Name: Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Odkryj różnice między technikami CARS i SRS w koherentnej mikroskopii Ramana do obrazowania chemicznego komórek bez znakowania. Porównanie rozdzielczości przestrzennej i spektralnej pomoże wybrać optymalną metodę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez fundusz startowy Wydziału Chemii Uniwersytetu Purdue.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiony tu protokół opisuje budowę multimodalnego mikroskopu CRS oraz bezpośrednie porównanie obrazowania CARS i SRS. W przypadku budowy mikroskopu krytycznymi etapami są przestrzenne i czasowe nakładanie się wiązki oraz optymalizacja rozmiaru wiązki. Zaleca się użycie próbki standardowej, takiej jak DMSO, przed obrazowaniem biologicznym w celu optymalizacji SNR i kalibracji przesunięć Ramana. Bezpośrednie porównanie obrazów CARS i SRS pokazuje, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, podczas gdy SRS daje lep...

Zjawisko rozpraszania Ramanowskiego zostało po raz pierwszy zaobserwowane w 1928 roku przez C. V. Ramana1. Podczas oddziaływania padającego fotonu z próbką może dojść do spontanicznego zdarzenia rozpraszania nieelastycznego, w którym zmiana energii fotonu odpowiada przejściu wibracyjnemu analizowanego związku chemicznego. Proces ten nie wymaga zastosowania znacznika chemicznego, co czyni go wszechstronnym narzędziem do analizy chemicznej bez konieczności znakowania, przy jednoczesnym minimalizowaniu zaburzeń próbki. Pomimo swoich zalet, spontaniczne rozpraszanie Ramanowskie cechuje się niskim przekrojem czynnym na rozpraszanie (zazwyczaj o 1011 rzędów wielkości niższym niż przekrój czynny absorpcji w podczerwieni [IR]), co wymusza długi czas akwizycji danych podczas analizy2. W związku z tym dążenie do zwiększenia czułości procesu rozpraszania Ramanowskiego jest niezbędne dla rozwoju technologii Ramanowskich w obrazowaniu w czasie rzeczywistym.
Jednym ze skutecznych sposobów na znaczne zwiększenie czułości rozpraszania Ramanowskiego są procesy koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CRS), w których zazwyczaj wykorzystuje się dwa impulsy laserowe do wzbudzenia przejść wibracyjnych cząsteczek3,4. Gdy różnica energii fotonów między dwoma laserami odpowiada modom wibracyjnym cząsteczek próbki, generowane są silne sygnały Ramanowskie. Dwiema najczęściej stosowanymi w obrazowaniu technikami CRS są koherentne rozpraszanie antystokesowskie (CARS) oraz stymulowane rozpraszanie Ramanowskie (SRS)5. W ciągu ostatnich dwóch dekad rozwój technologiczny sprawił, że mikroskopia CARS i SRS stały się potężnymi narzędziami do bezetykietowej kwantyfikacji oraz wyjaśniania zmian chemicznych w próbkach biologicznych.
Obrazowanie chemiczne za pomocą mikroskopii CARS można datować na 1982 rok, kiedy to po raz pierwszy zastosowano skanowanie laserowe do pozyskiwania obrazów CARS, co zademonstrowali Duncan i wsp.6. Modernizacja mikroskopii CARS została znacznie przyspieszona po szerokim zastosowaniu wielofotonowej mikroskopii fluorescencyjnej ze skanowaniem laserowym7. Wczesne prace grupy Xie z wykorzystaniem laserów o wysokiej częstotliwości powtarzania przekształciły CARS w szybką, bezetykietową platformę obrazowania chemicznego do charakterystyki cząsteczek w próbkach biologicznych8,9,10. Jednym z głównych problemów w obrazowaniu CARS jest obecność tła nieresonansowego, które zmniejsza kontrast obrazu i zniekształca widmo Ramana. Podjęto wiele wysiłków, aby albo zredukować tło nieresonansowe11,12,13,14,15, albo wyekstrahować rezonansowe sygnały Ramana z widm CARS16,17. Innym udoskonaleniem, które znacząco rozwinęło tę dziedzinę, jest hiperspektralne obrazowanie CARS, które umożliwia mapowanie spektralne w każdym pikselu obrazu przy poprawionej selektywności chemicznej18,19,20,21.
