Ocena otwartego prawdopodobieństwa porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów w warunkach nadmiaru koenzymu q
1 czerwca 2022
Ta metoda wykorzystuje udział porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów do wycieku protonów o niskiej przewodności, aby określić próg napięcia dla otwarcia porów u noworodków z zespołem łamliwego chromosomu X o zwiększonej zawartości kardiomiocytów mitochondrialnego koenzymu Q w porównaniu do kontroli typu dzikiego.
Protokół ten zapewnia nowy sposób badania otwarcia porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów o niskiej przewodności. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona łatwy sposób pomiaru prawdopodobieństwa otwarcia porów w funkcji potencjału błony mitochondrialnej. Technika ta może być łatwo zastosowana do mitochondriów wyizolowanych z dowolnego układu narządów i gatunku.
Rozpocznij od kalibracji elektrody tlenowej, umieszczając kroplę 50% roztworu elektrolitu chlorku potasu na górze kopuły tarczy elektrody. Umieść mały kawałek dwucentymetrowej przekładki bibuły papierosowej pokrytej nieco większym kawałkiem membrany politetrafluoroetylenowej na kropli elektrolitu. Następnie za pomocą aplikatora nasuń O-ring z małym krążkiem elektrody na kopułę elektrody.
Następnie dobrze uzupełnij zbiornik roztworem elektrolitu. Umieść większy O-ring we wgłębieniu wokół dołka tarczy elektrody. Następnie zainstaluj tarczę w komorze elektrody i podłącz ją do jednostki sterującej.
Dodaj dwa mililitry nasyconej powietrzem wody dejonizowanej i magnes pokryty politetrafluoroetylenem do komory reakcyjnej. Po zakończeniu podłącz komorę z tyłu jednostki sterującej. Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, a prędkość mieszania na 100.
Poczekaj, aż temperatura systemu się wyrówna przez 10 minut przed kalibracją. Po upewnieniu się, że temperatura jest prawidłowa, szybkość mieszania i ciśnienie, na karcie Kalibracja wybierz opcję Kalibracja fazy ciekłej, aby przeprowadzić kalibrację fazy ciekłej. Następnie naciśnij OK i poczekaj, aż sygnał się ustabilizuje.
Po osiągnięciu plateau naciśnij OK. Następnie dodaj około 20 miligramów ditionianu sodu, aby uzyskać zero tlenu w komorze. Ponownie naciśnij OK i poczekaj, aż sygnał się ustabilizuje, zanim klikniesz przycisk Zapisz, aby zaakceptować kalibrację. Aby przygotować tetrafenylofosfonię lub zespół elektrody selektywnej TPP, napełnij końcówkę elektrody selektywnej TPP 10-milimolowym roztworem TPP za pomocą strzykawki i elastycznej igły.
Unikaj pęcherzyków powietrza podczas napełniania końcówki elektrody. Poluzuj nasadkę uchwytu elektrody, aby włożyć wewnętrzną elektrodę odniesienia do końcówki TPP. Po zakończeniu zmontuj aparat elektrody selektywnej TPP, w tym elektrodę odniesienia i uchwyt elektrody.
Dokręć nakrętkę, aby zabezpieczyć końcówkę. Następnie podłącz do portu pomocniczego skrzynki sterowniczej i uchwytu elektrody TPP. Włóż elektrody selektywne TPP i referencyjne do przystosowanego zespołu tłoka dla elektrod jonoselektywnych.
Podłącz elektrodę odniesienia do portu odniesienia w skrzynce sterowniczej. Następnie, aby przygotować komorę reakcyjną, dodaj jeden mililitr mieszaniny reakcyjnej do komory reakcyjnej, nie tworząc pęcherzyków powietrza. Zamknąć komorę za pomocą dostosowanego zespołu tłoka z założonymi elektrodami selektywnymi TPP i referencyjnymi.
