Name: Ocena otwartego prawdopodobieństwa porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów w warunkach nadmiaru koenzymu q (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj metodę oceny prawdopodobieństwa otwarcia porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów w kardiomiocytach myszy z zespołem łamliwego chromosomu X. Technika mierzy dynamikę mPTP w funkcji potencjału błonowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez następujące granty: NIH/NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost award to the Department of Anesthesiology (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.) oraz NIH/NINDS R01NS112706 (R.J.L.)

Uzyskano zgodę Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Medycznego Uniwersytetu Columbia dla wszystkich opisanych metod. Myszy FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) i kontrolne (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) użyte jako systemy modelowe w tym badaniu zostały pozyskane komercyjnie (patrz Tabela materiałów). W każdej grupie eksperymentalnej wykorzystano od pięciu do jedenastu zwierząt. Myszy po urodzeniu w 10. dniu (P10) wykorzystano do modelowania punktu czasowego w okresie niemowlęctwa człowieka.
1. Izolacja mitochondrialna od serca myszy
<ol>
	<li>Przygotować do eksperymentów z izolacją mitochondriów i oddychaniem, jak opisano w Tabeli 1. Przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli zostało to wcześniej wykonane.
	<ol>
		<li>Przygotuj podłoże o gradiencie gęstości 15%: rozcieńczyć podłoże o gradiencie gęstości handlowej do 80% objętości/objętości (v/v) za pomocą rozcieńczalnika o gradiencie gęstości. Dalej rozcieńczyć pożywkę o gradiencie gęstości 80% 15% v/v, dodając bufor izolacyjny mitochondriów (MI)/albuminę surowicy bydlęcej (BSA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do tych eksperymentów należy wyizolować mitochondria ze świeżej, nie zamrożonej tkanki i użyć w dniu przygotowania, zwykle w ciągu pięciu godzin26. Wszystkie kroki izolacji należy wykonać na lodzie.
	<ol>
		<li>Odetnij głowę myszy i wytnij serce. Natychmiast umyj 1-2 razy na szalce Petriego z lodowatym MI/BSA. Odetnij przedsionek i zmiel tkankę.</li>
		<li>Przenieść zmieloną tkankę serca do homogenizatora szklano-szklanego zawierającego 1 ml MI/BSA. Homogenizować luźniejszym (A) tłuczkiem (10 uderzeń), a następnie mocniejszym (B) tłuczkiem (10 uderzeń).</li>
		<li>Odwirować homogenat o stężeniu 1 100 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek jądrowych i komórkowych.</li>
		<li>Pobrać sklaratyn delikatnie, nie dotykając puszystego osadu, i ostrożnie ułożyć go warstwami na 700 μl pożywki o gradiacji gęstości 15% w probówce wirówkowej. Wirować przy 18 500 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić osad w 1 ml buforu sacharozy (SB)/BSA i odwirować w stężeniu 10 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Całkowicie usunąć i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w SB/BSA do końcowej objętości 55 μl.</li>
		<li>Określ ilościowo zawartość białka mitochondrialnego za pomocą standardowego testu, takiego jak test białkowy kwasu bicinchoninowego (BCA).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zużycie tlenu (O2) w mitochondriach i ΔΨ
<ol>
	<li>Montaż i kalibracja elektrod tlenowych
	<ol>
		<li>Ustaw i skalibruj elektrodę tlenową (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
		<ol>
			<li>Umieść kroplę 50% roztworu elektrolitu chlorku potasu (KCl) na kopule tarczy elektrody.</li>
			<li>Umieść mały kawałek przekładki z bibuły papierosowej ~2 cm pokryty nieco większym kawałkiem dostarczonej membrany z politetrafluoroetylenu (PTFE) na kropli elektrolitu.</li>
			<li>Za pomocą dołączonego aplikatora nasuń O-ring małego krążka elektrody na kopułę elektrody. 
			UWAGA: Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza i że membrana jest gładka.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dobrze uzupełnij zbiornik roztworem elektrolitu.</li>
		<li>Umieść większy O-ring we wgłębieniu wokół dołka tarczy elektrody.</li>
		<li>Zainstaluj tarczę w komorze elektrody i podłącz ją do jednostki sterującej.</li>
		<li>Dodaj 2 ml nasyconej powietrzem wody dejonizowanej do komory reakcyjnej i magnes pokryty PTFE do komory.</li>
		<li>Podłącz komorę z tyłu jednostki sterującej.</li>
		<li>Ustaw temperaturę na 37 °C, a prędkość mieszania na 100.</li>
		<li>Odczekaj 10 minut, aż temperatura systemu się wyrówna przed rozpoczęciem kalibracji.</li>
		<li>Na karcie Kalibracja wybierz opcję Kalibracja fazy ciekłej, aby przeprowadzić kalibrację fazy ciekłej. Upewnij się, że temperatura jest ustawiona na 37 °C, prędkość mieszania wynosi 100, a ciśnienie jest ustawione na ciśnienie atmosferyczne (101.32 kPa).</li>
		<li>Naciśnij OK i poczekaj, aż sygnał się ustabilizuje.</li>
		<li>Po osiągnięciu plateau naciśnij OK.</li>
		<li>Ustalić zero O2 w komorze, dodając niewielką ilość (~ 20 mg) ditionitu sodu.</li>
		<li>Naciśnij OK i poczekaj, aż sygnał się ustabilizuje.</li>
		<li>Po osiągnięciu plateau naciśnij Zapisz, aby zaakceptować kalibrację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zespół elektrod selektywnych TPP+
	<ol>
		<li>Napełnij końcówkę elektrody selektywnej TPP+- roztworem TPP 10 mM za pomocą dołączonej strzykawki i elastycznej igły, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Zmontuj aparat elektrody selektywnej TPP+, w tym elektrodę odniesienia i uchwyt elektrody (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Na krótko poluzuj nasadkę uchwytu elektrody i włóż wewnętrzną elektrodę odniesienia do końcówki TPP+. Dokręć nakrętkę, aby zabezpieczyć końcówkę. Podłącz dostarczony do uchwytu elektrody i portu pomocniczego skrzynki sterowniczej.</li>
