Name: Pełna, kontra subregionalna kwantyfikacja obciążenia beta-amyloidem w wycinkach mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji obciążenia beta-amyloidem w mózgu myszy APP/PS1, porównującą analizę pełną i subregionalną. Protokół umożliwia wybór optymalnej techniki obrazowania w badaniach nad chorobą Alzheimera.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute of Aging of the National Institutes of Health pod numerami nagród R01AG062840 (dla RKS) i R01AG072896 (dla RKS). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health. Około 200 tys. dolarów (100%) z funduszy federalnych wsparło ten projekt. Chcielibyśmy również podziękować dr Joshua Yangowi za pomoc w redagowaniu manuskryptu.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Uniwersyteckimi Zasobami Laboratoryjnymi Zwierząt zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Uniwersytet Kalifornijski w Irvine, Institutional Animal Care and Use Committee. Eksperymenty przeprowadzono na samcach myszy B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax (APP/PS1) (13-miesięcznych, n = 35). Myszy pozyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów).
1. Przygotowanie tkanki mózgowej
<ol>
	<li>Znieczulić myszy za pomocą śmiertelnej dawki środka znieczulającego na bazie fenytoiny/pentobarbitalu (150 mg/kg) wstrzykiwanego dootrzewnowo (patrz tabela materiałów) zgodnie z zatwierdzonymi protokołami dla zwierząt. Wykonuj perfuzję serca lodowato zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (1x PBS) przez 5 minut z prędkością 5 ml / min, aby oczyścić naczynia krwionośne mózgu14.</li>
	<li>Zbierz tkankę mózgową zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem15, rozdziel na lewą i prawą półkulę mózgu i umieść prawą półmózg każdej myszy w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml świeżo przygotowanego 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS przez 72 godziny w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Mózgi mogą być utrwalone w zanurzeniu od 24 do 72 godzin, w zależności od badanego antygenu. Lewa półmózgówka, bez móżdżku, może zostać zamrożona w ciekłym azocie, a następnie przechowywana w temperaturze -80 °C, a następnie przetworzona do testów biochemicznych, takich jak ELISA i biochemiczne wykrywanie Aβ16. 
	UWAGA: PFA jest prawdopodobnym czynnikiem rakotwórczym, a kontakt skóry z PFA może prowadzić do objawów alergicznych skóry. Do obsługi używaj rękawiczek nitrylowych lub butylowych, masek i okularów ochronnych i przygotuj pod wyciągiem chemicznym.</li>
	<li>Po inkubacji w 4% PFA, inkubować półmózgi sekwencyjnie w 5 ml 10%, 20% i 30% roztworów sacharozy przygotowanych w 1x PBS przez 24 godziny, każdy w temperaturze 4 °C, aż tkanka mózgowa opadnie na dno stożkowej rurki.</li>
	<li>Po inkubacji w 30% roztworze sacharozy, usuń półmózg, delikatnie przetrzyj mózg na bibule filtracyjnej, aby usunąć nadmiar roztworu sacharozy, i zamroź utrwalony półmózg w sproszkowanym suchym lodzie na 30 minut. Przechowuj zamrożony półmózg w dobrze oznakowanych foliach aluminiowych w temperaturze -80 °C do kriosekcji. 
	UWAGA: W obecnym protokole półmózgi były przechowywane w temperaturze -80 °C przez 6-8 miesięcy.</li>
	<li>Podziel zamrożony półmózg na skrawki o grubości 20 μm za pomocą kriostatu (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: W obecnym protokole półmózgowie zostały podzielone na sekcje strzałkowe, a w razie potrzeby można również przygotować przekroje koronalne17. Krok 2 służy do barwienia immunofluorescencyjnego Aβ na utrwalonych i kriochronionych próbkach tkanki mózgowej.</li>
</ol>
2. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Umieść strzałkowe skrawki tkanki mózgowej (krok 1.5) na 24-dołkowej płytce (do sześciu skrawków mózgu myszy na 300 μl na studzienkę). Myć przez 5 minut z 1x PBS trzy razy w temperaturze pokojowej (23 °C), umieszczając płytkę na shakerze z delikatnym obracaniem.</li>
	<li>Inkubować skrawki tkanki mózgowej z 70% kwasem mrówkowym w dH20 w temperaturze pokojowej przez 10 min. 
	UWAGA: Kwas mrówkowy jest, dlatego należy unikać kontaktu ze skórą i oczami.</li>
	<li>Myj skrawki tkanki mózgowej przez 5 minut dH20 trzy razy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zablokuj niespecyficzne wiązanie z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,3% TritonX 100 (patrz tabela materiałów) w 1x PBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Inkubować skrawki tkanki mózgowej z pierwszorzędowym przeciwciałem znakowanym fluoroforem (6E10, patrz tabela materiałów) rozcieńczonym (1:1000) w 1x PBS zawierającym 0,3% TritonX 100 w temperaturze 4 °C przez 24 h. 
	UWAGA: Ponieważ przeciwciało pierwszorzędowe jest sprzężone z fluoroforem, płytka musi być pokryta od tego etapu lub wszystkie prace muszą być wykonywane w ciemnym pomieszczeniu, aby utrzymać skuteczność fluoroforu.</li>
	<li>Myj skrawki tkanki mózgowej przez 10 minut 1x PBS trzy razy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zamontuj skrawki tkanki mózgowej na dodatnio naładowanych szkiełkach szklanych (patrz Tabela materiałów), które są dobrze oznakowane (informacje na etykiecie na szkiełku są oparte na preferencjach), po krótkim przemyciu dH20 w celu usunięcia pozostałych soli. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu w ciemności. 
	UWAGA: Sekcje mózgu muszą być zamontowane ostrożnie, aby uniknąć fałd i rozdarć, wpływających na kwantyfikację danych. W przypadku rozdarć i/lub fałd, które leżą w obszarze zainteresowania i mogą zakłócać kwantyfikację danych, zaleca się ponowne barwienie i ponowne zamontowanie.</li>
	<li>Zamontuj skrawki tkanki mózgowej za pomocą wodnego podłoża montażowego (patrz Tabela materiałów) i umieść szklane szkiełko nakrywkowe na tkance. Uszczelnić końce szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci i przechowywać szkiełka w pudełku na szkiełka w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazowania. 
	UWAGA: W obecnym protokole preparaty zostały zobrazowane w ciągu 1 miesiąca po barwieniu.</li>
</ol>
3. Obrazowanie
<ol>
	<li>Zobrazuj wycinki mózgu wybarwione 6E10 za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (epifluorescencyjnego lub konfokalnego) (patrz Tabela materiałów), który ma 2-krotny obiektyw do uchwycenia całego wycinka tkanki mózgowej na jednym obrazie i jest wyposażony w odpowiedni filtr (GFP w tej pracy). 
	UWAGA: Ustawienia obrazowania muszą być spójne na różnych slajdach.</li>
	<li>Zapisz przechwycone obrazy jako plik TIFF lub zgodnie z wymaganiami i otwórz je w oprogramowaniu do analizy obrazów (patrz tabela materiałów) zgodnie z opisem w kroku 4.2 poniżej dla kwantyfikacji 6E10. 
	UWAGA: Przed przechwyceniem obrazu należy dołączyć podziałkę liniową w celu ilościowego określenia w oprogramowaniu do analizy obrazu, ImageJ.</li>
</ol>
4. Analiza całego regionu zainteresowania
UWAGA: Dwa obszary zainteresowania niniejszej pracy to hipokamp i izokora mózgowa. Analiza całego obszaru zainteresowania reprezentuje analizę całej kory izo-korowej (określanej jako kora w przyszłości) lub hipokampa w obrazowanym wycinku tkanki mózgowej.
<ol>
	<li>Pobierz oprogramowanie do analizy obrazu (patrz tabela materiałów) i uruchom oprogramowanie po zainstalowaniu.</li>
	<li>Po uruchomieniu oprogramowania kliknij Plik | Otwórz | Wybierz obraz, który ma zostać poddany analizie.</li>
	<li>Kliknij Analizuj | Ustawianie skali| Kliknij, aby usunąć skalę. Wybierz narzędzie Prosto z paska narzędzi oprogramowania i narysuj linię prostą wzdłuż paska podziałki. Kliknij Analizuj | Miara. Zwróć uwagę na długość lub odległość podziałki liniowej w pikselach. Kliknij Analizuj | Ustaw skalę.
