Name: Pierwotne hodowle komórkowe w celu zbadania potencjału regeneracyjnego mysiego gleju Müllera po leczeniu mikroRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj pierwotne hodowle komórkowe gleju Müllera myszy w celu badania regeneracji siatkówki po leczeniu mikroRNA. Ta metoda umożliwia testowanie kandydatów mikroRNA przed zastosowaniem in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Ann Beaton i wszystkim członkom laboratorium za ich wkład w pracę nad manuskryptem. Specjalne podziękowania kierujemy do dr Toma Reha, Julii Pollak i Russa Taylora za wprowadzenie pierwotnych kultur MG jako narzędzia przesiewowego do SGW podczas stażu podoktorskiego na Uniwersytecie Waszyngtońskim w Seattle. Badanie zostało sfinansowane z grantu Empire Innovation Program (EIP) dla SGW oraz funduszy start-up od SUNY Optometry dla SGW, a także nagrody R01EY032532 od National Eye Institute (NEI) dla SGW.

Uniwersytet Waszyngtoński złożył wniosek patentowy zawierający niektóre z ustaleń zawartych w tym raporcie wraz z wynalazcami Nikolasem Jorstadem, Stefanie G. Wohl i Thomasem A. Rehem. Patent nosi tytuł "Metody i kompozycje stymulujące regenerację siatkówki.

Protokół ten opisuje, jak wyhodować MG ze zdysocjowanych siatkówek myszy w celu przeprogramowania badań przy użyciu miRNA. Jak wykazano i potwierdzono w wielu poprzednich badaniach, zdecydowana większość (80%-90%) komórek znalezionych w tych kulturach to MG20,23,24. Ta metoda jest bardzo solidną i niezawodną techniką, a wyniki można łatwo odtworzyć, jeśli protokół jest przestrzegany prawidłowo21,27</...