		<li>Włóż elektrodę selektywną TPP+ i elektrody odniesienia do zespołu tłoka przystosowanego do elektrod jonoselektywnych. Podłącz elektrodę odniesienia do portu odniesienia w skrzynce sterowniczej.</li>
		<li>Włóż elektrody selektywne TPP+ i elektrody odniesienia do przystosowanego zespołu tłoka dla elektrod jonoselektywnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komory reakcyjnej
	<ol>
		<li>Dodać mieszaninę reakcyjną do komory reakcyjnej: 10 mM bursztynianu (substrat kompleksu II), 5 μM rotenon (inhibitor kompleksu I), 80 ng mL−1 nigerycyny (w celu załamania gradientu pH w poprzek IMM), 2,5 μg oligomycyny mL-1 (w celu wywołania oddychania w stanie 4) i buforu reakcyjnego do oddychania (RB)/bufor reakcyjny BSA do końcowej objętości 1 ml. Uważaj, aby nie dopuścić do wprowadzenia pęcherzyków powietrza do komory.</li>
		<li>Zamknąć komorę za pomocą dostosowanego zespołu tłoka z selektywnym TPP+ i założoną elektrodą odniesienia. Wybierz GO, aby rozpocząć nagrywanie. Po zamknięciu komory wprowadzić dodatkowe odczynniki bezpośrednio do roztworu reakcyjnego za pomocą oddzielnych mikrostrzykawek zmodyfikowanych plastikową rurką w celu regulacji długości igły.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalibracja TPP+
	<ol>
		<li>Po uzyskaniu stabilnego sygnału napięciowego należy skalibrować elektrodę selektywną TPP+, dodając co 1 μM roztworu TPP o wielkości 0,1 mM do końcowego stężenia 3 μM. Obserwuj, że przy każdym dodawaniu następuje logarytmiczny spadek sygnału napięciowego TPP+. 
		UWAGA: Kalibruj elektrodę selektywną TPP+ na początku każdego eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja danych
	<ol>
		<li>Poczekaj, aż śladyO2 i TPP+ ustabilizują się, a następnie dodaj 100 μg świeżo przygotowanych mitochondriów kardiomiocytów do komory reakcyjnej do końcowego stężenia 0,1 mg mL-1 przez port dodawania odczynnika w zespole tłoka. Obserwuj spadek poziomu O2 w komorze, gdy mitochondria stają się energetyzowane i zużywają O2 oraz nagły wzrost sygnału napięciowego TPP+, gdy mitochondria generują potencjał błonowy i pobierają TPP+ z roztworu.</li>
		<li>Dodać 2,5 μg oligomycyny mL-1, aby wywołać oddychanie w stanie 4. 
		UWAGA: Współczynniki zużycia O2 będą teraz reprezentować szybkość oddychania w wyniku wycieku protonów. Oligomycyna może być dodawana do komory reakcyjnej przed TPP+ jako alternatywa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena otwartego prawdopodobieństwa mPTP
	<ol>
		<li>Obserwuj, że ΔΨ spada z czasem podczas oddychania nieszczelnego. Po osiągnięciu pożądanego ΔΨ dodaj 1 μM CsA (inhibitor mPTP) do komory reakcyjnej, aby ocenić prawdopodobieństwo otwarcia mPTP przy tym konkretnym ΔΨ.</li>
		<li>Zmierzyć wpływ CsA na zużycieO2 i ΔΨ przed i po dodaniu CsA</li>
		<li>Określ zależność napięcia otwarcia mPTP, zmieniając ΔΨ, przy którym CsA jest dodawane w kolejnych eksperymentach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rasola, A., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+involvement+in+cell+death+and+in+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis.</a> Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).</li>
<li>Szabó, I., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+megachannel+is+the+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).</li>
<li>Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. Alberts, B., et al. 14, Garland Science. Chapter 14 767-830 (2002).</li>
<li>Perez, M. J., Quintanilla, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+or+disease%3A+duality+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore.</a> Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).</li>
<li>Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+pathological+roles+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart.</a> Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).</li>
<li>Javadov, S., Kuznetsov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+permeability+transition+and+cell+death%3A+the+role+of+cyclophilin+d%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d.</a> Frontiers in Physiology. 4, 76(2013).</li>
<li>Dorn, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+non-apoptotic+programmed+cell+death+in+diabetes+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure.</a> Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).</li>
<li>Boyman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%3A+Transient+and+permanent+opening+events%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).</li>
<li>Hom, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation.</a> Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+superoxide+production+negatively+regulates+neural+progenitor+proliferation+and+cerebral+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development.</a> Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).</li>
<li>Elrod, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophilin+D+controls+mitochondrial+pore-dependent+Ca%282%2B%29+exchange%2C+metabolic+flexibility%2C+and+propensity+for+heart+failure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).</li>
<li>Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+consequences+of+mitochondrial+permeability+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).</li>
<li>Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+mitochondrial+cyclosporin+A-sensitive+permeability+transition+pore+by+the+proton+electrochemical+gradient.+Evidence+that+the+pore+can+be+opened+by+membrane+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).</li>
