Name: Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj mikrodysekcję laserową z protokołem CEL-Seq2 do analizy ekspresji genów w pojedynczych tkankach. Metoda umożliwia badania transkryptomiczne u C. elegans i gatunków nie-modelowych bez konieczności stosowania specyficznych narzędzi genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez granty NIH (R01GM141395) i NSF (1656736) dla DF oraz stypendium NIH (F32GM136170) dla AW. Rysunek 1 został stworzony przy pomocy BioRender.com.

<ol><li>Haag, E. S., Fitch, D. H. A., Delattre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+%26%2334%3Bthe+worm%26%2334%3B+to+%26%2334%3Bthe+worms%26%2334%3B+and+back+again%3A+the+evolutionary+developmental+biology+of+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">From &#34;the worm&#34; to &#34;the worms&#34; and back again: the evolutionary developmental biology of nematodes.</a> Genetics. 210 (2), 397-433 (2018).</li>
<li>Sommer, R. J., Bumbarger, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode+model+systems+in+evolution+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nematode model systems in evolution and development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (3), 389-400 (2012).</li>
<li>WormBase. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://wormbase.org/#012-3-6">https://wormbase.org/#012-3-6</a> (2022).</li>
<li>WormAtlas. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://wormatlas.org">https://wormatlas.org</a> (2022).</li>
<li>WormBook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://wormbook.org">http://wormbook.org</a> (2022).</li>
<li>WormBook in Genetics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook">https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook</a> (2022).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+single-cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li>
<li>Kaletsky, R., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+C.+elegans+adult+cells+and+tissues+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of C. elegans adult cells and tissues with age.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 177-186 (2020).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+adult+Caenorhabditis+elegans+cells+reveals+tissue-specific+gene+and+isoform+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression.</a> PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).</li>
<li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 365 (6459), 1971(2019).</li>
<li>Kulkarni, A., Anderson, A. G., Merullo, D. P., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+bulk%3A+a+review+of+single+cell+transcriptomics+methodologies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Beyond bulk: a review of single cell transcriptomics methodologies and applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 58, 129-136 (2019).</li>
<li>Von Stetina, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+microarray+profiling+experiments+reveal+a+comprehensive+picture+of+gene+expression+in+the+C.+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system.</a> Genome Biology. 8 (7), 135(2007).</li>
<li>Baugh, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeodomain+protein+PAL-1+specifies+a+lineage-specific+regulatory+network+in+the+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The homeodomain protein PAL-1 specifies a lineage-specific regulatory network in the C. elegans embryo.</a> Development. 132 (8), 1843-1854 (2005).</li>
<li>Haenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+C.+elegans+intestinal+gene+expression+and+polyadenylation+by+fluorescence-activated+nuclei+sorting+and+3%27-end-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq.</a> Nucleic Acids Research. 40 (13), 6304-6318 (2012).</li>
<li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLoS One. 6 (4), 19505(2011).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77(2016).</li>
<li>Yanai, I., Hashimshony, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2-single-cell+RNA+sequencing+by+multiplexed+linear+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2-single-cell RNA sequencing by multiplexed linear amplification.</a> Methods in Molecular Biology. 1979, 45-56 (2019).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019(2012).</li>
<li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+grow+or+not+to+grow%3A+nutritional+control+of+development+during+Caenorhabditis+elegans+L1+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">To grow or not to grow: nutritional control of development during Caenorhabditis elegans L1 arrest.</a> Genetics. 194 (3), 539-555 (2013).</li>
<li>Baugh, L. R., Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation+responses+throughout+the+Caenorhabditis+elegans+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Starvation responses throughout the Caenorhabditis elegans life cycle.</a> Genetics. 216 (4), 837-878 (2020).</li>
<li>Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+glp-1+mutants+suggests+receptor+interaction+or+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition.</a> Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).</li>
<li>Mok, D. Z., Sternberg, P. W., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologically+defined+sub-stages+of+C.+elegans+vulval+development+in+the+fourth+larval+stage%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphologically defined sub-stages of C. elegans vulval development in the fourth larval stage.</a> BMC Developmental Biology. 15, 26(2015).</li>
<li>Lytal, N., Ran, D., An, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+methods+on+single-cell+RNA-seq+data%3A+an+empirical+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Normalization methods on single-cell RNA-seq data: an empirical survey.</a> Frontiers in Genetics. 11, 41(2020).</li>
<li>Vieth, B., Ziegenhain, C., Parekh, S., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((powsimR%3A+power+analysis+for+bulk+and+single+cell+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">powsimR: power analysis for bulk and single cell RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 33 (21), 3486-3488 (2017).</li>
<li>Bolkova, J., Lanctot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gene+expression+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+using+single+molecule+RNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative gene expression analysis in Caenorhabditis elegans using single molecule RNA FISH.</a> Methods. 98, 42-49 (2016).</li>
<li>Ji, N., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+of+C.+elegans+worms+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos.</a> WormBook. , 1-16 (2012).</li>
<li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-Protocol. 7 (12), 2357(2017).</li>
<li>Baird, S. E., Chamberlin, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+briggsae+methods%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis briggsae methods.</a> WormBook. , 1-9 (2006).</li>
<li>Felix, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscheius+tipulae%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Oscheius tipulae.</a> WormBook. , 1-8 (2006).</li>
<li>Han, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+transgenesis+efficiency+and+CRISPR-associated+tools+through+codon+optimization+and+native+intron+addition+in+Pristionchus+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes.</a> Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).</li>
<li>Fernandes Povoa, E. E., Ebbing, A. L. P., Betist, M. C., vander Veen, C., Korswagen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+dissociation+protocol+for+FACS-based+isolation+of+rare+cell+types+from+Caenorhabditis+elegans+L1+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">An optimized dissociation protocol for FACS-based isolation of rare cell types from Caenorhabditis elegans L1 larvae.</a> MethodsX. 7, 100922(2020).</li>
<li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).</li>
<li>Steiner, F. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+affinity+purification+of+nuclei+for+chromatin+profiling+in+whole+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific affinity purification of nuclei for chromatin profiling in whole animals.</a> Methods in Molecular Biology. 1228, 3-14 (2015).</li>
<li>Ebbing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+of+C.+elegans+males+and+hermaphrodites+identifies+sex-specific+differences+in+gene+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns.</a> Developmental Cell. 47 (6), 801-813 (2018).</li>
<li>Rödelsperger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+of+nematodes+identifies+sperm+cells+as+a+source+of+genomic+novelty+and+rapid+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics of nematodes identifies sperm cells as a source of genomic novelty and rapid evolution.</a> Molecular Biology and Evolution. 38 (1), 229-243 (2021).</li>
<li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Krytyczne etapy metody Jeśli zostanie wykonana prawidłowo, opisana tutaj metoda pozwoli uzyskać solidne profile RNA przy stosunkowo niewielkiej liczbie próbek wypreparowanych laserowo (w tym przykładzie 70 końcówek ogona). Jednak w przypadku próbek pochodzących od rozwijających się zwierząt ścisła synchronizacja ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia zmienności między próbkami. Z tego powodu protokół zaleca metodę hatch-off do synchronizacji robaków. Tutaj badacz może określić i precyzyjnie kontrolo...

