Name: Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj spektroskopię neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki białek amyloidowych i wody hydratacyjnej. Ta metoda pozwala badać mechanizmy chorób neurodegeneracyjnych bez uszkodzeń radiacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Michaeli Zamponi z Jülich Centre for Neutron Science w Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Niemcy, za część eksperymentów z rozpraszaniem neutronów przeprowadzonych na instrumencie SPHERES. Prace te skorzystały z działań konsorcjum Laboratorium Deuteracji (DLAB) finansowanego przez Unię Europejską w ramach umów HPRI-2001-50065 i RII3-CT-2003-505925 oraz z działalności finansowanej przez Brytyjską Radę ds. Badań Inżynieryjnych i Fizycznych (EPSRC) w ramach Institut Laue Langevin EMBL DLAB w ramach grantów GR/R99393/01 i EP/C015452/1. Uznaje się wsparcie ze strony Komisji Europejskiej w ramach 7. programu ramowego w ramach akcji kluczowej: Wzmacnianie europejskiej przestrzeni badawczej, infrastruktura badawcza [umowa 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot i Christian Beck dziękują Federalnemu Ministerstwu Edukacji i Badań Naukowych (BMBF, grant nr 05K19VTB) za sfinansowanie ich stypendiów podoktorskich.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Spektroskopia neutronowa jest jedyną metodą, która pozwala na sondowanie uśrednionej zespołowo dynamiki ps-ns próbek białek, niezależnie od wielkości białka lub złożoności roztworu, gdy stosuje się deuterację6. W szczególności, badając samodyfuzję zespołów białkowych w roztworze, można jednoznacznie określić rozmiar hydrodynamiczny takich zespołów. Niemniej jednak metoda ta jest zwykle ograniczona przez niski strumień neutronów, co oznacza długi czas akwizycji i wymóg dużej ilości próbki (zwykle 1...