<li>Petronilli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+voltage+sensor+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+is+tuned+by+the+oxidation-reduction+state+of+vicinal+thiols.+Increase+of+the+gating+potential+by+oxidants+and+its+reversal+by+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).</li>
<li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+binding+to+F-ATP+synthase+beta+subunit+triggers+the+mitochondrial+permeability+transition%5BTitle%5D)+AND+%22European+Molecular+Biology+Organization+Reports%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition.</a> European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).</li>
<li>Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+thiol+reagents%2C+and+membrane+potential+modulate+the+mitochondrial+permeability+transition+by+affecting+nucleotide+binding+to+the+adenine+nucleotide+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).</li>
<li>Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+mitochondrial+megachannel+by+divalent+cations+and+protons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).</li>
<li>Karch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+permeability+transition+by+deletion+of+the+ANT+family+and+CypD%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD.</a> Science Advances. 5 (8), (2019).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li>
<li>Antoniel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+histidine+in+OSCP+subunit+of+F-ATP+synthase+mediates+inhibition+of+the+permeability+transition+pore+by+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22European+Molecular+Biology+Organization+Reports%22%5BJournal%5D)">The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH.</a> European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).</li>
<li>Haworth, R. A., Hunter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ca2%2B-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+II.+Nature+of+the+Ca2%2B+trigger+site%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).</li>
<li>Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A+binding+to+mitochondrial+cyclophilin+inhibits+the+permeability+transition+pore+and+protects+hearts+from+ischaemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).</li>
<li>Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSCP+subunit+of+mitochondrial+ATP+synthase%3A+role+in+regulation+of+enzyme+function+and+of+its+transition+to+a+pore%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).</li>
<li>Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquinone-binding+site+regulates+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).</li>
<li>Griffiths, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+thermogenic+mitochondrial+respiration+due+to+futile+proton+leak+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).</li>
<li>Barajas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+newborn+Fmr1+knockout+mouse%3A+a+novel+model+of+excess+ubiquinone+and+closed+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+developing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart.</a> Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).</li>
<li>Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParks%2C+RJ+%22Mitochondrial+Bioenergetics%3A+Methods+and+ProtocolsMethods+in+Molecular+Biology%22">Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology</a>. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 11 187-196 (2018).</li>
<li>Carraro, M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+membrane+permeability+and+the+mitochondrial+permeability+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition.</a> Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).</li>
<li>Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAffourtit%2C+C+%22Mitochondrial+Bioenergetics%3A+Methods+and+ProtocolsMethods+in+Molecular+Biology%22">Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology</a>. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 9 157-170 (2018).</li>
<li>Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTeodoro%2C+JS+%22Mitochondrial+Bioenergetics%3A+Methods+and+ProtocolsMethods+in+Molecular+Biology%22">Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology</a>. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 6 109-119 (2018).</li>
<li>Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+properties+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pores%3A+Channel+diversity+and+disease+implication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357(2021).</li>
<li>Zoratti, M., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).</li>
<li>Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+performance+and+application+differences+between+manual+and+automated+patch-clamp+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Chemical+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques.</a> Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).</li>
<li>Petronilli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+long-lasting+openings+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+can+be+monitored+directly+in+intact+cells+by+changes+in+mitochondrial+calcein+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence.</a> Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W artykule opisano metodę oceny otwartego prawdopodobieństwa mPTP. W szczególności próg napięcia dla otwarcia mPTP o niskiej przewodności określono poprzez ocenę wpływu hamowania CsA na wyciek protonów w zakresie ΔΨ. Korzystając z tej techniki, mogliśmy zidentyfikować różnice w bramkowaniu napięcia mPTP między myszami FXS a kontrolami FVB, zgodnie z ich różnicami w zawartości CoQ specyficznej dla tkanki. Kluczowe znaczenie dla powodzenia tej metodologii ma to, że mitochondria są świeżo izolowane przed użyciem i są dobrej...