Nicienie - szczególnie nicienie rasy Rhabditidae związane z systemem modelowym Caenorhabditis elegans - są wspaniałą grupą zwierząt dla ewolucyjnej biologii rozwojowej (EDB) z wielu powodów1,2. Do zalet należy niewielka liczba komórek, zdefiniowane i spójne linie komórkowe, przejrzystość oraz łatwość hodowli i hodowli. Dostępnych jest również wiele zasobów, w tym wysokiej jakości genomy dla wielu gatunków, a dla C. elegans, obszerne narzędzia genetyki molekularnej i wiedza na temat rozwoju, genetyki, anatomii i fizjologii3,4,5,6.
Podobnie jak w przypadku wielu innych organizmów, możliwość scharakteryzowania dynamiki transkryptomu w pojedynczych tkankach lub pojedynczych komórkach zrewolucjonizowała analizę rozwoju C. elegans7,8,9,10. Możliwość porównania transkryptomów pojedynczych komórek u nicieni w podobny sposób przekształciłaby EDB przy użyciu tych organizmów. Na przykład, takie porównania dostarczyłyby wglądu w to, jak ewoluowały sieci regulacji genów dla cech (cech), które zostały zachowane, dla cech, które się rozeszły, lub dla cech, które ewoluowały niezależnie.