Glej Müllera (MG) to dominujący glej w siatkówce nerwowej. Mają podobne funkcje w porównaniu z innymi komórkami glejowymi w innych częściach ośrodkowego układu nerwowego, takie jak utrzymanie homeostazy wody i jonów, odżywianie neuronów i ochrona tkanki. MG mają jeszcze jedną fascynującą cechę: chociaż są dojrzałymi glejami, nadal wyrażają wiele genów wyrażanych w komórkach progenitorowych siatkówki (RPC) w późnym okresie rozwoju1,2. Zakłada się, że to podobieństwo jest przyczyną naturalnie występującej regeneracji neuronów opartej na MG w siatkówce ryby po uszkodzeniu siatkówki3,4. Podczas tego procesu MG ponownie wchodzi do cyklu komórkowego i deróżnicuje się w RPC, które następnie różnicują się we wszystkich sześciu typach neuronów siatkówki. Chociaż zjawisko to występuje naturalnie u ryb, MG ssaków nie przekształcają się w neurony5,6. Można je jednak przeprogramować. Wykazano, że wiele czynników przeprogramowuje MG w RPC/neurony; wśród tych czynników jest podstawowy czynnik transkrypcyjny helisa-pętla-helisa (bHLH) achaete-scute homolog 1 (Ascl1), który bierze udział w regeneracji ryb7,8. U myszy Ascl1 ulega ekspresji tylko w RPC podczas retinogenezy, ale nie występuje w dojrzałych MG lub neuronach siatkówki9.
Przeprogramowanie komórek bezpośrednio in vivo jest nie tylko wyzwaniem metodologicznym, ale także wymaga zgody instytucjonalnego komitetu ds. opieki i użytkowania zwierząt. Aby uzyskać zatwierdzenie, wymagane są wstępne dane dotyczące zastosowanego lub zmienionego czynnika (czynników), stężeń, skutków niedocelowych, mechanizmów leżących u podstaw objawów, toksyczności i skuteczności. Systemy hodowli komórkowych umożliwiają testowanie tych kryteriów przed użyciem w modelach in vivo. Ponadto, ponieważ MG stanowią tylko około 5% całej populacji komórek siatkówki10, hodowle MG pozwalają na badanie ich funkcji11, a także ich zachowania, w tym migracji12,13, proliferation14, reakcja stresowa na uraz/uszkodzenie15,16, ich interakcja z innymi typami komórek, takimi jak mikroglej17 lub komórki zwojowe siatkówki (RGC)18, lub ich potencjał neurogenny19,20,21. Wielu badaczy wykorzystuje unieśmiertelnione linie komórkowe do swoich badań, ponieważ mają one nieograniczony potencjał proliferacyjny i mogą być łatwo utrzymywane i transfekowane. Komórki pierwotne są jednak preferowane do testów biologicznie istotnych niż komórki unieśmiertelnione, ponieważ mają prawdziwe cechy komórkowe (ekspresję genów i białek) i, co ważniejsze, reprezentują pewien etap rozwoju, a zatem mają "wiek". Wiek zwierzęcia (a co za tym idzie komórek uzyskanych od zwierzęcia) jest szczególnie istotnym czynnikiem w przeprogramowywaniu komórek, ponieważ plastyczność komórek zmniejsza się wraz z postępem etapu rozwoju22.
Ten protokół opisuje szczegółowo, jak przeprogramować pierwotne MG za pomocą miRNA jako aktualną metodę in vitro do badania regeneracji. Ten model hodowli pierwotnej MG został opracowany w 2012 roku w celu oceny charakterystyki proliferacji komórek MG u myszy z nokautem P53 (myszy trp53-/-)23. Wykazano, że hodowane MG zachowują swoje cechy glejowe (tj. ekspresję białek S100β, Pax6 i Sox2 ocenianą za pomocą znakowania immunofluorescencyjnego) i że przypominają one in vivo MG (mikromacierz MG oczyszczonego FACS)23. Wkrótce potem mRNA glejowe i ekspresja białka zostały zwalidowane i potwierdzone w innym podejściu przy użyciu wektorów wirusowych20. Kilka lat później potwierdzono, że zdecydowana większość komórek znalezionych w tych hodowlach to MG przy użyciu specyficznego dla MG Rlbp1CreERT:tdTomatoreporter mouse24. Co więcej, kwantyfikacja zestawu miRNA zarówno w MG oczyszczonym FACS, jak i hodowanym pierwotnym MG wykazała, że poziomy miRNA MG (mGLiomiR) nie różnią się zbytnio w hodowanym MG w fazie wzrostu. Wydłużone okresy hodowli powodują jednak zmiany w poziomach miRNA, a co za tym idzie w poziomach mRNA i ekspresji białek, ponieważ miRNA są regulatorami translacyjnymi25.