	<ol>
		<li>W wyskakującym okienku wprowadź odległość w pikselach, znaną odległość podziałki liniowej (w tym przypadku w μm) oraz jednostkę długości jako μm. Zaznacz opcję Globalne, aby zastosować nowe ustawienie skali do wszystkich kolejnych obrazów, jeśli przetwarzanych jest wiele obrazów. Kliknij przycisk OK, aby zastosować plik settings. 
		UWAGA: Przed dalszą analizą zawsze zaleca się sprawdzenie, czy do obrazu została zastosowana dokładna skala.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby ustawić żądany pomiar dla obszaru przekroju, przejdź do Analiza | Ustawianie pomiarów | Zaznacz pola Obszar i Etykieta wyświetlania. Sprawdź, czy analizowany obraz jest zaznaczony w obszarze Przekieruj do.</li>
	<li>Aby ułatwić wizualizację hipokampa lub kory mózgowej, przejdź do Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast. Przeciągnij suwak Maksimum stopniowo w lewo, aby zwiększyć przejrzystość tkanek, aż do momentu, gdy będzie można zidentyfikować interesujące obszary mózgu. 
	UWAGA: Nie stosuj tego ustawienia, aby uniknąć fałszywych pomiarów podczas analizy, zamiast tego przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>Użyj narzędzia Zaznaczanie wielokątów lub Zaznaczanie odręczne, aby obrysować obszar hipokampa. Kliknij opcję Resetuj w ustawieniach jasności/kontrastu, gdy hipokamp zostanie zarysowany, aby powrócić do pierwotnej jasności. 
	UWAGA: Kroki należy powtórzyć osobno dla obszaru korowego.</li>
	<li>Aby zmierzyć całkowitą powierzchnię tkanki wybranego obszaru, kliknij Edytuj | Czysty na zewnątrz. Gdy wybrany region stanie się jedynym obrazem na ekranie, kliknij Analizuj | Zmierz, aby uzyskać całkowitą powierzchnię tkanki analizowanej w wyskakującym okienku. Zapisz dane w pliku Excel do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>Aby zmierzyć obszar dodatni 6E10, przejdź do Obraz | Dostosuj | Próg koloru. Gotowy filtr w metodzie Thresholding zwykle zapewnia pożądane wyniki, podkreślając najsilniejsze sygnały na czerwono. 
	UWAGA: Optymalny wybór progu będzie zależał od tła obrazu i intensywności barwienia. Wybierz ustawienie progu, które wychwyci plamę, a nie tło.</li>
	<li>Po wybraniu odpowiedniego progu zaznacz opcję Ciemne tło. Spowoduje to podświetlenie plam Aβ (plama zainteresowania) na czarnym tle. Kliknij Wybierz | Oryginalny | Wybierz, dając ciemne sygnały (osady Aβ) na białym tle. Kliknij Analizuj | Przeanalizuj cząstki i kliknij OK, gdy wygeneruje się wyskakujące okienko.</li>
	<li>Skopiuj wynik podsumowania wygenerowany przez oprogramowanie, klikając Edytuj | Kopia. Wklej do wcześniej uruchomionego pliku Excel z odpowiednimi etykietami. Jest to obszar 6E10-dodatni w wybranych regionach zainteresowania (hipokamp lub kora mózgowa). 
	UWAGA: W programie Excel pojawi się kolumna dla całkowitego obszaru 6E10-dodatniego (krok 4.10) i całkowitego obszaru tkanki (krok 4.7).</li>
	<li>Oblicz obszar 6E10-dodatni (%) w następujący sposób16: (Całkowita powierzchnia 6E10-dodatnia/Całkowita analizowana powierzchnia tkanki) x 100.</li>
</ol>
5. Analiza podregionu zainteresowania
UWAGA: Analiza podregionu zainteresowania reprezentuje analizę części kory mózgowej lub hipokampa w obrazowanym przekroju tkanki mózgowej.
<ol>
	<li>Pobierz oprogramowanie do analizy obrazu i uruchom je po zainstalowaniu.</li>
	<li>Po uruchomieniu oprogramowania kliknij Plik | Otwórz | Wybierz obraz, który ma zostać poddany analizie.</li>
	<li>Kliknij Analizuj | Ustawianie skali| Kliknij, aby usunąć skalę. Wybierz narzędzie Proste z paska narzędzi oprogramowania i narysuj linię prostą wzdłuż paska podziałki. Kliknij Analizuj | Miara. Zwróć uwagę na długość lub odległość podziałki liniowej w pikselach. Kliknij Analizuj | Ustaw skalę.
	<ol>
		<li>W wyskakującym okienku wprowadź odległość w pikselach, znaną odległość podziałki liniowej (w tym przypadku w μm) i wprowadź jednostkę długości jako μm. Zaznacz opcję Globalne, aby zastosować nowe ustawienie skali do wszystkich kolejnych obrazów, jeśli przetwarzanych jest wiele obrazów. Kliknij przycisk OK, aby zastosować plik settings. 
		UWAGA: Przed dalszą analizą zawsze zaleca się sprawdzenie, czy do obrazu została zastosowana dokładna skala.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby ustawić żądany pomiar dla obszaru przekroju, przejdź do Analiza | Ustawianie pomiarów | zaznacz pola Obszar i Etykieta wyświetlania. Sprawdź, czy analizowany obraz jest zaznaczony w obszarze Przekieruj do.</li>
	<li>Dostosuj jasność i kontrast, jeśli obraz jest zbyt ciemny, a obszary mózgu (np. hipokamp lub kora mózgowa w tym przypadku) nie mogą być łatwo zidentyfikowane. Użyj paska narzędzi oprogramowania i kliknij Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast i w razie potrzeby przeciągnij suwaki Maksimum w lewo, aby zwiększyć widoczność tkanki. 
	UWAGA: Nie stosuj tego ustawienia, aby uniknąć fałszywych pomiarów podczas analizy, zamiast tego przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia Prostokąt wybierz interesujący Cię obszar w korze lub hipokampie. Użyj paska narzędzi i kliknij Edytuj | Selekcja | Określ, zmieniając wysokość i szerokość na wstępnie zdefiniowaną wartość. Wyreguluj pudełko tak, aby było całkowicie pokryte chusteczką. Zresetuj jasność/kontrast, aby powrócić do oryginalnej jasności. 
	UWAGA: Rozmiar pola używanego do zaznaczania obszarów zainteresowania musi być spójny dla wszystkich obrazów. Na potrzeby niniejszej analizy rozmiar pudełka wynosił albo 300 pikseli x 300 pikseli (co odpowiada 1177 μm x 1177 μm), albo 400 pikseli x 200 pikseli (co odpowiada 1569 μm x 784 μm).</li>
	<li>Zduplikuj wybrany obszar zainteresowania, klikając pole prawym przyciskiem myszy i klikając Duplikuj. Otworzy się nowe okno z wybranym regionem. Zmień nazwę zduplikowanego obrazu, aby wyświetlić region, w którym się znajduje (np. kora mózgowa lub hipokamp).</li>
	<li>Dostosuj zduplikowany typ obrazu, korzystając z paska narzędzi i klikając Obraz | Rodzaj | 8-bitowy, aby przekonwertować zduplikowany obraz RGB na 8-bitowy, aby jak najlepiej przeanalizować płytki. Odwróć obraz, klikając Edytuj | Odwrócić.</li>
	<li>Aby zmierzyć obszar dodatni 6E10, przejdź do Obraz | Dostosuj | Próg. Wstępnie zdefiniowany filtr w metodzie progowania zwykle zapewnia pożądane wyniki, podświetlając najsilniejsze sygnały na czerwono. 
	UWAGA: Optymalny wybór progu będzie zależał od tła obrazu i intensywności barwienia. Wybierz ustawienie progu, które wychwyci plamę, a nie tło.</li>
	<li>Po wybraniu odpowiedniego progu wybierz pozycję Zastosuj.</li>
	<li>Aby przeanalizować obszar 6E10-dodatni, użyj paska narzędzi i kliknij Analizuj | Analizuj cząstki, upewniając się, że zaznaczona jest opcja "Podsumuj wyniki".</li>
	<li>Skopiuj dane wyjściowe podsumowania z %Area wygenerowanym przez oprogramowanie, klikając Edytuj | Kopia. Wklej do wcześniej uruchomionego pliku Excel z odpowiednimi etykietami.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.3-5.12 dla różnych obszarów tkanki. Upewnij się, że rozmieszczenie każdego pola w celu wyznaczenia obszaru zainteresowania jest spójne między każdym obrazem. 
	UWAGA: Narzędzie do obracania może być używane, jeśli wymiary przybornika Prostokąt nie mieszczą się w określonym obszarze ze względu na krzywiznę tkanki.</li>
	<li>Aby obrócić prostokąt, użyj paska narzędzi i kliknij Edytuj | Selekcja | W razie potrzeby obróć i dostosuj stopień obrotu. Zduplikuj obraz, jak wspomniano w kroku 5.7, i wyczyść go na zewnątrz, używając paska narzędzi i klikając Edytuj | Wyczyść na zewnątrz, co usuwa plamy 6E10 poza określonym prostokątem. Przejdź do kroku 5.8 opisanego powyżej.</li>
</ol>

