Ablacja za pośrednictwem nitroreduktazy/metronidazolu oraz platforma MATLAB (RpEGEN) do badania regeneracji nabłonka barwnikowego siatkówki danio pręgowanego

Danio pręgowany jest wyjątkowy ze względu na swoją wewnętrzną zdolność do regeneracji wielu różnych typów tkanek, w tym RPE. Protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji szlaków molekularnych, które napędzają regenerację RPE i mechanizmy związane z chorobą RPE. Podstawową zaletą tej metodologii jest wszechstronność.

Oprócz badania regeneracji RPE, protokół ten może być wykorzystany do badania procesów zwyrodnieniowych RPE i wpływu uszkodzenia RPE na sąsiednie tkanki w oku. Ssaki, w tym ludzie, nie są w stanie naprawić dużych urazów RPE wynikających z urazu lub choroby zwyrodnieniowej. Wykorzystanie danio pręgowanego jako narzędzia do odkrywania czynników proregeneracyjnych RPE jest znaczącym krokiem w kierunku promowania regeneracji RPE u ssaków.

Aby przygotować świeży 10-milimolowy roztwór MTZ, pięć dni po zapłodnieniu, dodaj proszek MTZ do wody systemowej bez PTU i dokładnie wymieszaj przez energiczne wstrząsanie przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Schłodzić 10-milimolowy roztwór MTZ przez godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze stołowym lub wytrząsarce. Aby przebadać larwy danio pręgowanego przed transgenem rpe65a:nsfB-eGFP, należy oddzielić transgeniczne larwy eGFP dodatnie od nietransgenicznych larw eGFP ujemnych za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego z laserem wzbudzającym o długości 488 nanometrów.

Natychmiast obudź przesiane larwy poprzez pipetowanie bezpośrednio na szalkę Petriego ze świeżym 1,5X PTU bez tricainy. Po zakończeniu badań przesiewowych należy następnie podzielić larwy eGFP dodatnie na dwie grupy szalek Petriego, jedną grupę, która ma otrzymać leczenie MTZ, a drugą grupę kontrolną bez ablacji. Następnie należy przeprowadzić ablację nabłonka barwnikowego siatkówki, usuwając 1,5 X PTU z ablowanych naczyń zabiegowych i dodać świeżo przygotowany 10-milimolowy roztwór MTZ.

Usuń również 1.5X PTU z nieablowanych naczyń kontrolnych i dodaj świeżą wodę systemową bez PTU. Usuń 10-milimolowy roztwór MTZ dokładnie po 24 godzinach i dodaj świeżą wodę systemową bez PTU. Wymień świeżą wodę systemową bez PTU na ujemnych naczyniach MTZ.

Przebadaj larwy eGFP dodatnie cztery dni po zapłodnieniu. eGFP jest widoczny cztery dni po zapłodnieniu, ale wydaje się ciemniejszy niż intensywność sygnału w piątym dniu. Umieścić larwy eGFP dodatnie na płytkach sześciodołkowych zamiast na szalkach Petriego w gęstości nie większej niż 10 larw na studzienkę w celu leczenia farmakologicznego.

Wyznaczyć oddzielne płytki sześciodołkowe dla larw poddanych ablacji i niepoddanych ablacji. Określić objętość 15 mikromolowych IWR-1 lub wymaganych do objętości wstępnych zabiegów kontrolnych DMSO i odpowiednio poddzielić 1,5X PTU do stożkowych rurek. Dodaj zapas IWR-1 do 1,5X PTU, aby uzyskać końcowe stężenie 15 mikromolowych IWR-1.

Dodaj dopasowaną objętość materiału DMSO do 1.5X PTU. Dobrze wymieszaj przez wirowanie i wizualnie potwierdź rozpuszczenie związków. Usuń 1,5X PTU z larw eGFP dodatnich na płytkach sześciodołkowych i dodaj pięć mililitrów na studzienkę świeżo przygotowanych 0,06% DMSO lub 15 mikromolowych zabiegów IWR-1.

Wykonaj ablację RPE następnego dnia. W ciągu pięciu dni po zapłodnieniu należy określić objętość zabiegów farmakologicznych i kontroli nośnika potrzebnych zarówno dla nieablowanych, jak i ablowanych płytek sześciodołkowych i podać odpowiednie objętości świeżej wody systemowej bez PTU lub 10-milimolowego roztworu MTZ do stożkowych probówek. Dodaj roztwory podstawowe IWR-1 i DMSO do odpowiednich rurek stożkowych, jak wykonano poprzednio.

Dobrze wymieszaj przez wirowanie i wizualnie potwierdź rozpuszczenie związków. Usuń 0,06% DMSO i 15 mikromolowych zabiegów wstępnych IWR-1 w 1,5X PTU z wyznaczonych nieablowanych i ablowanych płytek sześciodołkowych. Uzupełnić odpowiednią świeżą wodą systemową bez zabiegów roztworami PTU i MTZ.

Usunąć 0,06% DMSO i 15 mikromolowych zabiegów IWR-1 w 10-milimolowym roztworze MTZ dokładnie po 24 godzinach i uzupełnić zabiegami w świeżej wodzie systemowej bez PTU. Uzupełnij 0,06% DMSO i 15 mikromolowych zabiegów IWR-1 w słodkiej wodzie systemowej bez PTU na nieablowanej płytce sześciodołkowej. Monitorowanie powodzenia i zakresu ablacji in vivo przy użyciu oświetlenia światłem przechodzącym pod mikroskopem stereoskopowym w celu utrzymania larw po ablacji genetycznej.