Jednak izolowanie określonych tkanek lub komórek od nicieni jest jednym z największych wyzwań. W przypadku wielu organizmów pojedyncze komórki mogą być oddzielone od tkanek i zebrane w sposób bezstronny lub mogą być oznaczone specyficzną tkankowo ekspresją białka fluorescencyjnego i posortowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)11. U C. elegans wysokoprzepustowa izolacja komórek (HTP) była ograniczona głównie do zarodków, ponieważ twardy zewnętrzny naskórek (i hydrostatyczny szkielet) utrudniał izolację komórek od larw i dorosłych. Aby obejść ten problem, w niektórych metodach zastosowano narzędzia genetyczne u całych robaków C. elegans, takie jak specyficzne tkankowo znakowanie mRNA12 oraz porównania różnicowych ekspresji między typem dzikim a mutantami wpływającymi na typ komórki13. Nowsze metody pozwoliły przezwyciężyć to wyzwanie, rozpuszczając naskórek w celu wyizolowania jąder14 lub całych komórek8,9,15. Izolacja komórek i hodowla komórkowa mają jednak oczywiste wady, że komórki są usuwane ze swojego naturalnego kontekstu rozwojowego lub anatomicznego - np. z dala od sygnalizacji komórka-komórka i kontaktu z macierzą zewnątrzkomórkową - co ma wpływać na profil ekspresji genów15. Co więcej, narzędzia genetyczne i markery specyficzne dla tkanek są specyficzne dla gatunku (tj. mogą być stosowane tylko u C. elegans).
LMD zapewnia alternatywną metodę izolowania tkanek bez zakłócania naturalnego kontekstu komórek. Co istotne w przypadku EDB, LMD umożliwia również porównywanie transkryptomów z homologicznych tkanek różnych gatunków bez konieczności stosowania specyficznych dla gatunku zestawów narzędzi genetycznych, jeśli dostępne są sekwencje genomu lub całego transkryptomu tych gatunków. LMD polega na celowaniu w tkanki poprzez bezpośrednią obserwację mikroskopową i użycie mikrowiązki laserowej - zintegrowanej z optyką mikroskopu - w celu wycięcia i zebrania (przechwycenia) interesującej nas tkanki16. Ograniczenia LMD polegają na tym, że nie sprzyja on bardzo metodom HTP (chociaż profile transkrypcji dla końcówek ogonowych, jak opisano w tym protokole, były solidne przy ~ 70 próbkach), niektóre próbki mogą być trudne do wypreparowania, a cięcia są ograniczone do precyzji lasera i tego, co można zobrazować w mikroskopie.
Celem obecnego protokołu jest opisanie w jaki sposób LMD, a następnie sekwencja RNA pojedynczej tkanki, może być wykorzystana do uzyskania danych transkryptomu specyficznych dla etapu i tkanki od nicieni. W szczególności demonstruje LMD do izolowania końcówek ogonów od larw czwartego stadium (L4) C. elegans. Jednak tę metodę można dostosować do innych tkanek i oczywiście różnych gatunków.
U C. elegans istnieją 4 komórki, które tworzą końcówkę ogona zarówno u samców, jak i hermafrodytów. Podczas stadium L4 u samców - ale nie u hermafrodytów - komórki końca ogona zmieniają swój kształt i migrują do przodu i do wewnątrz. Proces ten zachodzi również u niektórych, ale nie wszystkich innych gatunków nicieni rabditydów. Dlatego końcówka ogona jest dobrym modelem dla ewolucji dymorfezy płciowej. Ze względu na swoje położenie, końcówka ogona jest również łatwa do odizolowania za pomocą LMD.
Aby uzyskać profile transkryptomu z końcówek ogona, obecny protokół wykorzystuje CEL-Seq2, metodę sekwencyjną RNA opracowaną dla pojedynczych komórek17,18. Metoda ta ma kilka zalet w przypadku tkanek pochodzących z LMD. CEL-Seq2 jest bardzo czuły i wydajny, wykorzystuje unikalne identyfikatory molekularne (UMI), aby umożliwić prostą kwantyfikację odczytów mRNA, transkrypcję in vitro w celu zapewnienia liniowej amplifikacji oraz kodowanie kreskowe, które umożliwia multipleksowanie pojedynczych próbek tkanek. Jedynym ograniczeniem CEL-Seq2 jest to, że odzyskane odczyty są stronnicze do końca 3' mRNA, a zatem nie można rozróżnić większości izoform.