Kwantyfikacja oddziaływań wiążących między Cu(II) a resztą peptydowymi w obecności i bez chromoforów

Metoda ta pozwoli naukowcowi na sondowanie trudnych do zbadania układów, takich jak peptydy i jony metali przejściowych pierwszego rzędu, które są na ogół trudne przy użyciu bardziej standardowych zastosowań. Główną zaletą jest tutaj stosowanie technik ortogonalnych, ponieważ dobrze się uzupełniają, a to może dać większy wgląd w system i pomóc nam nie przegapić żadnego zjawiska. Metoda opisana w tym filmie bardzo dobrze nadaje się do badania innych systemów.

Chociaż pokazujemy go za pomocą Cu (II) i peptydu, może być stosowany do wielu różnych interakcji peptydów metali i białek metali. Myślę, że najtrudniejszą częścią będzie znalezienie dobrego wyboru bufora dla twojego jonu metalu i peptydu. Zapoznałbym się z literaturą, aby zobaczyć, jakie były wcześniej używane przez innych.

Procedurę zademonstruje Sohee Choi, doktorantka w moim laboratorium badawczym. Aby rozpocząć, włącz elektroniczny spektrofotometr absorpcyjny i pozwól mu się rozgrzać przez około 15 do 20 minut przed użyciem. Następnie uruchom oprogramowanie spektrofotometru i skonfiguruj parametry, takie jak zakres skanowania od 200 do 900 nanometrów, zakres skanowania 200 nanometrów na sekundę i skorygowana linia bazowa podwójnej wiązki.

Następnie zbierz linię bazową bez kuwet ani próbek na ścieżkach wiązki. Używając dwóch dopasowanych kuwet w spektrofotometrze z podwójną wiązką, załaduj jedną kuwetę 115 mikrolitrami ultraczystej wody, a drugą kuwetę 115 mikrolitrami próbki peptydu, upewniając się, że w kuwetach nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ będą one zakłócać sygnał. Następnie umieść kuwetę z ultraczystą wodą w wiązce referencyjnej, a kuwetę z peptydem w wiązce próbki.

Następnie zbierz widmo absorpcyjne peptydu wolnego od metalu. Dodać substechiometryczną ilość roztworu Cu(II) do kuwety z próbką peptydu i zapisać objętość do późniejszej analizy. Delikatnie przeciskaj to w górę iw dół, aby wymieszać roztwór, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.

Po wyrównaniu przez pięć minut umieść kuwetę z powrotem w uchwycie na próbkę i zapisz widmo absorpcyjne. Następnie powtórzyć dodawanie podwielokrotności Cu(II) do roztworu peptydu dla różnych równoważników i zapisać całkowitą objętość Cu(II) dodanego do kuwety. Po zainicjowaniu oprogramowania, jak opisano wcześniej, w dwóch dopasowanych kuwetach załaduj jedną kuwetę 115 mikrolitrami ultra czystej wody, a drugą kuwetą 115 mikrolitrami złożonego roztworu miedzi i fenu.

Umieścić kuwetę z wodą w wiązce referencyjnej, a kuwetę z roztworem kompleksu miedziowo-fenowego w wiązce próbki. Następnie zbierz widmo absorpcyjne kompleksu ligandów metalowych. Następnie dodaj stechiometryczną ilość peptydu do roztworu kompleksu miedziowo-fenowego i delikatnie przeciśnij go w górę iw dół, aby dokładnie wymieszać, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza.

Następnie inkubuj roztwór przez pięć minut, aby osiągnąć równowagę. Włóż kuwetę z powrotem do uchwytu na próbkę i zapisz widmo absorpcji. Później powtórz dodawanie podwielokrotności peptydów do roztworu kompleksu miedź-fen dla różnych równoważników i zapisz objętość dodanego peptydu, aby można było określić rozcieńczone stężenie.

Najpierw włącz ITC i uruchom oprogramowanie ITC, aby uruchomić urządzenie. Po pierwszej inicjalizacji umieść biuretę z powrotem w domu i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Następnie wyjmij biuretę i pokrywę z celi referencyjnej.

Następnie usuń wodę z celi referencyjnej i spłucz trzykrotnie 450 mikrolitrami odgazowanej ultra czystej wody. Powoli nabierać ultra czystą wodę do oznaczenia 450 mikrolitrów strzykawki ładującej, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do strzykawki. Następnie włożyć strzykawkę ładującą do celi referencyjnej, aż znajdzie się około jednego milimetra od dna i powoli wstrzykiwać część roztworu, aż w strzykawce ładującej pozostanie 150 mikrolitrów.

Następnie kilkakrotnie szybko przesuń tłok strzykawki ładującej w górę i w dół o około 25 mikrolitrów, aby usunąć wszelkie pęcherzyki na powierzchni komórki. Następnie powoli wstrzykiwać, aż tłok osiągnie oznaczenie 100 mikrolitrów na strzykawce ładującej, dozując w ten sposób łącznie 350 mikrolitrów ultraczystej wody do celi referencyjnej i zakładając pokrywę kuwety referencyjnej. Po usunięciu pozostałego roztworu z celi próbki, załaduj 450 mikrolitrów 10-milimolowego EDTA za pomocą strzykawki ładującej i moczyć przez 10 minut, aby upewnić się, że jony metali śladowych zostały usunięte, ponieważ EDTA zwiąże metale śladowe.

Po usunięciu roztworu EDTA dokładnie wypłucz strzykawkę ładującą dużą ilością ultra czystej wody. Wyczyść ITC zgodnie ze wskazówkami producenta, przepłukując sample kuweta ultra czystą wodą. Usunąć resztki wody z celi próbki, a następnie kondycjonować celę próbki, przepłukując ją co najmniej trzykrotnie 450 mikrolitrami buforu.

