Name: Ustanowienie organoidów z ludzkiego zęba jako potężnego narzędzia w kierunku badań mechanistycznych i terapii regeneracyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj metodę tworzenia organoidów z ludzkiego zęba do badań biologii komórek macierzystych i procesu formowania szkliwa. Ten model umożliwia ekspansję komórek nabłonkowych oraz otwiera nowe możliwości w regeneracyjnej stomatologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni wszystkim pracownikom Chirurgii Jamy Ustnej i Szczękowo-Twarzowej (MKA) UZ Leuven, jak również pacjentom, za ich nieocenioną pomoc w zbieraniu świeżo pobranych trzecich zębów trzonowych. Chcielibyśmy również podziękować dr Reinhilde Jacobs i dr Elisabeth Tijskens za pomoc w pobraniu próbek. Prace te były wspierane przez granty z KU Leuven (BOF) i FWO-Flanders (G061819N). L.H. jest doktorantem FWO (1S84718N).

<ol><li>Yu, T., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+of+tooth+development%2C+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair.</a> Development (Cambridge). 147 (2), (2020).</li>
<li>Arrow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+enamel+defects%2C+caries+experience+and+oral+health-related+quality+of+life%3A+a+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Dental+Journal%22%5BJournal%5D)">Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study.</a> Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).</li>
<li>Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMitsiadis%2C+TA+%22Dental+Stem+Cells%3A+Regenerative+Potential.+Stem+Cell+Biology+and+Regenerative+Potential.+Stem+Cell+Biology+and+Regenerative+Medicine%22">Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine</a>. Zavan, B., Bressan, E. , Humana Press. Cham. (2016).</li>
<li>Mitsiadis, T. A., Orsini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+a+new+era+in+dentistry%3A+stem+cell-based+approaches+for+tooth+and+periodontal+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration.</a> Frontiers in Physiology. 7, 357(2016).</li>
<li>Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+dental+stem+cell-based+research+approaches%3A+the+future+of+dentistry%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry.</a> Stem Cells International. 2016, 7231038(2016).</li>
<li>Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescent+epithelial+cell+rests+of+malassez+can+differentiate+into+ameloblast-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).</li>
<li>Davis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+epithelial+cell+rests+of+Malassez+on+the+bicentennial+of+their+description%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Dentistry%22%5BJournal%5D)">A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description.</a> Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).</li>
<li>Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+adult+epithelial+stem+cells+from+the+periodontal+ligament%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament.</a> Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).</li>
<li>Kim, G. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+establishment+of+dental+epithelial-like+stem+cells+derived+from+human+ESCs+and+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).</li>
<li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath%2F+epithelial+rests+of+malassez+cell+line+from+human+periodontium%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Establishment of Hertwig's epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium.</a> Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).</li>
<li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+of+the+stem+cell+markers+in+human+hertwig%27s+epithelial+root+sheath%2FEpithelial+rests+of+Malassez+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Expression profile of the stem cell markers in human hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells.</a> Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).</li>
<li>Tsunematsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+odontogenic+epithelial+cells+derived+from+epithelial+rests+of+Malassez+possess+stem+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).</li>
<li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+and+application+of+3D-organoid+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li>
<li>Cox, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+from+pituitary+as+a+novel+research+model+toward+pituitary+stem+cell+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration.</a> Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).</li>
<li>Schutgens, F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+tools+for+understanding+biology+and+treating+diseases%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases).</a> Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).</li>
<li>Hemeryck, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+from+human+tooth+showing+epithelial+stemness+phenotype+and+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153(2022).</li>
<li>Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+organoids%3A+progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Oral organoids: progress and challenges.</a> Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4963(2020).</li>
<li>Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+rests+of+malassez+contain+unique+stem+cell+populations+capable+of+undergoing+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition.</a> Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).</li>
<li>Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+development+of+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath.</a> Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).</li>
<li>Fukumoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+functions+of+enamel+matrices+in+calcified+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Dental+Science+Review%22%5BJournal%5D)">New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues.</a> Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).</li>
<li>Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERM+functions%2C+EGF+and+orthodontic+movement+or+Why+doesn%27t+orthodontic+movement+cause+alveolodental+ankylosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dental+Press+Journal+of+Orthodontics%22%5BJournal%5D)">ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn't orthodontic movement cause alveolodental ankylosis.</a> Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).</li>
<li>Guajardo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+epidermal+growth+factor+in+cat+paradental+tissues+during+tooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Orthodontics+and+Dentofacial+Orthopedics%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+quantitative+reduction+of+rests+of+Malassez+according+to+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age.</a> Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).</li>
<li>Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+Model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: Model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADULT+%28acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth%29+syndrome%3A+a+case+report+from+India%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Dermatology+Online+Journal%22%5BJournal%5D)">ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India.</a> Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194(2018).</li>
<li>Future Health Biobank. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://futurehealthbiobank.com/ch-en/">https://futurehealthbiobank.com/ch-en/</a> (2022).</li>
<li>Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+co-culture+of+human+intestinal+organoids+and+lamina+propria-derived+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100519(2021).</li>
<li>Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+cell+communication+in+cancer+with+organoids%3A+Making+the+complex+simple%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166(2020).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyisocyanide+hydrogels+as+a+tunable+platform+for+mammary+gland+organoid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation.</a> Advanced Science. 7 (18), 2001797(2020).</li>
<li>Mollaki, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethical+challenges+in+organoid+use%5BTitle%5D)+AND+%22BioTech%22%5BJournal%5D)">Ethical challenges in organoid use.</a> BioTech. 10 (3), 12(2021).</li>
</ol>

