Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Protokół ten porównuje dwie najpowszechniej stosowane hiperspektralne koherentne techniki rozpraszania Ramana, w tym koherentne rozpraszanie Ramana anty-Stokesa i stymulowane procesy rozpraszania Ramana, co pozwala biologom wybrać najlepszą metodę obrazowania dla ich zastosowań biologicznych. Wykorzystując wewnętrzne sygnatury drgań, koherentna spektroskopia Ramana jest w stanie odwzorować informacje chemiczne i próbki biologiczne bez konieczności znakowania egzogenicznego. Koherentna mikroskopia ramanowska poszerzyła naszą wiedzę na temat metabolizmu komórkowego, mapowania, dystrybucji leków, diagnostyki chorób i ilościowego określania zmian chemicznych.

Jest to technika, która wymaga odpowiedniego przeszkolenia zarówno w optyce, jak i spektroskopii. Polecam przeczytanie kilku artykułów przeglądowych i przeszkolenie przez eksperta przed użyciem tej techniki. Na początek przygotuj szkiełka obrazowe, umieszczając kawałek taśmy dwustronnej na szkiełku nakrywkowym i wytnij mały prostokątny kształt taśmy ze środka taśmy, aby utworzyć otwartą przestrzeń do umieszczenia próbki.

Odpipetować od 1 do 2 mikrolitrów czystego DMSO i dozować kroplę w środku wolnego miejsca. Ostrożnie umieść górną szkiełko nakrywkowe i delikatnie umieść krawędzie szkiełek nakrywkowych, aby uszczelnić komorę, upewniając się, że próbka DMSO nie styka się z krawędziami taśmy. Do eksperymentów z wrażliwością przygotuj seryjne rozcieńczenia DMSO w tlenku deuteru, aby uzyskać zakres stężeń od 50 do 0% Weź od 1 do 2 mikrolitrów każdego roztworu i przygotuj sprasowane próbki, jak pokazano wcześniej.

Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i w razie potrzeby dodaj wodę lub olej immersyjny do soczewki obiektywu lub kondensatora. Prawidłowo przesuń krawędź kropli DMSO w polu view i wyreguluj soczewkę obiektywu, aby uzyskać najlepszą ostrość, a następnie wyśrodkuj kondensor za pomocą metody oświetlenia Kohlera i całkowicie otwórz przysłonę kondensatora. Następnie dostrój długość fali wiązki pompy do 800 nanometrów, aby celować w szczyt CH3 o liczbie falowej 2913 i ustaw moc zarówno pompy, jak i wiązki Stokesa na około 30 miliwatów przed mikroskopem, regulując półpłytkę falową.

W przypadku SRS ustaw wzmocnienie wzmacniacza lock-in na około 10 ze stałą czasową 7 mikrosekund, upewniając się, że stała czasowa jest mniejsza niż czas przebywania pikseli. Ustaw parametry akwizycji obrazu i oprogramowanie do akwizycji za pomocą liczby pikseli 200 na 200 przy rozmiarze skanowania około 100 na 100 mikrometrów kwadratowych, upewniając się, że obraz zawiera zarówno kroplę DMSO, jak i pusty obszar, a następnie zeskanuj próbkę i sprawdź obraz na ekranie komputera. Następnie zeskanuj zmotoryzowany obraz opóźnienia w wiązce pompy Stokesa, monitorując obrazy w czasie rzeczywistym i skanuj opóźnienie, aż sygnał zostanie zmaksymalizowany.

Przesuń kroplę DMSO, aby pokryć całe pole view i sprawdź, czy maksimum sygnału DC jest wyśrodkowane na obrazie, ponieważ sygnał jest zależny od wiązki pompy. Dostosuj położenie belki pompy za pomocą lustra lub przesunięcie napięcia w oprogramowaniu do obrazowania. Po optymalizacji DC wyreguluj lustra wiązki Stokesa, aż sygnał AC zostanie zmaksymalizowany, dostosowując wartość progową, aby wyświetlić około 50% nasycenia, jednocześnie sprawdzając, czy nasycenie jest wyśrodkowane w obrazie.

Jeśli nie, dostosuj lustra tylko w wiązce Stokesa i monitoruj sygnał podczas wyrównywania jako informację zwrotną w czasie rzeczywistym na temat jakości wyrównania. Aby przeprowadzić analizę SNR, otwórz oprogramowanie ImageJ i zaimportuj zapisany przykładowy plik tekstowy DMSO, klikając Plik, następnie Importuj, a następnie Obraz tekstowy i Opcje Otwórz z menu rozwijanego. Po zaimportowaniu obrazu naciśnij Control Shift C, aby wywołać funkcję jasności i kontrastu, a następnie naciśnij przycisk Auto w funkcji jasności i kontrastu, aż obszar próbki DMSO będzie wyglądał na nasycony, aby znaleźć maksymalny sygnał próbki.

Następnie kliknij narzędzie Owalne zaznaczanie w interfejsie ImageJ i podświetl niewielki obszar nasyconego regionu DMSO. Po podświetleniu naciśnij M, aby zmierzyć średnią i odchylenie standardowe wybranego obszaru. Aby zmierzyć tło, dostosuj paski w funkcji Jasność i Kontrast, aż będzie można zaobserwować sygnał pustego regionu, a następnie kliknij zaznaczenie Owal i podświetl obszar tła, upewniając się, że wybrany obszar nie zawiera DMSO.

Następnie naciśnij M, aby zmierzyć statystyki wybranego obszaru. Następnie oblicz SNR, jak pokazano wcześniej, mierząc średnią wartość hałasu i średnią wartość sygnału wraz z odchyleniem standardowym. Aby przetworzyć hiperspektralne obrazy CRS, zaimportuj plik tekstowy, klikając Plik, a następnie Importuj, Obraz tekstowy i Opcje Otwórz z menu rozwijanego.

Po zaimportowaniu kliknij Obraz, następnie Stosy, a następnie Narzędzia i Opcje Montażu do stosu, aby przekonwertować plik na stos obrazów, a następnie przewiń montaż, aż widoczny będzie pierwszy szczyt DMSO. Wybierz region w DMSO i kliknij Obraz, a następnie opcje Stos i Wykres profilu osi Z, aby wykreślić intensywność w stosunku do widma liczby klatki. Następnie kliknij Lista i skopiuj dane profilu, aby wyodrębnić surowe dane spektralne.

Aby przeliczyć odzyskane widmo na jednostki częstotliwości, należy przeprowadzić regresję liniową przy użyciu symetrycznego i asymetrycznego CH rozciągającego się od DMSO i odpowiadających im numerów ramek. Rozdzielczość spektralna DMSO została zmierzona za pomocą mikroskopii hiperspektralnej SRS i CARS, które wykazują rozdzielczość odpowiednio 14,6 i 17,1 liczby falowej, co wskazuje, że SRS ma lepszą rozdzielczość spektralną. Widma DMSO SRS uzyskano w stężeniach 0,1 i 0,01%, w których pik przy liczbie falowej 2913 może być rozwiązany w pierwszym, ale nie w drugim, co wskazuje, że granica wykrywalności wynosi od 0,1 do 0,01% DMSO.

Widma CARS pobrane fazowo pokazują, że pik liczby falowej DMSO 2913 może być wyraźnie rozdzielony dla 0,1%DMSO, ale nie dla 0,01%, co wskazuje na granicę wykrywalności między tymi dwoma stężeniami. Profile intensywności SRS i CARS ogniwa MIA PaCA-2 wykazały, że sygnał SRS daje rozdzielczość 398,6 nanometrów, podczas gdy sygnał CARS daje 1,2 razy lepszą rozdzielczość 330,3 nanometrów. Obrazy SRS i CARS z komórek MIA PaCa-2 w różnych pozycjach opóźnienia optycznego pokazują najsilniejsze sygnały z kropelkami lipidów jako jasnymi kropkami dla SRS, podczas gdy CARS mają znacznie zmniejszone kontrasty.

Jednak przesunięcie ku czerwieni o 37 liczb falowych w ogniskowaniu widmowym poprawiło kontrasty lipidowe zarówno dla SRS, jak i CARS. Widma SRS wykazują znacznie silniejszy sygnał o liczbie fali 2850 dla kropelek lipidów niż inne organelle, podczas gdy widma CARS wykazują niewielkie przesunięcie ku czerwieni. Aby zoptymalizować koherentny sygnał rozpraszania Ramana, najpierw znajdź ognisko próbki, następnie dostrój opóźnienie optyczne, a na koniec dostosuj lustra, aż do osiągnięcia maksimum.

Inne technologie pomp-sondy, takie jak absorpcja stanów nieustalonych, są z natury zintegrowane z platformą CRS. Technologia ta jest bardzo skuteczna w pomiarze kinetyki absorpcji silnych cząsteczek niefluorescencyjnych pochłaniających światło. Technika ta pozwala naukowcom na oglądanie małych cząsteczek w sposób bezznacznikowy o wysokiej aktywności chemicznej komórek.

Pozwala także naukowcom obserwować zmiany w metabolizmie lipidów, dynamice wewnątrzkomórkowej i dystrybucji leków.