Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej
28 kwietnia 2022
Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.
Rozpraszanie wsteczne neutronów mierzy globalną dyfuzję i wewnętrzną dynamikę białek i wody hydratacyjnej bez uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem. Spektroskopia neutronowa jednocześnie uzyskuje dostęp do korelacji przestrzennych i czasowych na poziomie molekularnym. W przypadku miękkiej materii i materiałów biologicznych szczególnie interesujące jest uzyskanie pośrednich informacji na temat lokalnego porządku w tych systemach zaburzeń dalekiego zasięgu.
Tak więc rozpraszanie wsteczne neutronów może być wykorzystane do badania dynamiki w biologii, chemii lub sensie materialnym. Kolejną ważną dziedziną jest energetyka, w ramach której prowadzone są na przykład badania nad bateriami i ogniwami paliwowymi. Rozpraszanie wsteczne neutronów zostało z powodzeniem wykorzystane do badania dynamiki molekularnej białek zaangażowanych w choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera i Parkinsona.
Uzyskane wyniki pomagają nam lepiej zrozumieć molekularne cechy charakterystyczne tych patologii i mogą utorować drogę do opracowania lepszej diagnostyki. Aby przygotować uchwyt na próbkę, należy rozpocząć od dokładnego oczyszczenia płaskiego aluminiowego uchwytu na próbkę oraz jego uszczelki z drutu indowego i wodą, a następnie etanolem, a następnie pozostawić do wyschnięcia. Zważ oddzielnie różne części uchwytu próbki, w tym dno, pokrywę i drut indowy, na wadze precyzyjnej.
Umieść jednomilimetrową uszczelkę z drutu indowego w rowku dolnej części uchwytu próbki, pozostawiając niewielką zakładkę w miejscu, w którym łączą się dwa końce. Dodać około 100 miligramów liofilizowanego białka tak, aby wypełniło wewnętrzną powierzchnię dolnej części uchwytu na próbkę. Następnie umieścić uchwyt próbki w eksykatorze z szalką Petriego zawierającą pięciotlenek fosforu w proszku na 24 godziny, aby całkowicie wysuszyć białko w proszku.
Zważyć wysuszoną dolną część uchwytu na próbkę zawierającą uszczelkę indową i wysuszony proszek w celu uzyskania masy wysuszonej próbki. Usunąć pięciotlenek fosforu z eksykatora i umieścić w nim szalkę Petriego z tlenkiem deuteru oraz próbkę w celu uwodnienia proszku. Powtórz suszenie i nawilżanie trzy razy, aby uzyskać pełną wymianę wodoru na deuter.
Regularnie mierz masę proszku, aby sprawdzić poziom nawodnienia, a gdy nawodnienie jest nieco powyżej pożądanego poziomu, poczekaj, aż masa powoli się zmniejszy. Po uzyskaniu pożądanego nawodnienia szybko załóż pokrywkę na dolną część i najpierw zamknij uchwyt próbki czterema, aby zatrzymać wymianę pary. Umieść i dokręć wszystkie pozostałe, aż nie będzie widoczna żadna szczelina między dolną częścią a pokrywą.
Zważyć szczelnie zamknięty uchwyt próbki, aby sprawdzić, czy po eksperymencie z neutronami nie ma potencjalnych strat hydratacji spowodowanych nieszczelnościami. Aby przygotować próbkę w stanie ciekłym, należy rozpuścić białko w zdeuterowanym buforze. Za pomocą wody określić odpowiednią objętość płynu, który należy umieścić w uchwycie na próbki.
Przed przystąpieniem do pracy z jakimkolwiek materiałem należy upewnić się, że dawka promieniowania jonizującego jest mniejsza niż 100 mikrosiwertów na godzinę. Następnie dokładnie osusz patyczek do pobierania próbek i usuń wszelkie poprzednie próbki. Umieść próbkę na patyczku do próbek, sprawdź, czy jest prawidłowo wyśrodkowany względem środka belki i włóż patyczek do próbki do pieca kriogenicznego.
Aby pozyskać dane w Nomad, przejdź do zakładki Wykonanie, a następnie przeciągnij i upuść kontroler kriostatu pieca do launchpada. Ustaw temperaturę na 200 kelwinów. Użyj trybu szybkiego i limitu czasu 30 minut, aby temperatura miała czas na ustabilizowanie się.