Autor korespondencyjny zapewnia, że wszyscy autorzy ujawnili wszelkie konflikty interesów.

Protokół ten opisuje wydajne i powtarzalne wytwarzanie organoidów, począwszy od ludzkiego zęba. Zgodnie z naszą wiedzą, jest to pierwsza metodologia tworzenia organoidów (nabłonkowych) opartych na obecnej koncepcji, począwszy od ludzkiej tkanki zębowej. Organoidy są długotrwale rozszerzalne i wykazują fenotyp łodygi nabłonka zębów, powielając DEC wcześniej zgłoszone w kompartmencie ERM DF7. Co więcej, organoidy odtwarzają funkcjonalne cechy DESC/ERM, w tym rozwój procesu różnicowania ameloblastów<...

Zęby odgrywają kluczową rolę w przeżuwaniu, mowie i samopoczuciu psychicznym (obrazie siebie). Ząb ludzki składa się z wysoko zmineralizowanych tkanek o różnej gęstości i twardości1. Szkliwo zębów, główny składnik korony zęba, jest najbardziej zmineralizowaną tkanką w organizmie człowieka. Podczas tworzenia szkliwa (amelogenezy), gdy rozwijają się zęby, komórki macierzyste nabłonka zębów (DESC) różnicują się w komórki tworzące szkliwo (ameloblasty). Raz uformowane szkliwo jest rzadko naprawiane lub odnawiane z powodu apoptotycznej utraty ameloblastów na początku wyrzynania się zębów1. Odbudowa uszkodzonej tkanki szkliwa, spowodowanej urazem lub chorobą bakteryjną, jest obecnie realizowana przy użyciu materiałów syntetycznych; Są one jednak dotknięte istotnymi niedociągnięciami, takimi jak mikrowycieki, gorsza osteointegracja i zakotwiczenie, skończona żywotność i brak w pełni funkcjonalnej naprawy2. W związku z tym solidna i niezawodna hodowla ludzkich DEC ze zdolnością do generowania ameloblastów i potencjałem do wytwarzania zmineralizowanej tkanki byłaby dużym krokiem naprzód w dziedzinie regeneracji zębów.
Wiedza na temat fenotypu ludzkiego DESC i funkcji biologicznej jest rzadkością3,4,5. Co ciekawe, zaproponowano, że DES ludzkich zębów istnieją w resztkach komórek nabłonkowych Malasseza (ERM), skupiskach komórek obecnych w mieszku zębowym (DF), który otacza niewyrżnięte zęby i pozostaje obecny w więzadle przyzębia wokół korzenia po wyrzynaniu się zęba1. Stwierdzono, że komórki ERM hodowane wspólnie z miazgą zębową różnicują się w komórki podobne do ameloblastów i generują tkankę podobną do szkliwa6. Jednak dogłębne badania nad specyficzną rolą komórek ERM w (re-) generacji szkliwa były ograniczone ze względu na brak wiarygodnych modeli badawczych7. Obecne systemy hodowli in vitro ERM są utrudnione przez ograniczoną żywotność i szybką utratę fenotypu w standardowo stosowanych warunkach 2D8,9,10,11,12. W związku z tym bardzo potrzebny jest elastyczny system in vitro, który wiernie rozwijałby, badał i różnicował ludzkie DESC.
W ciągu ostatniej dekady, potężna technika hodowli nabłonkowych komórek macierzystych in vitro została z powodzeniem zastosowana do kilku typów (ludzkich) tkanek nabłonkowych w celu zbadania ich biologii, a także choroby13,14,15,16. Technologia ta umożliwia komórkom macierzystym nabłonka tkankowego samorozwój w struktury komórkowe 3D (tj. organoidy) po zasianiu do rusztowania naśladującego macierz zewnątrzkomórkową (ECM) (zwykle Matrigel) i hodowli w określonym pożywce replikującej sygnalizację niszy komórek macierzystych tkanki i / lub embriogenezę. Typowe czynniki wzrostu potrzebne do rozwoju organoidów obejmują naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i bezskrzydłe aktywatory miejsca integracji MMTV (WNT) 14,15,16. Powstałe w ten sposób organoidy charakteryzują się trwałą wiernością w naśladowaniu oryginalnych nabłonkowych komórek macierzystych tkanki, a także wysoką rozszerzalnością przy zachowaniu ich fenotypu i właściwości funkcjonalnych, pokonując w ten sposób często ograniczoną dostępność pierwotnych tkanek ludzkich nabytych w klinice. Aby ustalić organoidy, izolacja nabłonkowych komórek macierzystych z tkanki heterogenicznej (tj. obejmującej inne typy