W 2013 roku ten model hodowli MG został wykorzystany do przetestowania różnych czynników transkrypcyjnych pod kątem ich zdolności do przeprogramowania MG na neurony siatkówki20. Stwierdzono, że Ascl1 jest bardzo solidnym i niezawodnym czynnikiem przeprogramowującym. Nadekspresja Ascl1 za pośrednictwem wektorów wirusowych indukowała zmiany morfologiczne, ekspresję markerów neuronalnych i nabywanie właściwości elektrofizjologicznych neuronów. Co ważniejsze, spostrzeżenia i wyniki uzyskane z tych pierwszych eksperymentów in vitro zostały z powodzeniem przeniesione do aplikacji in vivo22,26, wykazując, że pierwotne hodowle MG stanowią solidne i wiarygodne narzędzie do wstępnych badań przesiewowych czynników i oceny cech glejowych przed wdrożeniem in vivo.
Kilka lat temu pokazano, że wzbogacone w mózg miRNA miR-124, które jest również wysoko wyrażane w neuronach siatkówki, może indukować ekspresję Ascl1 w hodowlanych MG21. Ekspresję Ascl1 w żywych komórkach wizualizowano za pomocą myszy reporterowej Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Mysz reporterowa to genetycznie zmodyfikowana mysz, która ma gen reporterowy wstawiony do swojego DNA. Ten gen reporterowy koduje białko reporterowe, które w tym badaniu jest tdTomato, białkiem czerwonej fluorescencji. To białko reporterowe informuje o ekspresji interesującego genu, w tym przypadku Ascl1. Innymi słowy, komórki, które wyrażają Ascl1, zmienią kolor na czerwony. Ponieważ Ascl1 jest wyrażany tylko w RPCs9, ta mysz Ascl1 CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl umożliwia śledzenie konwersji MG do RPC z ekspresją Ascl1, co oznacza, że konwertujące komórki będą wyrażać czerwone fluorescencyjne białko reporterowe tdTomato. Jest to nieodwracalne etykietowanie, ponieważ DNA tych komórek jest zmienione. W związku z tym każde późniejsze różnicowanie neuronów zostanie uwidocznione, ponieważ etykieta tdTomato pozostaje w różnicujących się komórkach. Jeśli ekspresja Ascl1 RPC pochodząca z MG (z etykietą tdTomato) różnicuje się w neurony, neurony te nadal będą miały swoją czerwoną etykietę. Mysz ta umożliwia zatem nie tylko znakowanie RPC pochodzących od MG do obrazowania żywych komórek, ale także umożliwia mapowanie losów i śledzenie linii tych pochodzących z MG (czerwonych) RPC. Niedawno zidentyfikowano zestaw miRNA w RPC, a kultury MG myszy Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter wykorzystano do badań przesiewowych i testowania wpływu tych miRNA na zdolność i wydajność przeprogramowywania27. Okazało się, że jeden z kandydatów, miR-25 RPC-miRNA, jest zdolny do przeprogramowania hodowanego MG w komórki wykazujące ekspresję Ascl1 (Ascl1-Tomato+). Te przeprogramowane komórki z czasem przyjmują cechy neuronalne, w tym morfologię neuronów (małe somaty i krótkie lub długie drobne procesy), ekspresję transkryptów neuronalnych mierzoną za pomocą scRNA-Seq, a także ekspresję białek neuronalnych zwalidowaną za pomocą znakowania immunofluorescencyjnego27.
Tutaj protokół szczegółowo opisuje, jak hodować i transfekować MG z myszy P12 zaadaptowanych z poprzedniej pracy21,24,27. Do tego protokołu wybrano wspomniany miRNA miR-25, miRNA o wysokiej ekspresji w RPC, z niskimi poziomami ekspresji w MG lub neuronach siatkówki. W celu nadekspresji miR-25 stosuje się mysie mimiki miR-25, czyli sztuczne cząsteczki miRNA. Jako kontrolę wybiera się mimimikę miRNA z Caenorhabditis elegans, która nie pełni żadnej funkcji w komórkach ssaków. Wizualizacja konwersji MG na RPC została zrealizowana za pomocą myszy reporterowej RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), myszy o mieszanym tle (szczepy C57BL/6, S129 i ICR). Hodowlę tę można jednak przeprowadzić ze wszystkimi szczepami myszy, w tym ze szczepami typu dzikiego. W ciągu ostatnich kilku lat pierwotny protokół został zmodyfikowany w celu skrócenia czasu trwania fazy wzrostu i ogólnego okresu hodowli oraz zapewnienia bardziej solidnego statusu komórek glejowych i zminimalizowania stopnia degeneracji komórek, która występuje w dłuższych okresach hodowli. Wydłużono również regularne okno czasowe transfekcji z 3 h do 2 dni. Jak wspomniano wcześniej, chociaż obecny protokół opisuje hodowle MG jako narzędzie do badań nad regeneracją, metoda jest nie tylko przydatna do testowania czynników przeprogramowujących, ale może być również dostosowana do innych zastosowań, w tym badań nad zachowaniami migracyjnymi lub proliferacyjnymi MG, paradygmatami związanymi z urazami/uszkodzeniem komórek i/lub identyfikacją podstawowych mechanizmów i szlaków.