mPTP pośredniczy w przejściu przepuszczalności (PT), dzięki czemu IMM staje się nagle przepuszczalny dla małych cząsteczek i substancji rozpuszczonych1,2. To uderzające zjawisko jest wyraźnym odejściem od charakterystycznej nieprzepuszczalności IMM, która ma fundamentalne znaczenie dla ustalenia gradientu elektrochemicznego niezbędnego do fosforylacji oksydacyjnej3. PT, w przeciwieństwie do innych mechanizmów transportu mitochondrialnego, jest procesem o wysokiej przewodności, niespecyficznym i nieselektywnym, umożliwiającym przejście szeregu cząsteczek do 1,5 kDa4,5. mPTP jest kanałem bramkowanym napięciem w IMM, którego otwarcie zmienia ΔΨ, produkcję ATP, homeostazę wapnia, produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) i żywotność komórki4.
W skrajnym patologicznym przypadku, niekontrolowane i długotrwałe otwarcie mPTP o wysokiej przewodności prowadzi do załamania gradientu elektrochemicznego, pęcznienia matrycy, wyczerpania nukleotydów pirydynowych macierzy, pęknięcia błony zewnętrznej, uwolnienia białek międzybłonowych (w tym cytochromu c), a ostatecznie śmierci komórki4,6. Takie patologiczne otwarcie mPTP jest związane z uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym serca, niewydolnością serca, urazowym uszkodzeniem mózgu, różnymi chorobami neurodegeneracyjnymi i cukrzycą1,7. Jednak otwarcie mPTP o niskiej przewodności ma charakter fizjologiczny i, w przeciwieństwie do otwarcia o wysokiej przewodności, nie prowadzi do głębokiej depolaryzacji ani obrzęku mitochondriów4.
Niskokonduktanckie otwarcie porów ogranicza przepuszczalność do ~300 Da, umożliwia przepływ protonów niezależnie od syntezy ATP i jest potencjalnym źródłem fizjologicznego wycieku protonów5. Fizjologiczne otwarcie mPTP powoduje kontrolowany spadek ΔΨ, zwiększa strumień elektronów przez łańcuch transportu oddechowego i powoduje krótki wybuch lub błysk ponadtlenku, przyczyniając się do sygnalizacji ROS8. Regulacja takiego przejściowego otwarcia mPTP jest ważna dla homeostazy wapnia oraz prawidłowego rozwoju i dojrzewania komórek4,9,10,11. Na przykład przejściowe otwarcie porów w rozwijających się neuronach wyzwala różnicowanie, podczas gdy zamknięcie mPTP indukuje dojrzewanie w niedojrzałych kardiomiocytach4,5.
Chociaż funkcjonalne znaczenie mPTP dla zdrowia i choroby jest dobrze znane, jego dokładna tożsamość molekularna pozostaje przedmiotem dyskusji. Postęp w zakresie struktury molekularnej i funkcji mPTP został kompleksowo przeanalizowany w innym miejscu12. Krótko mówiąc, obecnie przypuszcza się, że stany wysokiej i niskiej przewodności mPTP są zapośredniczone przez odrębne jednostki12. Głównymi kandydatami są syntaza ATP F1/F0 (syntaza ATP) i transporter nukleotydów adeninowych (ANT) odpowiednio dla trybów wysokiej i niskiej przewodności12.
Pomimo braku konsensusu co do dokładnej tożsamości składnika tworzącego pory mPTP, pewne kluczowe cechy zostały szczegółowo opisane. Dobrze znaną cechą mPTP jest to, że jest on regulowany przez gradient elektrochemiczny w taki sposób, że depolaryzacja IMM prowadzi do otwarcia porów13. Wcześniejsze prace wykazały, że stan redoks vicinal tiol groups zmienia bramkowanie napięcia mPTP, tak że utlenianie otwiera pory przy stosunkowo wyższych ΔΨs, a redukcja grupy tiolowej skutkuje zamkniętym prawdopodobieństwem mPTP14. Jednak tożsamość białkowego czujnika napięcia jest nieznana.
Zidentyfikowano różne małe cząsteczki, które modulują prawdopodobieństwo otwarcia porów. Na przykład mPTP może być stymulowany do otwierania się wapniem, nieorganicznym fosforanem, kwasami tłuszczowymi i ROS i może być hamowany przez nukleotydy adeninowe (szczególnie ADP), magnez, protony i CsA5,12. Mechanizmy działania niektórych z tych regulatorów zostały wyjaśnione. Mitochondrialny wapń wyzwala otwarcie mPTP przynajmniej częściowo poprzez wiązanie się z podjednostką β syntazy ATP15. ROS może aktywować mPTP poprzez zmniejszenie jego powinowactwa do ADP i zwiększenie jego powinowactwa do cyklofiliny D (CypD), najlepiej przebadanego białkowego aktywatora mPTP16. Mechanizm aktywacji mPTP przez nieorganiczne fosforany i kwasy tłuszczowe jest mniej jasny. Jeśli chodzi o endogenne inhibitory, uważa się, że ADP hamuje mPTP poprzez wiązanie się z syntazą ANT lub ATP, podczas gdy magnez wywiera działanie hamujące, wypierając wapń z miejsca wiązania15,17,18,19.
Niskie pH hamuje otwieranie mPTP poprzez protonację histydyny 112 podjednostki białka regulatorowego oligomycyny (OSCP) syntazy ATP12,20,21. Prototypowy inhibitor farmakologiczny mPTP, CsA, działa poprzez wiązanie CypD i zapobieganie jego powiązaniu z OSCP22,23. Wcześniejsze prace wykazały również, że różne analogi CoQ oddziałują z mPTP, hamując go lub aktywując go24. W ostatnich pracach znaleźliśmy dowody na patologicznie otwarty mPTP, nadmierny wyciek protonów i nieefektywną fosforylację oksydacyjną z powodu niedoboru CoQ w mitochondriach przodomózgowia nowonarodzonych szczeniąt myszy FXS25.
Zamknięcie porów egzogennym CoQ zablokowało patologiczny wyciek protonów i wywołało dojrzałość morfologiczną kolców dendrytycznych25. Co ciekawe, u tych samych zwierząt, kardiomiocyty FXS miały nadmierny poziom CoQ i zamknięte prawdopodobieństwo mPTP w porównaniu z kontrolami typu dzikiego26. Chociaż przyczyna tych specyficznych tkankowo różnic w poziomach CoQ jest nieznana, odkrycia podkreślają koncepcję, że endogenny CoQ jest prawdopodobnie kluczowym regulatorem mPTP. Istnieje jednak poważna luka w naszej wiedzy, ponieważ mechanizm hamowania mPTP za pośrednictwem CoQ pozostaje nieznany.
Regulacja mPTP jest krytycznym wyznacznikiem sygnalizacji komórkowej i przeżycia4. Dlatego wykrycie otwarcia mPTP w mitochondriach ma kluczowe znaczenie przy rozważaniu określonych mechanizmów patofizjologicznych. Zazwyczaj próg otwarcia porów o wysokiej przewodności określa się za pomocą wapnia w celu wyzwolenia przejścia przepuszczalności. Takie obciążenie wapniem prowadzi do załamania się potencjału błonowego, szybkiego rozprzęgnięcia fosforylacji oksydacyjnej i obrzęku mitochondriów27,28. Staraliśmy się opracować metodę wykrywania otwarcia mPTP o niskiej przewodności in situ, bez indukowania go jako takiego.
Podejście wykorzystuje rolę mPTP jako kanału wycieku protonów. W tym celu zastosowano elektrody jonoselektywne typu Clark i TPP+ do jednoczesnego pomiaru zużycia tlenu i potencjału błony w izolowanych mitochondriach podczas oddychania nieszczelnego29. Próg otwarcia mPTP został określony przez początek hamowania wycieku protonów za pośrednictwem CsA przy określonych potencjałach błonowych. Stosując to podejście, precyzyjnie zdefiniowano różnice w bramkowaniu napięciowym mPTP w kontekście nadmiaru CoQ.