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 0,5 &mikro; Szkiełka szklane z membraną M PEN bez RNaz</td><td>Leica</td><td>11600288</td><td>do LMD</td></tr><tr><td>500 i micro; L Probówki PCR (bez nukleaz)</td> <td>Axygen</td><td>732-0675</td><td>do cięcia końcówek ogona w</td></tr><tr><td>Mikroskop złożony z obiektywem 40x i DIC</td><td>dowolny</td><td></td><td>do sprawdzania wieku robaków</td></tr><tr><td>Nawilżacz biurkowy</td><td>dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop preparacyjny z podstawą światła przechodzącego</td><td>dowolny</td><td></td><td>do wszystkich prac ślimakowych</td></tr><tr><td>szklane pipety Pasteura</td><td>dowolny</td><td></td><td>uchwyt kilofa ślimakowego</td></tr><tr><td>szkiełka podstawowe i nakrywkowe</td><td>do</td><td></td><td>sprawdzania wieku robaków</td></tr><tr><td>System mikrodysekcji LMD6</td><td>Leica</td><td>wielokrotność</td><td>do cięcia końcówek ogonowych</td></tr><tr><td>Probówki LoBind 0,5 ml</td><td>Receptura</td> bufora <td></td> Eppendorf 22431005 <td></td></tr><tr><td>M9</td><td>w WormBook</td>Metanol 99,8% Sigma 322415 do naprawy robaków Podłoże wzrostowe NGM US <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Biologiczne</td><td>i sole N1000</td><td>należy dodać: Przepis w WormBook</td></tr><tr><td>P10 płynna objętość pipety</td><td>, np. Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipeta o zmiennej objętości</td>, <td>np. Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 pipeta o zmiennej objętości</td>, <td>np. Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 1,000 i mikro; L</td><td>dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>końcówka do pipet 1-10 i mikro; L przefiltrował</td><td>dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>drut platynowo-irydowy</td><td>Tritech</td><td>PT-9010</td>, <td>aby wytrychy ślimakowe</td></tr> były <tr><td>sterylne i wolne od nukleaz 1 ml probówki wirówkowe</td><td>dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Dodaj bardzo małą ilość do bufora M9, aby zapobiec przywieraniu robaków do końcówek pipet</td></tr><tr><td>wentylowane plastikowe szalki Petriego o średnicy 6 mm</td><td>dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Do systemu CEL-Seq2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4200 TapeStation z odczynnikami do bardzo czułej detekcji RNA i DNA</td><td>Automatyczny system elektroforezy</td><td>Aligent</td><td></td></tr><tr><td>Kulki AMPure XP</td> Kulki <td>oczyszczające DNA</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td></tr><tr><td>Bufor wiążący koraliki&nbsp; 20% PEG8000, 2,5 M</td> Startery NaCl <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEL-Seq2 (patrz tabela S1)</td><td>Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf</td><td>6335000020</td><td>Termocykler z programowalną pokrywą i blokiem dla 200 &mikro; l rury.</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA I (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18052-025</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix 10 mM</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli Ligaza DNA</td><td>Invitrogen</td><td>18052-019</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT do oczyszczania produktu PCR</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td>roztwór egzonukleazy</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Zestaw do transkrypcji</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td>Dla kroku 4.6.1</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HF</td><td>NEB</td><td>M0531</td><td>PCR mix krok 4.9.7</td></tr><tr><td>losowy starter hexamer RT GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN</td><td>IDT</td><td></td><td>starter z 6 nukleotydami, które są losowe</td></tr><tr><td>Bufor fragmentacji RNA</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>Bufor zatrzymujący fragmentację RNA</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>RNA PCR Index Primers (RPI1&ndash; RPI48)</td><td>Illumina, NEB lub IDT</td><td></td><td>RPIX w kroku 4.9.7 protokołu, sekwencje dostępne w koralikach Illumina</td></tr><tr><td>RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY Surface Deminazinant</td><td>Thermo Scientific</td><td>7000TS1</td><td>lub inny podobny produkt</td></tr><tr><td>RNaseH (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Rekombinant Inhibitor rybonukleazy</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Bufor drugiej nici</td><td>Invitrogen</td><td>10812-014</td><td></td></tr><tr><td>Superscripit II</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td>odwrotna transkryptaza</td></tr></tbody></table>

mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Metodologie jednokomórkowe zrewolucjonizowały analizę transkryptomów określonych typów komórek. Jednak często wymagają one specyficznych dla gatunku "zestawów narzędzi" genetycznych, takich jak promotory napędzające specyficzną tkankowo ekspresję białek fluorescencyjnych. Co więcej, protokoły, które zakłócają tkanki w celu wyizolowania pojedynczych komórek, usuwają komórki z ich natywnego środowiska (np. sygnalizacji od sąsiadów) i mogą powodować reakcje stresowe lub inne różnice w stosunku do natywnych stanów ekspresji genów. W obecnym protokole mikrodysekcja laserowa (LMD) jest zoptymalizowana pod kątem izolowania pojedynczych końcówek ogonów nicieni w celu zbadania ekspresji genów podczas morfogenezy końcówki ogona samca.
LMD pozwala na izolację części zwierzęcia bez potrzeby zakłócania działania komórek lub zestawów narzędzi specyficznych dla gatunku, a zatem ma zastosowanie do każdego gatunku. Następnie, protokoły przygotowania biblioteki sekwencyjnej RNA pojedynczej komórki, takie jak CEL-Seq2, można zastosować do pojedynczych tkanek izolowanych za pomocą LMD i przeanalizować przy użyciu standardowych potoków, biorąc pod uwagę, że dla gatunku dostępny jest dobrze opisany genom lub transkryptom. Takie dane można wykorzystać do ustalenia, jak konserwatywne lub różne są transkryptomy, które leżą u podstaw rozwoju tej tkanki u różnych gatunków.
Ograniczenia obejmują możliwość wycięcia interesującej tkanki oraz wielkość próbki. Analiza mocy pokazuje, że do uzyskania 80% mocy potrzeba zaledwie 70 końcówek ogonowych na warunek. Aby uzyskać taką liczbę zwierząt na tym samym etapie rozwoju, potrzebna jest ścisła synchronizacja rozwoju. W ten sposób opisano również metodę synchronizacji zwierząt w odstępach 1 godzin.