<ol><li>Alzheimer's Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2021+Alzheimer%27s+disease+facts+and+figures%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">2021 Alzheimer's disease facts and figures.</a> Alzheimer's & Dementia. 17 (3), 327-406 (2021).</li>
<li>Langa, K. M., Foster, N. L., Larson, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+dementia%3A+emerging+concepts+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Mixed dementia: emerging concepts and therapeutic implications.</a> Journal of the American Medical Association. 292 (23), 2901-2908 (2004).</li>
<li>Gandy, S., DeKosky, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+treatment+and+prevention+of+Alzheimer%27s+disease%3A+rational+strategies+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Toward the treatment and prevention of Alzheimer's disease: rational strategies and recent progress.</a> Annual Review of Medicine. 64, 367-383 (2013).</li>
<li>Bloom, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta+and+tau%3A+the+trigger+and+bullet+in+Alzheimer+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurology%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta and tau: the trigger and bullet in Alzheimer disease pathogenesis.</a> JAMA Neurology. 71 (4), 505-508 (2014).</li>
<li>Gremer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibril+structure+of+amyloid-beta%281-42%29+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fibril structure of amyloid-beta(1-42) by cryo-electron microscopy.</a> Science. 358 (6359), 116-119 (2017).</li>
<li>Ferrero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-in-human%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+single-dose+escalation+study+of+aducanumab+%28BIIB037%29+in+mild-to-moderate+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+%26+Dementia+Translational+Research+%26+Clinical+Interventions%22%5BJournal%5D)">First-in-human, double-blind, placebo-controlled, single-dose escalation study of aducanumab (BIIB037) in mild-to-moderate Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's & Dementia Translational Research & Clinical Interventions. 2 (3), 169-176 (2016).</li>
<li>Poon, C. H., Wang, Y., Fung, M. L., Zhang, C., Lim, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+amyloid-beta+feature+of+Alzheimer%27s+disease%3A+development+and+potential+treatment+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Rodent models of amyloid-beta feature of Alzheimer's disease: development and potential treatment implications.</a> Aging and Disease. 11 (5), 1235-1259 (2020).</li>
<li>Christensen, A., Pike, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+and+quantification+of+beta-amyloid+pathology+in+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Staining and quantification of beta-amyloid pathology in transgenic mouse models of Alzheimer's disease.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 221(2020).</li>
<li>Thakker, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+amyloid-beta+antibodies+reduce+cerebral+amyloid+angiopathy+and+associated+micro-hemorrhages+in+aged+Tg2576+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (11), 4501-4506 (2009).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+amyloid-beta+accumulation+via+immunofluorescent+staining+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detecting amyloid-beta accumulation via immunofluorescent staining in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (170), e62254(2021).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematologic+safety+of+chronic+brain-penetrating+erythropoietin+dosing+in+APP%2FPS1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+%26+DementiaTranslational+Research+%26+Clinical+Interventions%22%5BJournal%5D)">Hematologic safety of chronic brain-penetrating erythropoietin dosing in APP/PS1 mice.</a> Alzheimer's & DementiaTranslational Research & Clinical Interventions. 5, 627-636 (2019).</li>
<li>Jankowsky, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+presenilins+specifically+elevate+the+levels+of+the+42+residue+beta-amyloid+peptide+in+vivo%3A+evidence+for+augmentation+of+a+42-specific+gamma+secretase%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase.</a> Human Molecular Genetics. 13 (2), 159-170 (2004).</li>
<li>Grant, M. K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebrospinal+fluid+6E10-immunoreactive+protein+species+contain+amyloid+precursor+protein+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Human cerebrospinal fluid 6E10-immunoreactive protein species contain amyloid precursor protein fragments.</a> PloS One. 14 (2), 0212815(2019).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Eichenbaum, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+invasive+method+for+murine+brain+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Minimally invasive method for murine brain fixation.</a> Biotechniques. 39 (4), 487-490 (2005).</li>
<li>Chang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+penetrating+biologic+tnf-alpha+inhibitor+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier penetrating biologic tnf-alpha inhibitor for Alzheimer's disease.</a> Molecular Pharmaceutics. 14 (7), 2340-2349 (2017).</li>
<li>Pinskiy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+of+whole-brain+sectioning%2C+using+the+tape-transfer+technique%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput method of whole-brain sectioning, using the tape-transfer technique.</a> PloS One. 10 (7), 0102363(2015).</li>
<li>Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological-based+stainings+using+free-floating+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Histological-based stainings using free-floating tissue sections.</a> Journal of Visualized Experiments. (162), e61622(2020).</li>
<li>van Stralen, K. J., Dekker, F. W., Zoccali, C., Jager, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+agreement%2C+more+complicated+than+it+seems%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Measuring agreement, more complicated than it seems.</a> Nephron Clinical Practice. 120 (3), 162-167 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany w niniejszym dokumencie protokół przedstawia procedurę przygotowania półkrwi i mózgu do przekroju strzałkowego, barwienie immunofluorescencyjne złogów Aβ przy użyciu przeciwciała 6E10 na swobodnie pływających odcinkach, obrazowanie wycinków mózgu barwionych Aβ, a następnie ilościowe oznaczanie złogów Aβ w korze i hipokampie tkanki mózgowej myszy za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Chociaż istnieją opublikowane protokoły do ilościowego określania obciążenia Aβ w sekcjach tkanki mózgowej 8,10, protokół ten opisuje etapy związane z ilościowym określaniem obciążenia Aβ w całej korze izo-korowej (określanej jako kora) i hipokampie w porównaniu z obciążeniem Aβ w podregionie zainteresowania w korze i hipokampie, kiedy może to być pożądane. Przedstawiono również korelację między pełnymi i podregionami zainteresowania analizami.
W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, opisany protokół dotyczy skrawków tkanki mózgowej o grubości 20 μm poddanych swobodnemu barwieniu immunologicznemu, co skutkuje optymalną penetracją przeciwciał w obrębie odcinka tkanki18. Technika swobodnego pływania może wymagać ręcznego przenoszenia skrawków tkanek między różnymi roztworami podczas barwienia immunofluorescencyjnego oraz ostrożnego obchodzenia się z sekcjami tkanek przez cały czas trwania zabiegu. Jest to szczególnie ważne, gdy skrawki tkanek są zanurzone w 70% roztworze kwasu mrówkowego w celu pobrania antygenu w obecnym protokole, co zwiększa kruchość tkanek w przypadku cienkich odcinków. Alternatywne podejścia do opisanego protokołu obejmują użycie grubszych odcinków tkanek (np. 30-40 μm) lub użycie odcinków tkanki, które są bezpośrednio montowane na dodatnio naładowanych szkiełkach przed barwieniem immunofluorescencyjnym. Po drugie, opisany w niniejszym dokumencie protokół wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie przeciwciało 6E10. Oprócz stosowania znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała 6E10, niefluorescencyjne przeciwciała 6E10 (np. przeciwciało 6E10 sprzężone z peroksydazą chrzanową) mogą być również stosowane do wykrywania obciążenia Aβ w skrawkach tkanki mózgowej, a obecny protokół można dostosować do ilościowego oznaczania Aβ-dodatnich barwników immunochemicznych w skrawkach tkanki mózgowej, jak opisano wcześniej8. Po trzecie, dokładność wyników kwantyfikacji obciążenia Aβ będzie zależeć od odpowiedniego wyboru progu w oprogramowaniu analitycznym, który zależy od tła tkankowego i intensywności sygnału. Wybór progu musi być dokonany przez użytkownika końcowego w taki sposób, aby do oznaczania ilościowego wybierane były tylko barwienia Aβ-dodatnie. Interwencja użytkownika końcowego jest wymagana w celu zoptymalizowania określonego progu, który można zastosować do wszystkich obrazów, aby zapewnić dokładność ustawienia progu. Po czwarte, ponieważ analiza podregionu zainteresowania wymaga wybrania małego obszaru zainteresowania w przekroju tkanki, do tej analizy wykorzystano dwa niezależne czytniki. Aby zachować niezależność i zaślepienie podczas zbierania danych, wszystkie obrazy zostały zakodowane numerycznie; Sekwencja analizy obrazu została losowo podzielona między czytelników w taki sposób, że różni czytelnicy analizowali różne obrazy w dowolnym momencie, a dane były przesyłane pod koniec każdego tygodnia. Ze względu na zwiększone prawdopodobieństwo zmienności między czytnikami w regionie wyboru zainteresowań w analizie podregionu zainteresowania, czytelnicy zostali przeszkoleni przy użyciu kilku przykładowych obrazów, aby zoptymalizować wybór regionów w korze i hipokampie przed rozpoczęciem zbierania danych. Trening ten ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia zmienności między czytnikami, a jak widać (Rysunek 5A,B), obszar 6E10-dodatni zgłoszony przez obu czytelników wykazuje silną względną zgodność w obecnym badaniu.
Obecny protokół i wyniki dostarczają cennych informacji na temat wpływu wielkości obszaru zainteresowania na kwantyfikację obszaru Aβ-dodatniego. Oczekuje się, że większy obszar zainteresowania będzie reprezentował tkankę bardziej niż mniejszy obszar zainteresowania. Dlatego pożądane jest pobieranie próbek z większej tkanki w celu dokładnego ilościowego określenia obciążenia Aβ w tkankach. Jednak w przypadku jednorodnego rozkładu obciążenia Aβ w tkance, mniejszy obszar pobierania próbek jest ogólnie uważany za dobrą reprezentację większej tkanki poddawanej analizie. Potwierdzają to obecne wyniki badań, a obciążenie Aβ w całej korze i hipokampie było silnym korelatem obciążenia Aβ w wybranym podregionie kory i hipokampa (ryc. 5C,D). Aby dodatkowo potwierdzić zgodność między pełnymi i podregionami analiz zainteresowania, porównano średni obszar 6E10-dodatni w korze i hipokampie i nie stwierdzono różnicy między tymi dwiema metodami (ryc. 5E). Potwierdza to, że każda z tych metod (analiza całego lub podregionu) daje porównywalne pomiary obciążenia Aβ.
Obecny protokół ma pewne ograniczenia. Te dwie metody (analiza całego regionu i podregionu) nie zawsze mogą być używane zamiennie. Wybór zastosowania analizy pełnej lub podregionu będzie zależał od regionalnego rozmieszczenia Aβ w tkance, na który wpływ ma wiek, płeć i szczep mysiego modelu AD. W wieku 13 miesięcy obciążenie Aβ jest rozprowadzane w korze i hipokampie myszy APP / PS1. Jednak po 6 miesiącach złogi Aβ są ograniczone do kory, a minimalne złogi obserwuje się w hipokampie12. W takich warunkach analiza całego obszaru zainteresowania może być pożądanym podejściem do zwiększenia obszaru pobierania próbek tkanek, a tym samym sygnału Aβ. Z drugiej strony, analiza podregionów może być metodą z wyboru, gdy interesujące jest obciążenie Aβ w określonym regionie mózgu (np. Korze somatosensorycznej). Dodatkowo, w wieku 13 miesięcy, samce myszy APP/PS1 wykazują intensywne barwienie 6E10-dodatnie, a barwienie immunofluorescencyjne daje doskonały sygnał o bardzo niskim tle, co sprawia, że obecny protokół jest bardzo odpowiedni do kwantyfikacji w danych warunkach. Nie jest jasne, czy ta metoda kwantyfikacji może być z powodzeniem zastosowana do mniej intensywnego barwienia, a odpowiedzi na to pytanie będą wymagały przyszłe prace. Przedstawiona w niniejszym dokumencie metoda immunofluorescencji i kwantyfikacji obrazu wykrywa wszystkie formy Aβ, w tym formę prekursora13. W rezultacie, jeśli istnieje zainteresowanie wykryciem określonego gatunku Aβ (np. Aβ1-40 lub Aβ1-42), można zastosować przeciwciała specyficzne dla tych izoform Aβ. Dlatego, chociaż metoda barwienia i wykrywania immunofluorescencyjnego 6E10 korelowała z pomiarami pomiarów Aβ1-42 w homogenatach całego mózgu przy użyciu ELISA (Figura 5F, G), korelacja była tylko niewielka. Można to przypisać pomiarowi tylko Aβ1-42 za pomocą testu ELISA i wykrywaniu wszystkich gatunków Aβ za pomocą barwienia immunologicznego 6E10. W niniejszym badaniu wykorzystano trzy czytniki w celu oceny zgodności i korelacji między analizami pełnymi i subregionalnymi. Posiadanie dodatkowych czytelników może poprawić solidność badania i może jeszcze bardziej potwierdzić zgodność między dwiema przedstawionymi tutaj metodami. Ponadto używamy korelacji Pearsona jako miary zgodności, która jest szeroko stosowana wśród innych metod do opisu zgodności między zmiennymi ciągłymi19. Jednak jednym z ograniczeń stosowania korelacji Pearsona do określenia zgodności jest to, że dwie metody użyte w niniejszym dokumencie mogą dawać podobne wyniki, ale jedna metoda może skutkować ogólnie wyższymi wartościami niż druga z powodu systematycznego odchylenia. Dlatego korelacja Pearsona jest dobrą miarą względnej zgodności19. Aby zwiększyć niezawodność protokołu, można zastosować dodatkowe metody potwierdzania bezwzględnej zgodności, takie jak porównanie średniej powierzchni dodatniej 6E10 za pomocą dwóch metod (rysunek 5E)19. Podsumowując, obecny protokół porównuje obciążenie Aβ wykryte przez barwienie immunofluorescencyjne i analizuje pełne i podregiony zainteresowania w skrawkach tkanki mózgowej. Wyniki wskazują na silną korelację między tymi dwiema metodami dla wycinków tkanki mózgowej pochodzących od 13-miesięcznych samców myszy APP/PS1, które wykazują obfite złogi Aβ.

