Name: Kwantyfikacja oddziaływań wiążących między Cu(II) a resztą peptydowymi w obecności i bez chromoforów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Poznaj metody kwantyfikacji termodynamiki wiązania Cu(II) z peptydami przy użyciu spektroskopii absorpcyjnej i kalorymetrii izotermicznej. Techniki te umożliwiają szczegółową analizę interakcji metal-białko.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SC dziękuje Whitehead Summer Research Fellowship. MJS dziękuje Startup Funds i Funduszowi Rozwoju Wydziału Uniwersytetu w San Francisco. MCH potwierdza finansowanie z National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) i National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).

1. Elektroniczna spektroskopia absorpcyjna: bezpośrednie miareczkowanie z konkurencją buforową
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Przygotować buforowany roztwór 50 mM 2-[bis(2-hydroksyetylo)amino]-2-(hydroksymetylo)propano-1,3-diolu (bisTris) o pH 7,4 przy użyciu wody ultraczystej o oporności >18 MΩ). Usuń jony metali śladowych poprzez inkubację z żywicą o wysokim powinowactwie przez co najmniej 2 godziny, a następnie filtrację.</li>
		<li>Rozpuścić lub rozcieńczyć znaną ilość peptydu w buforze niezawierającym metalu. 
		UWAGA: Podczas monitorowania pasm d-d o małych współczynnikach ekstynkcji21, należy stosować wyższe stężenia peptydu. W tym przypadku końcowe stężenie peptydu C w roztworze buforowym wynosiło 300 μM (objętość zależy od wielkości kuwety). Peptyd C został zsyntetyzowany w procesie syntezy peptydów w fazie stałej i jest szczegółowo opisany w innym miejscu w literaturze14.</li>
		<li>Rozpuścić znaną masę CuCl2 w ultraczystej wodzie, aby uzyskać roztwór o stężeniu 10-15 mM. 
		UWAGA: Ważne jest, aby początkowo rozpuścić sól metalu w niebuforowanej wodzie, aby zapobiec wytrącaniu się. Można stosować inne sole Cu(II), ale należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że anion jest słabo skoordynowany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie eksperymentu
	<ol>
		<li>Włącz elektroniczny spektrofotometr absorpcyjny i pozwól mu się rozgrzać przez ~15-20 minut przed użyciem. Uruchom oprogramowanie spektrofotometru i skonfiguruj parametry, takie jak zakres skanowania (200-900 nm), szybkość skanowania (200 nm/s) i korekcja linii bazowej podwójnej wiązki (więcej parametrów znajduje się w pliku uzupełniającym).</li>
		<li>Zbierz linię bazową bez kuwet ani próbek na ścieżkach wiązki.</li>
		<li>Używając dwóch dopasowanych kuwet w spektrofotometrze dwuwiązkowym, załaduj jedną kuwetę 115 μl ultraczystej wody, a drugą kuwetę 115 μl próbki peptydu. Upewnij się, że w kuwetach nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ będą one zakłócać sygnał.</li>
		<li>Umieść kuwetę z ultraczystą wodą w wiązce referencyjnej, a kuwetę z peptydem w wiązce próbki.</li>
		<li>Zbierz widmo absorpcyjne peptydu wolnego od metalu (apo).</li>
		<li>Dodać substechiometryczną ilość (0,5 równoważnika, 150 μM) roztworu Cu(II) do kuwety z próbką peptydu. Upewnij się, że objętość dodanego Cu(II) jest mniejsza niż 3 μl i zapisz objętość do późniejszej analizy.</li>
		<li>Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać roztwór, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Pozwól roztworowi reagować i równoważyć się przez 5 minut i zapisz widmo absorpcyjne.</li>
		<li>Powtórzyć dodawanie podwielokrotności Cu(II) jak w kroku 1.2.6 do roztworu peptydu dla następujących równoważników: 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 i 5,0 (lub łącznie 300, 450, 600, 900 i 1,500 μM). Upewnij się, że zapisałeś całkowitą objętość dodanego Cu(II) i całkowitą objętość kuwety. 
		UWAGA: Jeśli wymagana jest większa rozdzielczość, zmniejsz odstępy między odpowiednikami.</li>
		<li>Wyjmij sample kuweta i dokładnie wyczyść zgodnie ze wskazówkami producenta.</li>
		<li>Dodać buforowany roztwór bez peptydu i zapisać widmo absorpcyjne. Powtórzyć dodawanie podwielokrotności Cu(II) jak w krokach 1.2.5-1.2.8, rejestrując widmo absorpcyjne dla każdego równoważnika Cu(II).</li>
		<li>Eksportuj wszystkie widma jako pliki csv do przetworzenia. Dokładnie wyczyść kuwety zgodnie z instrukcjami producenta i wyłącz spektrofotometr.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie danych
	<ol>
		<li>Załaduj wszystkie widma do programu arkusza kalkulacyjnego.</li>
		<li>Odejmij widmo tylko buforowe (0 μM Cu(II)) od każdego innego widma, aby usunąć wszelkie cechy absorbancji z samego buforu.</li>
		<li>Znormalizować każde widmo, aby uwzględnić rozcieńczenie wynikające z dodania roztworu Cu(II) (krok 1.2.6). Zobacz plik uzupełniający, Eq (1)14 dla przykładu normalizacji, gdziev initial to objętość (115 μL) peptydu dodanego do kuwety, vCu(II) to objętość roztworu Cu(II) dodanego w kroku 1.2.6, awidmo odjęte buforem Abs to dane uzyskane w kroku 1.2.7.</li>
		<li>Sporządź wykres wszystkich widm, aby zidentyfikować obszary zmian. 
		UWAGA: Typowe pasma d-d z kompleksów Cu(II) mieszczą się w zakresie od 500 do 750 nm. To miareczkowanie spektrofotometryczne może być trudne ze względu na mały współczynnik ekstynkcji z pasm d-d, które są przejściami zabronionymi przez Laporte'a w geometrii oktaedrycznej21. Jeśli absorbancja jest zbyt słaba, alternatywnym podejściem jest zastosowanie ligandów chromoforowych, które powodują powstawanie pasm przenoszenia ładunku po związaniu się z Cu(II) (patrz sekcja 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Elektronowa spektroskopia absorpcyjna: konkurencja peptydów z ligandem chromoforycznym
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1,10-fenantrolinę (fen) w ultraczystej wodzie, aby uzyskać końcowe stężenie ~1 mM.</li>
		<li>Oprócz przygotowania próbki opisanej w sekcji 1.1 dla peptydu (etap 1.1.2) i Cu(II) (etap 1.1.3), należy przygotować 10 μM Cu(II) i 40 μM roztwór phen w buforze ([Cu(phen)3]2+). Upewnij się, że objętość wypełnia kuwetę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie eksperymentu
	<ol>
		<li>Uruchomić elektroniczny spektrofotometr absorpcyjny jak w krokach 1.2.1 i 1.2.2, ale ustawić zakres skanowania na 200-400 nm.</li>
		<li>W dwóch dopasowanych kuwetach załaduj jedną kuwetę 115 μl ultraczystej wody, a drugą kuwetę 115 μl roztworu [Cu(phen)3]2+. Umieścić kuwetę z wodą w wiązce referencyjnej, a kuwetę z roztworem [Cu(phen)3]2+ w wiązce próbki.</li>
		<li>Zbierz widmo absorpcyjne kompleksu metal-ligand</li>.
		<li>Dodać stechiometryczną ilość (≈1 równoważnika, ≈10 μM) peptydu do roztworu [Cu(phen)3]2+. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać, ale uważaj, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Zapisz objętość dodanego peptydu do przyszłej analizy. 
		UWAGA: Używając kuwet o pojemności 115 μL, dodanie 3,83 μL peptydu 300 μM daje końcowe stężenie peptydu 9,7 μM.</li>
		<li>Inkubować roztwór przez 5 minut, aby osiągnąć równowagę. Zapisz widmo absorpcyjne. 
		UWAGA: Jeśli powinowactwo wiązania metal-peptyd i metal-ligand są podobne, stężenie dodanego peptydu będzie musiało być w dużym nadmiarze. Pamiętaj, aby wziąć pod uwagę całkowitą objętość peptydu dodanego do normalizacji.</li>
		<li>Powtórzyć dodawanie podwielokrotności peptydów do roztworu [Cu(phen)3]2+ dla następujących przybliżonych równoważników: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 i 26. Zanotować objętość dodanego peptydu, aby można było określić stężenie rozcieńczone.</li>