komórek, takich jak komórki mezenchymalne) przed hodowlą nie jest wymagana, ponieważ komórki mezenchymalne nie przyczepiają się do ECM ani nie rozwijają się w nim, co ostatecznie prowadzi do powstania czysto nabłonkowych organoidów13,16,17,18,19. Ta obiecująca i wszechstronna technologia doprowadziła do opracowania różnorodnych modeli organoidów z różnych ludzkich tkanek nabłonkowych. Jednak organoidy pochodzące z ludzkich zębów, cenne dla dogłębnych badań nad rozwojem, regeneracją i chorobami zębów, nie zostały jeszcze ustalone20,21. Niedawno udało nam się opracować taki nowy model organoidowy, zaczynając od tkanki DF z trzecich zębów trzonowych (zębów mądrości) pobranych od dorastających pacjentów19.
Tutaj opisujemy protokół tworzenia nabłonkowych kultur organoidowych z dorosłego ludzkiego zęba (tj. z DF trzecich zębów trzonowych) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Powstałe w ten sposób organoidy wykazują ekspresję markerów macierzystych związanych z ERM, a jednocześnie są podatne na długoterminową ekspansję. Co ciekawe, w przeciwieństwie do większości innych modeli organoidów, zazwyczaj potrzebny EGF jest zbędny dla solidnego rozwoju i wzrostu organoidów. Co ciekawe, organoidy macierzyste wykazują właściwości różnicowania ameloblastów, naśladując w ten sposób cechy i procesy ERM/DESC zachodzące in vivo. Opisany tutaj nowy i unikalny model organoidów pozwala badać biologię, plastyczność i zdolność różnicowania DESC oraz otwiera drzwi do podjęcia pierwszych kroków w kierunku podejścia regeneracyjnego zębów.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml Probówka do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>30120.086</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-6250</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowe płaskie płytki</td><td>denne Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>SML0788</tr><tr><td>Agaroza</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bydlęca (klasa hodowli komórkowych)</td><td>Serva</td><td>47330.03</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało AMELX</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365284</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Gibco</td><td>15200018</td><td></td></tr><tr><td>B27 (bez witaminy A)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta</td><td>VWR</td><td></td><td></td>7202191</tr><tr><td>Katalaza z wątroby bydlęcej</td><td>Przeciwciało Sigma-Aldrich</td><td>C100</td><td></td></tr><tr><td>CD44</td><td>Abcam</td><td>ab34485</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek, 40 i mikro; m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CK14</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-11599</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>VWR</td><td>6310146</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dyspaza II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1:1 F12 bez Fe</td><td>Invitrogen</td><td>074-90715A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM w proszku o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Gibco</td><td>52100039</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>Serum osła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663 - 10ML</td><td></td></tr><tr><td>Stacja robocza do zatapiania, 220 do 240 Vac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587976</td><td></td></tr><tr><td>Absolut etanolu, &ge; 99,8% (EtOH)</td><td>Fisher Chemical</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 (= zasadowa FGF)</td><td>R& D Systems</td><td>234-FSE-025</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-25</td><td></td></tr><tr><td>GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RTN350-1KT</td><td>Zawiera 1% &beta;-merkaptoetanol rozpuszczony w buforze do lizy</td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura</td><td>Mechanizmy