</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>NanoDrop 2000/2000C</td><td>analizować jakość dsRNA</td></tr><tr><td>Wzmacniacz PCR</td><td>Bio-Rad Life Medical Products Co.</td><td>1851148</td><td>do amplifikacji sekwencji kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>do hodowli nicieni</td></tr><tr><td>wektor pGEM-T Easy</td><td>Promega Corporation</td><td>A1360</td><td>Do klonowania</td></tr><tr><td>Agar z dekstrozą ziemniaczaną (średni)</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>aby cultur Botrytis cinerea</td></tr><tr><td>Zestaw reagentów Prime Script RT z gDNA Eraser</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR047B</td><td>do syntetycznego cDNA</td></tr><tr><td>Primer Premier 5.0</td><td>PREMIER Biosoft</td><td>Nie ma</td><td>do projektowania zapalników PCR</td></tr><tr><td>Primery: ppm-1-F/R</td><td>Tsingke Biotechnology Co.</td><td>Nie ma</td><td>N: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACC</td></tr><tr><td>q-ppm-1-F/R</td><td>Tsingke Biotechnology Co.</td><td>Nie ma</td><td>N: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'</td></tr><tr><td>Cykler termiczny w czasie rzeczywistym & nbsp; qTOWER 2.2</td><td>Analytique Jena Instruments (Pekin) Co.</td><td></td><td>dla qPCR</td></tr><tr><td>Stoł trzęsący</td><td>Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co.</td><td></td><td>Do moczenia nicieni</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Chongqing Optec Instrument Co.</td><td>1814120</td><td>obserwować nicienie</td></tr><tr><td>T7-GFP-F/R</td><td>Tsingke Biotechnology Co.</td><td>Nie ma</td><td>N: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Promotor T7</td><td>Tsingke Biotechnology Co.</td><td>Nie ma</td><td>TAATACGACTCACTATAGGG</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji DNA żelu agarozowego Takara MiniBEST</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>9762</td><td>aby odzyskać DNA</td></tr><tr><td>TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR820A</td><td>dla qPCR</td></tr><tr><td>Trichloroetan</td><td>Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co.</td><td></td><td>do wyodrębniania RNA</td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>15596026</td><td>Całkowity odczynnik do ekstrakcji RNA, aby wyodrębnić RNA</td></tr></tbody></table>

zastosowanie interferencji rna w nicieni sosnowym, bursaphelenchus xylophilus

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Nicienie sosnowe, Bursaphelenchus xylophilus, jest jednym z najbardziej niszczycielskich gatunków inwazyjnych na świecie, powodującym więdnięcie i ostateczną śmierć sosen. Pomimo uznania ich ekonomicznego i środowiskowego znaczenia, jak dotąd niemożliwe było szczegółowe badanie funkcji genów nicieni pasożytniczych roślinnych (PPN) przy użyciu konwencjonalnej genetyki wyprzedzonej i metod transgenicznych. Jednak jako technologia genetyki odwrotnej, interferencja RNA (RNAi) ułatwia badanie funkcjonalnych genów nicieni, w tym B. xylophilus. 
Niniejszy artykuł przedstawia nowy protokół dotyczący RNAi genu ppm-1 u B. xylophilus, który według doniesień odgrywa kluczową rolę w rozwoju i rozmnażaniu innych nicieni patogennych. W przypadku RNAi promotor T7 był powiązany z 5′-końcem docelowego fragmentu za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), a podwójne RNA (dsRNA) było syntetyzowane poprzez transkrypcję in vitro . Następnie dostarczenie dsRNA przeprowadzono poprzez moczenie nicieni w roztworze dsRNA zmieszanym z syntetycznymi neurostymulantami. Zsynchronizowane młode osobniki B. xylophilus (około 20 000 osobników) były myte i moczone w dsRNA (0,8 μg/μL) w buforze moczeniowym przez 24 godziny w ciemności w temperaturze 25 °C.
Ta sama ilość nicieni została umieszczona w buforze moczenia bez dsRNA jako kontroli. Tymczasem kolejna identyczna ilość nicieni została umieszczona w buforze moczeniowym z genem dsRNA dsRNA z zielonego białka fluorescencyjnego (gfp) jako kontrolą. Po moczeniu poziom ekspresji docelowych transkrypcji został określony za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Efekty RNAi zostały następnie potwierdzone za pomocą mikroskopowej obserwacji fenotypów oraz porównania rozmiaru ciała dorosłych osobników w grupach. Obecny protokół może pomóc w dalszym rozwoju badań nad funkcjami genów B. xylophilus i innych pasożytniczych nicieni, w kierunku rozwoju strategii kontroli poprzez inżynierię genetyczną.

Analiza ekspresji ppm-1 u B. xylophilus po RNAi Względny poziom ekspresji genu ppm-1 B. xylophilus nasączonego gfp dsRNA oraz tego nasączonego docelowym genem dsRNA wynosił odpowiednio 0,92 i 0,52 (poziom ekspresji genu ppm-1 w grupie kontrolnej leczonejddH2O został ustawiony na 1) (Rysunek 1). W związku z tym egzogenne dsRNA nie wpływa na ekspresj...