Stymulowane rozproszenie Ramanowskie (SRS) jest nowszą technologią obrazowania niż CARS, mimo że zostało odkryte wcześniej22. W 2007 roku opisano mikroskopię SRS z wykorzystaniem źródła laserowego o niskiej częstotliwości powtarzania impulsów23. Wkrótce kilka grup zademonstrowało szybkie obrazowanie SRS przy użyciu laserów o wysokiej częstotliwości powtarzania impulsów24,25,26. Jedną z głównych zalet mikroskopii SRS nad CARS jest brak tła nierezonansowego27, choć w przypadku SRS mogą wystąpić inne rodzaje tła, takie jak modulacja krzyżowa fazy (XPM), absorpcja przejściowa (TA), absorpcja dwufotonowa (TPA) oraz efekt fototermiczny (PT)28. Ponadto sygnał SRS i stężenie próbki pozostają w relacji liniowej, w przeciwieństwie do CARS, gdzie zależność sygnału od stężenia jest kwadratowa29. Upraszcza to kwantyfikację chemiczną i rozplatanie widmowe (spectral unmixing). Wielokolorowe i hiperspektralne SRS ewoluowały w różnych formach30,31,32,33,34,35,36, przy czym ogniskowanie widmowe (spectral focusing) jest jednym z najpopularniejszych podejść w obrazowaniu chemicznym37,38.
Zarówno CARS, jak i SRS wymagają ogniskowania wiązek lasera pompującego i Stokesa na próbce, aby dopasować je do przejścia wibracyjnego cząsteczek w celu wzbudzenia sygnału. Mikroskopy CARS i SRS mają również wiele wspólnych cech. Jednak fizyka leżąca u podstaw tych dwóch procesów oraz detekcja sygnałów stosowana w tych technologiach mikroskopowych wykazują pewne różnice3,39. CARS jest procesem parametrycznym, w którym nie dochodzi do netto sprzężenia energii między fotonami a cząsteczkami3. SRS natomiast jest procesem nieparametrycznym i przyczynia się do transferu energii między fotonami a układami molekularnymi27. W CARS generowany jest nowy sygnał o częstotliwości anty-Stokesa, podczas gdy SRS objawia się jako transfer energii między wiązkami lasera pompującego i Stokesa.
Sygnał CARS spełnia równanie (1)28.
<img alt="Równanie koherentnego antystokesowskiego rozpraszania Ramanowskiego (CARS), wzór na intensywność optyczną, równanie I_CARS." src="/files/ftp_upload/63677/63677eq1v2.png" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">     (1)
W tym czasie sygnał SRS można zapisać zgodnie z równaniem (2)28.
<img alt="Wzór na stymulowane rozpraszanie Ramanowskie, ΔISRS ∝ Im(χ(3)) Ip Is, odnosi się do analizy sygnału optycznego." src="/files/ftp_upload/63677/63677eq2v2.png" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">    (2)
W tym przypadku Ip, Is, ICARS oraz ΔISRS to odpowiednio natężenia wiązki pompowania, wiązki Stokesa, sygnału CARS i sygnałów SRS. χ(3) to nieliniowa podatność optyczna trzeciego rzędu próbki, która jest wartością zespoloną składającą się z części rzeczywistej i urojonej.
Równania te opisują profile widmowe oraz zależność sygnału od stężenia w technikach CARS i SRS. Różnice w fizyce tych zjawisk skutkują odmiennymi schematami detekcji dla tych dwóch technologii mikroskopii. Detekcja sygnału w CARS zazwyczaj obejmuje separację widmową nowo wygenerowanych fotonów i detekcję za pomocą lampy fotopowielającej (PMT) lub urządzenia o ładunku sprzężonym (CCD); w przypadku SRS wymiana energii między wiązką pompową a wiązką Stokesa jest zazwyczaj mierzona poprzez szybką modulację intensywności przy użyciu modulatora optycznego i demodulację za pomocą fotodiody (PD) sprzężonej z wzmacniaczem synchronicznym.
Choć w ostatnich latach opublikowano wiele opracowań dotyczących rozwoju technologicznego i zastosowań w dziedzinach CARS oraz SRS, nie przeprowadzono systematycznych porównań tych dwóch technik CRS na tej samej platformie, szczególnie w odniesieniu do hiperspektralnej mikroskopii CARS i SRS. Bezpośrednie porównania czułości, rozdzielczości przestrzennej, rozdzielczości spektralnej oraz możliwości separacji chemicznej pozwoliłyby biologom na wybór najlepszej metody do ilościowego oznaczania składników chemicznych. W niniejszym protokole przedstawiono szczegółowe kroki budowy multimodalnej platformy obrazowania z funkcjami hiperspektralnego CARS i SRS, opartej na femtosekundowym systemie laserowym i skupianiu spektralnym. Obie techniki porównano w kierunku przednim pod kątem rozdzielczości spektralnej, czułości detekcji, rozdzielczości przestrzennej oraz kontrastów obrazowania komórek.