Neutron jest bezładunkową i masywną cząstką, która na przestrzeni lat była z sukcesem wykorzystywana do badania próbek w różnych dziedzinach, od fizyki fundamentalnej po biologię1. W zastosowaniach biologicznych szeroko wykorzystuje się rozpraszanie neutronów pod małym kątem, nieelastyczne rozpraszanie neutronów oraz krystalografię i reflektometrię neutronową2,3,4. Nieelastyczne rozpraszanie neutronów zapewnia pomiar dynamiki uśrednionej dla całego zespołu bez konieczności stosowania specyficznego znakowania jako takiego, oraz jakość sygnału, która nie zależy od rozmiaru ani rodzaju białka5.&#160;Pomiar można przeprowadzić w bardzo złożonym środowisku dla badanego białka, które naśladuje środowisko wewnątrzkomórkowe, takim jak deuterowany lizat bakteryjny, a nawet in vivo3,6,7. Do badania dynamiki można wykorzystać różne konfiguracje eksperymentalne, mianowicie: i) pomiar czasu przelotu (time-of-flight), zapewniający dostęp do dynamiki w zakresie sub-ps-ps, ii) rozpraszanie wsteczne (backscattering), zapewniające dostęp do dynamiki w zakresie ps-ns oraz iii) echo spinowe (spin-echo), zapewniające dostęp do dynamiki od ns do setek ns. Rozpraszanie wsteczne neutronów wykorzystuje prawo Bragga 2d sinθ = nλ, gdzie d jest odległością między płaszczyznami w krysztale,&#160;θ to kąt rozpraszania, n to rząd rozpraszania, a&#160;λ to długość fali. Zastosowanie kryształów do rozpraszania wstecznego w kierunku detektorów pozwala na osiągnięcie wysokiej rozdzielczości energetycznej, zazwyczaj ~0.8 µeV. Aby zmierzyć wymianę energii, stosuje się albo napęd Dopplera przenoszący kryształ w rozpraszaniu wstecznym w celu zdefiniowania i dostrojenia długości fali neutronów dopływających8,9,10 (Rysunek 1), albo konfigurację czasu przelotu kosztem obniżenia rozdzielczości energetycznej11.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63664/63664fig01.jpg" /> 
Rycina 1Schemat spektrometru neutronowego z rozpraszaniem wstecznym z napędem Dopplera. Wiązka wpadająca uderza w przerywacz (chopper) transformacji przestrzeni fazowej (PST).42, co zwiększa strumień w położeniu próbki. Następnie jest on rozpraszany wstecznie w kierunku próbki przez układ Dopplera, który wybiera energię E1 (cyjanowa strzałka). Neutrony są następnie rozpraszane przez próbkę (różne energie są reprezentowane przez kolory strzałek), a analizatory wykonane z kryształów Si 1 będą rozpraszać wstecznie jedynie neutrony o określonej energii E0 (tutaj strzałki koloru czerwonego). Zatem przekazanie pędu Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. otrzymuje się z wykrytej pozycji neutronu na matrycy detektorów, a transfer energii z różnicy E1- E0Czas przelotu oczekiwany dla impulsu neutronów wytworzonego przez PST jest wykorzystywany do odrzucenia sygnału z neutronów rozproszonych bezpośrednio w kierunku rurek detektora. Skrót: PST = transformacja przestrzeni fazowej (phase space transformation). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63664/63664fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
W przypadku spektroskopii rozproszenia wstecznego głównym wkładem w sygnał z próbek bogatych w protony wodoru, takich jak białka, jest rozproszenie niespójne, dla którego intensywność rozproszenia Sinc(q, ω) przedstawiono w rów. (1)12
<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq01.jpg" style="margin: auto;" /> (1)
Gdzie σinc to niekoherentny przekrój czynny rozpraszania rozważanego pierwiastka, k' to norma wektora falowego fali rozproszonej, k norma wektora falowego fali padającej, q (= k - k') to przekaz pędu, rj(t) wektor położenia atomu j w czasie t, a&#160;ω częstotliwość odpowiadająca transferowi energii między neutronem padającym a układem. Nawiasy kątowe oznaczają średnią ansamblową. Zatem rozpraszanie niekoherentne bada średnią ansamblową autokorelację pozycji pojedynczej cząstki w czasie i dostarcza informacji o autodynamice uśrednionej dla wszystkich atomów w układzie oraz różnych momentów początkowych (średnia ansamblowa). Funkcja rozpraszania jest transformatą Fouriera w czasie pośredniej funkcji rozpraszania I(q, t), którą można traktować jako transformatę Fouriera w przestrzeni funkcji korelacji van Hove’a przedstawionej w równaniu (2):
<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq02.jpg" style="margin: auto;" /> (2)
Gdzie ρ(r,t) jest gęstością prawdopodobieństwa znalezienia atomu w pozycji r i czasie t13.
W przypadku procesu dyfuzji fickiowskiej, wyniki funkcji samodyfuzji (patrz równanie (3)) po podwójnej transformacji Fouriera w funkcji rozpraszania sprowadzają się do rozkładu Lorentza o szerokości linii określonej przez γ = Dq2.
<img alt="Równanie 10" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq10.jpg" style="margin: auto;" /> (3)
Opracowano i uznano za przydatne bardziej zaawansowane modele, takie jak model dyfuzji skokowej Singwiego i Sjölandera dla wewnętrznej dynamiki białek w skali ps-ns14 lub model rotacyjny Searsa dla wody hydratacyjnej15,16,17.