Po przeprowadzeniu laserowej mikrodysekcji uchwyconej, poszczególne końcówki ogonów samców i hermafrodyt w czterech punktach czasowych (L3 22 h po wykluciu; L4 24, 26 i 28 h po wykluciu) przygotowano do sekwencjonowania RNA zgodnie z protokołem CEL-Seq2. Primery CEL-Seq2 zawierają unikalne kody kreskowe, które umożliwiają bioinformatyczną identyfikację odczytów sekwencjonowania z konkretnej próbki (w tym przypadku z pojedynczej końcówki ogona). Za pomocą tej metody wygenerowano dane sekwencjonowania dla łącznie 557 końcó...

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

Łączymy mikrodysekcję wychwytu laserowego z protokołem wyszukiwania RNA pojedynczej komórki o nazwie CEL-Seq2 w celu wygenerowania zestawów danych transkryptomicznych dla małych, pojedynczych próbek tkanek. Technika ta pozwala nam badać ekspresję genów w tkankach lub gatunkach, których nie można badać przy użyciu tradycyjnych metod sortowania komórek. Dodatkowo zapewnia większą specyficzność niż podejście oparte na masowym sekwencjonowaniu RNA.Tutaj zademonstrowaliśmy tę technikę dla czterokomórkowych końcówek ogona C.elegans, samców w czwartym stadium larwalnym i hermafrodytów. Ale piękno tego podejścia polega na tym, że można je zastosować nawet do gatunków niemodelowych. Procedurę zademonstrują pani Raya Jallad, doktorantka z mojego laboratorium oraz dr Antonio Herrera, obecnie główny naukowiec biomedyczny w szkole Baylor w Chattanooga w stanie Tennessee.Zacznij od delikatnego odpipetowania jednego do dwóch mililitrów buforu M9 do ścianki płytki bez rozpylania. Zakręć płytą, aby usunąć robaki. Usuń i wyrzuć cały płyn i robaki, przykładając końcówkę pipety do ścianki płytki na krawędzi agaru, aby uniknąć wybijania.Ten film pokazuje płytkę przed usunięciem matek i larw. Po usunięciu matek i larw należy pozostawić tylko zarodki. Larwa L1 zacznie pojawiać się po inkubacji przez około godzinę.Następnie umieść talerz w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po godzinie wyjąć płytkę z inkubatora. Ostrożnie upuść jeden mililitr buforu M9 na agar i zakręć płytką, aby usunąć L1, ale nie zarodki.Odwirować probówkę i pipetować L1 bezpośrednio na trawnik bakteryjny na talerzu z nasionami. Trzymaj robaki w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Pod mikroskopem preparacyjnym w powiększeniu od 30 do 50 razy zacznij wybierać samce i hermafrodyty z płytek synchronizacyjnych na oddzielne, nieosadzone płytki.Samce różnią się od hermafrodytów wybrzuszonym kształtem i jaśniejszym kolorem ogonów samców w porównaniu ze spiczastym kształtem i ciemniejszym kolorem ogonów hermafrodytów. Zmyj robaki z płytki jednym lub dwoma mililitrami buforu M9 za pomocą końcówki pipety wstępnie umytej buforem M9 zawierającym 0,01% detergentu. Przenieś robaki do jednomililitrowej probówki wirówkowej, wiruj przez minutę i dodaj jeden mililitr buforu M9.Ponownie wiruj przez minutę. Dodaj jeden mililitr lodowatego 70% metanolu i dobrze wymieszaj. Powtórz pranie z jednym mililitrem metanolu, dobrze wymieszaj.Wiruj przez minutę i dodaj 500 mikrolitrów 70% metanolu. Wymieszaj i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę do nocy. Odpipetować 20 mikrolitrów zamocowanych ślimaków na powlekanej stronie naftalanu etylenu lub szkiełka z membraną PEN.Poczekaj, aż metanol wyparuje. Zdejmij plastikową osłonę ze stolika i kliknij przycisk rozładowywania ze strzałką w górę, aby załadować szkiełka membranowe. Upewnij się, że szkiełko jest całkowicie suche, odwróć tak, aby membrana była skierowana w dół i włóż szkiełko.Kliknij przycisk Kontynuuj w oknie zmiany próbki. Uchwyt szkiełka przesunie się. Następnie załóż plastikową osłonę, na dole ekranu wybierz, który uchwyt na suwak zawiera suwak i kliknij przycisk rozładowywania ze strzałką w dół, aby załadować rurki.Wyciągnij tackę i wyjmij blok rurki. Włóż nakrętki czterech probówek PCR o pojemności 500 mikrolitrów do uchwytu i złóż probówkę pod spodem. Umieść blok z powrotem na tacy i wsuń tacę z powrotem do stolika mikroskopu.W wyskakującym oknie urządzenia kolektora zmian