Choroba Alzheimera (AD), szósta najczęstsza przyczyna zgonów w Stanach Zjednoczonych, nadal stanowi zagrożenie dla zdrowia publicznego, z szacunkową liczbą 6,2 miliona Amerykanów żyjących z AD. Oczekuje się, że do 2060 roku liczba ta wzrośnie do 13,8 miliona1. Do tej pory leczenie objawowe za pomocą leków, takich jak inhibitory cholinoesterazy i memantyna, jest podstawowym sposobem leczenia2. AD charakteryzuje się objawami neuropatologicznymi, takimi jak zewnątrzkomórkowe odkładanie się blaszek beta-amyloidu (Aβ) i wewnątrzkomórkowa hiperfosforylowana akumulacja tau w postaci splątków neurofibrylarnych3,4. Utworzony przez endoproteolityczne rozszczepienie białka prekursorowego amyloidu (APP) za pośrednictwem beta- i gamma-sekretazy, Aβ agreguje się, tworząc oligomery i fibryle, prowadząc do skutków neurotoksycznych5. Przypuszcza się, że Aβ pełni główną rolę patologiczną od 1980 roku i jest celem terapeutycznym jedynej zatwierdzonej przez FDA terapii modyfikującej chorobę dla AD6. W rezultacie, transgeniczne modele myszy AD zawierające mutacje w genach skutkujące silną akumulacją Aβ w mózgu są szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych nad AD od wczesnych lat 90. XX wieku7.
Wykrywanie gatunków Aβ w tych transgenicznych mózgach myszy AD odbywa się zazwyczaj za pomocą dwóch testów immunologicznych: testu immunoenzymatycznego (ELISA) i barwienia immunologicznego. Pierwszy test umożliwia ilościowe oznaczanie różnych gatunków Aβ i jest mniej czasochłonny w porównaniu z barwieniem immunologicznym, które wymaga kilku sekwencyjnych etapów przetwarzania i obrazowania tkanek, w tym sekcji tkanek, barwienia immunologicznego, obrazowania i kwantyfikacji8. Ponadto wyniki uzyskane po barwieniu immunologicznym są półilościowe8. Jednak zdolność do przestrzennej lokalizacji Aβ sprawia, że barwienie immunologiczne jest atrakcyjnym podejściem do wykrywania Aβ w tkankach mózgowych8.
Podczas korzystania z barwienia immunologicznego Aβ, różne grupy badawcze zastosowały kilka różnych paradygmatów kwantyfikacji. Na przykład niektóre grupy badawcze określają ilościowo obciążenie Aβ w całym obszarze zainteresowania (kora lub hipokamp), podczas gdy inne określają ilościowo obciążenie Aβ w określonym podregionie zainteresowania (część kory lub hipokampa)9,10,11. Chociaż metody wykrywania i oznaczania ilościowego Aβ zostały dobrze ugruntowane i udokumentowane, nie zgłoszono wpływu wielkości obszaru zainteresowania na pomiary obciążenia Aβ po barwieniu immunologicznym. W związku z tym obecny protokół miał na celu porównanie pomiarów obciążenia Aβ w pełnych i podobszarach zainteresowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, ImageJ.
W obecnym badaniu użyto 13-miesięcznych podwójnie transgenicznych samców myszy APP/PS1, które wykazują chimeryczną mysz/ludzką APP i zmutowaną presenilinę 1, do modelowania wczesnego początku AD12. Złogi Aβ zaczynają się rozwijać w wieku 6-7 miesięcy, a obfite nagromadzenie Aβ obserwuje się zarówno w korze, jak i hipokampie tych myszy w wieku 9-10 miesięcy12. Transgeniczne peptydy amyloidowe i holoproteina mogą być wykrywane przez 6E10-immunostaining13, co czyni go pożądanym modelem zwierzęcym dla obecnego protokołu. Procedura opisana w niniejszym dokumencie obejmuje preparację tkanki mózgowej, barwienie immunologiczne swobodnie pływających odcinków, obrazowanie i kwantację obciążenia Aβ w pełnych i podregionach będących przedmiotem zainteresowania. Analiza wykazuje silną korelację między kwantyfikacją pełno- i subregionalną, co wskazuje na solidną zgodność między tymi dwiema metodami w sekcjach tkanki mózgowej pochodzących od 13-miesięcznych samców myszy APP/PS1, które wykazują obfite złogi Aβ.