Kliknij ikonę odświeżania, aby uruchomić rampę temperatury w tle w celu pobrania danych podczas spadku temperatury. Przeciągnij i upuść kontroler ustawień Dopplera IN16 do launchpada. Ustaw profil prędkości na dokładną prędkość, ustawioną na maksymalną deltę E, przesunięcie energii na 0,00 mikroelektronowoltów, a liczbę kanałów na 128, aby uzyskać elastyczną konfigurację skanowania w oknie stałym.
Przeciągnij i upuść kontroler zliczania do launchpada, wypełnij pole napisów nazwą, która pozwoli na łatwą identyfikację danych i ustaw skany na 30 sekund z 60 powtórzeniami. Następnie przeciągnij i upuść kontroler ustawień Dopplera IN16 do launchpada. Ustaw profil prędkości na sign, set by na prędkość o wartości 4,5 metra na sekundę, a liczbę kanałów na 2048, aby uzyskać konfigurację quasi-elastycznego rozpraszania neutronów.
Przeciągnij i upuść kontroler zliczania i wypełnij pole napisów nazwą, która pozwala na łatwą identyfikację danych. Ustaw skany po 30 minut z czterema powtórzeniami. Aby uzyskać rampę temperatury, przeciągnij i upuść kontroler kriostatu pieca, ustaw temperaturę na 310 kelwinów i ustaw rampę na punkt zastany z deltą 0,05 kelvina na sześć sekund.
Użyj limitu czasu wynoszącego 200 minut. Użyj pętli for z 65 powtórzeniami. Do środka włóż kontroler ustawień dopplera IN16, a następnie kontroler zliczania i ustaw pojedyncze skanowanie na 30 sekund.
Następnie wprowadź ustawienia Dopplera IN16 zgodnie z wcześniejszym opisem, ale przy użyciu przesunięcia energii 1,5 mikroelektronowolta i 1024 kanałów. Następnie włóż kontroler zliczania i ustaw pojedyncze skanowanie na trzy minuty. Aby uzyskać ostatnie quasi-elastyczne rozpraszanie neutronów o temperaturze 312 kelwinów, przeciągnij i upuść ustawienia dopplerowskie IN16 i zlicz kontrolery skonfigurowane tak, jak pokazano wcześniej.
Następnie naciśnij przycisk Start, aby uruchomić skrypt. Skany lizosomów z elastycznym i nieelastycznym stałym oknem wykazały wzrost sygnału przy przenoszeniu niskiego pędu i niskim transferze energii, podczas gdy sygnał przy przenoszeniu wysokiej energii i niskim pędzie zmniejszył się. Początkowy współczynnik dyfuzji środka masy wynosił 15 angstremów do kwadratu na nanosekundę, który następnie wykładniczo zmniejszał się w czasie.
W temperaturach wyższych niż 220 kelwinów woda hydratacyjna wokół włókien tau była znacznie bardziej mobilna niż wokół monomerów tau. Frakcja cząsteczek wody podlegających ruchowi translacyjnemu oraz współczynniki dyfuzji translacyjnej, jak i rotacyjnej cząsteczek wody zostały zwiększone wokół włókien. Stężenie białka powinno wynosić 2000 miligramów na ml lub co najmniej 20 miligramów na ml dla białek białkowych ze względu na ograniczenia rozpraszania wstecznego neutronów wynikające ze strumienia neutronów lub tła bufora uchwytu próbki.
Rozpraszanie wsteczne neutronów zostało ostatnio zastosowane, na przykład, aby zrozumieć, w jaki sposób woda, która jest naturalnym białkiem środowiskowym, może zostać w pełni zastąpiona syntetycznym polimerem do zastosowań biotechnologicznych, takich jak na przykład dostarczanie leków.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Spektroskopia neutronowego rozproszenia wstecznego zapewnia nieniszczącą i bezznakową metodę badania dynamiki białek oraz ich wody hydratacyjnej. Niniejszy artykuł omawia dwa badania skoncentrowane na białkach amyloidowych, a konkretnie rozdzielczą w czasie dynamikę lizozymu podczas agregacji oraz dynamikę wody hydratacyjnej białka tau podczas tworzenia włókien.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Biochemia
Wstęp
- Neutronowe rozpraszanie wsteczne pozwala na pomiar globalnej dyfuzji i dynamiki wewnętrznej białek.
- Umożliwia ono badanie wody hydratacyjnej bez powodowania uszkodzeń radiacyjnych.
- Technika ta jest przydatna w zrozumieniu dynamiki molekularnej w materiałach biologicznych.
