Pełna, kontra subregionalna kwantyfikacja obciążenia beta-amyloidem w wycinkach mózgu myszy
19 maja 2022
Obecny protokół opisuje i porównuje procedurę przeprowadzania analizy całego regionu lub podregionu zainteresowania odcinków mózgu myszy strzałkowej w celu ilościowego określenia obciążenia beta-amyloidu w transgenicznym mysim modelu choroby Alzheimera APP/PS1.
Protokół ten porównuje obciążenie blaszką amyloidowo-beta w pełnych sekcjach i podregionach zainteresowania w sekcjach mózgu transgenicznych myszy APP / PS1. Metoda i wyniki przedstawione w tym konkretnym protokole umożliwią czytelnikom lub badaczom wybór między pełnym regionem zainteresowania a analizą podregionu zainteresowania w celu określenia obciążenia beta w sekcjach mózgu myszy. Aby rozpocząć, pobierz oprogramowanie do analizy obrazu.
Po instalacji uruchom oprogramowanie i kliknij plik, a następnie otwórz i wybierz obraz do analizy. Na pasku narzędzi oprogramowania wybierz narzędzie proste i narysuj linię prostą wzdłuż długości podziałki liniowej. Kliknij analizę, a następnie kliknij zakładki ustaw skalę.
Ponownie kliknij kartę analizy, a następnie zmierz karty, aby zanotować długość lub odległość paska skali w pikselach. W wyskakującym okienku wprowadź odległość w pikselach, znaną odległość paska skali i wprowadź jednostkę długości jako mikrometr. Następnie zaznacz pole globalne, aby zastosować nowe ustawienie skali do wszystkich kolejnych obrazów, jeśli przetwarzanych jest wiele obrazów.
Kliknij przycisk OK, aby zastosować ustawienia. Aby ustawić żądany pomiar dla obszaru przekroju, przejdź do analizy, następnie ustaw pomiary i wybierz pola obszaru i wyświetl etykietę. Upewnij się, że analizowany obraz jest zaznaczony na karcie Przekieruj do.
Aby ułatwić wizualizację hipokampa lub kory mózgowej, przejdź do obrazu i dostosuj jasność lub kontrast. Przeciągnij maksymalny suwak stopniowo w lewo, aby zwiększyć przejrzystość tkanek, aż do zidentyfikowania obszarów mózgu będących przedmiotem zainteresowania lub ROI. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokąta lub odręcznego, aby obrysować obszar hipokampa.
Po obrysowaniu regionu kliknij opcję resetowania ustawień jasności lub kontrastu, aby powrócić do oryginalnej jasności. Aby zmierzyć całkowitą powierzchnię tkanki w wybranym obszarze, kliknij edytuj i wyczyść na zewnątrz. Gdy wybrany region jest jedynym obrazem na ekranie, kliknij kartę analizy, a następnie zmierz, aby uzyskać całkowity obszar tkanki analizowany w wyskakującym okienku.
Następnie zapisz dane w pliku Excel. Aby zmierzyć zabarwiony obszar pozytywowy 6-E10, przejdź do kart obrazu, regulacji i progu koloru w kolejności. Gotowy filtr w ramach metody progowej zapewnia pożądane wyniki, podkreślając najsilniejsze sygnały na czerwono.
Po wybraniu odpowiedniego progu sprawdź ciemne tło, aby podświetlić plamki beta amyloidu na czarnym tle. Kliknij na wybór, a następnie oryginał i ponownie wybierz, podając ciemne sygnały osadów beta amyloidu na białym tle. Po wygenerowaniu wyskakującego okienka kliknij kartę analizuj i analizuj cząstki, a następnie naciśnij OK. Skopiuj dane wyjściowe podsumowania wygenerowane przez oprogramowanie, klikając przyciski edycji i kopiowania.
Następnie wklej do wcześniej uruchomionego pliku Excel z odpowiednimi etykietami. Oblicz procentowy obszar dodatni 6E-10 za pomocą wzoru Po pobraniu oprogramowania do analizy obrazu wykonuj kroki, aż ROI mózgu będzie możliwe do zidentyfikowania, jak pokazano wcześniej. Następnie, za pomocą narzędzia prostokąta, wybierz ROI w korze lub hipokampie.