<table><tbody><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>ThermoFisher Scientific, MA, USA</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Fisher Scientific, NH, Stany Zjednoczone</td><td>FB012929</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA dla ludzi z amyloidem beta 42</td><td>ThermoFisher Scientific, MA, Stany</td><td>Zjednoczone KHB3441</td><td></td></tr><tr><td>Wodne podłoża montażowe</td><td>Vector laboratories, CA, USA</td><td>H-5501-60</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>surowicy bydlęcejSigmaaldrich, MO, Stany Zjednoczone</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>BZ-X710 Uniwersalny mikroskop fluorescencyjny Keyence</td><td>Keyence, IL, USA</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta folia do paznokci</td><td>Preferencje użytkownika</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica Biosystems, IL, Stany</td><td>Zjednoczone Kriostat Leica CM1860 Kwas</td> mrówkowy Sigmaaldrich, MO, USA F0507-500ML Szkiełka nakrywkowe <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR, PA, USA</td><td>48393-081</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software, CA, USA</td><td>Wersja 8</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 1.51k</td><td>National Institutes of Health, MD, USA</td><td>Wersja 1.53e</td><td></td></tr><tr><td>Myszy</td><td>Jackson Laboratories, ME, USA</td><td>034829-JAX</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigmaaldrich, MO, USA</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fenytoina/ Znieczulenie na bazie pentobarbitalu (Euthasol)</td><td>Patterson Veterinary, MA, USA</td><td>07-805-9296</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; NH, USA</td><td>BP661-50</td><td></td></tr><tr><td>Plus (+) szkiełka mikroskopowe</td><td>Ted Pella, Inc., CA, USA</td><td>260100</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe (6E10)</td><td>Biolegend, CA, USA</td><td>803013</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigmaaldrich, MO, USA</td><td>47289</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigmaaldrich, MO, USA</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