Niko</td><td>170-40050</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>VWR</td><td>101194M</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632 (inhibitor ROCK, RI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>Insulina z trzustki bydła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało ITGA6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA012696</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (o obniżonym czynniku wzrostu; bez czerwieni fenolowej)</td> <td>Corning</td><td>15505739</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV Filtr strzykawkowy, 0,22&nbsp; &mu; m</td><td>Millipore</td><td>SLGV033R</td><td></td></tr><tr><td>Minimum niezbędne medium eagle (&alpha; MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>mysie przeciwciało IgG (Alexa 555)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało P63</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>Pap Pen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td>Długopis znakujący</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA), 16%</td><td>Merck</td><td>8.18715</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa penicyliny G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (Pen/Strep)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>szalka</td> <td>PetriegoCorning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta (P20, P200, P1000)</td><td>Eppendorf lub inne</td><td>2231300006</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta transferowa (3,5&nbsp; mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.001</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe IgG królika (Alexa 488)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>RSPO1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (p38i)</td><td>Biotechne (Tocris)</td><td>1264</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel (ostrze chirurgiczne)</td><td>Swann-Morton</td><td>207</td><td></td></tr><tr><td>SHH</td><td>R& D Systems</td><td>464-SH-200</td><td></td></tr><tr><td>Formy silikonowe (blok grzewczy)</td><td>VWR</td><td>720-1918</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>BDH</td><td>102415K</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (C3H3NaO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało SOX2</td><td>Abcam</td><td>ab92494</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>System PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Stericup-GP, 0,22 i mikro; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP Sterylny filtr górny z probówką wirówkową, 0,22 & mu; m</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne 1000 &mu; L końcówki do pipet z filtrem</td><td>Greiner</td><td>740288</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 20 &mu; L końcówki do pipet z filtrem</td><td>Greiner</td><td>774288</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 200 &mu; Końcówki do pipet L z filtrem i bez</td><td>Greiner</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne H2O</td><td>Fresenius</td><td>B230531</td><td></td></tr><tr><td>Sól siarczanu streptomycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny III do syntezy pierwszej nici supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11752-050</td><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji</td></tr><tr><td>Procesor tkanek</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>12505356</tr><tr><td>Transferrin</td><td>Serva</td><td>36760.01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe Vectashield + DAPI</td><td>Labconsult NV</td><td>H-1200</td><td>Medium montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPI</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>Biotechne (Tocris)</td><td>5036-WN-500</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny, 99%, do biochemii i histologii</td><td>VWR</td><td>2,89,75,325</td><td></td></tr></tbody></table>