Na instrumencie do neutronowego rozpraszania wstecznego (NBS) IN16B8,9 w ILL w Grenoble we Francji (Rycina uzupełniająca S1), konfiguracja powszechnie stosowana w przypadku białek składa się z kryształów Si 1 dla analizatorów z napędem Dopplera służącym do dostrajania długości fali padającej (Rycina dodatkowa S2A), zapewniając tym samym dostęp do zakresu przekazu pędu ~0,2 &#197;-1 &#60; q &#60; ~2 &#197;-1 or zakres przenoszenia energii wynoszący -30 &#181;eV &#60; <img alt="Równanie 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;" /> &#60; 30 &#181;eV– odpowiadające przedziałom czasowym od kilku ps do kilku ns oraz odległościom rzędu kilku &#197;Dodatkowo instrument IN16B umożliwia przeprowadzanie elastycznego i nieelastycznego skanowania w stałym oknie (E/IFWS).10które obejmują akwizycję danych przy ustalonym transferze energii. Ponieważ strumień neutronów jest ograniczony, metoda E/IFWS pozwala na maksymalizację strumienia dla jednego transferu energii, co skraca czas akwizycji niezbędny do uzyskania satysfakcjonującego stosunku sygnału do szumu. Nowszą opcją jest tryb spektrometru rozproszonego wstecznie i czasu przelotu (BATS)11, co pozwala na pomiar szerokiego zakresu transferów energii (np. -150 &#181;eV &#60; <img alt="Równanie 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;" /> &#60; 150 &#181;eV), przy wyższym strumieniu niż w przypadku napędu Dopplera, jednak kosztem niższej rozdzielczości energetycznej (Rycina uzupełniająca S2B).
Ważną właściwością rozpraszania neutronów jest to, że przekrój czynny na rozpraszanie niespójne&#160;σinc jest 40 razy większy dla wodoru niż dla deuteru i jest pomijalny dla innych pierwiastków powszechnie występujących w próbkach biologicznych. W związku z tym dynamikę białek w środowisku ciekłym można badać, stosując bufor zdeuterylowany, natomiast stan proszkowy pozwala na badanie albo wewnętrznej dynamiki białek przy użyciu uwodornionego proszku białkowego hydratyzowanego D2O, albo badanie wody hydratacyjnej dla całkowicie zdeuterylowanego proszku białkowego hydratyzowanego H2O. W stanie ciekłym rozpraszanie neutronów wstecznych zazwyczaj pozwala na jednoczesny dostęp do samodyfuzji środka masy białek (dyfuzja typu Fickowskiego) oraz ich dynamiki wewnętrznej. Ta druga obejmuje ruchy szkieletu i łańcuchów bocznych, zazwyczaj opisywane tzw. modelem dyfuzji skokowej lub innymi modelami3,18. W uwodornionych proszkach białkowych dyfuzja białek nie występuje i modelowana musi być jedynie dynamika wewnętrzna. W przypadku wody hydratacyjnej wkłady ruchów translacyjnych i rotacyjnych cząsteczek wody wykazują inną zależność od przeniesienia pędu q, co pozwala na ich rozróżnienie w procesie analizy danych17.
Niniejsza praca ilustruje metodę rozproszonego neutronowego powrotnego z wykorzystaniem badania białek, które wykazują zdolność do rozwijania się, agregowania w kanoniczną formę składającą się ze stosów pasm β — tzw. wzoru cross-β19,20 — oraz tworzenia wydłużonych włókien. Jest to tzw. agregacja amyloidowa, która jest szeroko badana ze względu na jej kluczową rolę w schorzeniach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera czy Parkinsona21,2. Badania nad białkami amyloidowymi są również motywowane funkcjonalną rolą, jaką mogą one pełnić23,24, lub ich wysokim potencjałem w opracowywaniu nowych biomateriałów25. Fizykochemiczne uwarunkowania agregacji amyloidowej pozostają niejasne i mimo ogromnego postępu w ostatnich latach, nie opracowano ogólnej teorii agregacji amyloidów21,26.
Agregacja amyloidów wiąże się ze zmianami w strukturze i stabilności białka w czasie, których badanie naturalnie obejmuje dynamikę powiązaną ze stabilnością konformacyjną białka, jego funkcją oraz krajobrazem energetycznym białka27. Dynamika jest bezpośrednio powiązana ze stabilnością konkretnego stanu poprzez wkład entropowy w przypadku najszybszych ruchów28, a funkcja białka może być podtrzymywana przez ruchy w różnych skalach czasowych: od sub-ps dla białek światłoczułych29 do ms dla ruchów domen, które mogą być wspomagane przez dynamikę w skali pikosekund i nanosekund30.
Przedstawione zostaną dwa przykłady wykorzystania spektroskopii neutronowego rozpraszania wstecznego do badania białek amyloidowych: jeden w stanie ciekłym w celu analizy dynamiki białek oraz drugi w stanie uwodnionego proszku w celu zbadania dynamiki wody hydratacyjnej. Pierwszy przykład dotyczy agregacji lizozymu w sfery o rozmiarach µm (tzw. cząsteczki), śledzonej w czasie rzeczywistym5, a drugi porównania dynamiki wody w stanach natywnym i zagregowanym ludzkiego białka tau31.
Lizozym jest enzymem uczestniczącym w obronie immunologicznej, składającym się ze 129 reszt aminokwasowych. Lizozym może tworzyć cząstki w buforze deuterowanym przy pD 10,5 i temperaturze 90 °C. Za pomocą rozpraszania neutronów wykazaliśmy, że ewolucja czasowa współczynnika dyfuzji środka masy lizozymu przebiega zgodnie z kinetyką jednowykładniczą fluorescencji tioflawiny T (fluorescencyjnej sondy stosowanej do monitorowania tworzenia się amyloidowych struktur cross-β32), co wskazuje, że powstawanie cząsteczkowych superstruktur oraz wzorów cross-β zachodzi w jednym kroku z tą samą szybkością. Co więcej, dynamika wewnętrzna pozostała stała w trakcie całego procesu agregacji, co można wyjaśnić albo szybką zmianą konformacyjną, której nie można zaobserwować za pomocą instrumentów NBS, albo brakiem znaczącej zmiany energii wewnętrznej białka podczas agregacji.
Ludzkie białko tau jest białkiem wewnętrznie nieuporządkowanym (IDP), składającym się z 41 aminokwasów w przypadku tzw. izoformy 2N4R, która bierze istotny udział w chorobie Alzheimera3. Wykorzystując neutronowe rozpraszanie wsteczne na proszkach perdeuteryzowanego białka tau, wykazaliśmy, że dynamika wody hydratacyjnej jest zwiększona w stanie włókien, przy większej populacji cząsteczek wody podlegających ruchom translacyjnym. Wynik ten sugeruje, że wzrost entropii wody hydratacyjnej może napędzać fibrylację amyloidową białka tau.