Na pasku narzędzi kliknij edytuj, a następnie wybierz i określ zakładkę zmieniającą wysokość i szerokość na predefiniowaną wartość. Wyreguluj pudełko tak, aby było całkowicie pokryte chusteczką. Zresetuj jasność lub kontrast do oryginalnej jasności.
Zduplikuj wybrany zwrot z inwestycji, klikając pole prawym przyciskiem myszy i klikając duplikat. Otworzy się nowe okno z wybranym regionem. Zmień nazwę zduplikowanego obrazu, aby wyświetlić region, w którym się znajduje.
Dostosuj typ zduplikowanego obrazu, używając paska narzędzi i klikając obraz, a następnie wpisz klucze 8-bitowe, aby przekonwertować zduplikowany obraz RGB na 8-bitowy, aby jak najlepiej przeanalizować płytki. Odwróć obraz, klikając edytuj, a następnie odwróć. Aby zmierzyć obszar dodatni 6E-10, przejdź do obrazu, a następnie dostosuj i próg.
Predefiniowany filtr w ramach metody progowania zapewni pożądane wyniki, podświetlając najsilniejsze sygnały na czerwono. Po wybraniu odpowiedniego progu należy wcisnąć przycisk Zastosuj. Aby przeanalizować obszar dodatni 6E-10, użyj paska narzędzi i kliknij zakładki Analizuj i Analizuj cząstki, upewniając się, że wyniki podsumowania są zaznaczone.
Skopiuj dane wyjściowe podsumowania z obszarem procentowym, klikając karty edycji i kopiowania. Następnie wklej dane wyjściowe podsumowania do wcześniej uruchomionego pliku Excel z odpowiednimi etykietami. Powtórz procedurę dla różnych obszarów tkanki, upewniając się, że umieszczenie każdego pola w celu nakreślenia zwrotu z inwestycji jest spójne między każdym obrazem.
W tej reprezentatywnej ocenie porównano metody pełnej i podrzędnej analizy ROI w celu ilościowego określenia dodatniego obszaru 6E-10 w korze mózgowej i hipokampie. Pełna analiza ROI polega na nakreśleniu całego ROI. Z kolei analiza sub ROI polega na wybraniu predefiniowanego regionu w ramach ROI.
Procedura krokowa dla pełnej i sub ROI 6E-10 dodatniej kwantyfikacji obszaru, z rotacją ROI dla kwantyfikacji sub ROI, jest pokazana tutaj. Korelacja między pełną i podrzędną analizą ROI jest pokazana tutaj. Zaobserwowano istotną dodatnią korelację między obszarem dodatnim 6E-10 zgłoszonym przez dwóch czytelników wykonujących analizę sub ROI dla kory i hipokampa.
Co więcej, uśredniony obszar dodatni poniżej ROI 6E-10 miał silną, istotną dodatnią korelację z obszarem uzyskanym przy użyciu pełnego zwrotu z inwestycji. Dla średniego obszaru dodatniego 6E-10 w pełni w analizach sub ROI nie zaobserwowano istotnej różnicy w korze i hipokampie. Zaobserwowano istotną korelację między pomiarami homogenatu całego mózgu a rozpuszczalnym amyloidem beta 1-42 przez Elizę a pełną analizą ROI z badania Wybór progu jest kluczem do uzyskania dokładnej kwantyfikacji danych.
Wymagana jest interwencja użytkownika, aby upewnić się, że pozytywne plamy są dokładnie wybrane za pomocą wybranego filtra. Oprócz oznaczania ilościowego beta-amyloidu, metoda ta może być stosowana do innych fluorescencyjnych barwników immunologicznych. Na przykład Iba-1 z kwantyfikacji obszaru dodatniego mikrogleju.
Przegląd
Ten protokół zapewnia szczegółowe porównanie pełnoobszarowych i subobszarowych analiz sagitkalnych przekrojów mózgu myszy w celu ilościowego określenia obciążenia amyloidem-beta w transgennym modelu myszym APP/PS1 choroby Alzheimera. Umożliwia badaczom skuteczne wybranie metodologii oceny obciążenia beta.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Badania nad chorobą Alzheimera
- Techniki analizy obrazów
Tło
- Nagromadzenie płatów amyloidu-beta jest charakterystyczne dla choroby Alzheimera.
