Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Łączymy mikrodysekcję wychwytu laserowego z protokołem wyszukiwania RNA pojedynczej komórki o nazwie CEL-Seq2 w celu wygenerowania zestawów danych transkryptomicznych dla małych, pojedynczych próbek tkanek. Technika ta pozwala nam badać ekspresję genów w tkankach lub gatunkach, których nie można badać przy użyciu tradycyjnych metod sortowania komórek. Dodatkowo zapewnia większą specyficzność niż podejście oparte na masowym sekwencjonowaniu RNA.

Tutaj zademonstrowaliśmy tę technikę dla czterokomórkowych końcówek ogona C.elegans, samców w czwartym stadium larwalnym i hermafrodytów. Ale piękno tego podejścia polega na tym, że można je zastosować nawet do gatunków niemodelowych. Procedurę zademonstrują pani Raya Jallad, doktorantka z mojego laboratorium oraz dr Antonio Herrera, obecnie główny naukowiec biomedyczny w szkole Baylor w Chattanooga w stanie Tennessee.

Zacznij od delikatnego odpipetowania jednego do dwóch mililitrów buforu M9 do ścianki płytki bez rozpylania. Zakręć płytą, aby usunąć robaki. Usuń i wyrzuć cały płyn i robaki, przykładając końcówkę pipety do ścianki płytki na krawędzi agaru, aby uniknąć wybijania.

Ten film pokazuje płytkę przed usunięciem matek i larw. Po usunięciu matek i larw należy pozostawić tylko zarodki. Larwa L1 zacznie pojawiać się po inkubacji przez około godzinę.

Następnie umieść talerz w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po godzinie wyjąć płytkę z inkubatora. Ostrożnie upuść jeden mililitr buforu M9 na agar i zakręć płytką, aby usunąć L1, ale nie zarodki.

Odwirować probówkę i pipetować L1 bezpośrednio na trawnik bakteryjny na talerzu z nasionami. Trzymaj robaki w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Pod mikroskopem preparacyjnym w powiększeniu od 30 do 50 razy zacznij wybierać samce i hermafrodyty z płytek synchronizacyjnych na oddzielne, nieosadzone płytki.

Samce różnią się od hermafrodytów wybrzuszonym kształtem i jaśniejszym kolorem ogonów samców w porównaniu ze spiczastym kształtem i ciemniejszym kolorem ogonów hermafrodytów. Zmyj robaki z płytki jednym lub dwoma mililitrami buforu M9 za pomocą końcówki pipety wstępnie umytej buforem M9 zawierającym 0,01% detergentu. Przenieś robaki do jednomililitrowej probówki wirówkowej, wiruj przez minutę i dodaj jeden mililitr buforu M9.

Ponownie wiruj przez minutę. Dodaj jeden mililitr lodowatego 70% metanolu i dobrze wymieszaj. Powtórz pranie z jednym mililitrem metanolu, dobrze wymieszaj.

Wiruj przez minutę i dodaj 500 mikrolitrów 70% metanolu. Wymieszaj i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę do nocy. Odpipetować 20 mikrolitrów zamocowanych ślimaków na powlekanej stronie naftalanu etylenu lub szkiełka z membraną PEN.

Poczekaj, aż metanol wyparuje. Zdejmij plastikową osłonę ze stolika i kliknij przycisk rozładowywania ze strzałką w górę, aby załadować szkiełka membranowe. Upewnij się, że szkiełko jest całkowicie suche, odwróć tak, aby membrana była skierowana w dół i włóż szkiełko.

Kliknij przycisk Kontynuuj w oknie zmiany próbki. Uchwyt szkiełka przesunie się. Następnie załóż plastikową osłonę, na dole ekranu wybierz, który uchwyt na suwak zawiera suwak i kliknij przycisk rozładowywania ze strzałką w dół, aby załadować rurki.

Wyciągnij tackę i wyjmij blok rurki. Włóż nakrętki czterech probówek PCR o pojemności 500 mikrolitrów do uchwytu i złóż probówkę pod spodem. Umieść blok z powrotem na tacy i wsuń tacę z powrotem do stolika mikroskopu.

W wyskakującym oknie urządzenia kolektora zmian wybierz probówki PCR i kliknij OK. Kliknij pustą rurkę w lewym dolnym rogu ekranu pod nasadkami rurki urządzenia kolektora, a następnie na panelu sterowania mikroskopu wybierz TLBF dla oświetlenia światłem przechodzącym w jasnym polu. Używając obiektywu 2,5X, wyreguluj ostrość, aż robaki i struktura powierzchni membrany PEN będą widoczne.