wybierz probówki PCR i kliknij OK. Kliknij pustą rurkę w lewym dolnym rogu ekranu pod nasadkami rurki urządzenia kolektora, a następnie na panelu sterowania mikroskopu wybierz TLBF dla oświetlenia światłem przechodzącym w jasnym polu. Używając obiektywu 2,5X, wyreguluj ostrość, aż robaki i struktura powierzchni membrany PEN będą widoczne.Przełącz się na obiektyw 20X i przenieś scenę do regionu bez robaków. Dostosuj ostrość tak, aby struktury przypominające pęcherzyki w membranie miały żółtawy kolor, aby ustawić ostrość lasera na właściwej płaszczyźnie ogniskowej, a następnie ustaw parametry lasera. W przypadku końcówek ogonowych zacznij od mocy 45 przysłony 30 w prędkości 20.Na panelu sterowania lasera wybierz opcję kalibracji i postępuj zgodnie z instrukcjami. Następnie na dole ekranu przy nasadkach rurki urządzenia kolektora kliknij pozycję A, po prawej stronie ekranu wybierz pojedynczy kształt, a następnie narysuj i wytnij. Następnie wybierz punkt do punktu i narysuj linię.Kliknij rozpocznij cięcie, aby laser przeciął membranę. Znajdź robaka i przełącz się, aby się poruszać i ciąć. Użyj myszki, aby przeciąć ogon.Aby pobrać próbkę, przełącz się na ustawienie rysowania i cięcia z funkcją punkt do punktu i narysuj kształt, aby zakończyć cięcie sekcji membrany. Wybierz następną rurkę na nasadce rurki urządzenia zbierającego na dole ekranu i odetnij następną końcówkę ogona. Po wycięciu czterech ogonów rozładuj stojak na rury, klikając rozładuj strzałką w dół.Znajdź skrawki membrany pod mikroskopem preparacyjnym i kontynuuj przetwarzanie próbki. Tutaj sekwencjonowanie RNA za pomocą CEL-Seq2. Odpipetować 1,2 mikrolitra wzorcowej mieszanki startera CEL-Seq2 bezpośrednio na próbkę i zamknąć probówkę.Oznaczyć etykietą numer startera i natychmiast umieścić nakrętkę probówki bezpośrednio na kawałku suchego lodu, aby błyskawicznie zamrozić próbkę, zapobiegając w ten sposób degradacji RNA. Powtarzać tę czynność, aż wszystkie próbki zostaną pobrane. Na koniec przechowuj probówki w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza.Hermafrodyty C.elegans L3 i samce w wieku od 21 do 23 godzin po wykluciu można odróżnić pod mikroskopem preparacyjnym na podstawie morfologii ich ogonów. Opowieść o hermafrodycie jest wąska, podczas gdy opowieść o samcach jest spuchnięta i wydaje się jasna. Wygląd struktury suwaka membrany PEN i ogona ślimaka jest pokazany na tych zdjęciach.Tutaj ostrość jest prawidłowa dla obiektywów 20X i 40X w mikroskopie. Widoczne są tu wypreparowany ogon, częściowo wycięta membrana PEN. Po zamknięciu szczeliny w nacięciu, kawałek membrany wpadnie do nasadki rurki poniżej suwaka.Pokazano tutaj nasadkę rurki z sekcją membrany PEN zawierającą wypreparowaną końcówkę ogona. Obraz graficzny przedstawia unikalny identyfikator molekularny przekształcony w logarytm naturalny lub liczbę UMI na pojedynczą końcówkę ogona dla różnych punktów czasowych i płci. Oprogramowanie powsimR służy do określenia, ile niezależnych próbek jest wymaganych do wykrycia genów o zróżnicowanej ekspresji lub genów DE na różnych poziomach ekspresji.Obraz graficzny tutaj przedstawia prawdziwie dodatni wskaźnik wykrywania genów DE między dwoma warunkami dla czterech różnych symulacji obejmujących różne rozmiary próbek w każdym stanie. Linia przerywana wskazuje 80% odsetek prawdziwie dodatnich. Wskaźnik fałszywych odkryć i te same cztery symulacje są pokazane tutaj.Linia przerywana wskazuje 10% współczynnik fałszywych wykryć. Wykresy pokazały, że wielkość próby wynosząca 70 końcówek ogona na warunek jest wystarczająca do wykrycia genów DE, z wyjątkiem genów o bardzo niskim poziomie ekspresji. Aby zapewnić prawidłową synchronizację, upewnij się, że na płytce znajdują się tylko zarodki.Aby zapobiec utracie próbki, należy odpipetować mieszaninę startera bezpośrednio na sekcję membrany PEN w nasadce i bardzo delikatnie zamykać nakrętkę. Ponieważ jest niezależny od gatunku, możemy użyć tego protokołu do zbadania, w jaki sposób ewoluowały sieci regulacji genów dla struktur homologicznych u różnych gatunków.