ustanowienie organoidów z ludzkiego zęba jako potężnego narzędzia w kierunku badań mechanistycznych i terapii regeneracyjnej

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

Zęby mają kluczowe znaczenie w życiu, nie tylko dla jedzenia, żucia i mowy, ale także dla dobrego samopoczucia psychicznego. Wiedza na temat rozwoju i biologii zębów człowieka jest niewielka. W szczególności niewiele wiadomo o nabłonkowych komórkach macierzystych zęba i ich funkcji. Udało nam się opracować nowatorski model organoidowy, zaczynając od ludzkiej tkanki zęba (tj. mieszków zębowych, wyizolowanych z usuniętych zębów mądrości). Organoidy są solidnie i długoterminowo rozszerzalne i podsumowują proponowany przedział komórek macierzystych nabłonka ludzkiego zęba pod względem ekspresji markerów, a także aktywności funkcjonalnej. W szczególności organoidy są zdolne do rozwijania procesu różnicowania ameloblastów, który zachodzi in vivo podczas amelogenezy. Ten unikalny model organoidu dostarczy potężnego narzędzia do badania nie tylko rozwoju ludzkich zębów, ale także patologii stomatologicznej i może utorować drogę do terapii regeneracyjnej zębów. Zastąpienie utraconych zębów zębem biologicznym opartym na tym nowym modelu organoidu może być atrakcyjną alternatywą dla obecnego standardowego wszczepiania materiałów syntetycznych.

Rozwój organoidów zębowych 
Przedstawiamy szczegółowy protokół tworzenia kultur organoidów z ludzkiej tkanki DF uzyskanej po ekstrakcji zęba mądrości (Rycina 1A). Wyizolowane DF są dysocjowane enzymatycznie i mechanicznie. Uzyskane komórki są hodowane w BMM w pożywkach, które zostały empirycznie zdefiniowane w celu optymalnego rozwoju i wzrostu organoidów (pożywka do organoidów zębowych; TOM)19.
Organoidy zazwyczaj rozwi...

Przedstawiamy protokół rozwoju kultur organoidów nabłonkowych, zaczynając od ludzkiego zęba. Organoidy są bardzo rozprężalne i rekapitulują nabłonkowe komórki macierzyste zęba, w tym ich zdolność do różnicowania ameloblastów. Unikalny model organoidowy stanowi obiecujące narzędzie do badania biologii ludzkiej uzębienia (komórek macierzystych) z perspektywami podejścia regeneracyjnego zębów.

Ustanowienie organoidów z ludzkiego zęba jako potężnego narzędzia w kierunku badań mechanistycznych i terapii regeneracyjnej

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...