Następnie usuń resztkowy bufor, który kondycjonuje komórkę próbki i załaduj roztwór peptydu do celi próbki za pomocą strzykawki ładującej. Następnie przepłukać strzykawkę do miareczkowania 200 mikrolitrami buforowanego roztworu, najpierw usuwając tłok. Za pomocą mikropipety odpipetować roztwór buforowy przez otwór w górnej części szklanej strzykawki do miareczkowania, przeciąć strzykawkę i wyjąć igłę znajdującą się poniżej.

Później całkowicie włożyć tłok do strzykawki do miareczkowania. Następnie zanurzyć końcówkę igły strzykawki do miareczkowania w roztworze metalu i powoli pociągnąć tłok do góry, powodując napełnienie strzykawki roztworem metalu i powstając pustą objętość w górnej części szklanej strzykawki do miareczkowania. Aby usunąć pustą przestrzeń, obrócić strzykawkę do miareczkowania równolegle do podłogi.

Następnie zdejmij tłok i lekko przechyl szklaną część w kierunku podłogi. Delikatnie wstrząsnąć strzykawką do miareczkowania, tak aby roztwór przesunął się do szklanej części strzykawki do miareczkowania i wypełnił większość pustej przestrzeni. Ale upewnij się, że pozostały dwa do trzech mikrolitrów pustej objętości.

Trzymając strzykawkę równolegle do podłogi, ponownie włożyć tłok. Następnie należy trzymać strzykawkę do miareczkowania pionowo i zanurzyć końcówkę igły z powrotem w roztworze metalu. Następnie wcisnąć tłok w dół, aż powietrze przestanie wydostawać się z igły i załadować strzykawkę do miareczkowania, powoli pociągając tłok do góry do poziomu nieco powyżej oznaczenia 50 mikrolitrów, trzymając końcówkę igły w roztworze.

Ostrożnie włożyć szklaną część strzykawki do miareczkowania do biurety i dokręcić do oporu. Następnie, używając lekkiej, delikatnej wycieraczki, wchłonąć roztwór, który wydostaje się ze strzykawki do miareczkowania w wyniku ściśnięcia tłoka bez dotykania końcówki igły. Następnie włóż biuretę ze strzykawką do miareczkowania do celi próbki i mocno ją zamocuj.

Aby skonfigurować parametry oprogramowania ITC, wybierz opcję Instrument Control (Sterowanie instrumentem). Ustaw szybkość mieszania i temperaturę. Następnie w obszarze Szczegóły eksperymentu wprowadź stężenia strzykawki i komórek w jednostkach milimolowych.

Następnie w sekcji Experiment Method (Metoda eksperymentu) wybierz opcję Incremental Tiration (Miareczkowanie przyrostowe). Kliknij Setup i określ 20 wstrzyknięć po 2,5 mikrolitra, a jeśli wymagana jest większa rozdzielczość do zaobserwowania zdarzenia wiązania, zwiększ liczbę wstrzyknięć i zmniejsz objętość na wstrzyknięcie. Następnie wprowadź odstęp czasowy między każdym wstrzyknięciem, tak aby był wystarczająco długi, aby sygnał zrównoważył się i powrócił do linii bazowej, zwykle 300 sekund.

Następnie kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć eksperyment i określić miejsce zapisywania danych. Miareczkowanie Cu (II) przeprowadzono do peptydu C, wykazując, że dodanie 150 mikromoli Cu (II) spowodowało natychmiastowy wzrost w paśmie na 600 nanometrach przypisanym pasmu d-d Cu (II) i kontynuowało wzrost do momentu dodania 300 milimolowych Cu (II). Dalsza addycja powyżej 300 mikromolowych Cu(II) nie zwiększyła absorpcji zakazu d-d wskazującego na nasycenie i to, że Cu(II) wiąże się z peptydem C w kompleksie 1:1 o wartości logarytmu K większej niż sześć.

Peptyd C miareczkowano do około 10 mikromolowego kompleksu miedzi-fenu, a absorpcja z pasma przenoszenia ładunku przy 265 nanometrach zmniejszyła się, co wskazuje, że peptyd C był w stanie chelatować Cu (II) z ligandu fenantroliny o wartości log K od 7,4 do 7,8. Termogram ITC pokazuje miareczkowanie 1,4 milimolowego Cu(II) do 154 mikromolowego peptydu C w 155-milimolowym buforze MOPS. Stwierdzono, że powinowactwo wiązania ma wartość logarytmu K równą ośmiu ze zmianą entalpii jako 8 kilodżuli na mol.

Energia swobodna Gibbsa wynosi minus 46 kilodżuli na mol, a zmiana entropii wynosi 120 dżuli na mol na kelwin. Kontrolowane miareczkowanie 1,4 milimolowego Cu(II) do 15-milimolowego buforu MOPS przy braku peptydu C nie wykazuje wiązania w termogramie. Powiedziałbym, że upewnienie się, że wszystko jest czyste.

Jeśli po poprzednich eksperymentach pozostały jony lub peptydy metali, może to drastycznie wpłynąć na stechiometrię i zapewnić nieznaną konkurencję w eksperymentach wiązania. Dichroizm kołowy to kolejna metoda badania interakcji peptydów metali lub białek metali, ponieważ dotyczy chiralności. Spektrometria mas może również badać te kompleksy, przyglądając się zmianom masy.

Ten zestaw technik był używany przez wiele laboratoriów, które badają jony metali oddziałujące z peptydami lub białkami.