<table><tbody><tr><td>Zestaw skanerów 2D galvo</td><td>Thorlabs</td><td>GVS002</td><td></td></tr><tr><td>Modulator akustyczno-optyczny</td><td>Isomet</td><td>M1205-P80L-0,5</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik AOM</td><td>Isomet</td><td>532B-2</td><td></td></tr><tr><td>Karta akwizycji danych</td><td>National Instruments</td><td>PCle 6363</td><td>Filtr na zamówienie niestandardowe (980 sp)</td></tr><tr><td>Stopień opóźniający</td><td>Zaber</td><td>X-LSM050A</td><td></td></tr><tr><td>Deuter tlenek</td><td>Millipore Sigma</td><td>151882-100G</td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne do kombinacji wiązki</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP1000</td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne do separacji sygnałów</td><td>Semrock</td><td>FF776-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MiliporeSigma</td><td>200-664-3</td><td></td></tr><tr><td>MIA PaCa 2 Komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-1420</td><td></td></tr><tr><td>Femtosekundowy system laserowy</td><td>Spectral Physics</td><td>InSightX3+</td><td></td></tr><tr><td>Filtr do SAMOCHODÓW</td><td>Chroma</td><td>AT655/30m</td><td></td></tr><tr><td>Filtr do SRS</td><td>Chroma</td><td>ET980sp</td><td></td></tr><tr><td>Generator funkcyjny</td><td>Rigol</td><td>DG1022Z</td><td></td></tr><tr><td>Pręty szklane</td><td>Lattice Electro Optics</td><td>SF-57</td><td></td></tr><tr><td>Płyta półfalowa</td><td>Newport</td><td>10RP02-51; 10RP02-46</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW 2020</td><td>National Instruments</td><td></td><td>To jest oprogramowanie do akwizycji obrazu</td></tr><tr><td>Wzmacniacz blokujący</td><td>Zurich Instrument</td><td>HF2LI</td><td></td></tr><tr><td>Obudowa mikroskopu</td><td>Olympus</td><td>BX51W1</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka obiektywu</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60XW</td><td></td></tr><tr><td>Origin Pro 2019b</td><td>OriginLab Corporation</td><td></td><td>To jest oprogramowanie do dopasowania spektralnego</td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>Tektronix</td><td>TBS2204B</td><td></td></tr><tr><td>Fotodioda</td><td>Hamamatsu</td><td>S3994-01</td><td></td></tr><tr><td>Detektor PMT</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>PMT Wzmacniacz napięcia</td><td>Advanced Research Instrument Corp.</td><td>PMT4V3</td><td></td></tr><tr><td>Polaryzacyjny rozdzielacz wiązki kostka</td><td>Thorlabs</td><td>PBS255</td><td></td></tr><tr><td>Listwa zaciskowa</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) są najczęściej używanymi technologiami obrazowania koherentnego rozpraszania Ramana. Obrazowanie hiperspektralne SRS i CARS oferuje informacje spektralne Ramana w każdym pikselu, co umożliwia lepszą separację różnych składów chemicznych. Chociaż obie techniki wymagają dwóch laserów wzbudzających, ich schematy wykrywania sygnału i właściwości spektralne są zupełnie różne. Celem tego protokołu jest wykonanie zarówno obrazowania hiperspektralnego SRS, jak i CARS na jednej platformie i porównanie dwóch technik mikroskopowych do obrazowania różnych próbek biologicznych. Metoda ogniskowania spektralnego jest stosowana do pozyskiwania informacji spektralnych za pomocą laserów femtosekundowych. Używając standardowych próbek chemicznych, porównuje się czułość, rozdzielczość przestrzenną i rozdzielczość spektralną SRS i CARS w tych samych warunkach wzbudzenia (tj. moc w próbce, czas przebywania pikseli, soczewka obiektywu, energia impulsu). Kontrasty obrazowe CARS i SRS dla próbek biologicznych są zestawiane i porównywane. Bezpośrednie porównanie osiągów CARS i SRS pozwoliłoby na optymalny wybór metody obrazowania chemicznego.