<table><tbody><tr><td>Aluminiowy uchwyt</td><td></td><td></td> na próbkę <td>Niedostępny w handlu. Albo lokalna osoba kontaktowa na instrumencie może je dostarczyć, albo mogą być one wyprodukowane na podstawie rysunku technicznego, który może być dostarczony przez lokalny kontakt.</td></tr><tr><td>Chlorek deuteru, 35 % wag. w D2O, &ge; 99 atom % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td> 543047</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru (D, 99,9%)</td><td>Eurisotop</td><td>DLM-4DR-PK</td><td></td></tr><tr><td>Wysokopróżniowy smar silikonowy Dow Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.5901</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator szklany</td><td>VWR&</td><td>nbsp; 75871-660</td><td></td></tr><tr><td>Szklana płyta eksykatora, 140 mm</td><td>VWR</td><td>89038-068</td><td></td></tr><tr><td>Drut indowy, średnica 1,0 mm (0,04 cala), Puratronic, 99,999%</td><td>Alfa Aesar</td><td>00470.G1</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym z białka jaja kurzego dializowany, liofilizowany, proszek, ~100 000 U/mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62970</td><td></td></tr><tr><td>nPDyn</td><td></td><td>v3.x</td><td>patrz github.com/kpounot/nPDyn, funkcje modelu do montażu zawarte również w oprogramowaniu</td></tr><tr><td>Waga OHAUS AX324 Adventurer, kalibracja wewnętrzna</td><td>Dutscher</td><td>92641</td><td></td></tr><tr><td>Pięciotlenek fosforu, ReagentPlus, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214701</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta ErgoOne 0,5-10 &mu; L</td><td>Pipeta Starlab</td><td>S7100-0510</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 100-1,000 &mu; L</td><td>Pipeta Starlab</td><td>S7100-1000</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 20-200 &mu; L</td><td>Starlab</td><td>S7100-2200</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipet TipOne 1,000 &mu; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-6001</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipet TipOne 10 &mu; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-3200</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipet TipOne 200 &mu; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór deuterotlenek sodu, 40 % wag. w D2O, 99,5 atomu % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372072</td><td></td></tr></tbody></table>

spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Rozpraszanie neutronów daje możliwość badania dynamiki w próbkach dla szerokiego zakresu energii w sposób nieniszczący i bez oznaczania innego niż deuter. W szczególności spektroskopia rozpraszania wstecznego neutronów rejestruje sygnały rozpraszania pod wieloma kątami rozpraszania jednocześnie i dobrze nadaje się do badania dynamiki systemów biologicznych w skali czasowej ps-ns. Dzięki zastosowaniuD2O, i ewentualnie deuterowanych składników buforowych, metoda ta umożliwia monitorowanie zarówno dyfuzji środka masy, jak i ruchów szkieletu i łańcucha bocznego (dynamiki wewnętrznej) białek w stanie ciekłym.
Dodatkowo, dynamika wody hydratacyjnej może być badana za pomocą proszków perdeuterowanych białek uwodnionych H2O. W artykule przedstawiono przebieg pracy zastosowany w instrumencie IN16B w Instytucie Laue-Langevin (ILL) w celu zbadania dynamiki białka i hydratacji wody. Wyjaśniono sposób przygotowania próbek roztworów i uwodnionych próbek białka w proszku za pomocą wymiany parowej. Procedura analizy danych zarówno dla dynamiki białek, jak i hydratacji wody jest opisana dla różnych typów zestawów danych (widma quasielastyczne lub skany ze stałym oknem), które można uzyskać za pomocą spektrometru rozpraszania wstecznego neutronów.
Metoda jest zilustrowana dwoma badaniami z udziałem białek amyloidowych. Wykazano, że agregacja lizozymu w sferyczne agregaty o wielkości μm - oznaczone cząstkami - zachodzi w jednoetapowym procesie w zakresie przestrzeni i czasu badanym na IN16B, podczas gdy dynamika wewnętrzna pozostaje niezmieniona. Ponadto badano dynamikę wody hydratacyjnej tau na uwodnionych proszkach białka perdeuterowanego. Wykazano, że ruchy translacyjne wody są aktywowane po utworzeniu włókien amyloidowych. Na koniec omówiono kluczowe etapy protokołu dotyczące tego, w jaki sposób rozpraszanie neutronów jest umiejscowione w odniesieniu do badania dynamiki w odniesieniu do innych eksperymentalnych metod biofizycznych.