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodę moczenia interferencji RNA u Bursaphelenchus xylophilus , aby ułatwić badanie funkcji genów.

Zastosowanie interferencji RNA w nicieni sosnowym, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

RNAi stało się skuteczną metodą identyfikacji funkcji genów u nicieni i jest proponowane jako nowy sposób skutecznej kontroli nicieni patogennych. RNAi polega na moczeniu nicieni w dsRNA, co może wystarczyć do zabiegu. Na początek zbierz nicienie metodą lejka Baermanna.W tym celu umieść zaciskaną gumową rurkę pod lejkiem i umieść dwie warstwy papieru filtrującego w otworze lejka. Przenieś kultury grzybów Botrytis cinerea do lejka i dodaj wodę, aby zanurzyć matę grzybową. Po zebraniu nicieni należy dodać 500 mikrolitrów odczynnika ekstrakcyjnego i 100 mikrolitrów kulek magnetycznych do dwumililitrowej rurki wirówki.Aspiruj 20 mikrolitrów nicieni i zmiel próbki w ilości 9 000 x g przez 30 sekund. Inkubuj przez pięć minut i wiruj w 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przelej supernatant do nowej rurki wirówki.Dodaj 100 mikrolitrów chloroformu i wymieszaj, odwracając rurkę kilkakrotnie. Inkubuj przez trzy minuty, a następnie wiruj w 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie przelej supernatant do nowej rurki wirówki.Dodaj 250 mikrolitrów alkoholu izopropylowego i intensywnie zacznij wirowanie. Wiruj w 12 000 x g przez 10 minut i wiruj. Usuń supernatant i dodaj 500 mikrolitrów 75% etanolu, aby przemyć RNA.Wykonaj próbkę w wirze, a następnie wiruj w temperaturze 12 000 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Susz na powietrzu pellet RNA przez pięć minut, a następnie ponownie zawiesij go w 30 mikrolitrach wody wolnej od RNazy. Oblicz stężenie RNA według tego wzoru i oblicz stosunek A260 do A280.Następnie użyj pary starterów, aby amplifikować częściową sekwencję kodującą genu BX ppm-1 z B. xylophilus. Następnie sklonuj sekwencje genu ppm-1 do wektora pGEM-T Easy zawierającego promotor T7. Odzyskaj fragment genu ppm-1 o długości 894 pary zasad, używając sklonowanego plazmidu jako szablonu dla PCR.Następnie użyj zestawu transkrypcyjnego in vitro do syntezy dsRNA. Przeanalizuj jakość dsRNA za pomocą spektrofotometru i zwizualizuj produkty na żelu o wartości 1% agarozy. Dodaj cztery mikrolitry buforu moczącego 5X i zwiększ objętość do 20 mikrolitrów podwójnie destylowaną wodą, aby uzyskać końcowe stężenie RNA 0,8 mikrograma na mililitr.Następnie umieść nicienie w naczyniu na 30 minut i czekaj, aż jajka przykleją się do dna. Ostrożnie usuwaj wodę i nicienie, nie mieszając jaj, aż w misce pozostaną tylko jaja. Wykluwaj zebrane jaja w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny, aby uzyskać larwy J2.Zbieraj larwy do rurki i myj je trzy razy podwójnie destylowaną wodą. Następnie przeniesiono larwy do probówki zawierającej roztwór dsRNA. Do tego dodaj roztwór resorcynolu, aby uzyskać roztwór 1%.Umieść larwy na stole do trzęsania, aby zapewnić wystarczające wchłanianie dsRNA do larw. W przypadku grup kontrolnych nasącz tę samą ilość nicieni w buforze mokającym bez sondy dsRNA lub sondą dsRNA GFP. Wykonaj qPCR z wykorzystaniem genów actB i tbb-2 jako wewnętrznych odniesień do oceny zmian w poziomie ekspresji genów.Do oszacowania względnego poziomu ekspresji genów na podstawie krzywej rozpuszczenia i wartości Ct użyj metody delta delta Ct. Po RNAi hodować larwy J2 do dorosłości na trawnikach Botrytis cinerea na płytkach PDA. Zbieraj dorosłe osobniki metodą lejka Baermanna, jak pokazano w sekcji pierwszej.Zrób zdjęcia dorosłych nicieni pod mikroskopem i użyj oprogramowania ImageJ, aby zmierzyć długość ciała 50 samiców i 50 samic. Analizuj dane, obliczając średnią i odchylenie standardowe dla każdej próbki. Zastosuj test Student T, aby porównać wyniki próbek z różnych grup.Analiza względnej ekspresji genów po RNAi wykazała, że ppm-1 dsRNA może skutecznie hamować ekspresję jednego genu ppm-1 B. Xylophilus. Natomiast egzogenne dsRNA GFP nie miało wpływu na ekspresję ppm-1. Po RNAi rozmiar dorosłych osobników wyraźnie się zmniejszył mimo osiągnięcia dojrzałości płciowej, co skutkowało fenotypem mutanta o małym rozmiarze ciała.Średnia długość ciała samic i samców mutantów wynosiła 544 i 526 mikrometrów, w porównaniu do 971 i 912 mikrometrów dla grupy kontrolnej. Najważniejsze jest przeniesienie nicieni do roztworu podwójnego RNA i dodanie kolejnego odczynnika, aby pobudzić nicienie do żerowania. Metoda ta nadaje się do badań genowych na dużą skalę i jest powszechnie stosowana w badaniach komórkowych. Badanie funkcji genów B. Xylophilus tą metodą ma wartość przewodnią dla biologicznej kontroli B. Xylophilus.