Porównanie rozdzielczości spektralnej 
Rysunek 2 przedstawia porównanie rozdzielczości spektralnej mikroskopii hiperspektralnej SRS (Rysunek 2A) i CARS (Rysunek 2B>) z wykorzystaniem próbki DMSO. W przypadku widma SRS do dopasowania widma zastosowano dwie funkcje Lorentza (patrz krok protokołu 2.3), a rozdzielczość wyniosła 14,6 cm-1 dla piku 2 913 cm-1. Dla CARS do dopasowania wykorzystano ...

Ten artykuł bezpośrednio porównuje rozdzielczość, czułość i kontrasty obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i spójnego rozpraszania anty-Stokesa Ramana (CARS) zintegrowanych w tej samej platformie mikroskopowej. Wyniki pokazują, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, SRS daje lepsze kontrasty i rozdzielczość spektralną, a obie metody mają podobną czułość.

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Stimulated Raman scattering (SRS) and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy are the most widely used coherent Raman scattering imaging ...

Protokół ten porównuje dwie najpowszechniej stosowane hiperspektralne koherentne techniki rozpraszania Ramana, w tym koherentne rozpraszanie Ramana anty-Stokesa i stymulowane procesy rozpraszania Ramana, co pozwala biologom wybrać najlepszą metodę obrazowania dla ich zastosowań biologicznych. Wykorzystując wewnętrzne sygnatury drgań, koherentna spektroskopia Ramana jest w stanie odwzorować informacje chemiczne i próbki biologiczne bez konieczności znakowania egzogenicznego. Koherentna mikroskopia ramanowska poszerzyła naszą wiedzę na temat metabolizmu komórkowego, mapowania, dystrybucji leków, diagnostyki chorób i ilościowego określania zmian chemicznych.Jest to technika, która wymaga odpowiedniego przeszkolenia zarówno w optyce, jak i spektroskopii. Polecam przeczytanie kilku artykułów przeglądowych i przeszkolenie przez eksperta przed użyciem tej techniki. Na początek przygotuj szkiełka obrazowe, umieszczając kawałek taśmy dwustronnej na szkiełku nakrywkowym i wytnij mały prostokątny kształt taśmy ze środka taśmy, aby utworzyć otwartą przestrzeń do umieszczenia próbki.Odpipetować od 1 do 2 mikrolitrów czystego DMSO i dozować kroplę w środku wolnego miejsca. Ostrożnie umieść górną szkiełko nakrywkowe i delikatnie umieść krawędzie szkiełek nakrywkowych, aby uszczelnić komorę, upewniając się, że próbka DMSO nie styka się z krawędziami taśmy. Do eksperymentów z wrażliwością przygotuj seryjne rozcieńczenia DMSO w tlenku deuteru, aby uzyskać zakres stężeń od 50 do 0% Weź od 1 do 2 mikrolitrów każdego roztworu i przygotuj sprasowane próbki, jak pokazano wcześniej.Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i w razie potrzeby dodaj wodę lub olej immersyjny do soczewki obiektywu lub kondensatora. Prawidłowo przesuń krawędź kropli DMSO w polu view i wyreguluj soczewkę obiektywu, aby uzyskać najlepszą ostrość, a następnie wyśrodkuj kondensor za pomocą metody oświetlenia Kohlera i całkowicie otwórz przysłonę kondensatora. Następnie dostrój długość fali wiązki pompy do 800 nanometrów, aby celować w szczyt CH3 o liczbie falowej 2913 i ustaw moc zarówno pompy, jak i wiązki Stokesa na około 30 miliwatów przed mikroskopem, regulując półpłytkę falową.W przypadku SRS ustaw wzmocnienie wzmacniacza lock-in na około 10 ze stałą czasową 7 mikrosekund, upewniając się, że stała czasowa jest mniejsza niż czas przebywania pikseli. Ustaw parametry akwizycji obrazu i oprogramowanie do akwizycji za pomocą liczby pikseli 200 na 200 przy rozmiarze skanowania około 100 na 100 mikrometrów kwadratowych, upewniając się, że obraz zawiera zarówno kroplę DMSO, jak i pusty obszar, a następnie zeskanuj próbkę i sprawdź obraz na ekranie komputera. Następnie zeskanuj zmotoryzowany obraz opóźnienia w wiązce pompy Stokesa, monitorując obrazy w czasie rzeczywistym i skanuj opóźnienie, aż sygnał zostanie zmaksymalizowany.Przesuń kroplę DMSO, aby pokryć całe pole view i sprawdź, czy maksimum sygnału DC jest wyśrodkowane na obrazie, ponieważ sygnał jest zależny od wiązki pompy. Dostosuj położenie belki pompy za pomocą lustra lub przesunięcie napięcia w oprogramowaniu do obrazowania. Po optymalizacji DC wyreguluj lustra wiązki Stokesa, aż sygnał AC zostanie zmaksymalizowany, dostosowując wartość progową, aby wyświetlić około 50% nasycenia, jednocześnie sprawdzając, czy nasycenie jest wyśrodkowane w obrazie.Jeśli nie, dostosuj lustra tylko w wiązce Stokesa i monitoruj sygnał podczas wyrównywania jako informację zwrotną w czasie rzeczywistym na temat jakości wyrównania. Aby przeprowadzić analizę SNR, otwórz oprogramowanie ImageJ i zaimportuj zapisany przykładowy plik tekstowy DMSO, klikając Plik, następnie Importuj, a następnie Obraz tekstowy i Opcje Otwórz z menu rozwijanego. Po zaimportowaniu obrazu naciśnij Control Shift C, aby wywołać funkcję jasności i kontrastu, a następnie naciśnij przycisk Auto w funkcji jasności i kontrastu, aż obszar próbki DMSO będzie wyglądał na nasycony, aby znaleźć maksymalny sygnał próbki.Następnie kliknij narzędzie Owalne zaznaczanie w interfejsie ImageJ i podświetl niewielki obszar nasyconego regionu DMSO. Po podświetleniu naciśnij M, aby zmierzyć średnią i odchylenie standardowe wybranego obszaru. Aby zmierzyć tło, dostosuj paski w funkcji Jasność i Kontrast, aż będzie można zaobserwować sygnał pustego regionu, a następnie kliknij zaznaczenie Owal i podświetl obszar tła, upewniając się, że wybrany obszar nie zawiera DMSO.Następnie naciśnij M, aby zmierzyć statystyki wybranego obszaru. Następnie oblicz SNR, jak pokazano wcześniej, mierząc średnią wartość hałasu i średnią wartość sygnału wraz z odchyleniem standardowym. Aby przetworzyć