Agregację lizozymu w cząstki przeprowadzono w temperaturze 90 °C przy stężeniu białka 50 mg/mL w buforze deuterowanym (0.1 M NaCl przy pD 10.5). Powstawanie cząstek jest inicjowane przez wzrost temperatury do 90 °C i następuje w ciągu 6 h (Rycina dodatkowa S8). Akwizycja danych została przeprowadzona na urządzeniu IN16B, zgodnie z opisanym powyżej protokołem (dane są na stałe archiwizowane przez ILL i dostępne pod adresem&#160;http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-81).
Spekt...

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Rozpraszanie wsteczne neutronów mierzy globalną dyfuzję i wewnętrzną dynamikę białek i wody hydratacyjnej bez uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem. Spektroskopia neutronowa jednocześnie uzyskuje dostęp do korelacji przestrzennych i czasowych na poziomie molekularnym. W przypadku miękkiej materii i materiałów biologicznych szczególnie interesujące jest uzyskanie pośrednich informacji na temat lokalnego porządku w tych systemach zaburzeń dalekiego zasięgu.Tak więc rozpraszanie wsteczne neutronów może być wykorzystane do badania dynamiki w biologii, chemii lub sensie materialnym. Kolejną ważną dziedziną jest energetyka, w ramach której prowadzone są na przykład badania nad bateriami i ogniwami paliwowymi. Rozpraszanie wsteczne neutronów zostało z powodzeniem wykorzystane do badania dynamiki molekularnej białek zaangażowanych w choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera i Parkinsona.Uzyskane wyniki pomagają nam lepiej zrozumieć molekularne cechy charakterystyczne tych patologii i mogą utorować drogę do opracowania lepszej diagnostyki. Aby przygotować uchwyt na próbkę, należy rozpocząć od dokładnego oczyszczenia płaskiego aluminiowego uchwytu na próbkę oraz jego uszczelki z drutu indowego i wodą, a następnie etanolem, a następnie pozostawić do wyschnięcia. Zważ oddzielnie różne części uchwytu próbki, w tym dno, pokrywę i drut indowy, na wadze precyzyjnej.Umieść jednomilimetrową uszczelkę z drutu indowego w rowku dolnej części uchwytu próbki, pozostawiając niewielką zakładkę w miejscu, w którym łączą się dwa końce. Dodać około 100 miligramów liofilizowanego białka tak, aby wypełniło wewnętrzną powierzchnię dolnej części uchwytu na próbkę. Następnie umieścić uchwyt próbki w eksykatorze z szalką Petriego zawierającą pięciotlenek fosforu w proszku na 24 godziny, aby całkowicie wysuszyć białko w proszku.Zważyć wysuszoną dolną część uchwytu na próbkę zawierającą uszczelkę indową i wysuszony proszek w celu uzyskania masy wysuszonej próbki. Usunąć pięciotlenek fosforu z eksykatora i umieścić w nim szalkę Petriego z tlenkiem deuteru oraz próbkę w celu uwodnienia proszku. Powtórz suszenie i nawilżanie trzy razy, aby uzyskać pełną wymianę wodoru na deuter.Regularnie mierz masę proszku, aby sprawdzić poziom nawodnienia, a gdy nawodnienie jest nieco powyżej pożądanego poziomu, poczekaj, aż masa powoli się zmniejszy. Po uzyskaniu pożądanego nawodnienia szybko załóż pokrywkę na dolną część i najpierw zamknij uchwyt próbki czterema, aby zatrzymać wymianę pary. Umieść i dokręć wszystkie pozostałe, aż nie będzie widoczna żadna szczelina między dolną częścią a pokrywą.Zważyć szczelnie zamknięty uchwyt próbki, aby sprawdzić, czy po eksperymencie z neutronami nie ma potencjalnych strat hydratacji spowodowanych nieszczelnościami. Aby przygotować próbkę w stanie ciekłym, należy rozpuścić białko w zdeuterowanym buforze. Za pomocą wody określić odpowiednią objętość płynu, który należy umieścić w uchwycie na próbki.Przed przystąpieniem do pracy z jakimkolwiek materiałem należy upewnić się, że dawka promieniowania