<table><tbody><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascl1-CreERT mysz Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J Jax</td><td>laboratories</td><td>#012882</td><td>Myszy Ascl1-CreERT skrzyżowano z myszami tdTomato-STOPfl</td></tr><tr><td>/fl&nbsp; Klasa B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>Jax laboratories</td><td>#007914</td><td>Genotypowanie jest wymagane w celu identyfikacji myszy Ascl1CreER dodatnich</td></tr><tr><td><silnych>odczynników</td><td></td><td></td><td></td>(</tr><tr><td>Z)-4-hydroksytamoksyfen, &ge; 98% izomer Z</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td>rozpuszczony w etanolu, zamrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>16 % roztwór wodny paraformaldehydu (PFA)</td><td>VWR</td><td>100504-782</td><td>2% PFA wykonane z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), zamrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment IgG Anty-Królicze IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-546-152</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment IgG IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>705-606-147</td><td>rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie Otx2, R& D Systems</td><td>Fisher Scientific</td><td>AF1979</td><td>rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-królicze MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942-200UL</td><td>rozcieńczenie 1:250</td></tr><tr><td>Przeciwciała przeciwko białku czerwonej fluorescencji (RFP</td><td>) -</td><td></td><td>ABIN334653 rozcieńczenie online 1:500</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72132</td><td>rozpuszczony w PBS, mrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>Suplement B-27</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-504-044</td><td>mrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>Brain Phys Neuronal</td><td>Medium STEMCELL Technologies</td><td>05790</td><td>używane jako podłoże neuronalne w sekcji 1.2, przechowywać w temperaturze 4 &deg; C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td></tr><tr><td>Zestaw do obrazowania Click-iT EdU Alexa Fluor 647</td><td>Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td>odtworzyć następującą instrukcję, 4&deg; C</td></tr><tr><td>Dibutyryl-cAMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73886</td><td>rozpuszczony w dimetylosulfotlenku (DMSO), mrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenku (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td>mrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; Opti-MEM Obniżona pożywka surowicy, suplement GlutaMAX</td><td>Fisher Scientific</td><td>51-985-034</td><td>przechowywać w 4 stopniach; C</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; TrypLE Express Enzyme (1X), czerwień fenolowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-605-028</td><td>stosowany jako roztwór zawierający trypsynę, przechowywać w temperaturze 4 &; C</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-025-134</td><td>sklep pod adresem 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Białko myszy Laminin, naturalne</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-017-015</td><td> mrożone podwielokrotności, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.164323 1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) </td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>mrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>miRIDIAN mikroRNA Naśladuje Horyzont Kontroli Negatywnej</td><td></td><td>CN-001000-01-50</td><td>rozpuszczony w wodzie wolnej od RNaz (200 &mikro; M), zamrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p naśladuje</td><td>Horizon</td><td>C-310564-05-0050</td><td>rozpuszczony w wodzie wolnej od RNaz (200 &mikro; M), mrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>N-2 Suplement</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-502-048</td><td>mrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-103-049</td><td>stosowane jako pożywka wzrostowa w sekcji 1.1, przechowywać w temperaturze 4 & st; C</td></tr><tr><td>System dysocjacji papainy</td><td>Worthington Biochemiczny</td><td>LK003153</td><td>odtworzony w zrównoważonym roztworze soli Earle'a, mrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td>mrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-012-043</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-ornityny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4538-50MG</td><td>rozpuszczony w sterylnej wodzie, zamrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko BDNF</td><td>R& D Systems</td><td>248-BDB-050/CF</td><td>rozpuszczony w sterylnych PBS i FBS, mrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>Rekombinowane mysie białko EGF Fisher</td><td>Scientific</td><td>2028EG200</td><td>rozpuszczone w sterylnym PBS, mrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>Rekombinowane białko szczurze GDNF Fisher</td><td>Scientific</td><td>512GF010</td><td>odtworzone w sterylnym PBS, zamrożone podwielokrotności</td></tr><tr><td>Rodamina Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment osiołka IgG anty-szczurzego (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>712-296-150</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>Medium do montażu na szkiełku</td><td>Fisher Scientific</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji (Lipofectamina 3000)</td><td>Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>plasticware/supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,6 ml probówka do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 &mikro; L WSKAZÓWKA&nbsp; Filtr sterylny&nbsp; Końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-439</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; L WSKAZÓWKA&nbsp; sterylny filtr Końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-431</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L TIP sterylny filtr Końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml probówka do mikrowirówki</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-138</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L WSKAZÓWKA&nbsp; sterylny filtr Końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>Pipety o regulowanej objętości (2,5, 10, 20, 100, 200 i 1000 i mikro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>2231300008</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-669-12</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Płaskie płytki denne z pokrywkami, Liczba studzienek=12</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Płytki z płaskim dnem z pokrywkami, Liczba studzienek=24</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>PIPET&nbsp; sterylny filtr 10ML jednorazowy serologiczny Pipety</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>PIPET&nbsp; sterylny filtr 50ML Jednorazowe pipety serologiczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10Q</td><td></td></tr><tr><td>PIPET&nbsp; sterylny filtr 5ML Jednorazowe pipety serologiczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>Bezpudrowe rękawice nitrylowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-1597B</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełka nakrywkowe (średnica 12 mm, grubość 0,17 - 0,25 mm)</td>Filtr próżniowy <td>Fisher Scientific</td><td>22293232</td><td></td></tr><tr><td>, wielkość porów = 0,22 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-106</td><td></td></tr><tr><td>equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1300 B2 Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Thermo Scientific</td><td>1310</td><td></td></tr><tr><td>Wielofunkcyjny mikroskop fluorescencyjny Keyence BZ-X 810</td><td>Keyence</td><td>9011800000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy z zoomem lornetkowym</td><td>Vision Scientific</td><td>VS-1EZ-IFR07</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe szalki Petriego (średnica 100 mm)</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5 - Biologie/Titanium</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #55 - Biologie/Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione Dumont #7 - Biologie/Titanium</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>2231000508</tr><tr><td>Cienkie nożyczki - ostre</td><td>narzędzia naukowe</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki McPherson-Vannas, 8 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>Metalowa wanna z koralikami</td><td>Lab Armor</td><td>74309-714</td><td></td></tr><tr><td>Mikser nutacyjny, elektryczny=115V, 60Hz, prędkości=24 obr/min</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowa dyssekcja szalki Petriego (90 mm średnica)</td><td>Oprzyrządowanie systemów żywych</td><td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta, ekonomiczna #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>501979</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 z płaszczem wodnym</td><td>VWR</td><td>10810-744</td><td></td></tr></tbody></table>