laser-microdissection-for-species-agnostic-single-tissue-applications

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroskopia z przechwytywaniem laserowym, znana również jako laserowa mikrodysekcja (LMD), umożliwia użytkownikowi izolację niewielkiej liczby komórek lub tkanek z zamrożonych lub ...

Mikrorozcięcie laserowe z wychwytem (Laser Capture Microdissection) tkanek ssaków

Film opisuje laserową sekcję 3D organotypowego modelu współhodowli z precyzją na poziomie mikronów. W modelach organotypowych 3D składniki zrębu, takie jak fibroblasty, są trójwymiarowo współhodowane z komórkami nabłonka nowotworowego. Model 3D służy jako narzędzie eksperymentalne, które umożliwia badanie inwazji i interakcji rak-zrąb w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Mikrodysekcja laserowa: technika izolowania inwazyjnych komórek raka jelita grubego z modelu hodowli organotypowej 3D

Ten film opisuje technikę uzyskiwania pojedynczej komórki z heterogenicznej populacji komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej. Pojedyncza wyizolowana komórka może być wykorzystana do dalszych badań genomicznych lub badań nad rakiem.

Pobieranie próbek pojedynczych komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej: technika zbierania komórek docelowych z heterogenicznej populacji komórek

SIVQ-LCM to innowacyjne podejście, które wykorzystuje algorytm komputerowy, Przestrzennie Niezmienniczą Kwantyzację Wektorową (SIVQ), do sterowania procesem mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM). Przepływ pracy SIVQ-LCM znacznie poprawia szybkość i dokładność mikrodysekcji, dzięki czemu ma zastosowanie zarówno w warunkach badawczych, jak i klinicznych.

Protokół SIVQ-LCM dla instrumentu ArcturusXT

Mikrodysekcja jest szeroko stosowana do badania DNA, RNA i białek w tkance.   Mikroskopia laserowa (LCM) jest najczęściej stosowaną metodą, ale od niedawna dostępna jest nowa technika mielenia, mezodysekcja.  Pokazujemy ekstrakcję RNA z mezorozpreparowanych szkiełek tkankowych zatopionych w parafinie w formalinie ziarniniaków Mycobacterium tuberculosis.

Nowatorskie podejście do mikrodysekcji w celu odzyskania specyficznych transkryptów Mycobacterium tuberculosis z ziarniniaków płuc zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Tutaj prezentujemy protokół do wspomaganej laserem mikrodysekcji określonych typów komórek roślinnych do profilowania transkrypcyjnego. Chociaż protokół jest odpowiedni dla różnych gatunków i typów komórek, nacisk kładziony jest na wysoce niedostępne komórki żeńskiej linii zarodkowej, ważne dla rozmnażania płciowego i apomiktycznego w rodzaju krzyżowych Boechera.

Mikrodysekcja wspomagana laserowo (LAM) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy przepływ pracy dla sterowanej przez sztuczną inteligencję segmentacji obszarów zainteresowania potwierdzonych patologicznie na podstawie barwionych, cienkich obrazów skrawków tkanek w celu wzbogacenia populacji komórek z rozdzielczością histologiczną za pomocą mikrodysekcji laserowej. Strategia ta obejmuje nowatorski algorytm umożliwiający przenoszenie znaczników oznaczających interesujące populacje komórek bezpośrednio do mikroskopów laserowych.

Uprzemysłowiona, sterowana sztuczną inteligencją mikrodysekcja laserowa do mikroskalowej analizy proteomicznej mikrośrodowiska guza

Laserowe mikrodyparowanie tkanek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej pozwala na precyzyjne pobieranie komórek z interesujących obszarów histologicznych w celu analizy danych multi-omicznych z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi.

Izolacja komórek z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi z próbek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej za pomocą mikrodysekcji laserowej

Protokół ten opisuje metodę izolowania RNA z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby myszy z unieruchomioną o Optymalnej Temperaturze Cięcia z zastosowaniem złożonego tkanki wątroby za pomocą mikrosekcji laserowej, umożliwiającej ukierunkowaną analizę ekspresji genów w dalszej fazie.

Mikroskop laserowego przechwytywania tkanki wątroby myszy utrwalonej paraformaldehydem do analizy RNA

Poznaj mikrodysekcję laserową z protokołem CEL-Seq2 do analizy ekspresji genów w pojedynczych tkankach. Metoda umożliwia badania transkryptomiczne u C. elegans i gatunków nie-modelowych bez konieczności stosowania specyficznych narzędzi genetycznych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Przeglądaj więcej filmów