- Znajduje zastosowanie w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
Cel badania
- Zbadanie dynamiki białek amyloidowych.
- Zbadanie dynamiki wody hydratacyjnej związanej z agregacją białek.
- Zrozumienie molekularnych mechanizmów leżących u podłoża chorób neurodegeneracyjnych.
Zastosowane metody
- Spektroskopia neutronowego rozproszonego powrotnego
- Pomiary rozdzielcze w czasie
- Analiza agregacji białek
- Badanie dynamiki hydratacji
Główne wyniki
- Charakterystyka dynamiki lizozymu podczas agregacji.
- Wgląd w dynamikę wody hydratacyjnej białka tau.
- Wykazanie skuteczności neutronowego rozpraszania wstecznego w badaniu dynamiki białek.
- Wkład w zrozumienie molekularnych podstaw chorób amyloidowych.
Wnioski
- Rozproszenie neutronów wstecznie jest potężnym narzędziem do badania dynamiki białek.
- Technika ta dostarcza cennych informacji na temat zachowania białek w systemach biologicznych.
- Wyniki mogą pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych dla chorób neurodegeneracyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Spektroskopia neutronowa o wysokiej rozdzielczości umożliwia badania w obszarze biofarmaceutyki&Zespoły D badają dynamikę białek i wody hydratacyjnej w skali od pikosekund do nanosekund, co wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka na wczesnym etapie odkrywania leków. Ta nieniszcząca, bezetykietowa metoda dostarcza ilościowych informacji na temat mobilności molekularnej i agregacji istotnych dla celów terapeutycznych w chorobach neurodegeneracyjnych. Integracja tych pomiarów zwiększa pewność prognostyczną w kluczowych punktach zwrotnych procesu odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach nad biofarmaceutykami&D
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośredni pomiar wewnętrznej dynamiki białek oraz dyfuzji środka masy w celu walidacji celu terapeutycznego.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnianie stanów agregacji i ich sygnatur dynamicznych.
- Dostarcza danych ilościowych służących do opracowania modeli prognostycznych zachowania białek istotnych dla przebiegu choroby.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych próbek białek w celu uzyskania powtarzalnych pomiarów dynamicznych.
- Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe wyniki do kalibracji i benchmarkingu analizy.
- Umożliwia rzetelne porównanie wpływu związków na mobilność białek i skłonność do agregacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane z dynamiki molekularnej z fenotypami istotnymi dla choroby, takimi jak agregacja amyloidu.
- Zapewnia ciągłość procesu od odkryć biofizycznych po wybór i walidację modeli przedklinicznych.
- Dostarcza potencjalnych translacyjnych biomarkerów w oparciu o zmiany w wodzie hydratacyjnej i ruchomości białek.
Integracja potoków i przepływów pracy
Spektroskopia neutronowego rozpraszania wstecznego wpisuje się w kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych, łącząc wczesne badania mechanistyczne z badaniami translacyjnymi w obszarze chorób neurodegeneracyjnych oraz zaburzeń związanych z błędnym fałdowaniem białek.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie dynamiki białek i wody hydratacyjnej w celu wyjaśnienia mechanizmów agregacji oraz ryzyka biologicznego.
- Przesiewanie: Dostarczanie powtarzalnych, ilościowych wyników dla przesiewania związków i opracowywania testów.
- Analityka: Zapewnienie pomiarów współczynników dyfuzji i przejść dynamicznych o wysokiej rozdzielczości do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Powiązanie zmian mobilności molekularnej z fenotypami istotnymi dla choroby i punktami końcowymi badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Utworzenie platformy wielokrotnego użytku do badań dynamicznych dla różnych białek docelowych i formulacji.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne pomiary dynamiczne.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i redukuje ryzyko biologiczne na późniejszych etapach poprzez wczesną minimalizację ryzyka.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i modalności w oparciu o profile dynamiczne z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie spektroskopii neutronowej oraz przygotowania próbek w celu kontroli deuteracji i hydratacji.
- Konieczny jest dostęp do specjalistycznej aparatury, takiej jak spektrometry rozproszenia wstecznego neutronów oraz kriogeniczne środowiska próbek.
- Wymagana jest rygorystyczna standaryzacja protokołów obsługi próbek i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do różnych systemów białkowych może wymagać optymalizacji stężenia oraz warunków buforowych.
- Przepustowość próbek oraz ograniczenia strumienia neutronów mogą ograniczać zastosowania w szeroko zakrojonych badaniach przesiewowych.