pierwotne hodowle komórkowe w celu zbadania potencjału regeneracyjnego mysiego gleju müllera po leczeniu mikrorna

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

Glej Müllera (MG) są dominującym glejem w siatkówce nerwowej i mogą funkcjonować jako źródło regeneracji neuronów siatkówki. U niższych kręgowców, takich jak ryby, regeneracja napędzana przez MG zachodzi naturalnie; U ssaków wymagana jest jednak stymulacja pewnymi czynnikami lub manipulacja genetyczna/epigenetyczna. Ponieważ MG stanowią tylko 5% populacji komórek siatkówki, istnieje zapotrzebowanie na systemy modelowe, które pozwalają na badanie wyłącznie tej populacji komórek. Jednym z tych systemów modelowych są pierwotne hodowle MG, które są powtarzalne i mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań, w tym do badań przesiewowych i identyfikacji cząsteczek/czynników, testowania związków lub czynników, monitorowania komórek i/lub testów funkcjonalnych. Model ten służy do badania potencjału mysiego MG do przekształcania się w neurony siatkówki po suplementacji lub hamowaniu mikroRNA (miRNA) poprzez transfekcję sztucznych miRNA lub ich inhibitorów. Zastosowanie myszy reporterowych specyficznych dla MG w połączeniu z znakowaniem immunofluorescencyjnym i sekwencjonowaniem jednokomórkowego RNA (scRNA-seq) potwierdziło, że 80%-90% komórek znalezionych w tych hodowlach to MG. Korzystając z tego modelu, odkryto, że miRNA mogą przeprogramować MG w komórki progenitorowe siatkówki (RPC), które następnie różnicują się w komórki podobne do neuronów. Zaletą tej techniki jest to, że kandydaci na miRNA mogą być testowani pod kątem ich skuteczności i wyników przed ich użyciem w zastosowaniach in vivo.

Niniejszy protokół opisuje sposób hodowli komórek MG z siatkówek myszy P12 oraz metodę przeprogramowania tych komórek w neurony siatkówki za pomocą miR-25 z wykorzystaniem myszy reporterowej RPC Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl . Metoda ta została zastosowana w poprzednich pracach, w których szczegółowo opisano inne odpowiednie miRNA (mimetyki lub inhibitory, jako pojedyncze cząsteczki lub w kombinacjach) do przeprogramowania MG w RPC, które następnie przyjmują charakterystykę komórek neuronal...

