Pierwotne hodowle komórkowe w celu zbadania potencjału regeneracyjnego mysiego gleju Müllera po leczeniu mikroRNA

Protokół ten pozwala na zbadanie potencjału i zdolności gleju Müllera do przekształcania się w komórki progenitorowe siatkówki po leczeniu określonymi czynnikami, takimi jak mikroRNA. Zaletą tej techniki jest to, że kandydaci na mikroRNA mogą być testowani pod kątem ich skuteczności i wyników przed ich użyciem w zastosowaniach in vivo. W demonstracji procedury pomoże Seoyoung Kang, doktorantka z laboratorium Stefanie Wohl.

Najpierw zanurz na krótko usuniętą gałkę oczną w tubce z etanolem, aby uniknąć przeniesienia bakterii ze zwierzęcia. Następnie krótko umyj gałkę oczną na 10-centymetrowej szalce Petriego przed umieszczeniem jej na 24-dołkowej płytce na lodzie. Po usunięciu i oczyszczeniu gałek ocznych umieść jedno oko w naczyniu preparacyjnym umieszczonym pod mikroskopem preparacyjnym ze źródłem światła.

Teraz napraw jedną gałkę oczną, chwytając nerw wzrokowy i otaczającą go tkankę łączną wokół twardówki za pomocą cienkich kleszczyków Dumont 5 i ostrożnie dociśnij ją do naczynia preparacyjnego. Następnie wykonaj otwór w środku rogówki za pomocą igły o rozmiarze 30, aby umożliwić łatwiejszy dostęp nożyczkom żylnym. Następnie wypreparuj rogówkę wokół ciała rzęskowego za pomocą nożyczek żylnych i ostrożnie usuń rogówkę, soczewkę, tęczówkę i ciało szkliste za pomocą cienkich kleszczyków Dumont 5.

Później wypreparuj twardówkę nożyczkami żylnymi, aż do dotarcia do nerwu wzrokowego i ostrożnie usuń siatkówkę za pomocą cienkich kleszczy Dumont 5. Teraz użyj drugich cienkich kleszczyków Dumont 5, aby docisnąć siatkówkę i całkowicie usunąć ciało szkliste. Przenieś siatkówki, przeciąć około 2,5 centymetra końcówki sterylnej pipety transferowej, aby zwiększyć średnicę.

Teraz, korzystając z tej wskazówki, podnieś całe siatkówki bez uszkadzania tkanki i przenieś je do nowej sterylnej szalki Petriego z zimnym HBSS i kołysz szalką. Następnie, używając nowej sterylnej pipety do transferu, ostrożnie dociśnij siatkówkę, aby zmyć komórki nabłonka barwnikowego siatkówki. Natychmiast umieść izolowaną siatkówkę w nowej, czystej studzience z 24-dołkowej płytki wypełnionej jednym mililitrem HBSS, trzymając 24-dołkową płytkę na lodzie podczas sekcji.

Przygotować mieszaninę dysocjacyjną papainy DNazy I zgodnie z opisem w manuskrypcie. Teraz za pomocą pipety do przenoszenia z powiększoną końcówką podnieś siatkówki. Poczekaj, aż siatkówki osiądą na dnie końcówki i uwolnij siatkówki bez nadmiernego HBSS do probówki zawierającej mieszaninę Papainy DNazy I.

Następnie umieść probówkę na nutatorze w inkubatorze i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie oddziel komórki, ostrożnie pipetując w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Po dysocjacji komórek dodaj 275 mikrolitrów inhibitora proteazy jajowatej z zestawu do dysocjacji papainy, aby zneutralizować papainę i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół.

Umieść probówki w wirówce i wiruj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez osiem minut przy względnej sile odśrodkowej 300. Dodaj naskórkowy czynnik wzrostu do obliczonej objętości pożywki podgrzanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki.

Nie dotykając osadu znajdującego się na dnie probówki, usunąć supernatant ostrożnie i całkowicie. Teraz ponownie zaswoić osad komórkowy za pomocą 500 mikrolitrów pożywki wzrostowej uzupełnionej naskórkowym czynnikiem wzrostu. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do jednego dołka z oznakowanej płytki 12-dołkowej.