Ten nowy model organoidów pochodzących z ludzkich zębów stanowi pierwsze potężne narzędzie do rozszyfrowania biologii ludzkich komórek macierzystych zębów z perspektywą zastosowań regeneracyjnych zębów. Obecnie ten model organoidu zęba jest jedynym dostępnym narzędziem do niezawodnego i solidnego wzrostu i ekspansji komórek macierzystych nabłonka ludzkich zębów. Ten protokół organoidowy można zastosować do tworzenia modeli badawczych, nie tylko ze zdrowych, ale także chorych zębów, takich jak guzy zębów i wpływ bakterii.Eksploracja takich modeli chorób może odkryć nowe cele terapeutyczne. Ten model organoidowy jest bardzo pomocny w rozszyfrowaniu procesu tworzenia szkliwa w ludzkim zębie i może umożliwić budowę części zęba, takich jak szkliwo, w celach generatywnych. Procedurę zademonstruje Lara Hemeryck, doktorantka w mojej grupie badawczej.Na początek należy zebrać trzecie zęby trzonowe wraz z powiązanymi mieszkami zębowymi w podłożu zbiorczym umieszczonym na lodzie i przenieść zawartość probówek na szalkę Petriego. Przytrzymaj ząb pęsetą i ostrożnie odizoluj mieszki włosowe za pomocą ostrza chirurgicznego. Zmyj pozostałą krew z mieszków zębowych, umieszczając na krótko tkanki mieszków włosowych w pierwszej studzience 70% etanolu na 20 sekund, a następnie przenieś ją do następnej płytki etanolowej śmierci na 20 sekund i dalej do trzeciej studzienki etanolowej.Kontynuuj trzykrotne płukanie w studzienkach z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, a następnie płucz mieszki zębowe w trzech pozostałych dołkach do pobierania mieszków zębowych przez maksymalnie 20 minut. Przenieś przepłukane mieszki włosowe na nową szalkę Petriego. Wytnij mały kawałek jednego z mieszków włosowych w celu utrwalenia paraformaldehydu i przechowuj go w probówce do mikrowirówki zawierającej 500 mikrolitrów pożywki zbiorczej przez maksymalnie sześć godzin.Resztę mieszków zębowych zmielić na małe kawałki i przenieść je do 15-mililitrowej probówki zawierającej cztery mililitry podgrzanego podłoża dysocjacyjnego, a następnie inkubować rurkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny w łaźni wodnej. Co 15 minut pipetować pożywkę dysocjacyjną mieszków zębowych i mieszać w górę iw dół za pomocą szklanej pipety, aby przyspieszyć rozpad tkanek. Kiedy kawałki mieszków włosowych nie są już obserwowane, przystąp do dysocjacji za pomocą zwężonej, wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura.W międzyczasie przygotuj 10 mililitrów pożywki A zawierającej 100 mikrolitrów DNazy i dodaj pięć mililitrów tej pożywki do każdej probówki ze zdysocjowanymi mieszkami zębowymi. Inkubować przez minutę w temperaturze pokojowej. Przepłukać filtr jednym mililitrem pożywki A. Na tym etapie połączyć kilka probówek z dysocjowanymi mieszkami zębowymi od jednego pacjenta i odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórkową 200 razy g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Usunąć supernatant. Zawiesić osad w jednym mililitrze zdefiniowanego podłoża bez surowicy i przenieść zawiesinę komórek do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Oblicz stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i oblicz liczbę dołków, które można zasiać.Ostateczna mieszanina składa się z zawiesiny komórkowej i macierzy błony podstawnej w stosunku od 30 do 70. Usunąć odpowiednią ilość supernatantu i powoli zawiesić go, aby uzyskać stosunek 70 do 30 lodowatej matrycy błony podstawnej do zawiesiny komórek do posiewu. Po ponownym zawieszeniu w matrycy membrany podstawnej, probówkę mikrowirówki należy trzymać na lodzie, aby uniknąć zestalenia matrycy błony podstawnej.Odpipetować 20 mikrolitrów kropelek matrycy błony podstawnej w środku podgrzanej 48-dołkowej płytki hodowlanej. Odwróć płytkę do góry nogami i umieść ją do zestalenia w inkubatorze z 1,9% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Dodaj inhibitor kinazy związanej z rho i amfoterycynę B do pożywki organoidowej zębów i podgrzej pożywkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Wyjąć 