pełna, kontra subregionalna kwantyfikacja obciążenia beta-amyloidem w wycinkach mózgu myszy

Full- versus Sub-Regional Quantification of Amyloid-Beta Load on Mouse Brain Sections

Zewnątrzkomórkowe nagromadzenie blaszek beta-amyloidu (Aβ) jest jedną z głównych patologicznych cech choroby Alzheimera (AD) i jest celem jedynej zatwierdzonej przez FDA terapii modyfikującej chorobę AD. W związku z tym, użycie transgenicznych modeli myszy, które nadmiernie eksprymują białko prekursorowe amyloidu i tym samym gromadzą płytki Aβ w mózgu, jest szeroko stosowane do modelowania ludzkiej choroby Alzheimera u myszy. Dlatego testy immunologiczne, w tym test immunoenzymatyczny (ELISA) i barwienie immunologiczne, zwykle mierzą obciążenie Aβ w tkankach mózgowych pochodzących od transgenicznych myszy z AD. Chociaż metody wykrywania i oznaczania ilościowego Aβ zostały dobrze ugruntowane i udokumentowane, nie zgłoszono wpływu wielkości obszaru zainteresowania wybranego w tkance mózgowej na pomiary obciążenia Aβ po barwieniu immunologicznym. W związku z tym obecny protokół miał na celu porównanie pomiarów obciążenia Aβ w pełnych i podobszarach zainteresowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Etapy związane z przygotowaniem tkanki mózgowej, swobodnym barwieniem immunologicznym sekcji mózgu, obrazowaniem i kwantyfikacją obciążenia Aβ w pełnych i podregionach zainteresowania opisano przy użyciu wycinków mózgu pochodzących od 13-miesięcznych podwójnie transgenicznych samców myszy APP / PS1. Obecny protokół i wyniki dostarczają cennych informacji na temat wpływu wielkości obszaru zainteresowania na kwantyfikację obszaru Aβ-dodatniego i wykazują silną korelację między obszarem Aβ-dodatnim uzyskanym przy użyciu analiz pełnych i podregionów zainteresowania dla odcinków mózgu pochodzących od 13-miesięcznych samców myszy APP/PS1, które wykazują rozległe odkładanie Aβ.

W niniejszej pracy porównano dwie różne metody ilościowego oznaczenia obszaru pozytywnego pod kątem 6E10 w hipokampie i korze tkanek mózgu myszy. Dwie te metody to analiza całego regionu oraz analiza podregionu zainteresowania (Rysunek 1). Analiza całego regionu zainteresowania, zgodnie z nazwą, polega na obrysowaniu całego obszaru zainteresowania (w tym przypadku izokory lub hipokampa) w celu wyznaczenia obszaru pozytywnego pod kątem 6E10 (Rysunek 1A,B). Analiza podregionu zainteresowania polega na wyborze zdefiniowanego wcześniej obszaru wewnątrz regionu zainteresowania w celu wyznaczenia obszaru pozytywnego pod kątem 6E10 (Rysunek 1C,D). Krok po kroku przedstawiono protokół ImageJ dla obu metod na Rysunku 2, Rysunku 3 oraz Rysunku 4.
W badaniu tym wykorzystano trzech oceniających; dwóch niezależnych oceniających przeprowadziło analizę podregionów zainteresowania (sub-region of interest), a trzeci oceniający przeprowadził analizę pełnego regionu zainteresowania (full-region of interest). Jak pokazano na Rysunku 5A,B, stwierdzono silną, istotną statystycznie korelację dodatnią (p &lt; 0,0001) między obszarem pozytywnym dla 6E10 zgłoszonym przez dwóch oceniających przeprowadzających analizę podregionów zainteresowania (współczynnik korelacji Pearsona r = 0,97 dla kory i r = 0,96 dla hipokampa). Wyciągnięto średnią z obszarów pozytywnych dla 6E10 zgłoszonych przez dwóch oceniających w analizie podregionów zainteresowania, a ta średnia wartość obszaru 6E10-pozytywnego dla podregionu wykazywała silną, istotną statystycznie korelację dodatnią (p &lt; 0,0001) z obszarem 6E10-pozytywnym uzyskanym za pomocą analizy pełnego regionu zainteresowania zarówno dla kory (współczynnik korelacji Pearsona r = 0,96; Rysunek 5C), jak i dla hipokampa (współczynnik korelacji Pearsona r = 0,95; Rysunek 5D). Średnia powierzchnia 6E10-pozytywna w korze i hipokampie uzyskana w analizach pełnego regionu i podregionów zainteresowania była porównywalna, bez istotnych różnic, co potwierdza zgodność obu metod (Rysunek 5E). Ponadto, w podgrupie myszy zmierzono poziom nierozpuszczalnego Aβ1-42 w homogenatach całego mózgu, a obszar 6E10-pozytywny w korze (Rysunek 5F) i hipokampie (Rysunek 5G) określony przez analizę pełnego regionu zainteresowania korelował istotnie (p &lt; 0,01) z obciążeniem nierozpuszczalnym Aβ1-42 zmierzonym za pomocą testu ELISA (patrz Tabela materiałów).
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna obszarów mózgu: kora i hipokamp, analiza całych obszarów i podregionów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63669/63669fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wybór pełnych obszarów zainteresowania w porównaniu do podregionów. Reprezentatywne obrazy przedstawiające obrysowaną pełną izokorę (korę) w (A) oraz hipokamp w (B) dla analizy pełnego obszaru zainteresowania. Reprezentatywne obrazy przedstawiają wybór podregionu/podregionów kory w (C) oraz hipokampa w (D) dla analizy podregionu zainteresowania. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63669/63669fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Kroki mikroskopii fluorescencyjnej: jasność/kontrast, obrys hipokampa, proces wyboru sygnału." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63669/63669fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Protokół ilościowego oznaczania obszaru pozytywnego pod kątem 6E10 w całym regionie zainteresowania. Kroki analizy obrazu przedstawiające obraz oryginalny (A), obraz po regulacji jasności/kontrastu (B), wybór obszaru zainteresowania (C), czyszczenie (D), regulację progu (E) oraz końcowy obraz gotowy do analizy (F). Numery na rycinie oznaczają numery kroków w protokole. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63669/63669fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Sekwencja przetwarzania obrazu z mikroskopii fluorescencyjnej; przedstawiono etapy regulacji jasności, zaznaczania oraz progowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63669/63669fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Protokół kwantyfikacji obszaru dodatniego dla 6E10 w podregionie zainteresowania. Kroki analizy obrazu przedstawiające obraz oryginalny (A), obraz po regulacji jasności i kontrastu (B), zaznaczenie obszaru zainteresowania (C), duplikację obrazu regionu zainteresowania (D), zmianę obrazu na 8-bitowy i jego inwersję (E), regulację progu (F) oraz końcowy obraz gotowy do analizy (G). Numery na rycinie oznaczają numery kroków w protokole. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63669/63669fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, analiza neuronów; panel A-C, wybór, duplikacja, czyszczenie obszaru." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63669/63669fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Protokół rotacji obszaru zainteresowania. Kroki analizy obrazu przedstawiające wybór obszaru zainteresowania i rotację ramki wyboru w celu dopasowania do krzywizny tkanki (A), obraz obszaru zainteresowania po duplikacji (B) oraz obraz po usunięciu obszaru zewnętrznego (poza obszarem zainteresowania) (C). Numery na rysunku oznaczają numer kroku w protokole. Pasek skali = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63669/63669fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy rozrzutu i wykres słupkowy analizujące korelację między analizą obszaru kory a hipokampa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63669/63669fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Korelacja między analizami pełnego i podregionów zainteresowania. Wykresy rozrzutu przedstawiają korelację obszaru pozytywnego pod kątem 6E10 wyznaczonego przez dwóch niezależnych badaczy przeprowadzających analizę podregionu zainteresowania dla kory (A) i hipokampa (B). Silna dodatnia korelacja jest obserwowana między obszarem pozytywnym pod kątem 6E10 wynikającym z analizy podregionu zainteresowania a analizą pełnego regionu zainteresowania zarówno dla kory (C), jak i hipokampa (D). Nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy w średnim obszarze pozytywnym pod kątem 6E10 między analizą pełnego regionu zainteresowania a analizą podregionu zainteresowania w korze i hipokampie (E). Istotna korelacja jest obserwowana między pomiarami nierozpuszczalnego Aβ1-42 w homogenacie całego mózgu wykonanymi metodą ELISA a analizą pełnego regionu zainteresowania zarówno dla kory (F), jak i hipokampa (G). Dane analizowano przy użyciu współczynnika korelacji Pearsona, r, w (A-D) i (F-G) oraz przy użyciu dwukierunkowej analizy wariancji ANOVA z powtarzanymi pomiarami w (E), korzystając z oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyki. Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM) dla n = 35 myszy w (E); wartość p < 0,05 dla testu dwustronnego uznano za statystycznie istotną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63669/63669fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Obecny protokół opisuje i porównuje procedurę przeprowadzania analizy całego regionu lub podregionu zainteresowania odcinków mózgu myszy strzałkowej w celu ilościowego określenia obciążenia beta-amyloidu w transgenicznym mysim modelu choroby Alzheimera APP/PS1.