application-rna-interference-pinewood-nematode-bursaphelenchus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prezentujemy sposób wykorzystania techniki karmienia RNAi do wyciszania genów docelowych oraz oceny fenotypu wielkości ciała u C. elegans. Metoda ta może zostać zastosowana w szeroko zakrojonych badaniach przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnych, interesujących komponentów genetycznych, takich jak te zaangażowane w regulację wielkości ciała poprzez sygnalizację DBL-1/TGF-β.

Wykorzystanie strategii karmienia w celu indukowania interferencji RNA do przesiewowej analizy genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicienia C. elegans

RNA (RNAi) są podstawą badań nad Tribolium. W tym miejscu przedstawiamy przegląd naszej techniki RNAi larwalnych w Tribolium castaneum. Larwalne RNAi to prosta, ale potężna technika, która zapewnia szybki dostęp do fenotypów utraty funkcji, umożliwiając naukowcom badanie funkcji genów w różnych kontekstach.

Interferencja larwalnego RNA u chrząszcza mącznego (Tribolium castaneum)

Interferencja RNA (RNAi) jest niezwykle cennym narzędziem do odkrywania funkcji genów. Jednak zdolność do celowania w geny za pomocą RNAi w stadiach przeddorosłych jest ograniczona w przypadku głównego wektora malarii u ludzi Anopheles gambiae. Opisujemy protokół RNAi w celu zmniejszenia funkcji genu poprzez bezpośrednią iniekcję podczas rozwoju poczwarki.

Dostarczanie RNAi do poczwarek Anopheles gambiae

Przedstawiono protokół badania zachowań godowych nicienia sosnowego, Bursaphelenchus xylophilus. Cechy behawioralne B. xylophilus są opisane w procesie krycia.

Obserwacja i kwantyfikacja zachowań godowych nicieni sosnówki, Bursaphelenchus xylophilus

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

Ten artykuł demonstruje nowe techniki opracowane do doustnego dostarczania dwuniciowego RNA (dsRNA) przez tkanki naczyniowe roślin w celu interferencji RNA (RNAi) u owadów żywiących się sokiem łyka.

Dwuniciowe metody doustnego dostarczania RNA w celu wywołania interferencji RNA u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym

Nicienie entomopatogeniczne żyją w symbiozie z bakteriami i razem skutecznie infekują owady, osłabiając ich wrodzony układ odpornościowy. W celu wspierania badań nad genetycznymi podstawami zakażenia nicieniami opisano metody utrzymywania i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogenicznymi.

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Manipulacja interferencją RNA (RNAi) stanowi ogromne wyzwanie dla wielu gatunków parazytoidów o niewielkich rozmiarach, takich jak osy Trichogramma. W badaniu tym opracowano skuteczną metodę RNAi u Trichogramma denrolimi. Obecna metodologia zapewnia solidny model do badania regulacji genów u os Trichogramma.

Interferencja RNA w parazytoidzie jaja, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Protokół opisuje infekcję in vivo i in vitro nicieniami sosnówki Pinus pinaster oraz ich analizę lotną za pomocą chromatografii gazowej (GC) i GC sprzężonej ze spektrometrią mas (GC-MS).

Zakażenie sosen in vivo i in vitro nicieniem sosnowym Bursaphelenchus xylophilus i izolacja indukowanych substancji lotnych

Prezentowany tutaj jest protokół dostarczania nanocząsteczek chitozan/dsRNA larwom jedwabników Bombyx mori w celu wywołania wyciszenia genów poprzez spożycie.

Interferencja RNA larw w jedwabniku Bombyx mori poprzez dostarczanie nanocząstek chitozanu/dsRNA

Poznaj metodę namaczania w RNAi do badania funkcji genów u nicieni sosnowych Bursaphelenchus xylophilus. Technika ta umożliwia skuteczną inhibicję ekspresji genów i obserwację zmian fenotypowych.

Zastosowanie interferencji RNA w nicieni sosnowym, Bursaphelenchus xylophilus

Przeglądaj więcej filmów