hiperspektralne obrazy CRS, zaimportuj plik tekstowy, klikając Plik, a następnie Importuj, Obraz tekstowy i Opcje Otwórz z menu rozwijanego.Po zaimportowaniu kliknij Obraz, następnie Stosy, a następnie Narzędzia i Opcje Montażu do stosu, aby przekonwertować plik na stos obrazów, a następnie przewiń montaż, aż widoczny będzie pierwszy szczyt DMSO. Wybierz region w DMSO i kliknij Obraz, a następnie opcje Stos i Wykres profilu osi Z, aby wykreślić intensywność w stosunku do widma liczby klatki. Następnie kliknij Lista i skopiuj dane profilu, aby wyodrębnić surowe dane spektralne.Aby przeliczyć odzyskane widmo na jednostki częstotliwości, należy przeprowadzić regresję liniową przy użyciu symetrycznego i asymetrycznego CH rozciągającego się od DMSO i odpowiadających im numerów ramek. Rozdzielczość spektralna DMSO została zmierzona za pomocą mikroskopii hiperspektralnej SRS i CARS, które wykazują rozdzielczość odpowiednio 14,6 i 17,1 liczby falowej, co wskazuje, że SRS ma lepszą rozdzielczość spektralną. Widma DMSO SRS uzyskano w stężeniach 0,1 i 0,01%, w których pik przy liczbie falowej 2913 może być rozwiązany w pierwszym, ale nie w drugim, co wskazuje, że granica wykrywalności wynosi od 0,1 do 0,01% DMSO.Widma CARS pobrane fazowo pokazują, że pik liczby falowej DMSO 2913 może być wyraźnie rozdzielony dla 0,1%DMSO, ale nie dla 0,01%, co wskazuje na granicę wykrywalności między tymi dwoma stężeniami. Profile intensywności SRS i CARS ogniwa MIA PaCA-2 wykazały, że sygnał SRS daje rozdzielczość 398,6 nanometrów, podczas gdy sygnał CARS daje 1,2 razy lepszą rozdzielczość 330,3 nanometrów. Obrazy SRS i CARS z komórek MIA PaCa-2 w różnych pozycjach opóźnienia optycznego pokazują najsilniejsze sygnały z kropelkami lipidów jako jasnymi kropkami dla SRS, podczas gdy CARS mają znacznie zmniejszone kontrasty.Jednak przesunięcie ku czerwieni o 37 liczb falowych w ogniskowaniu widmowym poprawiło kontrasty lipidowe zarówno dla SRS, jak i CARS. Widma SRS wykazują znacznie silniejszy sygnał o liczbie fali 2850 dla kropelek lipidów niż inne organelle, podczas gdy widma CARS wykazują niewielkie przesunięcie ku czerwieni. Aby zoptymalizować koherentny sygnał rozpraszania Ramana, najpierw znajdź ognisko próbki, następnie dostrój opóźnienie optyczne, a na koniec dostosuj lustra, aż do osiągnięcia maksimum.Inne technologie pomp-sondy, takie jak absorpcja stanów nieustalonych, są z natury zintegrowane z platformą CRS. Technologia ta jest bardzo skuteczna w pomiarze kinetyki absorpcji silnych cząsteczek niefluorescencyjnych pochłaniających światło. Technika ta pozwala naukowcom na oglądanie małych cząsteczek w sposób bezznacznikowy o wysokiej aktywności chemicznej komórek.Pozwala także naukowcom obserwować zmiany w metabolizmie lipidów, dynamice wewnątrzkomórkowej i dystrybucji leków.