Po zamknięciu komory należy wprowadzić dodatkowe odczynniki bezpośrednio do komory reakcyjnej za pomocą oddzielnych mikrostrzykawek zmodyfikowanych plastikowymi rurkami. Gdy konfiguracja będzie gotowa, wybierz opcję Idź, aby rozpocząć nagrywanie. Po uzyskaniu stabilnego sygnału napięciowego należy skalibrować elektrodę selektywną TPP, dodając jeden mikromolowy przyrost 0,1 milimolowego roztworu TPP, aby uzyskać końcowe stężenie trzech mikromolowych.
Obserwuj logarytmiczny spadek sygnału napięcia TPP przy każdym dodawaniu. Po ustabilizowaniu tlenu i śladów TPP, dodać 100 mikrogramów świeżo przygotowanych mitochondriów kardiomiocytów do komory reakcyjnej przez port dodawania odczynnika w zespole tłoka do końcowego stężenia 0,1 miligrama na mililitr. Obserwuj spadek poziomu tlenu w komorze, gdy mitochondria stają się energetyzowane i zużywają tlen.
Zobacz także nagły wzrost sygnału napięcia TPP, gdy mitochondria generują potencjał błonowy i pobierają TPP z roztworu. Następnie dodaj 2,5 mikrograma na mililitr oligomycyny, aby wywołać oddychanie w stanie 4. Aby ocenić otwarte prawdopodobieństwo przejścia przez pory przepuszczalności mitochondriów lub mPTP, obserwuj spadek potencjału błony w czasie podczas oddychania nieszczelnego.
Po osiągnięciu pożądanego potencjału błonowego dodać jedną mikromolową cyklosporynę A jako inhibitor mPTP do komory reakcyjnej, aby ocenić prawdopodobieństwo otwarcia mPTP przy tym określonym potencjale błonowym. Następnie zmierz wpływ cyklosporyny A na zużycie tlenu i potencjał błonowy przed i po dodaniu cyklosporyny A. W reprezentatywnych krzywych jednoczesnego zużycia tlenu i potencjału błonowego, wysoki potencjał błonowy ustalono na zero, pośredni na pięć i niski na 10 miliwoltów w stosunku do dwumikromolowego poziomu kalibracji TPP.
Mitochondria o zerowym miliwoltach wykazywały 100% prawdopodobieństwa zamknięcia mPTP, a przy 10 miliwoltach wykazywały 100% prawdopodobieństwo otwarcia. Po dodaniu oligomycyny nie zaobserwowano znaczącej różnicy w zużyciu tlenu, co sugeruje, że trifosforan adenozyny lub syntaza ATP w minimalnym stopniu przyczynia się do oddychania w stanie 2. Ponadto porównano szybkość zużycia tlenu i potencjał błonowy przed i po dodaniu cyklosporyny A.
Spadek wskaźnika zużycia tlenu i wzrost stabilizacji potencjału błonowego wskazywały na zamknięcie otwartego mPTP. Gdy mPTP jest zamknięty, nie nastąpił spadek tempa zużycia tlenu, a potencjał błony nadal spadał. Wyniki wykazały podobne domknięte i otwarte prawdopodobieństwa mPTP przy wysokich i niskich potencjałach błonowych w mitochondriach serca kontrolnych FVB i nokautujących Fmr1.
Przy pośrednim potencjale błonowym mitochondria serca z nokautem Fmr1 wykazywały zwiększone prawdopodobieństwo zamknięcia mPTP w porównaniu z kontrolami FVB. Do komory nie trzeba wprowadzać pęcherzyków powietrza, ponieważ doprowadzi to do niestabilnych odczytów zużycia tlenu i utrudni interpretację. Po tej procedurze można zmierzyć ładowność wapnia.
Metoda ta ocenia otwarcie porów o wysokiej przewodności i uzupełnia wyniki naszej techniki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie bada otwarcie niskiego przewodnictwa poru przejścia przenikalności mitochondrialnej (mPTP) u myszy z nieuwagiem X w zespole niemowlęców, podkreślając próg napięcia dla otwarcia poru. Wyniki porównują zawartość koenzymu Q mitochondrialnego kardiomiocytów w organizmach modelowych z kontrolami typu dzikiego, ustanawiając nowe podejście do mierzenia zachowania mPTP jako funkcji potencjału błony mitochondrialnej.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Fizjologia mitochondrialna
- Zespół nieprzytomnego X
- Funkcja kardiomiocytów
Tło
- Por przejścia przenikalności mitochondrialnej (mPTP) odgrywa kluczową rolę w metabolizmie energetycznym komórek.
- Zespół nieprzytomnego X jest znany z wpływu na funkcjonowanie komórek i metabolizm.
- Celem badania jest wyjaśnienie związku między zachowaniem mPTP a potencjałem mitochondrialnym w komórkach sercowych.
Stosowane metody
- Kalibracja elektrod tlenu do pomiaru aktywności mitochondrialnej
- Mitochondria kardiomiocytów z myszy z nieuwagiem X w zespole niemowlęców i kontrolami typu dzikiego
- Zastosowanie inhibitorów mPTP, takich jak cyklosporyna A, do oceny prawdopodobieństwa otwarcia poru
Główne wyniki
- Zidentyfikowano próg napięcia dla otwarcia mPTP w mitochondrialnych komórkach sercowych.
- Wykazano różne prawdopodobieństwa otwarcia mPTP między mitochondrialnymi komórkami zespołu nieprzytomnego X a kontrolami typu dzikiego.
- Zweryfikowano, że prawdopodobieństwa zamknięcia i otwarcia mPTP są wpływane przez potencjał błony.
Wnioski
- Badanie ustanawia nową metodologię analizy dynamiki mPTP i ich implikacji w modelach chorobowych.
- Te wyniki zwiększają nasze zrozumienie dysfunkcji mitochondrialnych w zespole nieprzytomnego X i powiązanych stanów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) open probability as a function of membrane potential enables mechanistic de-risking in early discovery and target validation for mitochondrial dysfunction. This approach provides predictive confidence for evaluating mitochondrial liabilities and supports portfolio triage in disease-relevant models. The method's adaptability across organ systems and species enhances its enterprise value for translational research and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of mPTP gating mechanisms under defined voltage thresholds.
- Supports functional target validation by quantifying pore open probability in response to modulators like cyclosporine A.
- Facilitates mechanistic de-risking of mitochondrial targets in disease-relevant systems.
- Provides a platform for comparative studies across genetic backgrounds and tissue types.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized, quantitative readouts for mPTP activity using simultaneous oxygen consumption and membrane potential measurements.
- Enables reproducible assessment of compound effects on mitochondrial function in isolated organelles.
- Supports assay scalability and cross-laboratory standardization through robust electrode-based protocols.
- Prepares validated biological systems for downstream screening of mitochondrial modulators.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial functional readouts with disease-relevant phenotypes in genetic models.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of mitochondrial targets.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying functional mitochondrial liabilities.
- Facilitates biomarker alignment for translational research in mitochondrial pathologies.
Pipeline & Workflow Integration
This technique integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, mechanistic de-risking, and quantitative assessment of mitochondrial function in isolated systems.
- Discovery Biology: Provides voltage-dependent mPTP open probability data for pathway clarification and target validation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in mitochondrial assays.
- Analytics: Generates simultaneous oxygen consumption and membrane potential measurements for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical models by supporting disease-relevant system interrogation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable protocol for diverse organ systems and species in mitochondrial research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales mitochondrial functional assays for cross-team reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking mitochondrial liabilities early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of mitochondrial-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation and electrode-based measurement techniques.
- Demands access to polarography and TPP-selective electrode instrumentation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility of quantitative outputs.
- Adaptable to various organ systems and species with protocol optimization.
- Careful handling is needed to avoid air bubbles and ensure stable oxygen consumption readings.