48-dołkową płytkę z inkubatora. Umieścić go pionowo i dodać 250 mikrolitrów przygotowanej wstępnie podgrzanej pożywki do każdej studzienki z kropelką macierzy błony podstawnej zawierającą komórki i włożyć płytkę z powrotem do inkubatora dwutlenku węgla. Aby odświeżyć podłoże, przechyl płytkę pod kątem 45 stopni.Delikatnie usuń poprzednie podłoże, unikając dotykania kropelki macierzy błony podstawnej i dodawaj 250 mikrolitrów nowego wstępnie rozgrzanego podłoża organoidowego zębów co dwa do trzech dni. Aby przeprowadzić przejście organoidów, usuń pożywkę ze studzienek z organoidami i połącz do czterech zlewających się studzienek. Aby zebrać organoidy, dodaj 400 mikrolitrów lodowatego, wolnego od surowicy zdefiniowanego podłoża na studzienkę bezpośrednio na kroplę matrycy membrany i wielokrotnie pipetuj pożywkę w górę iw dół, aż cała kropla zostanie usunięta.Jeśli studzienki są połączone, przenieś 400 mikrolitrów z pierwszego dołka do następnego, aby usunąć organoid zawierający kropelki. Przenieść usunięty zespół organoidów do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mikrolitra i powtarzać dodawanie zdefiniowanego podłoża wolnego od surowicy, aż wszystkie struktury organoidów zostaną zebrane z dołków. Odwiruj go 200 razy g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Usunąć supernatant z probówki wirówkowej i ponownie zawiesić osad w podgrzanej porcji produktu TrypLE Express. Dodaj 400 mikrolitrów lodowatego podłoża bez surowicy, aby dezaktywować enzym i odwirować go w temperaturze 200 razy g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Usunąć supernatant.Wstępnie pokryj końcówkę lodowatym pożywką bez surowicy i ponownie zawiesić osad organoidowy w sterylnym stanie. Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach lodowatego surowicy wolnego od zdefiniowanego podłoża dla metody niskiego pasażu. Dociśnij całkowicie opróżnioną końcówkę pipety do dna rurki mikrowirówki, aby zmniejszyć jej średnicę.Pipetować w górę i w dół przez pięć minut, aby mechanicznie rozbić organoidy. W przypadku metody wyższego pasażu ponownie zawieś osad w 700 mikrolitrach lodowatego podłoża zdefiniowanego bez surowicy z końcówką P1000. Dodaj końcówkę P200 do końcówki P1000 i wstępnie pokryj lodowatym podłożem zdefiniowanym bez serum.Zapobiegaj tworzeniu się pęcherzyków powietrza, regulując ustawienie objętości pipety. Aspiruj co najmniej 90% średniej objętości za pomocą organoidów i pipetuj w górę iw dół przez pięć minut, aby mechanicznie rozbić organoidy. Organoidy zwykle rozwijają się dwa tygodnie po wysianiu komórek mieszków włosowych.Organoidy są długotrwale rozszerzalne do 11 pasaży. Wysiewanie około 20 000 komórek na kroplę macierzy błony podstawnej daje optymalną gęstość organoidów, podczas gdy wysiewanie większej liczby komórek prowadzi do nieoptymalnego wzrostu organoidów z podobnymi organoidami o zbyt dużej gęstości z powodu niewystarczającej przestrzeni do wzrostu. Rozwinięte organoidy wykazują gęsty wygląd i zawierają komórki wykazujące wysoki stosunek nukleocytoplazmatyczny.Ponadto organoidy wykazują ekspresję markera ERM cytokeratyny 14, potwierdzając ich nabłonkowe pochodzenie i inne proponowane markery ERM, takie jak P63, CD44 i integryna alfa-6. Organoidy wyrażają SOX2, dobrze znany marker DESC u myszy. Co ciekawe, główny składnik macierzy szkliwa, amelogenina, również ulega ekspresji w organoidach.Organoidy zachowują swój fenotyp łodygi ERMM podczas pasażu, o czym świadczy stabilna ekspresja markerów. Aby uzyskać optymalny, długoterminowy wzrost organoidów, konieczne jest stosowanie zalecanych metod pasażu, czyli metod pasażu dolnego lub wyższego. Po uformowaniu organoidy mogą być wykorzystane do dalszej analizy procesu amelogenezy i osadzania się macierzy szkliwa, które obecnie nie jest osiągane w badaniach stomatologicznych.Technika ta umożliwia badanie biologii komórek macierzystych nabłonka zębów, procesu tworzenia szkliwa i interakcji z mezenchymą zęba, która jest współczynnikiem niezbędnym do prawidłowego tworzenia zębów.