direct-comparison-hyperspectral-stimulated-raman-scattering-coherent

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Do generowania koherentnego rozpraszania antystokesowskiego Ramana (CARS) oraz dwukrotnie rezonansowego CARS (DR-CARS) wykorzystuje się kombinację trzech krótkopulsowych laserów o pojedynczej długości fali. Różnica między tymi sygnałami zapewnia zwiększoną czułość w przypadku sygnałów koherentnego rozpraszania Ramana, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia, co umożliwia obrazowanie słabych rozpraszaczy ramanowskich.

Obrazowanie różnicowe struktur biologicznych z wykorzystaniem dwustrojonego koherentnego antystokesowego rozpraszania Ramanowskiego (CARS)

Mikroskopia koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) oparta na naturalnej wibracji wiązań molekułowych pozwala na chemicznie selektywne obrazowanie żywych komórek bez znaczników. W pracy przedstawiono implementację komplementarnej techniki mikroskopowej na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym opartym na laserze femtosekundowym Ti:sapphire i laserze OPO.

Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO

W tym manuskrypcie opisana jest implementacja mikroskopu z wymuszonym rozpraszaniem Ramana (SRS), uzyskanego przez integrację eksperymentalnego zestawu SRS z laserowym mikroskopem skaningowym. Mikroskop SRS oparty jest na dwóch femtosekundowych (fs) źródłach laserowych, Ti-Sapphire (Ti:Sa) i zsynchronizowanym optycznym oscylatorze parametrycznym (OPO).

Wdrożenie mikroskopu nieliniowego opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

Ten protokół przedstawia szybki test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) w ciągu 2,5 godziny poprzez stymulowane pojedynczymi komórkami obrazowanie metabolizmu D2O. Metoda ta ma zastosowanie do bakterii w moczu lub środowisku krwi pełnej, które są transformujące dla szybkiego jednokomórkowego fenotypowego AspAT w klinice.

Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) jest potężną, nieniszczącą i bezznacznikową techniką obrazowania. Jednym z pojawiających się zastosowań jest stymulowana histologia Ramana, w której dwukolorowe obrazowanie SRS w przejściach Ramana białek i lipidów jest wykorzystywane do generowania obrazów pseudo-hematoksyliny i eozyny. W tym miejscu demonstrujemy protokół dwukolorowego obrazowania SRS w czasie rzeczywistym w diagnostyce tkanek.

Dwukolorowe, stymulowane rozpraszaniem Ramana w czasie rzeczywistym mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek

Ten artykuł przedstawia integrację modułu spektralnego ogniskowania i lasera impulsowego o podwójnym wyjściu, umożliwiającego szybkie obrazowanie hiperspektralne nanocząsteczek złota i komórek rakowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów multimodalnych nieliniowych technik optycznych na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym.

Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej

Przedstawiamy protokół do pozyskiwania obrazów chemicznych za pomocą mikroskopii SRS (ang. broadband stimulated Raman scattering). Opierając się na mikroskopie SRS, który działa z różnicową detekcją wielokanałową typu lock-in, protokół opisuje przygotowanie próbki, regulację aparatury SRS i chemometrię w celu rozplątania różnych składników chemicznie niejednorodnych próbek.

Multipleksowe obrazowanie chemiczne oparte na szerokopasmowej mikroskopii rozpraszania Ramana stymulowanego

Wizualizacja mielinizacji jest ważnym celem dla wielu badaczy zajmujących się układem nerwowym. CARS to technika kompatybilna z immunofluorescencją, która może natywnie obrazować lipidy w tkankach, takich jak mózg, oświetlając wyspecjalizowane struktury, takie jak mielina.

Zastosowanie koherentnej antystokesowskiej spektroskopii Ramana (CARS) do obrazowania mielinizacji w wycinkach mózgu

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Odkryj różnice między technikami CARS i SRS w koherentnej mikroskopii Ramana do obrazowania chemicznego komórek bez znakowania. Porównanie rozdzielczości przestrzennej i spektralnej pomoże wybrać optymalną metodę.

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego (Wideo) | JoVE Journal

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Przeglądaj więcej filmów