<table><tbody><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Dostosowany zespół tłoka do elektrod pH lub jonoselektywnych do stosowania z systemami OXYT1</td><td>PP</td><td>941039</td><td></td></tr><tr><td>rurki PE BD Intramedic, PE 50, 0,023 cala 10 stóp</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-11B</td><td>w celu modyfikacji długości synringe Hamiltona w razie potrzeby</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA). Bez kwasów tłuszczowych</td><td>Sigma</td><td>A7030-10G</td><td></td></tr><tr><td>Dri-Ref Elektroda referencyjna, 2 mm</td><td>World Precision Inst. LLC</td><td>DRIREF-2</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt elektrody do końcówek KWIK-Tips</td><td>World Precision Inst. LLC</td><td>KWIK-2</td><td>&nbsp; jonoselektywny uchwyt elektrody</td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(&beta;-aminoetylowy eter)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraoctowy&nbsp; (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>FVB.129P2-PDE6B+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J</td><td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td><td></td><td>FXS myszy, Fmr1 KO&nbsp;</td></tr><tr><td>FVB.129P2-PDE6B+ Tyrc-ch/AntJ</td><td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td><td></td><td>Myszy FVB</td></tr><tr><td>Hamilton 80366 Standardowe strzykawki, 10 uL, igła cementowa, 6/pk</td> Mikrostrzykawka <td>Cole-Parmer</td><td>EW-07938-30</td><td>Strzykawka mikrolitrowa</td></tr><tr><td>Hamilton 80500 Standard, 50 μL,</td><td>Mikrostrzykawka</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cole-Parmer EW-07938-02Hansatech Instruments System Oxytherm+ (oddychanie) Kompletne</td><td>systemy PP</td><td>Elektroda tlenowa</td><td>OXYTHERM+R</td> i oprogramowanie</tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>1374248</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546-250G</td><td></td></tr><tr><td>P1,P5-diadenozyno-5 i prime; pentafosforan pentasodium (AP5A)</td><td>Sigma</td><td>D4022-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P1644</td><td>pożywka do separacji w gradinie gęstości</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)</td><td>Sigma</td><td>5.43841</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>TPP+ Końcówki elektrod (3)</td><td>World Precision Inst. LLC</td><td>INFORMACJA TURYSTYCZNA</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena otwartego prawdopodobieństwa porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów w warunkach nadmiaru koenzymu q

Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess

Pory przejściowe przepuszczalności mitochondriów (mPTP) to megakanał z bramką napięcia, nieselektywny, wewnętrzną błonę mitochondrialną (IMM), ważny dla zdrowia i choroby. mPTP pośredniczy w wycieku protonów przez IMM podczas otwarcia o niskiej przewodności i jest specyficznie hamowany przez cyklosporynę A (CsA). Koenzym Q (CoQ) jest regulatorem mPTP, a specyficzne dla tkanek różnice w zawartości CoQ i otwartym prawdopodobieństwie mPTP w mitochondriach przodomózgowia i serca w nowonarodzonym mysim modelu zespołu łamliwego chromosomu X (FXS, nokaut Fmr1). Opracowaliśmy technikę określania progu napięcia dla otwarcia mPTP w tym zmutowanym szczepie, wykorzystując rolę mPTP jako kanału wycieku protonów.
Aby to zrobić, zużycie tlenu i potencjał błonowy (ΔΨ) były jednocześnie mierzone w izolowanych mitochondriach za pomocą polarografii i elektrody jonoselektywnej tetrafenylofosfonium (TPP+) podczas oddychania nieszczelnego. Próg otwarcia mPTP został określony przez początek hamowania wycieku protonów za pośrednictwem CsA przy określonych potencjałach błonowych. Stosując to podejście, różnice w bramkowaniu napięciowym mPTP zostały precyzyjnie zdefiniowane w kontekście nadmiaru CoQ. Ta nowatorska technika pozwoli w przyszłości na prowadzenie badań mających na celu pogłębienie wiedzy na temat fizjologicznej i patologicznej regulacji otwarcia mPTP przy niskiej przewodności.

Przedstawiono typowe krzywe zużycia O2 i ΔΨ wygenerowane w tych eksperymentach (Rysunek 1A,B). Logarytmiczny spadek sygnału napięcia podczas kalibracji TPP+ jest widoczny na początku każdego eksperymentu. Brak tego wzorca logarytmicznego może sugerować problem z elektrodą selektywną TPP+. Mitochondria zazwyczaj generują ΔΨ natychmiast po dodaniu do buforu oddechowego. ΔΨ można interpretować na podstawie zmian napięcia TPP+ w oparc...

Ta metoda wykorzystuje udział porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów do wycieku protonów o niskiej przewodności, aby określić próg napięcia dla otwarcia porów u noworodków z zespołem łamliwego chromosomu X o zwiększonej zawartości kardiomiocytów mitochondrialnego koenzymu Q w porównaniu do kontroli typu dzikiego.

Ocena otwartego prawdopodobieństwa porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów w warunkach nadmiaru koenzymu q

The mitochondrial permeability transition pore (mPTP) is a voltage-gated, nonselective, inner mitochondrial membrane (IMM) mega-channel important in ...