jonizującego jest mniejsza niż 100 mikrosiwertów na godzinę. Następnie dokładnie osusz patyczek do pobierania próbek i usuń wszelkie poprzednie próbki. Umieść próbkę na patyczku do próbek, sprawdź, czy jest prawidłowo wyśrodkowany względem środka belki i włóż patyczek do próbki do pieca kriogenicznego.Aby pozyskać dane w Nomad, przejdź do zakładki Wykonanie, a następnie przeciągnij i upuść kontroler kriostatu pieca do launchpada. Ustaw temperaturę na 200 kelwinów. Użyj trybu szybkiego i limitu czasu 30 minut, aby temperatura miała czas na ustabilizowanie się.Kliknij ikonę odświeżania, aby uruchomić rampę temperatury w tle w celu pobrania danych podczas spadku temperatury. Przeciągnij i upuść kontroler ustawień Dopplera IN16 do launchpada. Ustaw profil prędkości na dokładną prędkość, ustawioną na maksymalną deltę E, przesunięcie energii na 0,00 mikroelektronowoltów, a liczbę kanałów na 128, aby uzyskać elastyczną konfigurację skanowania w oknie stałym.Przeciągnij i upuść kontroler zliczania do launchpada, wypełnij pole napisów nazwą, która pozwoli na łatwą identyfikację danych i ustaw skany na 30 sekund z 60 powtórzeniami. Następnie przeciągnij i upuść kontroler ustawień Dopplera IN16 do launchpada. Ustaw profil prędkości na sign, set by na prędkość o wartości 4,5 metra na sekundę, a liczbę kanałów na 2048, aby uzyskać konfigurację quasi-elastycznego rozpraszania neutronów.Przeciągnij i upuść kontroler zliczania i wypełnij pole napisów nazwą, która pozwala na łatwą identyfikację danych. Ustaw skany po 30 minut z czterema powtórzeniami. Aby uzyskać rampę temperatury, przeciągnij i upuść kontroler kriostatu pieca, ustaw temperaturę na 310 kelwinów i ustaw rampę na punkt zastany z deltą 0,05 kelvina na sześć sekund.Użyj limitu czasu wynoszącego 200 minut. Użyj pętli for z 65 powtórzeniami. Do środka włóż kontroler ustawień dopplera IN16, a następnie kontroler zliczania i ustaw pojedyncze skanowanie na 30 sekund.Następnie wprowadź ustawienia Dopplera IN16 zgodnie z wcześniejszym opisem, ale przy użyciu przesunięcia energii 1,5 mikroelektronowolta i 1024 kanałów. Następnie włóż kontroler zliczania i ustaw pojedyncze skanowanie na trzy minuty. Aby uzyskać ostatnie quasi-elastyczne rozpraszanie neutronów o temperaturze 312 kelwinów, przeciągnij i upuść ustawienia dopplerowskie IN16 i zlicz kontrolery skonfigurowane tak, jak pokazano wcześniej.Następnie naciśnij przycisk Start, aby uruchomić skrypt. Skany lizosomów z elastycznym i nieelastycznym stałym oknem wykazały wzrost sygnału przy przenoszeniu niskiego pędu i niskim transferze energii, podczas gdy sygnał przy przenoszeniu wysokiej energii i niskim pędzie zmniejszył się. Początkowy współczynnik dyfuzji środka masy wynosił 15 angstremów do kwadratu na nanosekundę, który następnie wykładniczo zmniejszał się w czasie.W temperaturach wyższych niż 220 kelwinów woda hydratacyjna wokół włókien tau była znacznie bardziej mobilna niż wokół monomerów tau. Frakcja cząsteczek wody podlegających ruchowi translacyjnemu oraz współczynniki dyfuzji translacyjnej, jak i rotacyjnej cząsteczek wody zostały zwiększone wokół włókien. Stężenie białka powinno wynosić 2000 miligramów na ml lub co najmniej 20 miligramów na ml dla białek białkowych ze względu na ograniczenia rozpraszania wstecznego neutronów wynikające ze strumienia neutronów lub tła bufora uchwytu próbki.Rozpraszanie wsteczne neutronów zostało ostatnio zastosowane, na przykład, aby zrozumieć, w jaki sposób woda, która jest naturalnym białkiem środowiskowym, może zostać w pełni zastąpiona syntetycznym polimerem do zastosowań biotechnologicznych, takich jak na przykład dostarczanie leków.