		<li>Wyjmij sample i dokładnie wyczyść kuwetę zgodnie z instrukcjami producenta. Zbierz widmo bufora. Zebrać widmo peptydu 50 μM w buforze.</li>
		<li>Eksportuj wszystkie dane jako pliki csv do przetworzenia i wyczyść kuwety zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie danych
	<ol>
		<li>Załaduj widma do arkusza kalkulacyjnego i odejmij widmo bufora od innych widm.</li>
		<li>Znormalizuj widma zgodnie z plikiem uzupełniającym, korektor (2)14.</li>
		<li>Korzystając ze współczynnika ekstynkcji dla [Cu(phen)3]2+ przy 265 nm (ε max = 90 000 M-1 cm-1)22, określ stężenie [Cu(phen)3]2+ przy każdym dodaniu peptydu.</li>
		<li>Dla każdego dodania peptydu oznaczyć stężenie kompleksu peptydowego Cu(II), odejmując pozostałe stężenie [Cu(phen)3]2+, jak określono w kroku 2.3.2, od początkowego stężenia [Cu(phen)3]2+ (przy 0 μM peptydu).</li>
		<li>Oblicz stężenie wolnego liganda phen za pomocą równania w pliku uzupełniającym, Eq (3)14.</li>
		<li>Oblicz stężenie wolnego peptydu za pomocą pliku uzupełniającego, Eq (4)14, gdzie [peptyd]stock reprezentuje nierozcieńczony peptyd miareczkowany do kuwety, V1 oznacza objętość dodanego peptydu podstawowego, V2 to całkowita objętość kuwety, a [Cu2+-peptyd] określa się w kroku 2.3.4.</li>
		<li>Oblicz eksperymentalne powinowactwo wiązania (Kex) za pomocą korektora (5) w pliku uzupełniającym23.</li>
		<li>Powiąż stałą dysocjacji peptydu Cu(II) z Kex przez Eq (6)23 w pliku uzupełniającym, gdzie Kd,Cu(II)-phen = 1,0 × 10-9 (patrz 22). Określ średnią i odchylenie standardowe od wszystkich wyznaczonych stałych dysocjacji. 
		UWAGA: W stosunku 4:1 phen:Cu(II), [Cu(phen)3]2+, [Cu(phen)2]2+ i [Cu(phen)]2+ i [Cu(phen)]2+ występują w roztworze, a peptyd będzie chelatował Cu(II) z dala od gatunku ([Cu(phen)]2+) o najsłabszym wiązaniu22.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kalorymetria miareczkowa izotermiczna
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Przygotować buforowany roztwór 15 mM kwasu 3-morfolinopropano-1-sulfonowego (MOPS) o pH 7,4 przy użyciu wody ultraczystej (rezystancja >18 MΩ). Usunąć jony metali śladowych poprzez inkubację z żywicą o wysokim powinowactwie przez co najmniej 2 godziny, a następnie filtrację próżniową przez membranę 0,45 μm w butelce.</li>
		<li>Rozpuścić znaną masę CuCl2 w ultraczystej wodzie, aby przygotować roztwór o stężeniu ≈50-100 mM. Rozcieńczyć ten roztwór Cu(II) do buforu, aby otrzymać 1,0 ml roztworu o końcowym stężeniu 1,4 mM Cu(II). Zanotować dokładną objętość użytego roztworu CuCl2</li>.
		<li>Rozpuścić lub rozcieńczyć roztwór peptydu w buforze, aby uzyskać 450 μl roztworu peptydu o stężeniu 154 μM. Upewnij się, że do roztworu peptydowego zostanie dodana taka sama proporcja dodatkowej wody ultraczystej z kroku 3.1.2, co zmniejszy ciepło rozcieńczenia i zwiększy stosunek sygnału do szumu.</li>
		<li>Po przygotowaniu próbek należy upewnić się, że roztwory mają takie samo pH i, w razie potrzeby, odpowiednio dostosować.</li>
		<li>Opcjonalny krok: Odgazowanie roztworów w celu zminimalizowania mikropęcherzyków załadowanych do ITC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie eksperymentu
	<ol>
		<li>Włącz funkcję ITC. Uruchom oprogramowanie ITC, aby uruchomić urządzenie. Poczekaj na pierwszą inicjalizację, która poprosi o ponowne umieszczenie biurety w domu; Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.</li>
		<li>Zdejmij pokrywę z komórki referencyjnej. Usunąć wodę z celi referencyjnej i spłukać trzykrotnie 450 μl odgazowanej ultraczystej wody.</li>
		<li>Powoli nabierać ultraczystą wodę do oznaczenia 450 μl strzykawki ładującej, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do strzykawki. Włożyć strzykawkę ładującą do kuwety referencyjnej tak, aby znajdowała się ≈1 mm od dna, a następnie powoli wstrzykiwać część roztworu, aż w strzykawce ładującej pozostanie 150 μl. Kilkakrotnie przesunąć tłok strzykawki ładującej w górę i w dół o ≈25 μl, aby usunąć pęcherzyki na powierzchni komórki. Powoli wstrzykiwać, aż tłok osiągnie oznaczenie 100 μl na strzykawce ładującej, dozując w ten sposób łącznie 350 μl ultraczystej wody do celi referencyjnej, a następnie założyć pokrywę kuwety referencyjnej.</li>
		<li>Usunąć resztki roztworu z celi próbki i obciążyć 450 μl 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) za pomocą strzykawki ładującej. Moczyć przez 10 minut, aby upewnić się, że jony metali śladowych zostały usunięte, ponieważ EDTA wiąże metale śladowe.</li>
		<li>Usunąć roztwór EDTA (ze związanymi jonami metali śladowych) i dokładnie przepłukać strzykawkę ładującą dużą ilością ultraczystej wody.</li>
		<li>Wyczyść ITC zgodnie ze wskazówkami producenta, przepłukując sample cell ultraczystą wodą.</li>
		<li>Kondycjonować celę próbki, przepłukując ją co najmniej trzykrotnie 450 μl buforu.</li>
		<li>Usuń bufor, który kondycjonuje próbkę komórki. Załadować roztwór peptydu do celi próbki za pomocą strzykawki ładującej (wykonaj krok 3.2.3).</li>
		<li>Przepłukać strzykawkę do miareczkowania 200 μl roztworu buforowego. W tym celu należy zdjąć tłok i za pomocą mikropipety odpipetować bufor przez otwór w górnej części szklanej strzykawki do miareczkowania, przez strzykawkę i wyjąć igłę znajdującą się poniżej.</li>
		<li>Całkowicie włożyć tłok do strzykawki do miareczkowania.</li>
		<li>Zanurzyć końcówkę igły strzykawki do miareczkowania w roztworze metalu i powoli pociągnąć tłok do góry, powodując wypełnienie strzykawki roztworem metalu i powstanie pusta objętość w górnej części szklanej strzykawki do miareczkowania. Usunąć większość pustej przestrzeni, obracając strzykawkę do miareczkowania równolegle do podłogi, wyjąć tłok i lekko przechylić szklaną część w kierunku podłogi. Delikatnie potrząsnąć strzykawką do miareczkowania, tak aby roztwór przesunął się do końca szklanej części strzykawki do miareczkowania i wypełnił większość pustej przestrzeni, ale upewnij się, że pozostały 2-3 μl pustej objętości. Trzymając strzykawkę równolegle do podłogi, ponownie włożyć tłok.</li>
		<li>Trzymać strzykawkę do miareczkowania pionowo, zanurzyć końcówkę igły z powrotem w roztworze metalu i wcisnąć tłok w dół, aż powietrze przestanie wydostawać się z igły. Załadować strzykawkę do miareczkowania, powoli pociągając tłok do góry do poziomu nieco powyżej oznaczenia 50 μl, trzymając końcówkę igły w roztworze.</li>
		<li>Ostrożnie włożyć szklaną część strzykawki do miareczkowania do biurety i dokręcić do oporu. Gdy niewielka ilość roztworu wydostanie się ze strzykawki do miareczkowania w wyniku ściśnięcia tłoka, należy użyć lekkiej, delikatnej wycieraczki, aby ostrożnie wchłonąć roztwór bez dotykania końcówki igły.</li>
		<li>Włożyć biuretę ze strzykawką do miareczkowania do celi próbki i mocno ją zamocować.</li>
		<li>Skonfiguruj parametry w oprogramowaniu ITC. Zaczynając od Instrument Control, ustaw szybkość mieszania (typowe szybkości mieszania wahają się od 150 do 350 obr./min) i temperaturę, w której zostanie przeprowadzony eksperyment (zwykle 25 °C). Wprowadź stężenia strzykawki i komórek w jednostkach milimolowych w obszarze Szczegóły eksperymentu.</li>
		<li>W sekcji Experiment Method (Metoda eksperymentu) wybierz opcję Incremental Tiration (Miareczkowanie przyrostowe). Kliknij Setup (Konfiguracja) i określ 20 wstrzyknięć po 2,5 μl. Jeśli do zaobserwowania zdarzenia wiązania wymagana jest większa rozdzielczość, należy zwiększyć liczbę wstrzyknięć i zmniejszyć objętość na wstrzyknięcie. Wprowadź odstęp czasowy między każdym wstrzyknięciem, tak aby był wystarczająco długi, aby sygnał zrównoważył się i powrócił do linii podstawowej, zwykle 300 s.</li>