Pełna, kontra subregionalna kwantyfikacja obciążenia beta-amyloidem w wycinkach mózgu myszy

Extracellular accumulation of amyloid-beta (A&#946;) plaques is one of the major pathological hallmarks of Alzheimer's disease (AD), and is the target of ...

Protokół ten porównuje obciążenie blaszką amyloidowo-beta w pełnych sekcjach i podregionach zainteresowania w sekcjach mózgu transgenicznych myszy APP / PS1. Metoda i wyniki przedstawione w tym konkretnym protokole umożliwią czytelnikom lub badaczom wybór między pełnym regionem zainteresowania a analizą podregionu zainteresowania w celu określenia obciążenia beta w sekcjach mózgu myszy. Aby rozpocząć, pobierz oprogramowanie do analizy obrazu.Po instalacji uruchom oprogramowanie i kliknij plik, a następnie otwórz i wybierz obraz do analizy. Na pasku narzędzi oprogramowania wybierz narzędzie proste i narysuj linię prostą wzdłuż długości podziałki liniowej. Kliknij analizę, a następnie kliknij zakładki ustaw skalę.Ponownie kliknij kartę analizy, a następnie zmierz karty, aby zanotować długość lub odległość paska skali w pikselach. W wyskakującym okienku wprowadź odległość w pikselach, znaną odległość paska skali i wprowadź jednostkę długości jako mikrometr. Następnie zaznacz pole globalne, aby zastosować nowe ustawienie skali do wszystkich kolejnych obrazów, jeśli przetwarzanych jest wiele obrazów.Kliknij przycisk OK, aby zastosować ustawienia. Aby ustawić żądany pomiar dla obszaru przekroju, przejdź do analizy, następnie ustaw pomiary i wybierz pola obszaru i wyświetl etykietę. Upewnij się, że analizowany obraz jest zaznaczony na karcie Przekieruj do.Aby ułatwić wizualizację hipokampa lub kory mózgowej, przejdź do obrazu i dostosuj jasność lub kontrast. Przeciągnij maksymalny suwak stopniowo w lewo, aby zwiększyć przejrzystość tkanek, aż do zidentyfikowania obszarów mózgu będących przedmiotem zainteresowania lub ROI. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokąta lub odręcznego, aby obrysować obszar hipokampa.Po obrysowaniu regionu kliknij opcję resetowania ustawień jasności lub kontrastu, aby powrócić do oryginalnej jasności. Aby zmierzyć całkowitą powierzchnię tkanki w wybranym obszarze, kliknij edytuj i wyczyść na zewnątrz. Gdy wybrany region jest jedynym obrazem na ekranie, kliknij kartę analizy, a następnie zmierz, aby uzyskać całkowity obszar tkanki analizowany w wyskakującym okienku.Następnie zapisz dane w pliku Excel. Aby zmierzyć zabarwiony obszar pozytywowy 6-E10, przejdź do kart obrazu, regulacji i progu koloru w kolejności. Gotowy filtr w ramach metody progowej zapewnia pożądane wyniki, podkreślając najsilniejsze sygnały na czerwono.Po wybraniu odpowiedniego progu sprawdź ciemne tło, aby podświetlić plamki beta amyloidu na czarnym tle. Kliknij na wybór, a następnie oryginał i ponownie wybierz, podając ciemne sygnały osadów beta amyloidu na białym tle. Po wygenerowaniu wyskakującego okienka kliknij kartę analizuj i analizuj cząstki, a następnie naciśnij OK. Skopiuj dane wyjściowe podsumowania wygenerowane przez oprogramowanie, klikając przyciski edycji i kopiowania.Następnie wklej do wcześniej uruchomionego pliku Excel z odpowiednimi etykietami. Oblicz procentowy obszar dodatni 6E-10 za pomocą wzoru Po pobraniu oprogramowania do analizy obrazu wykonuj kroki, aż ROI mózgu będzie możliwe do zidentyfikowania, jak pokazano wcześniej. Następnie, za pomocą narzędzia prostokąta, wybierz ROI w korze lub hipokampie.Na pasku narzędzi kliknij edytuj, a następnie wybierz i określ zakładkę zmieniającą wysokość i szerokość na predefiniowaną wartość. Wyreguluj pudełko tak, aby było całkowicie pokryte chusteczką. Zresetuj jasność lub kontrast do oryginalnej jasności.Zduplikuj wybrany zwrot z inwestycji, klikając pole prawym przyciskiem myszy i klikając duplikat. Otworzy się nowe okno z wybranym regionem. Zmień nazwę zduplikowanego obrazu, aby wyświetlić region, w którym się znajduje.Dostosuj typ zduplikowanego obrazu, używając paska narzędzi i klikając obraz, a następnie wpisz klucze 8-bitowe, aby przekonwertować zduplikowany obraz RGB na 8-bitowy, aby jak najlepiej przeanalizować płytki. Odwróć obraz, klikając edytuj, a następnie odwróć. Aby zmierzyć obszar dodatni 6E-10, przejdź do obrazu, a następnie dostosuj i próg.Predefiniowany filtr w ramach metody progowania zapewni pożądane wyniki, podświetlając najsilniejsze sygnały na czerwono. Po wybraniu odpowiedniego progu należy wcisnąć przycisk Zastosuj. Aby przeanalizować obszar dodatni 6E-10, użyj paska narzędzi i kliknij zakładki Analizuj i Analizuj cząstki, upewniając się, że wyniki podsumowania są zaznaczone.Skopiuj dane wyjściowe podsumowania z obszarem procentowym, klikając karty edycji i kopiowania. Następnie wklej dane wyjściowe podsumowania do wcześniej uruchomionego pliku Excel z odpowiednimi etykietami. Powtórz procedurę dla różnych obszarów tkanki, upewniając się, że umieszczenie każdego pola w celu nakreślenia zwrotu z inwestycji jest spójne między każdym obrazem.W tej reprezentatywnej ocenie porównano metody pełnej i podrzędnej analizy ROI w celu ilościowego określenia dodatniego obszaru 6E-10 w korze mózgowej i hipokampie. Pełna analiza ROI polega na nakreśleniu całego ROI. Z kolei analiza sub ROI polega na wybraniu predefiniowanego regionu w ramach ROI.Procedura krokowa dla pełnej i sub ROI 6E-10 dodatniej kwantyfikacji obszaru, z rotacją ROI dla kwantyfikacji sub ROI, jest pokazana tutaj. Korelacja między pełną i podrzędną analizą ROI jest pokazana tutaj. Zaobserwowano istotną dodatnią korelację między obszarem dodatnim 6E-10 zgłoszonym przez dwóch czytelników wykonujących analizę sub ROI dla kory i hipokampa.Co więcej, uśredniony obszar dodatni poniżej ROI 6E-10 miał silną, istotną dodatnią korelację z obszarem uzyskanym przy użyciu pełnego zwrotu z inwestycji. Dla średniego obszaru dodatniego 6E-10 w pełni w analizach sub ROI nie zaobserwowano istotnej różnicy w korze i hipokampie. Zaobserwowano istotną korelację między pomiarami homogenatu całego mózgu a rozpuszczalnym amyloidem beta 1-42 przez Elizę a pełną analizą ROI z badania Wybór progu jest kluczem do uzyskania dokładnej kwantyfikacji danych.Wymagana jest interwencja użytkownika, aby upewnić się, że pozytywne plamy są dokładnie wybrane za pomocą wybranego filtra. Oprócz oznaczania ilościowego beta-amyloidu, metoda ta może być stosowana do innych fluorescencyjnych barwników immunologicznych. Na przykład Iba-1 z kwantyfikacji obszaru dodatniego mikrogleju.