Protokół ten zapewnia nowy sposób badania otwarcia porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów o niskiej przewodności. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona łatwy sposób pomiaru prawdopodobieństwa otwarcia porów w funkcji potencjału błony mitochondrialnej. Technika ta może być łatwo zastosowana do mitochondriów wyizolowanych z dowolnego układu narządów i gatunku.Rozpocznij od kalibracji elektrody tlenowej, umieszczając kroplę 50% roztworu elektrolitu chlorku potasu na górze kopuły tarczy elektrody. Umieść mały kawałek dwucentymetrowej przekładki bibuły papierosowej pokrytej nieco większym kawałkiem membrany politetrafluoroetylenowej na kropli elektrolitu. Następnie za pomocą aplikatora nasuń O-ring z małym krążkiem elektrody na kopułę elektrody.Następnie dobrze uzupełnij zbiornik roztworem elektrolitu. Umieść większy O-ring we wgłębieniu wokół dołka tarczy elektrody. Następnie zainstaluj tarczę w komorze elektrody i podłącz ją do jednostki sterującej.Dodaj dwa mililitry nasyconej powietrzem wody dejonizowanej i magnes pokryty politetrafluoroetylenem do komory reakcyjnej. Po zakończeniu podłącz komorę z tyłu jednostki sterującej. Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, a prędkość mieszania na 100.Poczekaj, aż temperatura systemu się wyrówna przez 10 minut przed kalibracją. Po upewnieniu się, że temperatura jest prawidłowa, szybkość mieszania i ciśnienie, na karcie Kalibracja wybierz opcję Kalibracja fazy ciekłej, aby przeprowadzić kalibrację fazy ciekłej. Następnie naciśnij OK i poczekaj, aż sygnał się ustabilizuje.Po osiągnięciu plateau naciśnij OK. Następnie dodaj około 20 miligramów ditionianu sodu, aby uzyskać zero tlenu w komorze. Ponownie naciśnij OK i poczekaj, aż sygnał się ustabilizuje, zanim klikniesz przycisk Zapisz, aby zaakceptować kalibrację. Aby przygotować tetrafenylofosfonię lub zespół elektrody selektywnej TPP, napełnij końcówkę elektrody selektywnej TPP 10-milimolowym roztworem TPP za pomocą strzykawki i elastycznej igły.Unikaj pęcherzyków powietrza podczas napełniania końcówki elektrody. Poluzuj nasadkę uchwytu elektrody, aby włożyć wewnętrzną elektrodę odniesienia do końcówki TPP. Po zakończeniu zmontuj aparat elektrody selektywnej TPP, w tym elektrodę odniesienia i uchwyt elektrody.Dokręć nakrętkę, aby zabezpieczyć końcówkę. Następnie podłącz do portu pomocniczego skrzynki sterowniczej i uchwytu elektrody TPP. Włóż elektrody selektywne TPP i referencyjne do przystosowanego zespołu tłoka dla elektrod jonoselektywnych.Podłącz elektrodę odniesienia do portu odniesienia w skrzynce sterowniczej. Następnie, aby przygotować komorę reakcyjną, dodaj jeden mililitr mieszaniny reakcyjnej do komory reakcyjnej, nie tworząc pęcherzyków powietrza. Zamknąć komorę za pomocą dostosowanego zespołu tłoka z założonymi elektrodami selektywnymi TPP i referencyjnymi.Po zamknięciu komory należy wprowadzić dodatkowe odczynniki bezpośrednio do komory reakcyjnej za pomocą oddzielnych mikrostrzykawek zmodyfikowanych plastikowymi rurkami. Gdy konfiguracja będzie gotowa, wybierz opcję Idź, aby rozpocząć nagrywanie. Po uzyskaniu stabilnego sygnału napięciowego należy skalibrować elektrodę selektywną TPP, dodając jeden mikromolowy przyrost 0,1 milimolowego roztworu TPP, aby uzyskać końcowe stężenie trzech mikromolowych.Obserwuj logarytmiczny spadek sygnału napięcia TPP przy każdym dodawaniu. Po ustabilizowaniu tlenu i śladów TPP, dodać 100 mikrogramów świeżo przygotowanych mitochondriów kardiomiocytów do komory reakcyjnej przez port dodawania odczynnika w zespole tłoka do końcowego stężenia 0,1 miligrama na mililitr. Obserwuj spadek poziomu tlenu w komorze, gdy mitochondria stają się energetyzowane i zużywają tlen.Zobacz także nagły wzrost sygnału napięcia TPP, gdy mitochondria generują potencjał błonowy i pobierają TPP z roztworu. Następnie dodaj 2,5 mikrograma na mililitr oligomycyny, aby wywołać oddychanie w stanie 4. Aby ocenić otwarte prawdopodobieństwo przejścia przez pory przepuszczalności mitochondriów lub mPTP, obserwuj spadek potencjału błony w czasie podczas oddychania nieszczelnego.Po osiągnięciu pożądanego potencjału błonowego dodać jedną mikromolową cyklosporynę A jako inhibitor mPTP do komory reakcyjnej, aby ocenić prawdopodobieństwo otwarcia mPTP przy tym określonym potencjale błonowym. Następnie zmierz wpływ cyklosporyny A na zużycie tlenu i potencjał błonowy przed i po dodaniu cyklosporyny A. W reprezentatywnych krzywych jednoczesnego zużycia tlenu i potencjału błonowego, wysoki potencjał błonowy ustalono na zero, pośredni na pięć i niski na 10 miliwoltów w stosunku do dwumikromolowego poziomu kalibracji TPP.Mitochondria o zerowym miliwoltach wykazywały 100% prawdopodobieństwa zamknięcia mPTP, a przy 10 miliwoltach wykazywały 100% prawdopodobieństwo otwarcia. Po dodaniu oligomycyny nie zaobserwowano znaczącej różnicy w zużyciu tlenu, co sugeruje, że trifosforan adenozyny lub syntaza ATP w minimalnym stopniu przyczynia się do oddychania w stanie 2. Ponadto porównano szybkość zużycia tlenu i potencjał błonowy przed i po dodaniu cyklosporyny A.Spadek wskaźnika zużycia tlenu i wzrost stabilizacji potencjału błonowego wskazywały na zamknięcie otwartego mPTP. Gdy mPTP jest zamknięty, nie nastąpił spadek tempa zużycia tlenu, a potencjał błony nadal spadał. Wyniki wykazały podobne domknięte i otwarte prawdopodobieństwa mPTP przy wysokich i niskich potencjałach błonowych w mitochondriach serca kontrolnych FVB i nokautujących Fmr1.Przy pośrednim potencjale błonowym mitochondria serca z nokautem Fmr1 wykazywały zwiększone prawdopodobieństwo zamknięcia mPTP w porównaniu z kontrolami FVB. Do komory nie trzeba wprowadzać pęcherzyków powietrza, ponieważ doprowadzi to do niestabilnych odczytów zużycia tlenu i utrudni interpretację. Po tej procedurze można zmierzyć ładowność wapnia.Metoda ta ocenia otwarcie porów o wysokiej przewodności i uzupełnia wyniki naszej techniki.