high-resolution-neutron-spectroscopy-to-study-picosecond-nanosecond

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Kluczowe etapy funkcjonowania białka, w szczególności zmiany konformacyjne szkieletu i reakcje transferu protonów, często odbywają się w skali od mikrosekund do milisekund. Te dynamiczne procesy można badać za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowo-rozdzielczym, w szczególności w przypadku białek, których funkcja jest wyzwalana przez światło.

Transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją Fouriera

Tutaj prezentujemy protokół do badania miękkiej materii i systemów biofizycznych w szerokiej mezoskopowej skali długości, od nm do μm, która obejmuje użycie dyfraktometru KWS-2 SANS o wysokiej intensywności i regulowanej rozdzielczości.

Badanie miękkiej materii i układów biologicznych w szerokiej skali długości od rozmiarów nanometrów i mikrometrów na małokątowym dyfraktometrze neutronowym KWS-2

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Obecny protokół opisuje metody badania struktury i dynamiki dwóch modelowych białek, które odgrywają ważną rolę w zdrowiu człowieka. Technika ta łączy laboratoryjną charakterystykę biofizyczną ze spektroskopią echa spinowego neutronów, aby uzyskać dostęp do dynamiki w skalach czasu i długości istotnych dla ruchów międzydomenowych białek.

Badanie dynamiki białek za pomocą spektroskopii neutronowego echa spinowego

Krystalografia białek neutronowych to technika strukturalna, która pozwala na lokalizację atomów wodoru, dostarczając tym samym ważnych szczegółów mechanistycznych funkcji białek. Przedstawiamy tutaj przebieg pracy montażu kryształu białka, zbieranie danych dyfrakcji neutronów, udoskonalanie struktury i analizę map gęstości długości rozpraszania neutronów.

Gromadzenie i przetwarzanie danych krystalografii neutronowej do modelowania atomów wodoru w strukturach białkowych

Ten artykuł opisuje protokoły przygotowania próbek, redukcji danych i analizy danych w badaniach neutronowego echa spinowego (NSE) błon lipidowych. Rozsądne znakowanie lipidów deuterem umożliwia dostęp do różnych dynamik błon w mezoskopowych skalach długości i czasu, w których zachodzą ważne procesy biologiczne.

Spektroskopia neutronowego echa spinowego jako unikalna sonda do badania dynamiki błony lipidowej i interakcji błona-białko

Strukturalny zespół monomerycznej alfa-synukleiny wpływa na jej fizjologiczne funkcje i właściwości fizykochemiczne. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób przeprowadzić spektrometrię mas z wymianą milisekundową wodór/deuter i późniejsze analizy danych w celu określenia informacji konformacyjnych na monomerze tego wewnętrznie nieuporządkowanego białka w warunkach fizjologicznych.

Spektrometria mas z wymianą milisekundową wodoru i deuteru do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny w warunkach fizjologicznych

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) może scharakteryzować dynamikę strukturalną białka w sposób specyficzny dla reszt. Udostępniamy praktyczny protokół do rejestrowania eksperymentów z relaksacją NMR 15N R1 i R2 oraz eksperymentów z heterojądrowym efektem Overhausera (hetNOE) {1H}-15N, wrażliwych na skalę czasową od pikosekund do nanosekund.

NMR 15N Eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji wielokrotnych fosforylacji wewnętrznie nieuporządkowanego białka za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), używając białka Tau jako studium przypadku. Rekombinowany Tau jest izotopowo wzbogacany i modyfikowany in vitro przez kinazę przed pozyskaniem i analizą danych.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych

W tej metodzie prezentujemy procedury biochemiczne do szybkiej i efektywnej izolacji pośrednich białek filamentowych (IF) z wielu tkanek myszy. Izolowane IFs mogą być wykorzystywane do badania zmian w modyfikacjach potranslacyjnych za pomocą spektrometrii mas i innych testów biochemicznych.

Izolacja pośrednich białek filamentowych z wielu tkanek myszy w celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych związanych ze starzeniem się

Poznaj spektroskopię neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki białek amyloidowych i wody hydratacyjnej. Ta metoda pozwala badać mechanizmy chorób neurodegeneracyjnych bez uszkodzeń radiacyjnych.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Przeglądaj więcej filmów