Przepłucz probówkę kolejnymi 500 mikrolitrami pożywki wzrostowej uzupełnionej naskórkowym czynnikiem wzrostu i dodaj ją do studzienki. Ostrożnie kołysz płytką studzienki, a następnie umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z dwutlenkiem węgla. Zacznij od sprawdzenia zbieżności komórek od 90% do 100%.

Następnie usuń pożywkę i dodaj jeden mililitr zimnego HBSS, aby dobrze umyć. Delikatnie kołysz płytką i usuń HBSS bez pozostawiania śladów. Później dodaj 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanego roztworu zawierającego trypsynę, aby odłączyć komórki od studzienki.

Delikatnie kołysz i inkubuj przez dwie minuty w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po przeniesieniu płytki z inkubatora do szafy bezpieczeństwa biologicznego, należy zassać roztwór zawierający trypsynę, przechylając ją. Kilkakrotnie rozprowadź go ostrożnie i powoli w studzience, aż komórki całkowicie się oderwą.

Następnie przenieś tę zawiesinę komórek do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra i włóż probówki do wirówki. Wiruj z prędkością 300 razy g przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i włóż probówki z powrotem do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Usunąć sklarowany osad bez dotykania osadu.

Teraz ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy, dodając 600 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej i pipetując w górę iw dół około 30 do 40 razy. Na koniec wysiew 100 mikrolitrów otrzymanej zawiesiny komórek w środku sześciu powlekanych szkiełek nakrywkowych płytki 24-dołkowej. Umieść płytkę w inkubatorze i pozwól komórkom osiąść do późniejszej transfekcji za pomocą mimików mikro RNA.

Rysunek przedstawia warunki kontrolne pięć dni po transfekcji z kilkoma obecnymi komórkami Ascl1-pomidorowo-dodatnimi. Jednak po leczeniu miR-25 znajduje się znacznie więcej komórek Ascl1-pomidorowo-dodatnich. Kwantyfikacja wykazała czterokrotny wzrost liczby komórek dodatnich Ascl1-Tomato w studzienkach poddanych działaniu miR-25 w porównaniu z grupą kontrolną.

Co najważniejsze, zdecydowana większość komórek Ascl1-pomidorowo-dodatnich znalezionych w studzienkach traktowanych riR-25 przyjęła morfologię neuronalną. Cechy tej morfologii neuronalnej obejmowały zmniejszony rozmiar somy komórek, rozwój drobnych procesów i tworzenie maleńkich sieci. Kwantyfikacja wykazała, że około 70% wszystkich komórek dodatnich Ascl1-Tomato miało cechy neuronalne.

Znakowanie immunofluorescencyjne pokazuje, że komórki Ascl1-Tomato dodatnie o morfologii neuronów wyrażają markery neuronalne OTX2 i MAP2, potwierdzając tożsamość neuronalną. Kwantyfikacja tych komórek wykazała, że po nadekspresji miR-25 obecnych jest około 40 dodatnich neuronów Ascl1-Tomato na pole, w porównaniu z pięcioma komórkami neuronalnymi na pole w kontrolach. Zidentyfikowane komórki neuronalne stanowią około 70% całkowitej populacji komórek Ascl1-Tomato dodatnich w próbkach poddanych działaniu miR-25.

Ponadto kwantyfikacja bezwzględnej liczby neuronów koeksprymujących OTX2 i MAP2 wykazała, że po leczeniu miR-25 znaleziono około 60 neuronów na pole w porównaniu do 10 neuronów na pole w grupie kontrolnej. Konieczne jest stosowanie pracy w czystym i zdezynfekowanym środowisku przy użyciu czystych i sterylnych narzędzi oraz ostrożna praca polegająca na unikaniu surowego traktowania. Dalsze zastosowania mogą obejmować na przykład kwantyfikację białek, analizę DNA lub RNA lub badania elektrofizjologiczne.

Technika ta pomogła nam zgłębić wstępne pytania dotyczące przeprogramowania jądrowego, które należy do dziedziny medycyny regeneracyjnej. Istnieje wiele czynników i warunków, które można przetestować, aby zbadać nowe pytania.