Aby wygenerować obszar zainteresowania RPE lub ROI przy użyciu Fidżi, otwórz ośmiobitowy obraz TIFF, zmień orientację obrazu tak, aby strona grzbietowa była podniesiona, a dystalna w lewo, wybierając obraz, przekształć i odwróć w poziomie. W przypadku ostatniego polecenia wybierz opcję, która najlepiej odpowiada kierunkowości potrzebnej dla tego obrazu. Uruchom menedżera ROI, wybierając analizę, narzędzia, menedżera ROI.

Korzystaj z obrazu, powiększania i przełączania między kanałami DAPI i Brightfield. Używaj skrótów klawiaturowych, aby zwiększyć wydajność. Zidentyfikuj punkt, w którym wierzchołkowa strona RPE przylega do końcówki zewnętrznej błony ograniczającej i użyj tego anatomicznego punktu orientacyjnego jako punktu wyjścia ROI.

Utwórz ROI RPE za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów na pasku narzędzi Fidżi, korzystając zarówno z kanałów obrazu DAPI, jak i Brightfield, a także funkcji powiększania obrazu, aby zidentyfikować wierzchołkowe i podstawowe granice RPE. Doprowadź grzbietowe i brzuszne końce ROI do ostrego punktu, zamiast stępiać się lub zaokrąglać. Dodaj ROI, klikając dodaj w menedżerze ROI.

Zapisz plik ROI, wybierając więcej i zapisz w menedżerze ROI. Kliknij dwukrotnie rpegen. m, aby otworzyć go w okienku edytora.

W sekcji zmiennej zdefiniowanej przez użytkownika w pliku rpegen. m wprowadź lokalizacje katalogów zawierających pliki ROI, pliki obrazów TIFF oraz miejsca, w których mają być zapisywane pliki wyjściowe. Wprowadź nazwę grupy pliku mat, który ma zostać wyeksportowany, oraz lokalizację kanału Brightfield w stosie obrazów TIFF.

Uruchom skrypt, klikając przycisk uruchamiania w menu edytora w górnej części programu MATLAB. Po zapisaniu pliku MAT pojawi się rysunek z trzema panelami, który zostanie również zapisany jako plik PDF w katalogu wyjściowym dla każdego uruchomienia obrazu. Poczekaj, aż te pliki PDF kontroli jakości zostaną zapisane w folderze wyjściowym, a ostatni rysunek zniknie.

Otwórz poszczególne pliki PDF i sprawdź, czy wszystkie zwroty akcji są zgodne z obrazami Brightfield. Kliknij dwukrotnie rpegen_permplot. m, aby otworzyć go w nowej karcie edytora.

W sekcji zmienne zdefiniowane przez jednego użytkownika wprowadź lokalizację katalogu dla folderu wyjściowego zawierającego pliki MAT z uruchomienia skryptu rpegen. m. Wprowadź każdą nazwę pliku MAT, który ma zostać załadowany.

Uruchom tę sekcję skryptu, klikając przycisk uruchom sekcję w menu edytora. W sekcji drugiej wprowadź nazwy dwóch grup do porównania statystycznego w zmiennych danych A i danych B oraz wyznacz liczbę powtórzeń symulacji permutacji w zmiennej powtórzeń. W tym pokazie użyto tylko 2 000 powtórzeń, aby skrócić czas przetwarzania.

Uruchom tę sekcję skryptu, klikając przycisk uruchom sekcję w menu edytora. Uruchamiaj wykresy skupień i grupuj wyniki mapy skupień oraz sekcje wartości P niezależnie za pomocą przycisku Uruchom sekcję. Całe uszkodzenie wierzchowca larwy w ciągu pięciu dni po zapłodnieniu wykazało jasną ekspresję transgenu w RPE w czasie badania przesiewowego w kierunku ablacji genetycznej.

Kriosekcja poprzeczna larwy bez ablacji w ciągu sześciu dni po zapłodnieniu wykazała, że ekspresja transgenu była ograniczona do dojrzałych komórek RPE, a najjaśniejsza ekspresja ograniczała się do centralnej 2/3 RPE. Groty strzałek wskazują mikrokosmki wierzchołkowe. Kriosekcja poprzeczna larwy poddanej ablacji w ciągu jednego dnia po urazie ujawniła zaburzenie morfologii komórek eGFP-dodatnich.

Strzałki wskazują jądra piknotyczne. Całe uszkodzenia wierzchowców larw niepoddanych ablacji w ciągu siedmiu dni po zapłodnieniu wykazywały pigmentację RPE w całym oku, a larwy poddane ablacji w ciągu dwóch dni po urazie wykazywały strefę ablacji bez pigmentu w centralnym RPE. Wykres wygenerowany przy użyciu RpEGEN wykazał podobieństwo między nieablowanymi dziewięciodniowymi grupami DMSO i IWR-1 po zapłodnieniu na całej długości RPE.

Wykres wykazał ogólną jaśniejszą intensywność pikseli w grupach DMSO i IWR-1 po ablacji, które wydawały się najjaśniejsze w grupach po ablacji IWR-1 w porównaniu z jakąkolwiek inną grupą leczoną. Różnice w pigmentacji centralnego RPE były znaczące w porównaniu larw poddanych ablacji IWR-1 z kontrolami poddanymi ablacji DMSO. Korzystając z tego paradygmatu ablacji danio pręgowanego, byliśmy w stanie zidentyfikować kilka molekularnych szlaków sygnałowych, takich jak sygnalizacja wiatru, którą pokazaliśmy tutaj, które są krytycznymi regulatorami regeneracji RPE.