full-versus-sub-regional-quantification-amyloid-beta-load-on-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Uszkodzenia mózgu wynikające z niedokrwienia mózgu mogą być nieinwazyjnie obrazowane i badane u szczurów za pomocą przedklinicznej pozytonowej tomografii emisyjnej połączonej z wstrzykiwaną sondą radioaktywną, 18F-fluorodeoksyglukozą. Co więcej, wykorzystanie nowoczesnych narzędzi programowych, które zawierają szablony mózgu dotyczące ilości zainteresowania (VOI), znacznie zwiększa ilość informacji uzyskanych z tych badań.

Nieinwazyjne obrazowanie i analiza niedokrwienia mózgu u żywych szczurów przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej z 18F-FDG

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej stereotaktycznej infuzji beta-amyloidu do mózgu. Metodologia ta zapewnia alternatywny model mysi in vivo w celu rozwiązania krótkoterminowych skutków beta-amyloidu na neurony mózgowe.

Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy

Opracowaliśmy metodologię ilościowego modelowania 3D in silico (q3DISM) amyloid-β (Aβ) fagocytoza przez jednojądrzaste fagocyty w modelach gryzoni choroby Alzheimera. Metodę tę można uogólnić w celu ilościowego określenia praktycznie każdego zdarzenia fagocytarnego in vivo.

Ilościowe modelowanie 3D in silico (q3DISM) mózgowej fagocytozy beta-amyloidowej w modelach gryzoni choroby Alzheimera

Obrazowanie molekularne z laserową desorpcją/jonizacją wspomaganą matrycą, spektrometria mas (MALDI-IMS) pozwala na jednoczesne mapowanie wielu analitów w próbkach biologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania i wizualizacji białka β amyloidu w tkankach mózgowych choroby Alzheimera i próbkach mózgowej angiopatii amyloidowej za pomocą MALDI-IMS.

Wizualizacja złogów β amyloidu w ludzkim mózgu za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Synteza białek jest krytycznym procesem biologicznym dla komórek. W mózgu jest niezbędna do zmian adaptacyjnych. Pomiar tempa syntezy białek w nienaruszonym mózgu wymaga starannych rozważań metodologicznych. W tym artykule przedstawiono ilościową metodę autoradiograficzną L-[1-14C]-leucyny do oznaczania regionalnych szybkości syntezy białek mózgowych in vivo.

Ilościowa metoda autoradiograficzna do oznaczania regionalnych szybkości syntezy białek mózgowych in vivo

Ten protokół opisuje nowatorską technikę pomiaru trzech najważniejszych parametrów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu na tym samym zestawie próbek mózgu gryzoni. Wykorzystanie tylko jednej próbki mózgu jest bardzo korzystne pod względem kosztów etycznych i ekonomicznych.

Pomiar obrzęku mózgu po udarze, strefy zawału i uszkodzenia bariery krew-mózg w jednym zestawie próbek mózgu gryzoni

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.

Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) służy jako zwierzęcy model stwardnienia rozsianego. W tym artykule opisano podejście do oceny zapalenia rdzenia kręgowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w EAE. Dodatkowo przedstawiono metodę ilościowego określania poziomu rozpuszczalnego światła neurofilamentów w surowicy myszy, ułatwiającą ocenę uszkodzenia aksonów u żywych myszy.

Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

Wcześniaki (poród &lt; 37. tygodniu) to pilny globalny problem zdrowotny z nieoptymalnymi opcjami profilaktyki i leczenia. Przedstawiamy myszy model wcześnianego porodu wywołanego infekcją bakteryjną pochwy oraz opisujemy, jak analizować wynikającą z tego chorobność i śmiertelność noworodków.

Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Ten protokół przedstawia metody oceny rozkładu i ilości odkładania się żelaza w tkankach, zwłaszcza w mózgu. Protokół szczegółowo opisuje procedury przygotowania próbek, barwienia Perls/DAB, przechwytywania obrazu i analizy danych.

Ocena osadzania się żelaza w mózgach myszy 5xFAD za pomocą barwienia Perls/DAB

Poznaj metodę kwantyfikacji obciążenia beta-amyloidem w mózgu myszy APP/PS1, porównującą analizę pełną i subregionalną. Protokół umożliwia wybór optymalnej techniki obrazowania w badaniach nad chorobą Alzheimera.

Pełna, kontra subregionalna kwantyfikacja obciążenia beta-amyloidem w wycinkach mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów