Ustanowienie organoidów z ludzkiego zęba jako potężnego narzędzia w kierunku badań mechanistycznych i terapii regeneracyjnej
13 kwietnia 2022
Przedstawiamy protokół rozwoju kultur organoidów nabłonkowych, zaczynając od ludzkiego zęba. Organoidy są bardzo rozprężalne i rekapitulują nabłonkowe komórki macierzyste zęba, w tym ich zdolność do różnicowania ameloblastów. Unikalny model organoidowy stanowi obiecujące narzędzie do badania biologii ludzkiej uzębienia (komórek macierzystych) z perspektywami podejścia regeneracyjnego zębów.
Ten nowy model organoidów pochodzących z ludzkich zębów stanowi pierwsze potężne narzędzie do rozszyfrowania biologii ludzkich komórek macierzystych zębów z perspektywą zastosowań regeneracyjnych zębów. Obecnie ten model organoidu zęba jest jedynym dostępnym narzędziem do niezawodnego i solidnego wzrostu i ekspansji komórek macierzystych nabłonka ludzkich zębów. Ten protokół organoidowy można zastosować do tworzenia modeli badawczych, nie tylko ze zdrowych, ale także chorych zębów, takich jak guzy zębów i wpływ bakterii.
Eksploracja takich modeli chorób może odkryć nowe cele terapeutyczne. Ten model organoidowy jest bardzo pomocny w rozszyfrowaniu procesu tworzenia szkliwa w ludzkim zębie i może umożliwić budowę części zęba, takich jak szkliwo, w celach generatywnych. Procedurę zademonstruje Lara Hemeryck, doktorantka w mojej grupie badawczej.
Na początek należy zebrać trzecie zęby trzonowe wraz z powiązanymi mieszkami zębowymi w podłożu zbiorczym umieszczonym na lodzie i przenieść zawartość probówek na szalkę Petriego. Przytrzymaj ząb pęsetą i ostrożnie odizoluj mieszki włosowe za pomocą ostrza chirurgicznego. Zmyj pozostałą krew z mieszków zębowych, umieszczając na krótko tkanki mieszków włosowych w pierwszej studzience 70% etanolu na 20 sekund, a następnie przenieś ją do następnej płytki etanolowej śmierci na 20 sekund i dalej do trzeciej studzienki etanolowej.
Kontynuuj trzykrotne płukanie w studzienkach z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, a następnie płucz mieszki zębowe w trzech pozostałych dołkach do pobierania mieszków zębowych przez maksymalnie 20 minut. Przenieś przepłukane mieszki włosowe na nową szalkę Petriego. Wytnij mały kawałek jednego z mieszków włosowych w celu utrwalenia paraformaldehydu i przechowuj go w probówce do mikrowirówki zawierającej 500 mikrolitrów pożywki zbiorczej przez maksymalnie sześć godzin.
Resztę mieszków zębowych zmielić na małe kawałki i przenieść je do 15-mililitrowej probówki zawierającej cztery mililitry podgrzanego podłoża dysocjacyjnego, a następnie inkubować rurkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny w łaźni wodnej. Co 15 minut pipetować pożywkę dysocjacyjną mieszków zębowych i mieszać w górę iw dół za pomocą szklanej pipety, aby przyspieszyć rozpad tkanek. Kiedy kawałki mieszków włosowych nie są już obserwowane, przystąp do dysocjacji za pomocą zwężonej, wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura.
W międzyczasie przygotuj 10 mililitrów pożywki A zawierającej 100 mikrolitrów DNazy i dodaj pięć mililitrów tej pożywki do każdej probówki ze zdysocjowanymi mieszkami zębowymi. Inkubować przez minutę w temperaturze pokojowej. Przepłukać filtr jednym mililitrem pożywki A. Na tym etapie połączyć kilka probówek z dysocjowanymi mieszkami zębowymi od jednego pacjenta i odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórkową 200 razy g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Usunąć supernatant. Zawiesić osad w jednym mililitrze zdefiniowanego podłoża bez surowicy i przenieść zawiesinę komórek do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Oblicz stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i oblicz liczbę dołków, które można zasiać.
Ostateczna mieszanina składa się z zawiesiny komórkowej i macierzy błony podstawnej w stosunku od 30 do 70. Usunąć odpowiednią ilość supernatantu i powoli zawiesić go, aby uzyskać stosunek 70 do 30 lodowatej matrycy błony podstawnej do zawiesiny komórek do posiewu. Po ponownym zawieszeniu w matrycy membrany podstawnej, probówkę mikrowirówki należy trzymać na lodzie, aby uniknąć zestalenia matrycy błony podstawnej.
Odpipetować 20 mikrolitrów kropelek matrycy błony podstawnej w środku podgrzanej 48-dołkowej płytki hodowlanej. Odwróć płytkę do góry nogami i umieść ją do zestalenia w inkubatorze z 1,9% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Dodaj inhibitor kinazy związanej z rho i amfoterycynę B do pożywki organoidowej zębów i podgrzej pożywkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Wyjąć 48-dołkową płytkę z inkubatora. Umieścić go pionowo i dodać 250 mikrolitrów przygotowanej wstępnie podgrzanej pożywki do każdej studzienki z kropelką macierzy błony podstawnej zawierającą komórki i włożyć płytkę z powrotem do inkubatora dwutlenku węgla. Aby odświeżyć podłoże, przechyl płytkę pod kątem 45 stopni.
Delikatnie usuń poprzednie podłoże, unikając dotykania kropelki macierzy błony podstawnej i dodawaj 250 mikrolitrów nowego wstępnie rozgrzanego podłoża organoidowego zębów co dwa do trzech dni. Aby przeprowadzić przejście organoidów, usuń pożywkę ze studzienek z organoidami i połącz do czterech zlewających się studzienek. Aby zebrać organoidy, dodaj 400 mikrolitrów lodowatego, wolnego od surowicy zdefiniowanego podłoża na studzienkę bezpośrednio na kroplę matrycy membrany i wielokrotnie pipetuj pożywkę w górę iw dół, aż cała kropla zostanie usunięta.
Jeśli studzienki są połączone, przenieś 400 mikrolitrów z pierwszego dołka do następnego, aby usunąć organoid zawierający kropelki. Przenieść usunięty zespół organoidów do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mikrolitra i powtarzać dodawanie zdefiniowanego podłoża wolnego od surowicy, aż wszystkie struktury organoidów zostaną zebrane z dołków. Odwiruj go 200 razy g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Usunąć supernatant z probówki wirówkowej i ponownie zawiesić osad w podgrzanej porcji produktu TrypLE Express. Dodaj 400 mikrolitrów lodowatego podłoża bez surowicy, aby dezaktywować enzym i odwirować go w temperaturze 200 razy g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Usunąć supernatant.
Wstępnie pokryj końcówkę lodowatym pożywką bez surowicy i ponownie zawiesić osad organoidowy w sterylnym stanie. Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach lodowatego surowicy wolnego od zdefiniowanego podłoża dla metody niskiego pasażu. Dociśnij całkowicie opróżnioną końcówkę pipety do dna rurki mikrowirówki, aby zmniejszyć jej średnicę.
Pipetować w górę i w dół przez pięć minut, aby mechanicznie rozbić organoidy. W przypadku metody wyższego pasażu ponownie zawieś osad w 700 mikrolitrach lodowatego podłoża zdefiniowanego bez surowicy z końcówką P1000. Dodaj końcówkę P200 do końcówki P1000 i wstępnie pokryj lodowatym podłożem zdefiniowanym bez serum.
Zapobiegaj tworzeniu się pęcherzyków powietrza, regulując ustawienie objętości pipety. Aspiruj co najmniej 90% średniej objętości za pomocą organoidów i pipetuj w górę iw dół przez pięć minut, aby mechanicznie rozbić organoidy. Organoidy zwykle rozwijają się dwa tygodnie po wysianiu komórek mieszków włosowych.
Organoidy są długotrwale rozszerzalne do 11 pasaży. Wysiewanie około 20 000 komórek na kroplę macierzy błony podstawnej daje optymalną gęstość organoidów, podczas gdy wysiewanie większej liczby komórek prowadzi do nieoptymalnego wzrostu organoidów z podobnymi organoidami o zbyt dużej gęstości z powodu niewystarczającej przestrzeni do wzrostu. Rozwinięte organoidy wykazują gęsty wygląd i zawierają komórki wykazujące wysoki stosunek nukleocytoplazmatyczny.
Ponadto organoidy wykazują ekspresję markera ERM cytokeratyny 14, potwierdzając ich nabłonkowe pochodzenie i inne proponowane markery ERM, takie jak P63, CD44 i integryna alfa-6. Organoidy wyrażają SOX2, dobrze znany marker DESC u myszy. Co ciekawe, główny składnik macierzy szkliwa, amelogenina, również ulega ekspresji w organoidach.
Organoidy zachowują swój fenotyp łodygi ERMM podczas pasażu, o czym świadczy stabilna ekspresja markerów. Aby uzyskać optymalny, długoterminowy wzrost organoidów, konieczne jest stosowanie zalecanych metod pasażu, czyli metod pasażu dolnego lub wyższego. Po uformowaniu organoidy mogą być wykorzystane do dalszej analizy procesu amelogenezy i osadzania się macierzy szkliwa, które obecnie nie jest osiągane w badaniach stomatologicznych.
Technika ta umożliwia badanie biologii komórek macierzystych nabłonka zębów, procesu tworzenia szkliwa i interakcji z mezenchymą zęba, która jest współczynnikiem niezbędnym do prawidłowego tworzenia zębów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten nowy model organoidów pochodnych z ludzkiego zęba stanowi potężne narzędzie do badania biologii ludzkich macierzystych komórek zęba oraz zastosowań w regeneracji zębów. Organoidy te umożliwiają niezawodną i stabilną ekspansję ludzkich macierzystych komórek nabłonka zęba, co czyni je niezwykle użytecznymi w badaniach naukowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Badania stomatologiczne
- Medycyna regeneracyjna
Wstęp
- Model organoidowy jest pochodną ludzkich zębów.
- Odtwarza on komórki macierzyste nabłonka oraz ich zdolność do różnicowania się w ameloblasty.
- Model ten można zastosować zarówno w przypadku zębów zdrowych, jak i chorych.
- Badanie modeli chorobowych może doprowadzić do odkrycia nowych celów terapeutycznych.
Cel badania
- Opracowanie protokołu tworzenia kultur organoidów nabłonkowych z ludzkich zębów.
- Badanie procesów tworzenia się szkliwa w ludzkich zębach.
- Umożliwienie rekonstrukcji części zęba w celach regeneracyjnych.
Zastosowane metody
- Utworzenie kultur organoidów z próbek ludzkich zębów.
- Ekspansja nabłonkowych komórek macierzystych.
- Zastosowanie modelu do badania stanów zdrowych oraz chorobowych.
- Badanie procesów tworzenia się szkliwa.
Główne wyniki
- Model organoidowy jest stabilny i podatny na ekspansję.
- Skutecznie odtwarza on charakterystykę ludzkich komórek macierzystych zęba.
- Pozwala na lepsze zrozumienie procesu różnicowania ameloblastów.
- Potencjalne zastosowania w regeneracji zębów oraz odkrywaniu celów terapeutycznych.
Wnioski
- Ten model organoidowy stanowi znaczący postęp w badaniach stomatologicznych.
- Otwiera on nowe możliwości badania chorób zębów oraz terapii regeneracyjnych.
- Przyszłe badania mogą doprowadzić do opracowania innowacyjnych metod leczenia schorzeń stomatologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Utworzenie organoidów pochodzących z ludzkich zębów umożliwia mechanistyczną analizę biologii macierzystych komórek nabłonka zęba, bezpośrednio wypełniając długoletnią lukę w badaniach nad regeneracją tkanek zębowych. Ten stabilny, rozszerzalny model zapewnia wysoką wiarygodność w walidacji celów dla tworzenia szkliwa oraz modelowania chorób, stanowiąc krytyczny punkt zwrotny dla translacyjnych badań i rozwoju w stomatologii. Zdolność do modelowania stanów zdrowych i chorobowych zwiększa znaczenie tego podejścia w kontekście innowacji regeneracyjnych i terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie badanie funkcji oraz ekspresji markerów ludzkich macierzystych komórek nabłonka zębowego.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez modelowanie różnicowania ameloblastów i odkładania macierzy szkliwa.
- Ułatwia identyfikację szlaków istotnych dla przebiegu chorób oraz potencjalnych celów terapeutycznych w patologii zębów.
- Zapewnia platformę do funkcjonalnej walidacji hipotez regeneracyjnych w biologii zęba.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowany, powtarzalny system do ilościowej oceny markerów komórek macierzystych i różnicowania.
- Wspiera opracowywanie testów do przesiewania związków wpływających na tworzenie szkliwa lub utrzymanie komórek macierzystych.
- Umożliwia skalowalność i ponowne wykorzystanie w wielu pasażach, co sprzyja solidnemu projektowaniu eksperymentów.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszych etapów procesów przesiewowych pod kątem mechanistycznym i fenotypowym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelowaniem istotnym dla chorób w przypadku guzów stomatologicznych i badań nad wpływem bakterii.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po przedkliniczną walidację strategii regeneracyjnych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o rozwoju z uwzględnieniem ryzyka poprzez modelowanie procesów tworzenia szkliwa specyficznych dla człowieka.
- Wspiera translacyjne odkrywanie biomarkerów dla zastosowań w inżynierii tkankowej zębów.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Ten model organoidowy integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, łącząc wczesne badania mechanistyczne z rozwojem translacyjnych terapii regeneracyjnych.
- Biologia odkrywcza: Usprawnia testowanie hipotez dotyczących funkcji komórek macierzystych i amelogenezy w systemie istotnym dla ludzi.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki w zakresie ekspresji markerów i stanu różnicowania.
- Analityka: Umożliwia analizę porównawczą organoidów pochodzących z tkanek zdrowych i chorych.
- Badania translacyjne: Ułatwia modelowanie przedkliniczne regeneracji i patologii tkanek zęba.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, rozszerzalną platformę dla różnorodnych badań stomatologicznych i linii terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów stomatologicznych i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w celu odtwarzalnego i skalowalnego generowania oraz analizy organoidów.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go w programach regeneracyjnych w stomatologii i zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację inicjatyw w zakresie regeneracji stomatologicznej i modelowania chorób z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli organoidów, pracy z tkankami zębowymi oraz analizie markerów.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury do hodowli komórkowych i analizy.
- Konieczna jest standaryzacja między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności w różnych pasażach i warunkach.
- Możlizna jest konieczność adaptacji w celu modelowania konkretnych chorób zębowych lub próbek pochodzących od pacjentów.
- Protokoły długoterminowej ekspansji i pasażowania muszą zostać zoptymalizowane, aby utrzymać pluripotencję oraz zdolność do różnicowania.