assessment-open-probability-mitochondrial-permeability-transition

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie włókien permeabilizowanych saponiną w połączeniu z respirometryczną analizą fosforylacji oksydacyjnej umożliwia zintegrowaną ocenę funkcji mitochondriów. Oddychanie mitochondrialne w stanach fizjologicznych i patologicznych może odzwierciedlać różne wpływy regulacyjne, w tym oddziaływania mitochondrialne, morfologię oraz biochemikę.

Ocena fosforylacji oksydacyjnej metodą respirometryczną w włóknach mięśnia sercowego permeabilizowanych saponiną

Metoda podwójnego znakowania oksydazy cytochromu c/dehydrogenazy sodowej (COX/SDH) umożliwia bezpośrednią wizualizację niedoborów enzymów oddechowych mitochondriów w świeżo zamrożonych przekrojach tkanek. Jest to prosta technika histochemiczna, która okazuje się przydatna w badaniu chorób mitochondrialnych, starzenia się oraz zaburzeń związanych z wiekiem.

Wizualizacja funkcji oddechowej mitochondriów przy użyciu histochemii z podwójnym znakowaniem oksydazy cytochromu C / dehydrogenazy bursztynianowej (COX/SDH)

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Opisano wpływ aktywacji izoformy kinazy białkowej C (PKC) na funkcje mitochondrialne związane z oddychaniem i fosforylacją oksydacyjną oraz na żywotność komórek. Podejście to adaptuje technikę adenowirusową w celu selektywnej nadekspresji izoform PKC w pierwotnych hodowlach komórkowych oraz szereg analiz służących do określenia funkcji mitochondriów i stanu energetycznego komórki.

Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Ten protokół opisuje separację funkcjonalnych mitochondrialnych kompleksów łańcucha transportu elektronów (Cx) I-V i ich superkompleksów za pomocą natywnej elektroforezy w celu ujawnienia informacji o ich budowie i strukturze. Natywny żel można poddać immunoblottingowi, testom w żelu i oczyszczaniu za pomocą elektroelucji w celu dalszego scharakteryzowania poszczególnych kompleksów.

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

W tym artykule opisana jest metoda pomiaru zużycia tlenu za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości w permeabilizowanych piersiach Drosophila. Technika ta wymaga minimalnej ilości tkanki w porównaniu z klasyczną techniką izolacji mitochondriów, a uzyskane wyniki są bardziej istotne fizjologicznie.

Pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach Drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki

Wysokorozdzielcza respirometria sprzężona z czujnikami fluorescencyjnymi określa zużycie tlenu w mitochondriach i generowanie reaktywnych form tlenu (ROS). Niniejszy protokół opisuje technikę oceny częstości oddechów mitochondriów i produkcji ROS w przepuszczalnym nerwie kulszowym.

Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Ten protokół opisuje test porównawczy, wykorzystujący aktywność kompleksu mitochondrialnego CI+CIII i CII+CIII w obecności lub braku Na+, w celu zbadania istnienia częściowo segmentowanych funkcjonalnych pul CoQ.

Wrażliwość wewnętrznej błony mitochondrialnej na Na+ ujawnia częściowo segmentowane funkcjonalne pule CoQ

Ta technika opisuje efektywny przepływ pracy do wizualizacji i ilościowego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w komórkach HeLa za pomocą obrazowania na żywo opartego na fluorescencji.

Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

Badania bioenergetyczne i metabolomiczne mitochondriów ujawniły ich wieloaspektową rolę w wielu chorobach, ale metody izolacji tych organelli są różne. Opisana tutaj metoda jest w stanie oczyścić wysokiej jakości mitochondria z wielu źródeł tkankowych. Jakość określa się na podstawie współczynników kontroli oddechu i innych wskaźników ocenianych za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

Poznaj metodę oceny prawdopodobieństwa otwarcia porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów w kardiomiocytach myszy z zespołem łamliwego chromosomu X. Technika mierzy dynamikę mPTP w funkcji potencjału błonowego.

Ocena otwartego prawdopodobieństwa porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów w warunkach nadmiaru koenzymu q

Przeglądaj więcej filmów