Przełącz się na obiektyw 20X i przenieś scenę do regionu bez robaków. Dostosuj ostrość tak, aby struktury przypominające pęcherzyki w membranie miały żółtawy kolor, aby ustawić ostrość lasera na właściwej płaszczyźnie ogniskowej, a następnie ustaw parametry lasera. W przypadku końcówek ogonowych zacznij od mocy 45 przysłony 30 w prędkości 20.

Na panelu sterowania lasera wybierz opcję kalibracji i postępuj zgodnie z instrukcjami. Następnie na dole ekranu przy nasadkach rurki urządzenia kolektora kliknij pozycję A, po prawej stronie ekranu wybierz pojedynczy kształt, a następnie narysuj i wytnij. Następnie wybierz punkt do punktu i narysuj linię.

Kliknij rozpocznij cięcie, aby laser przeciął membranę. Znajdź robaka i przełącz się, aby się poruszać i ciąć. Użyj myszki, aby przeciąć ogon.

Aby pobrać próbkę, przełącz się na ustawienie rysowania i cięcia z funkcją punkt do punktu i narysuj kształt, aby zakończyć cięcie sekcji membrany. Wybierz następną rurkę na nasadce rurki urządzenia zbierającego na dole ekranu i odetnij następną końcówkę ogona. Po wycięciu czterech ogonów rozładuj stojak na rury, klikając rozładuj strzałką w dół.

Znajdź skrawki membrany pod mikroskopem preparacyjnym i kontynuuj przetwarzanie próbki. Tutaj sekwencjonowanie RNA za pomocą CEL-Seq2. Odpipetować 1,2 mikrolitra wzorcowej mieszanki startera CEL-Seq2 bezpośrednio na próbkę i zamknąć probówkę.

Oznaczyć etykietą numer startera i natychmiast umieścić nakrętkę probówki bezpośrednio na kawałku suchego lodu, aby błyskawicznie zamrozić próbkę, zapobiegając w ten sposób degradacji RNA. Powtarzać tę czynność, aż wszystkie próbki zostaną pobrane. Na koniec przechowuj probówki w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza.

Hermafrodyty C.elegans L3 i samce w wieku od 21 do 23 godzin po wykluciu można odróżnić pod mikroskopem preparacyjnym na podstawie morfologii ich ogonów. Opowieść o hermafrodycie jest wąska, podczas gdy opowieść o samcach jest spuchnięta i wydaje się jasna. Wygląd struktury suwaka membrany PEN i ogona ślimaka jest pokazany na tych zdjęciach.

Tutaj ostrość jest prawidłowa dla obiektywów 20X i 40X w mikroskopie. Widoczne są tu wypreparowany ogon, częściowo wycięta membrana PEN. Po zamknięciu szczeliny w nacięciu, kawałek membrany wpadnie do nasadki rurki poniżej suwaka.

Pokazano tutaj nasadkę rurki z sekcją membrany PEN zawierającą wypreparowaną końcówkę ogona. Obraz graficzny przedstawia unikalny identyfikator molekularny przekształcony w logarytm naturalny lub liczbę UMI na pojedynczą końcówkę ogona dla różnych punktów czasowych i płci. Oprogramowanie powsimR służy do określenia, ile niezależnych próbek jest wymaganych do wykrycia genów o zróżnicowanej ekspresji lub genów DE na różnych poziomach ekspresji.

Obraz graficzny tutaj przedstawia prawdziwie dodatni wskaźnik wykrywania genów DE między dwoma warunkami dla czterech różnych symulacji obejmujących różne rozmiary próbek w każdym stanie. Linia przerywana wskazuje 80% odsetek prawdziwie dodatnich. Wskaźnik fałszywych odkryć i te same cztery symulacje są pokazane tutaj.

Linia przerywana wskazuje 10% współczynnik fałszywych wykryć. Wykresy pokazały, że wielkość próby wynosząca 70 końcówek ogona na warunek jest wystarczająca do wykrycia genów DE, z wyjątkiem genów o bardzo niskim poziomie ekspresji. Aby zapewnić prawidłową synchronizację, upewnij się, że na płytce znajdują się tylko zarodki.

Aby zapobiec utracie próbki, należy odpipetować mieszaninę startera bezpośrednio na sekcję membrany PEN w nasadce i bardzo delikatnie zamykać nakrętkę. Ponieważ jest niezależny od gatunku, możemy użyć tego protokołu do zbadania, w jaki sposób ewoluowały sieci regulacji genów dla struktur homologicznych u różnych gatunków.