Pierwotne kultury glejowe Müllera uzyskane z siatkówki myszy stanowią bardzo solidne i niezawodne narzędzie do badania konwersji gleju w komórki progenitorowe siatkówki po leczeniu mikroRNA. Pojedyncze cząsteczki lub ich kombinacje mogą być badane przed ich późniejszym zastosowaniem w metodach in vivo.

Pierwotne hodowle komórkowe w celu zbadania potencjału regeneracyjnego mysiego gleju Müllera po leczeniu mikroRNA

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Protokół ten pozwala na zbadanie potencjału i zdolności gleju Müllera do przekształcania się w komórki progenitorowe siatkówki po leczeniu określonymi czynnikami, takimi jak mikroRNA. Zaletą tej techniki jest to, że kandydaci na mikroRNA mogą być testowani pod kątem ich skuteczności i wyników przed ich użyciem w zastosowaniach in vivo. W demonstracji procedury pomoże Seoyoung Kang, doktorantka z laboratorium Stefanie Wohl.Najpierw zanurz na krótko usuniętą gałkę oczną w tubce z etanolem, aby uniknąć przeniesienia bakterii ze zwierzęcia. Następnie krótko umyj gałkę oczną na 10-centymetrowej szalce Petriego przed umieszczeniem jej na 24-dołkowej płytce na lodzie. Po usunięciu i oczyszczeniu gałek ocznych umieść jedno oko w naczyniu preparacyjnym umieszczonym pod mikroskopem preparacyjnym ze źródłem światła.Teraz napraw jedną gałkę oczną, chwytając nerw wzrokowy i otaczającą go tkankę łączną wokół twardówki za pomocą cienkich kleszczyków Dumont 5 i ostrożnie dociśnij ją do naczynia preparacyjnego. Następnie wykonaj otwór w środku rogówki za pomocą igły o rozmiarze 30, aby umożliwić łatwiejszy dostęp nożyczkom żylnym. Następnie wypreparuj rogówkę wokół ciała rzęskowego za pomocą nożyczek żylnych i ostrożnie usuń rogówkę, soczewkę, tęczówkę i ciało szkliste za pomocą cienkich kleszczyków Dumont 5.Później wypreparuj twardówkę nożyczkami żylnymi, aż do dotarcia do nerwu wzrokowego i ostrożnie usuń siatkówkę za pomocą cienkich kleszczy Dumont 5. Teraz użyj drugich cienkich kleszczyków Dumont 5, aby docisnąć siatkówkę i całkowicie usunąć ciało szkliste. Przenieś siatkówki, przeciąć około 2,5 centymetra końcówki sterylnej pipety transferowej, aby zwiększyć średnicę.Teraz, korzystając z tej wskazówki, podnieś całe siatkówki bez uszkadzania tkanki i przenieś je do nowej sterylnej szalki Petriego z zimnym HBSS i kołysz szalką. Następnie, używając nowej sterylnej pipety do transferu, ostrożnie dociśnij siatkówkę, aby zmyć komórki nabłonka barwnikowego siatkówki. Natychmiast umieść izolowaną siatkówkę w nowej, czystej studzience z 24-dołkowej płytki wypełnionej jednym mililitrem HBSS, trzymając 24-dołkową płytkę na lodzie podczas sekcji.Przygotować mieszaninę dysocjacyjną papainy DNazy I zgodnie z opisem w manuskrypcie. Teraz za pomocą pipety do przenoszenia z powiększoną końcówką podnieś siatkówki. Poczekaj, aż siatkówki osiądą na dnie końcówki i uwolnij siatkówki bez nadmiernego HBSS do probówki zawierającej mieszaninę Papainy DNazy I.Następnie umieść probówkę na nutatorze w inkubatorze i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie oddziel komórki, ostrożnie pipetując w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Po dysocjacji komórek dodaj 275 mikrolitrów inhibitora proteazy jajowatej z zestawu do dysocjacji papainy, aby zneutralizować papainę i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół.Umieść probówki w wirówce i wiruj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez osiem minut przy względnej sile odśrodkowej 300. Dodaj naskórkowy czynnik wzrostu do obliczonej objętości pożywki podgrzanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki.Nie dotykając osadu znajdującego się na dnie probówki, usunąć supernatant ostrożnie i całkowicie. Teraz ponownie zaswoić osad komórkowy za pomocą 500 mikrolitrów pożywki wzrostowej uzupełnionej naskórkowym czynnikiem wzrostu. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do jednego dołka z oznakowanej płytki 12-dołkowej.Przepłucz probówkę kolejnymi 500 mikrolitrami pożywki wzrostowej uzupełnionej naskórkowym czynnikiem wzrostu i dodaj ją do studzienki. Ostrożnie kołysz płytką studzienki, a następnie umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z dwutlenkiem węgla. Zacznij od sprawdzenia zbieżności komórek od 90% do 100%.Następnie usuń pożywkę i dodaj jeden mililitr zimnego HBSS, aby dobrze umyć. Delikatnie kołysz płytką i usuń HBSS bez pozostawiania śladów. Później dodaj 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanego roztworu zawierającego trypsynę, aby odłączyć komórki od studzienki.Delikatnie kołysz i inkubuj przez dwie minuty w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po przeniesieniu płytki z inkubatora do szafy bezpieczeństwa biologicznego, należy zassać roztwór zawierający trypsynę, przechylając ją. Kilkakrotnie rozprowadź go ostrożnie i powoli w studzience, aż komórki całkowicie się oderwą.Następnie przenieś tę zawiesinę komórek do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra i włóż probówki do wirówki. Wiruj z prędkością 300 razy g przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i włóż probówki z powrotem do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Usunąć sklarowany osad bez dotykania osadu.Teraz ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy, dodając 600 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej i pipetując w górę iw dół około 30 do 40 razy. Na koniec wysiew 100 mikrolitrów otrzymanej zawiesiny komórek w środku sześciu powlekanych szkiełek nakrywkowych płytki 24-dołkowej. Umieść płytkę w inkubatorze i pozwól komórkom osiąść do późniejszej transfekcji za pomocą mimików mikro RNA.Rysunek przedstawia warunki kontrolne pięć dni po transfekcji z kilkoma obecnymi komórkami Ascl1-pomidorowo-dodatnimi. Jednak po leczeniu miR-25 znajduje się znacznie więcej komórek Ascl1-pomidorowo-dodatnich. Kwantyfikacja wykazała czterokrotny wzrost liczby komórek dodatnich Ascl1-Tomato w studzienkach poddanych działaniu miR-25 w porównaniu z grupą kontrolną.Co najważniejsze, zdecydowana większość komórek Ascl1-pomidorowo-dodatnich znalezionych w studzienkach traktowanych riR-25 przyjęła morfologię neuronalną. Cechy tej morfologii neuronalnej obejmowały zmniejszony rozmiar somy komórek, rozwój drobnych procesów i tworzenie maleńkich sieci. Kwantyfikacja wykazała, że około 70% wszystkich komórek dodatnich Ascl1-Tomato miało cechy neuronalne.Znakowanie immunofluorescencyjne pokazuje, że komórki Ascl1-Tomato dodatnie o morfologii neuronów wyrażają markery neuronalne OTX2 i MAP2, potwierdzając tożsamość neuronalną. Kwantyfikacja tych komórek wykazała, że po nadekspresji miR-25 obecnych jest około 40 dodatnich neuronów Ascl1-Tomato na pole, w porównaniu z pięcioma komórkami neuronalnymi na pole w kontrolach. Zidentyfikowane komórki neuronalne stanowią około 70% całkowitej populacji komórek Ascl1-Tomato dodatnich w próbkach poddanych działaniu miR-25.Ponadto kwantyfikacja bezwzględnej liczby neuronów koeksprymujących OTX2 i MAP2 wykazała, że po leczeniu miR-25 znaleziono około 60 neuronów na pole w porównaniu do 10 neuronów na pole w grupie kontrolnej. Konieczne jest stosowanie pracy w czystym i zdezynfekowanym środowisku przy użyciu czystych i sterylnych narzędzi oraz ostrożna praca polegająca na unikaniu surowego traktowania. Dalsze zastosowania mogą obejmować na przykład kwantyfikację białek, analizę DNA lub RNA lub badania elektrofizjologiczne.Technika ta pomogła nam zgłębić wstępne pytania dotyczące przeprogramowania jądrowego, które należy do dziedziny medycyny regeneracyjnej. Istnieje wiele czynników i warunków, które można przetestować, aby zbadać nowe pytania.