- Model myszy APP/PS1 jest powszechnie stosowany do badania tego stanu.
- Zrozumienie metodologii ilościowego określenia płatów jest kluczowe dla badań.
- Ten protokół przyczynia się do standaryzacji podejść w badaniach nad chorobą Alzheimera.
Cel badania
- Porównanie skuteczności analizy pełnoobszarowej i subobszarowej w ilościowym określaniu amyloidu-beta.
- Zapewnienie krok po kroku procedury, którą badacze mogą powtórzyć.
- Wyjaśnienie korelacji i różnic między dwoma podejściami analitycznymi.
Stosowane metody
- Do ilościowego określania obciążenia amyloidem-beta stosuje się oprogramowanie do analizy obrazów.
- Analiza jest przeprowadzana na przekrojach mózgu myszy transgenicznych APP/PS1.
- Procedury obejmują ustawienie pomiarów dla analizy obszaru i stosowanie filtrów dla dokładnego ustawienia progów.
- Wiele obrazów może być przetworzonych przy zastosowanych globalnych ustawieniach skalowania.
Główne wyniki
- Analiza porównawcza ujawnila silne dodatnie korelacje między pełnoobszarową a subobszarową analizą.
- Nie zaobserwowano istotnych różnic w ilościowo określonym obszarze amyloidu-beta między dwoma metodami.
- Wybór progów okazał się kluczowy dla precyzyjnych wyników ilościowych.
- Wyniki wykazują zastosowanie w ilościowym określaniu innych fluorescencyjnych barwników immunologicznych poza amyloidem-beta.
Wnioski
- Badanie umożliwia badaczom wybór odpowiednich metodologii do ilościowego określania amyloidu-beta.
- Podkreśla znaczenie dokładnych technik ustawiania progów i pomiarów.
- Zdobyte informacje mogą poprawić zrozumienie patologii choroby Alzheimera i powiązanych mechanizmów neuronowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of amyloid-beta plaque load in transgenic mouse brain sections is critical for target validation and mechanistic de-risking in Alzheimer's disease research. This protocol enables standardized comparison of full-region versus sub-region quantification, supporting predictive confidence in preclinical model selection and assay development. Reliable measurement of amyloid-beta burden informs early discovery decisions and portfolio triage for neurodegenerative disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of amyloid-beta pathology in disease-relevant mouse models.
- Supports functional target validation by quantifying plaque burden across brain regions.
- Facilitates mechanistic de-risking by correlating full and sub-regional quantification outputs.
- Improves predictive confidence for advancing Alzheimer's disease targets.
Screening & Assay Development
- Standardizes image analysis workflows for reproducible quantification of immunostained brain sections.
- Provides quantitative outputs suitable for assay benchmarking and cross-study comparisons.
- Enables preparation of validated biological systems for downstream compound screening.
- Supports scalability and platform reuse for other fluorescent immuno-stains.
Translational & Preclinical Research
- Aligns quantification methods with translational biomarker strategies in Alzheimer's models.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by correlating ELISA and image-based readouts.
- Reduces biological risk in preclinical advancement decisions by providing reliable plaque load metrics.
Pipeline & Workflow Integration
This quantification protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for neurodegenerative disease research, supporting both early hypothesis testing and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise amyloid-beta measurement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides statistical outputs and correlation analyses to compare full and sub-regional measurements.
- Translational Research: Connects image-based quantification with biochemical assays for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow adaptable to other immuno-stains and neurodegenerative targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in Alzheimer's disease models.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of plaque quantification workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing reliable target engagement metrics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodegenerative disease assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in image analysis and immunostaining interpretation.
- Depends on access to validated image analysis software and quantitative data infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of region-of-interest selection and thresholding parameters.
- Adaptable to various brain regions and fluorescent markers with consistent methodology.
- Accuracy is contingent on user intervention for threshold selection and region delineation.