		<li>Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć eksperyment i określić miejsce zapisywania danych.</li>
		<li>Po zakończeniu eksperymentu wyczyść celę próbki i strzykawkę do miareczkowania.</li>
		<li>Przeprowadź wszystkie eksperymenty w co najmniej trzech egzemplarzach, aby zapewnić precyzyjne zbieranie danych.</li>
		<li>Przeprowadź eksperyment kontrolny, w którym roztwór metalu jest miareczkowany do roztworu buforowanego (pod nieobecność peptydu), aby upewnić się, że ciepło rozcieńczania jonu metalu jest małe i że nie ma niewyjaśnionych równowag. Jeśli ciepło rozcieńczania jest duże, należy rozważyć inny system buforowy, jeśli to możliwe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie danych
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie do analizy ITC i załaduj plik danych do analizy.</li>
		<li>Przejdź do zakładki Linia bazowa i sprawdź termogram. Zwróć uwagę na wszelkie egzogenne ciepło wydzielające się lub pochłaniane z pęcherzyków powietrza lub innych artefaktów na termogramie. Poszukaj kolców, które nie są spowodowane wstrzyknięciem roztworu metalu.</li>
		<li>Upewnij się, że linia bazowa wygenerowana przez oprogramowanie analityczne jest zgodna z częścią danych po wstrzyknięciu i zrównoważeniu. Jeśli odchyla się, użyj punktów obrotu linii bazowej, aby dostosować linię bazową. Upewnij się, że regiony integracji obejmują pik wygenerowany w wyniku wstrzyknięcia metalu, ale nie zawierają żadnych pęcherzyków powietrza ani artefaktów na termogramie znalezionym w kroku 2. Odejmij linię bazową od termogramu. 
		UWAGA: Ten rodzaj manipulacji jest zalecany tylko po zebraniu wielu termogramów, aby eksperymentator wiedział, co jest rzeczywistymi danymi, a co artefaktem, ponieważ dostosowanie linii bazowej i regionów integracji może drastycznie wpłynąć na dane.</li>
		<li>Przejdź do okna Modelowanie, aby rozpocząć dopasowywanie danych, w którym oprogramowanie analityczne pokaże zintegrowane i znormalizowane dane dla każdego wstrzyknięcia.</li>
		<li>Kliknij lewym przyciskiem myszy odniesienie pierwszego wtrysku, aby usunąć je z algorytmu dopasowania. 
		UWAGA: Jest to powszechne, ponieważ dochodzi do niewielkiego wymieszania titranta z roztworem komórek próbki, co prowadzi do niedokładnego dozowania zębów trzonowych w pierwszym wstrzyknięciu.</li>
		<li>W sekcji Modele wybierz opcję Puste (stałe) z menu rozwijanego Styl, które jest oparte na końcowej entalpii wtrysku i zostanie odjęte od każdego punktu danych, biorąc pod uwagę ciepło rozcieńczenia. Ponadto wybierz opcję Niezależny (lub najlepszy model dla systemu) z drugiego menu rozwijanego Styl, aby dopasować dane. 
		UWAGA: W przypadku standardowych interakcji powiązań 1:1 najczęściej spotykanym modelem jest model niezależny.</li>
		<li>Dopasuj dane za pomocą dwóch modeli, naciskając zielony przycisk odtwarzania z Σ. 
		UWAGA: Innym programem do przetwarzania danych ITC jest SEDPHAT24.</li>
		<li>Uwzględnij wszystkie konkurujące ze sobą równowagi w analizie post hoc opisanej wcześniej przez Grossoehme i wsp.20.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li>
<li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li>
<li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+structure%2C+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).</li>
<li>Kaplan, J. H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+transport+in+mammalian+cells%3A+Special+care+for+a+metal+with+special+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li>
<li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+binding+of+Cu%28II%29+ions+to+a+fragment+of+the+A%CE%B2+%281-42%29+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy%2C+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li>
<li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li>
<li>García, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper%28II%29+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106%E2%88%92115%3A+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li>
<li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper%28II%29+by+CD+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li>
<li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li>
<li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li>
<li>Żamojć, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper%28II%29+ions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li>
<li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-%CE%B2+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li>
<li>Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper%28II%29+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li>
<li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li>
<li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li>
<li>Magyar, J. S., Godwin, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectropotentiometric+analysis+of+metal+binding+to+structural+zinc-binding+sites%3A+Accounting+quantitatively+for+pH+and+metal+ion+buffering+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects.</a> Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).</li>
<li>Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28Un%29suitability+of+the+use+of+pH+buffers+in+biological%2C+biochemical+and+environmental+studies+and+their+interaction+with+metal+ions+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review.</a> RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).</li>
<li>Sigel, H., Martin, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+properties+of+the+amide+bond.+stability+and+structure+of+metal+ion+complexes+of+peptides+and+related+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands.</a> Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteins+containing+cytochrome%2C+iron-sulfur%2C+or+copper+redox+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers.</a> Chemical Reviews. 114 (8), 4366(2014).</li>
<li>Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li>
<li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiessler%2C+GL+%22Inorganic+Chemistry%22">Inorganic Chemistry</a>. , Pearson. (2014).</li>
<li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+direct+red+81+dye%2Fcopper%28II%29-phenanthroline+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li>
<li>Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li>
<li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li>
<li>NIST. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Critically+Selected+Stability+Constants+of+Metal+Complexes%2C+Version+8.0%22">Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0</a>. , (2004).</li>
<li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman%27s+reagent+and+with+4%2C4%E2%80%B2-dithiodipyridine%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4′-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W artykule przedstawiono solidną metodę ilościowego określania powinowactwa i termodynamiki wiązania Cu(II) z peptydami. Kompleksy z Cu(II) idealnie nadają się do monitorowania pasma absorpcji d-d w miejscu metalu ze względu na konfigurację elektronową d9 . Chociaż współczynnik ekstynkcji jest niewielki, co wymaga większych stężeń kompleksu, aby uzyskać wiarygodny sygnał, miareczkowanie Cu(II) do peptydu może szybko dostarczyć wglądu w stechiometrię wiązania i przybliżone powinowactwo wiązania. Jednak dostrzeż...

Biologia ewoluowała, aby wykorzystywać różnorodną chemię jonów metali potrzebnych do adaptacji i przetrwania życia w otaczającym środowisku. Szacuje się, że 25%-50% białek wykorzystuje jony metali do budowy i funkcji1. Szczególna rola i stan redoks jonu metalu jest bezpośrednio związana ze składem i geometrią biologicznych ligandów, które go koordynują. Ponadto jony metali aktywnych redoks, takie jak Cu(II), muszą być ściśle regulowane, aby nie oddziaływały ze środkami utleniającymi za pomocą chemii podobnej do Fentona, tworząc reaktywne formy tlenu (ROS)2,3,4. Zrozumienie sposobów wiązania i powinowactwa, które napędzają jego biochemię, powinno pomóc w wyjaśnieniu biologicznej roli jonu metalu.
Wiele technik jest używanych do badania oddziaływań wiążących metale i peptydy. Są to głównie techniki spektroskopowe, ale obejmują również symulacje komputerowe wykorzystujące dynamikę molekularną, co widać poprzez interakcje Cu(II) z fragmentem beta-amyloidu (Aβ)5. Szeroko stosowaną techniką spektroskopową, która jest dostępna dla wielu uniwersytetów, jest magnetyczny rezonans jądrowy (NMR). Wykorzystując paramagnetyczną naturę Cu(II), Gaggelli i in. byli w stanie pokazać, gdzie jon metalu wiąże się na petide poprzez relaksację pobliskich jąder6. Elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR) może być również wykorzystany do zbadania lokalizacji i trybu wiązania jonów metali paramagnetycznych7. Inne techniki spektroskopowe, takie jak dichroizm kołowy (CD), mogą opisywać koordynację wokół Cu(II) w układach takich jak układy tripeptydowe8, a spektrometria mas może pokazać stechiometrię i to, do których pozostałości jon metalu jest koordynowany za pomocą wzorców fragmentacji9,10.
Niektóre z tych technik, takie jak NMR, są bezznacznikowe, ale wymagają dużych stężeń peptydu, co stanowi wyzwanie dla badań. Inna popularna technika, zwana spektroskopią fluorescencyjną, została wykorzystana do powiązania pozycji tyrozyny lub tryptofanu z hartowaniem z klasy Cu(II)<sup="xref">11,12. Podobnie, ta technika może pokazać zmiany strukturalne w wyniku wiązania Cu(II) class13. Jednak wyzwania związane z tymi badaniami wiązania metal-peptyd polegają na tym, że badają one aminokwasy chromoforowe, takie jak tyrozyna, które nie wszystkie systemy mają, że jon metalu wiąże się w klasycznym modelu i że technika ta może nie sprzyjać w warunkach fizjologicznych. Rzeczywiście, pojawia się kilka peptydów, które nie zawierają takich aminokwasów chromoforowych lub wiążą się z klasycznymi modelami, co wyklucza stosowanie tych technik14,15. W tym artykule szczegółowo opisano podejścia do oceny właściwości wiązania w tych scenariuszach w warunkach fizjologicznie istotnych.
Ligandy biologiczne mogą przyjmować różne stany protonacji, które mogą wpływać na wiązanie jonów metali, takie jak pierścień imidazolowy na histydynie. Jeśli pH nie jest konsekwentnie utrzymywane, wyniki mogą być zawiłe lub sprzeczne. Z tego powodu są niezbędnym składnikiem w badaniu oddziaływań metal-białko/peptyd. Wykazano jednak, że wiele korzystnie oddziałuje z jonami metali16,17. Oprócz konkurowania z interesującą cząsteczką biologiczną, bufor może mieć podobne atomy koordynujące, które mogą być trudne do odróżnienia od koordynujących atomów peptydu lub białka. W niniejszej pracy skupiono się na elektronicznej spektroskopii absorpcyjnej i izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC) jako dwóch uzupełniających się technikach badania oddziaływań Cu(II)-peptyd, ze szczególnym uwzględnieniem wyboru buforu.
Elektroniczna spektroskopia absorpcyjna to szybka, szeroko dostępna technika badania oddziaływań wiążących metale. Naświetlanie światłem w ultrafiolecie (UV) lub w zakresie widzialnym może prowadzić do absorpcji pasm d-d skoncentrowanych na metalu, które dostarczają cennych informacji na temat klasyfikacji ligandów, geometrii metali i pozornego powinowactwa wiązań18,19. W przypadku tych kompleksów bezpośrednie miareczkowanie jonów metali do roztworów białek lub peptydów może określić ilościowo stechiometrię wiązania i pozorne powinowactwo wiązania. W niektórych przypadkach, takich jak konfiguracje elektronowe d5 lub d10, kompleks nie absorbuje światła (tj. jest spektroskopowo cichy). W tych spektroskopowo cichych kompleksach metali przejściowych ograniczenia te można obejść, stosując konkurencyjny ligand, który po skoordynowaniu z jonem metalu daje wykrywalne pasma przenoszenia ładunku. W obu przypadkach podejście to ogranicza się do ilościowego określenia tylko stechiometrii i pozornego powinowactwa wiązania, a żaden wgląd w entalpię wiązania nie jest dostarczany bez przybliżeń.
Uzupełniając informacje uzyskane z elektronicznej spektroskopii absorpcyjnej, ITC jest atrakcyjną techniką do bezpośredniego i rygorystycznego oznaczania entalpii wiązania20. ITC bezpośrednio mierzy ciepło uwalniane lub zużywane podczas wiązania, a ponieważ miareczkowanie odbywa się przy stałym ciśnieniu, mierzone ciepło jest entalpią wszystkich równowag (ΔHITC). Ponadto określa się ilościowo stechiometrię zdarzenia wiązania (n) i pozorne powinowactwo wiązania (KITC). Na podstawie tych parametrów wyznaczana jest energia swobodna (ΔGITC) i entropia (ΔSITC), zapewniając termodynamiczny obraz zdarzenia wiązania. Ponieważ nie opiera się na absorpcji światła, ITC jest idealną techniką dla spektroskopowo cichych gatunków, na przykład kompleksów jonów metali d5 lub d10. Ponieważ jednak kalorymetria mierzy ciepło, wszelkie niedopasowane systemy buforowe i nieuwzględnione równowagi mogą niekorzystnie wpłynąć na analizę w celu dokładnego określenia termodynamiki wiązania jonów metali i należy dołożyć wszelkich starań, aby uwzględnić te czynniki20. Jeśli ITC jest wykonywane z odpowiednim rygorem, jest solidną techniką określania termodynamiki kompleksów metal-białko/peptyd.
Tutaj używany jest chromoforycznie cichy peptyd wiążący miedź, peptyd C, aby zademonstrować komplementarne zastosowanie tych dwóch technik. Peptyd C jest produktem rozszczepienia 31 reszt (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) powstającym podczas dojrzewania insuliny; brakuje mu reszt chromoforowych, ale wykazano, że wiąże Cu(II) z fizjologicznie istotnym powinowactwem14,15. Miejsce wiązania Cu(II) składa się z łańcuchów bocznych glutaminianu i asparaginianu, a także N-końca peptydu14,15. Te koordynujące się atomy bardzo przypominają te z wielu powszechnie używanych systemów buforowych. W tym miejscu pokazano tandemowe zastosowanie pasm d-d i przenoszenia ładunku w elektronicznej spektroskopii absorpcyjnej i ITC w ilościowym określaniu termodynamiki wiążącej Cu(II) z peptydem C. Podejście wynikające z badania wiązania Cu(II) z peptydem C można zastosować do innych jonów metali i układów białkowo-peptydowych.

<table><tbody><tr><td>1,10-fenantrolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>131377-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bufor bis-Tris</td><td>Fisher</td><td>BP301-100</td><td></td></tr><tr><td>Membrana butelkowa 0,45 mikrona</td><td>Nalgene</td><td>296-4545</td><td>Dopuszczalny jest każdy system filtracji, który usuwa żywicę bez wprowadzania zanieczyszczeń</td></tr><tr><td>Chlorek miedzi(II)</td><td>Alfa Aesar</td><td>12458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczny spektrofotometr absorpcyjny</td><td>Varian</td><td>Cary 5000</td><td>Innym odpowiednim czułym spektrofotometrem jest dopuszczalna</td></tr><tr><td>żywica o wysokim powinowactwie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7901-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kalorymetr miareczkowania izotermicznego (ITC)</td><td>TA Instrumenty</td><td>Nano ITC Oprogramowanie</td> do analizy ITC o małej objętości <td></td></tr><tr><td></td><td>TA Instruments</td><td>NanoAnalyze</td><td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&ndash; 148) może być również używany</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ITC</td><td>TA Instruments</td><td>ITCRun</td><td></td></tr><tr><td>lekka delikatna wycieraczka</td><td>Kimwipe</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka ładująca</td><td>Hamilton</td><td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td><td></td></tr><tr><td>dopasowane kuwety</td><td>Starna Cells, Inc</td><td>16.100-Q-10/Z20</td><td>Upewnij się, że okienko kuwety o małej objętości odpowiada wysokości wiązki spektrofotometru</td></tr><tr><td>Bufor MOPS</td> Oprogramowanie spektrofotometru <td>Alfa Aesar</td><td>A12914</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cary</td><td>WinUV Scan</td><td></td></tr><tr><td>arkusz kalkulacyjny</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td>Każdy odpowiedni program do arkuszy kalkulacyjnych będzie działał</td></tr><tr><td>strzykawka do miareczkowania</td><td>TA Instruments</td><td>5346</td><td></td></tr><tr><td>woda ultraczysta</td><td>Millipore Sigma</td><td>Milli-Q</td><td>Każda woda jest w porządku, o ile >18 M&Omega; opór</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja oddziaływań wiążących między cu(ii) a resztą peptydowymi w obecności i bez chromoforów

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Miedź(II) jest niezbędnym metalem w systemach biologicznych, nadając unikalne właściwości chemiczne biomolekułom, z którymi oddziałuje. Doniesiono, że bezpośrednio wiąże się z różnymi peptydami i odgrywa zarówno niezbędne, jak i patologiczne role, począwszy od pośredniczącej struktury, przez właściwości przenoszenia elektronów, po nadawanie funkcji katalitycznej. Kwantyfikacja powinowactwa wiązania i termodynamiki tych kompleksów peptydowych Cu(II) in vitro dostarcza informacji na temat termodynamicznej siły napędowej wiązania, potencjalnej konkurencji między różnymi jonami metali dla peptydu lub między różnymi peptydami dla Cu(II) oraz częstości występowania kompleksu peptydowego Cu(II) in vivo. Jednak ilościowe określenie termodynamiki wiązania może być trudne ze względu na niezliczone czynniki, w tym uwzględnienie wszystkich konkurujących równowag w eksperymencie miareczkowania, zwłaszcza w przypadkach, gdy brakuje dyskretnych uchwytów spektroskopowych reprezentujących peptyd, jon metalu bloku d i ich interakcje.
Tutaj dostępny jest solidny zestaw eksperymentów do dokładnego ilościowego określenia termodynamiki peptydu Cu(II). W artykule skoncentrowano się na zastosowaniu elektronicznej spektroskopii absorpcyjnej w obecności i bez ligandów chromoforowych w celu zapewnienia potrzebnej kontroli spektroskopowej na Cu(II) oraz zastosowaniu bezznacznikowej kalorymetrii miareczkowania izotermicznego. W obu technikach eksperymentalnych proces jest opisany w taki sposób, aby uwzględniał wszystkie konkurujące ze sobą równowagi. Chociaż ten artykuł koncentruje się na Cu(II), opisany zestaw eksperymentów może mieć zastosowanie poza interakcjami Cu(II) z peptydem i zapewnić ramy dla dokładnej kwantyfikacji innych układów metal-peptyd w fizjologicznie istotnych warunkach.

Celem było ilościowe określenie i potwierdzenie termodynamiki wiązania Cu(II) do C-peptydu przy użyciu komplementarnych technik spektroskopii absorpcyjnej i ITC. Ze względu na wysoką stabilność spektroskopii absorpcyjnej przeprowadzono bezpośrednie miareczkowanie Cu(II) w roztworze 300 µM C-peptydu (Rysunek 1). Dodanie 150 µM Cu(II) spowodowało natychmiastowy wzrost pasma przy 600 nm, przypisywanego pasmu d-d Cu(II), a wzrost ten trwał aż do dodania 300 µM Cu(II). Dalsze dodawanie powyżej 30...

Ten artykuł skupia się na wykorzystaniu elektronicznej spektroskopii absorpcyjnej i izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do badania i ilościowego określania termodynamiki wiązania Cu(II) z peptydami i białkami.

Kwantyfikacja oddziaływań wiążących między Cu(II) a resztą peptydowymi w obecności i bez chromoforów

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

Metoda ta pozwoli naukowcowi na sondowanie trudnych do zbadania układów, takich jak peptydy i jony metali przejściowych pierwszego rzędu, które są na ogół trudne przy użyciu bardziej standardowych zastosowań. Główną zaletą jest tutaj stosowanie technik ortogonalnych, ponieważ dobrze się uzupełniają, a to może dać większy wgląd w system i pomóc nam nie przegapić żadnego zjawiska. Metoda opisana w tym filmie bardzo dobrze nadaje się do badania innych systemów.Chociaż pokazujemy go za pomocą Cu (II) i peptydu, może być stosowany do wielu różnych interakcji peptydów metali i białek metali. Myślę, że najtrudniejszą częścią będzie znalezienie dobrego wyboru bufora dla twojego jonu metalu i peptydu. Zapoznałbym się z literaturą, aby zobaczyć, jakie były wcześniej używane przez innych.Procedurę zademonstruje Sohee Choi, doktorantka w moim laboratorium badawczym. Aby rozpocząć, włącz elektroniczny spektrofotometr absorpcyjny i pozwól mu się rozgrzać przez około 15 do 20 minut przed użyciem. Następnie uruchom oprogramowanie spektrofotometru i skonfiguruj parametry, takie jak zakres skanowania od 200 do 900 nanometrów, zakres skanowania 200 nanometrów na sekundę i skorygowana linia bazowa podwójnej wiązki.Następnie zbierz linię bazową bez kuwet ani próbek na ścieżkach wiązki. Używając dwóch dopasowanych kuwet w spektrofotometrze z podwójną wiązką, załaduj jedną kuwetę 115 mikrolitrami ultraczystej wody, a drugą kuwetę 115 mikrolitrami próbki peptydu, upewniając się, że w kuwetach nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ będą one zakłócać sygnał. Następnie umieść kuwetę z ultraczystą wodą w wiązce referencyjnej, a kuwetę z peptydem w wiązce próbki.Następnie zbierz widmo absorpcyjne peptydu wolnego od metalu. Dodać substechiometryczną ilość roztworu Cu(II) do kuwety z próbką peptydu i zapisać objętość do późniejszej analizy. Delikatnie przeciskaj to w górę iw dół, aby wymieszać roztwór, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.Po wyrównaniu przez pięć minut umieść kuwetę z powrotem w uchwycie na próbkę i zapisz widmo absorpcyjne. Następnie powtórzyć dodawanie podwielokrotności Cu(II) do roztworu peptydu dla różnych równoważników i zapisać całkowitą objętość Cu(II) dodanego do kuwety. Po zainicjowaniu oprogramowania, jak opisano wcześniej, w dwóch dopasowanych kuwetach załaduj jedną kuwetę 115 mikrolitrami ultra czystej wody, a drugą kuwetą 115 mikrolitrami złożonego roztworu miedzi i fenu.Umieścić kuwetę z wodą w wiązce referencyjnej, a kuwetę z roztworem kompleksu miedziowo-fenowego w wiązce próbki. Następnie zbierz widmo absorpcyjne kompleksu ligandów metalowych. Następnie dodaj stechiometryczną ilość peptydu do roztworu kompleksu miedziowo-fenowego i delikatnie przeciśnij go w górę iw dół, aby dokładnie wymieszać, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza.Następnie inkubuj roztwór przez pięć minut, aby osiągnąć równowagę. Włóż kuwetę z powrotem do uchwytu na próbkę i zapisz widmo absorpcji. Później powtórz dodawanie podwielokrotności peptydów do roztworu kompleksu miedź-fen dla różnych równoważników i zapisz objętość dodanego peptydu, aby można było określić rozcieńczone stężenie.Najpierw włącz ITC i uruchom oprogramowanie ITC, aby uruchomić urządzenie. Po pierwszej inicjalizacji umieść biuretę z powrotem w domu i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Następnie wyjmij biuretę i pokrywę z celi referencyjnej.Następnie usuń wodę z celi referencyjnej i spłucz trzykrotnie 450 mikrolitrami odgazowanej ultra czystej wody. Powoli nabierać ultra czystą wodę do oznaczenia 450 mikrolitrów strzykawki ładującej, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do strzykawki. Następnie włożyć strzykawkę ładującą do celi referencyjnej, aż znajdzie się około jednego milimetra od dna i powoli wstrzykiwać część roztworu, aż w strzykawce ładującej pozostanie 150 mikrolitrów.Następnie kilkakrotnie szybko przesuń tłok strzykawki ładującej w górę i w dół o około 25 mikrolitrów, aby usunąć wszelkie pęcherzyki na powierzchni komórki. Następnie powoli wstrzykiwać, aż tłok osiągnie oznaczenie 100 mikrolitrów na strzykawce ładującej, dozując w ten sposób łącznie 350 mikrolitrów ultraczystej wody do celi referencyjnej i zakładając pokrywę kuwety referencyjnej. Po usunięciu pozostałego roztworu z celi próbki, załaduj 450 mikrolitrów 10-milimolowego EDTA za pomocą strzykawki ładującej i moczyć przez 10 minut, aby upewnić się, że jony metali śladowych zostały usunięte, ponieważ EDTA zwiąże metale śladowe.Po usunięciu roztworu EDTA dokładnie wypłucz strzykawkę ładującą dużą ilością ultra czystej wody. Wyczyść ITC zgodnie ze wskazówkami producenta, przepłukując sample kuweta ultra czystą wodą. Usunąć resztki wody z celi próbki, a następnie kondycjonować celę próbki, przepłukując ją co najmniej trzykrotnie 450 mikrolitrami buforu.Następnie usuń resztkowy bufor, który kondycjonuje komórkę próbki i załaduj roztwór peptydu do celi próbki za pomocą strzykawki ładującej. Następnie przepłukać strzykawkę do miareczkowania 200 mikrolitrami buforowanego roztworu, najpierw usuwając tłok. Za pomocą mikropipety odpipetować roztwór buforowy przez otwór w górnej części szklanej strzykawki do miareczkowania, przeciąć strzykawkę i wyjąć igłę znajdującą się poniżej.Później całkowicie włożyć tłok do strzykawki do miareczkowania. Następnie zanurzyć końcówkę igły strzykawki do miareczkowania w roztworze metalu i powoli pociągnąć tłok do góry, powodując napełnienie strzykawki roztworem metalu i powstając pustą objętość w górnej części szklanej strzykawki do miareczkowania. Aby usunąć pustą przestrzeń, obrócić strzykawkę do miareczkowania równolegle do podłogi.Następnie zdejmij tłok i lekko przechyl szklaną część w kierunku podłogi. Delikatnie wstrząsnąć strzykawką do miareczkowania, tak aby roztwór przesunął się do szklanej części strzykawki do miareczkowania i wypełnił większość pustej przestrzeni. Ale upewnij się, że pozostały dwa do trzech mikrolitrów pustej objętości.Trzymając strzykawkę równolegle do podłogi, ponownie włożyć tłok. Następnie należy trzymać strzykawkę do miareczkowania pionowo i zanurzyć końcówkę igły z powrotem w roztworze metalu. Następnie wcisnąć tłok w dół, aż powietrze przestanie wydostawać się z igły i załadować strzykawkę do miareczkowania, powoli pociągając tłok do góry do poziomu nieco powyżej oznaczenia 50 mikrolitrów, trzymając końcówkę igły w roztworze.Ostrożnie włożyć szklaną część strzykawki do miareczkowania do biurety i dokręcić do oporu. Następnie, używając lekkiej, delikatnej wycieraczki, wchłonąć roztwór, który wydostaje się ze strzykawki do miareczkowania w wyniku ściśnięcia tłoka bez dotykania końcówki igły. Następnie włóż biuretę ze strzykawką do miareczkowania do celi próbki i mocno ją zamocuj.Aby skonfigurować parametry oprogramowania ITC, wybierz opcję Instrument Control (Sterowanie instrumentem). Ustaw szybkość mieszania i temperaturę. Następnie w obszarze Szczegóły eksperymentu wprowadź stężenia strzykawki i komórek w jednostkach milimolowych.Następnie w sekcji Experiment Method (Metoda eksperymentu) wybierz opcję Incremental Tiration (Miareczkowanie przyrostowe). Kliknij Setup i określ 20 wstrzyknięć po 2,5 mikrolitra, a jeśli wymagana jest większa rozdzielczość do zaobserwowania zdarzenia wiązania, zwiększ liczbę wstrzyknięć i zmniejsz objętość na wstrzyknięcie. Następnie wprowadź odstęp czasowy między każdym wstrzyknięciem, tak aby był wystarczająco długi, aby sygnał zrównoważył się i powrócił do linii bazowej, zwykle 300 sekund.Następnie kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć eksperyment i określić miejsce zapisywania danych. Miareczkowanie Cu (II) przeprowadzono do peptydu C, wykazując, że dodanie 150 mikromoli Cu (II) spowodowało natychmiastowy wzrost w paśmie na 600 nanometrach przypisanym pasmu d-d Cu (II) i kontynuowało wzrost do momentu dodania 300 milimolowych Cu (II). Dalsza addycja powyżej 300 mikromolowych Cu(II) nie zwiększyła absorpcji zakazu d-d wskazującego na nasycenie i to, że Cu(II) wiąże się z peptydem C w kompleksie 1:1 o wartości logarytmu K większej niż sześć.Peptyd C miareczkowano do około 10 mikromolowego kompleksu miedzi-fenu, a absorpcja z pasma przenoszenia ładunku przy 265 nanometrach zmniejszyła się, co wskazuje, że peptyd C był w stanie chelatować Cu (II) z ligandu fenantroliny o wartości log K od 7,4 do 7,8. Termogram ITC pokazuje miareczkowanie 1,4 milimolowego Cu(II) do 154 mikromolowego peptydu C w 155-milimolowym buforze MOPS. Stwierdzono, że powinowactwo wiązania ma wartość logarytmu K równą ośmiu ze zmianą entalpii jako 8 kilodżuli na mol.Energia swobodna Gibbsa wynosi minus 46 kilodżuli na mol, a zmiana entropii wynosi 120 dżuli na mol na kelwin. Kontrolowane miareczkowanie 1,4 milimolowego Cu(II) do 15-milimolowego buforu MOPS przy braku peptydu C nie wykazuje wiązania w termogramie. Powiedziałbym, że upewnienie się, że wszystko jest czyste.Jeśli po poprzednich eksperymentach pozostały jony lub peptydy metali, może to drastycznie wpłynąć na stechiometrię i zapewnić nieznaną konkurencję w eksperymentach wiązania. Dichroizm kołowy to kolejna metoda badania interakcji peptydów metali lub białek metali, ponieważ dotyczy chiralności. Spektrometria mas może również badać te kompleksy, przyglądając się zmianom masy.Ten zestaw technik był używany przez wiele laboratoriów, które badają jony metali oddziałujące z peptydami lub białkami.

quantifying-binding-interactions-between-cu-ii-peptide-residues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Struktura roztworu NMR peptydu modelowego metalochaperonu z Cu (I) została określona, a szczegółowy protokół od przygotowania próbki i zbierania danych 1D i 2D do struktury trójwymiarowej jest opisany.

Oznaczanie struktury i koordynacji kompleksów peptyd-metal metodą 1D i 2D 1H NMR

Badanie przesiewowe macierzy peptydowej to wysokoprzepustowy test do identyfikacji miejsc interakcji białko-białko. Pozwala to na mapowanie wielu interakcji białka docelowego i może służyć jako metoda identyfikacji miejsc dla inhibitorów, które celują w białko. Tutaj opisujemy protokół badania przesiewowego i analizy macierzy peptydowych.

Identyfikacja miejsc interakcji białko-białko za pomocą macierzy peptydowych

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Ten protokół szczegółowo opisuje ważne kroki wymagane do biokoniugacji białka zawierającego cysteinę z maleimidem, w tym oczyszczanie odczynników, warunki reakcji, oczyszczanie biokoniugatu i charakterystykę biokoniugatu.

Synteza biokoniugatów białkowych za pomocą chemii cysteiny-maleimidu

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Interakcja między kanałami HCN a ich podjednostką pomocniczą została zidentyfikowana jako cel terapeutyczny w dużym zaburzeniu depresyjnym. W tym artykule przedstawiono opartą na polaryzacji fluorescencyjnej metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tej interakcji białko-białko.

Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

Tutaj opisano akumulację jonów miedziawych w roztworze do powlekania siarczanu miedzi w eksperymencie modelowym oraz analizę opartą na pomiarach ilościowych. Eksperyment ten odtwarza proces akumulacji jonów miedziawych w kąpieli galwanicznej.

Akumulacja i analiza jonów miedziawych w roztworze galwanicznym siarczanu miedzi

Mobilność jonów-spektrometria mas i techniki modelowania molekularnego mogą scharakteryzować selektywną wydajność chelatacji metali zaprojektowanych peptydów wiążących metale oraz peptydu wiążącego miedź metanobaktyny. Opracowanie nowych klas peptydów chelatujących metale pomoże w opracowaniu metod leczenia chorób związanych z nierównowagą jonów metali.

Techniki spektrometrii ruchliwości jonów i mas do określania struktury i mechanizmów rozpoznawania jonów metali i aktywności redoks oligopeptydów wiążących metale

Ten artykuł opisuje eksperymentalny protokół wykorzystujący elektrorozpylanie, ruchliwość jonów, spektrometrię mas, półempiryczne obliczenia kwantowe i dysocjację wywołaną zderzeniem progu o rozdzielczości energetycznej do pomiaru względnej termochemii dysocjacji powiązanych kompleksów metali trójskładnikowych.

Badania termochemiczne trójskładnikowych kompleksów Ni(II) i Zn(II) z wykorzystaniem spektrometrii ruchliwości jonów i mas

Poznaj metody kwantyfikacji termodynamiki wiązania Cu(II) z peptydami przy użyciu spektroskopii absorpcyjnej i kalorymetrii izotermicznej. Techniki te umożliwiają szczegółową analizę interakcji metal-białko.

Kwantyfikacja oddziaływań wiążących między Cu(II) a resztą peptydowymi w obecności i bez chromoforów

Przeglądaj więcej filmów