primary-cell-cultures-to-study-regeneration-potential-murine-mller

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film pokazuje izolację i hodowlę komórek progenitorowych móżdżku z móżdżku móżdżku. Progenitorzy neuronów ziarnistości móżdżku są izolowane i oczyszczane poprzez adhezję różnicową, skutecznie usuwając astrocyty. Ci wyhodowani przodkowie następnie różnicują się w neurony ziarniste móżdżku.

Izolowanie i hodowla mysich progenitorów neuronów ziarnistych móżdżku

Ten film pokazuje hodowlę komórek glejowych Müllera (MG) wyizolowanych z siatkówki myszy. Siatkówki są dysocjowane w zawiesinę jednokomórkową za pomocą enzymów trawiennych. Komórki są następnie hodowane w pożywce z czynnikiem wzrostu, który sprzyja proliferacji komórek MG i śmiertelności komórek neuronalnych. Martwe komórki neuronalne są usuwane podczas pasażowania, a komórki MG są hodowane w celu dalszej analizy.

Ustanowienie hodowli komórek glejowych Müllera uzyskanej z siatkówki myszy

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli pierwotnych mieszanych komórek glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłej myszy. Protokół obejmuje enzymatyczne trawienie tkanki, a następnie usunięcie uszkodzonych błon komórkowych i resztek mieliny w celu uzyskania populacji pojedynczej komórki. Komórki są następnie hodowane w pożywkach zoptymalizowanych pod kątem wzrostu mieszanych komórek glejowych.

Ustanawianie pierwotnych mieszanych kultur komórek glejowych z rdzenia kręgowego myszy

Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego.  Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.

Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Wysiłki zmierzające do szczegółowego zrozumienia funkcji mikrogleju zostały utrudnione przez brak modeli hodowli mikrogleju, które podsumowują właściwości dojrzałego mikrogleju in vivo. Protokół ten opisuje podejście oparte na izolacji i hodowli, mające na celu utrzymanie solidnego przetrwania wysoce rozgałęzionego dojrzałego mikrogleju szczurów w warunkach o zdefiniowanej pożywce.

Izolacja i hodowla mikrogleju gryzoni w celu promowania dynamicznej, rozgałęzionej morfologii w pożywce wolnej od surowicy

Prezentujemy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej gleju otoczającego węch (OEG) po uszkodzeniu neuronalnym. Opiera się na kokulturze aksotomijnych dorosłych neuronów zwojowych siatkówki (RGN) na monowarstwach OEG, a następnie badaniu regeneracji aksonów, poprzez analizę markerów aksonalnych i somatodendrytycznych RGN.

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Ten protokół prezentuje unikalny sposób generowania kultur komórkowych ośrodkowego układu nerwowego z embrionalnych mózgów myszy w 17. dniu do badań neuro(immunologicznych). Model ten można analizować przy użyciu różnych technik eksperymentalnych, w tym RT-qPCR, mikroskopii, ELISA i cytometrii przepływowej.

Ustanowienie mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych z embrionalnych mózgów myszy w celu zbadania infekcji i odporności wrodzonej

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół izolowania komórek Müllera glejowych siatkówki od oczu myszy. Protokół rozpoczyna się od enukleacji i sekcji oczu myszy, po której następuje izolacja, wysiew i hodowla komórek Müllera.

Izolacja pierwotnych komórek glejowych Müllera siatkówki myszy

Poznaj pierwotne hodowle komórkowe gleju Müllera myszy w celu badania regeneracji siatkówki po leczeniu mikroRNA. Ta metoda umożliwia testowanie kandydatów mikroRNA przed zastosowaniem in vivo.

Pierwotne hodowle komórkowe w celu zbadania potencjału regeneracyjnego mysiego gleju Müllera po leczeniu mikroRNA

Przeglądaj więcej filmów