establishing-organoids-from-human-tooth-as-powerful-tool-toward

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ciągle rosnący siekacz myszy dostarcza modelu do badania odnawiania tkanek zębowych z komórek macierzystych nabłonka zębów (DESCs). Przedstawiono solidny system do konsekwentnego i niezawodnego pozyskiwania tych komórek z siekacza i namnażania ich in vitro.

Izolacja i hodowla komórek macierzystych nabłonka zębów z siekacza dorosłej myszy

Ten protokół opisuje przejściową inżynierię genetyczną komórek macierzystych zębów pobranych z ludzkiego mieszków zębowych. Zastosowana strategia modyfikacji niewirusowej może stać się podstawą do udoskonalenia terapeutycznych produktów z wykorzystaniem komórek macierzystych.

Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA

Opisujemy izolację, dyspersję i powlekanie komórek pierwotnych miazgi zębowej (DP) z neuronami trójdzielnymi (TG) hodowanymi na nałożonych na nich filtrach transwell. Odpowiedzi komórkowe komórek DP można analizować za pomocą immunofluorescencji lub analizy RNA/białka. Immunofluorescencja markerów neuronalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej pozwala na analizę odpowiedzi na przerost neurytów.

Metoda kohodowli do badania przerostu neurytów w odpowiedzi na sygnały parakrynne miazgi zębowej

Metoda hodowli narządów typu Trowella została wykorzystana do rozwikłania skomplikowanych sieci sygnałowych, które regulują rozwój zębów, a ostatnio do badania regulacji związanych z komórkami macierzystymi stale rosnącego siekacza myszy. Fluorescencyjne modele zwierzęce i metody obrazowania na żywo ułatwiają dogłębną analizę komórek macierzystych zębów i ich specyficznego mikrośrodowiska niszowego.

Zastosowanie hodowli narządów typu Trowell do badania regulacji komórek macierzystych zęba

Ten protokół przedstawia metodę hodowli i 3D hodowli komórek podobnych do ameloblastów w mikrograwitacji, aby zachować ich wydłużony i spolaryzowany kształt, a także ekspresję białek specyficzną dla szkliwa. Opisano również warunki hodowli konstruktów inżynierii przyzębia i narządów płuc w warunkach mikrograwitacji.

Rozmnażanie komórek i narządów zębów i dróg oddechowych w mikrograwitacji

Mieszek włosowy zawiera populację nabłonków i komórki mezenchymalne. Populację nabłonka wybrano z niejednorodnej populacji komórek pęcherzyków zębowych poprzez zapewnienie odrębnej pożywki hodowlanej. Komórki nabłonkowe przetrwały i utworzyły kolonie w podłożu wolnym od surowicy.

Izolacja komórek nabłonkowych z ludzkiego pęcherzyka zębowego

Ten protokół opisuje kluczowe kroki do wygenerowania i scharakteryzowania mysich organoidów 3D ustno-przełykowych, które reprezentują normalne, przednowotworowe i płaskonabłonkowe zmiany rakowokomórkowe wywołane przez chemiczną kancerogenezę.

Modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3D

Obrazowanie na żywo ex vivo to potężna technika badania dynamicznych procesów ruchów komórkowych i interakcji w żywych tkankach. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który implementuje mikroskopię dwufotonową do śledzenia na żywo komórek nabłonka zębów w hodowanych całych siekaczach dorosłych myszy.

Wykorzystanie obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek podczas odnawiania zębów myszy

Ten protokół przedstawia metodę generowania organoidów naczyniowych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przykład terapii genowej adenowirusa w ludzkich rogówkach z hodowlą narządów cukrzycowych jest przedstawiony w kierunku normalizacji opóźnionego gojenia się ran i znacznie zmniejszonej ekspresji markerów nabłonkowych komórek macierzystych w tych rogówkach. Opisano również optymalizację tego procesu w kulturach nabłonka rąbka włokanego wzbogaconych komórkami macierzystymi.

Adenowirusowa terapia genowa w keratopatii cukrzycowej: wpływ na gojenie się ran i ekspresję markerów komórek macierzystych w rogówkach i komórkach nabłonka rąbka ludzkiego hodowanych w narządach

Poznaj metodę tworzenia organoidów z ludzkiego zęba do badań biologii komórek macierzystych i procesu formowania szkliwa. Ten model umożliwia ekspansję komórek nabłonkowych oraz otwiera nowe możliwości w regeneracyjnej stomatologii.

Ustanowienie organoidów z ludzkiego zęba jako potężnego narzędzia w kierunku badań mechanistycznych i terapii regeneracyjnej

Przeglądaj więcej filmów