Preparowanie, naprawianie i wizualizacja poczwarki Drosophila notum

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala na przeprowadzenie immunohistochemii na guzie poczwarki Drosophila, nawet po tym, jak zostały one wcześniej zranione i zobrazowane na żywo, bez naruszania architektury tkanki. Technika ta pozwala na wykorzystanie szerokiej gamy dostępnych już barwników przeciwciał do barwienia komórek, struktur i białek w nabłonku notum. Użyliśmy tej techniki do immunochemii i barwienia DNA.

Jednak ta sekcja może być wykorzystana jako punkt wyjścia dla innych technik, takich jak hybrydyzacja in situ. Protokół ten może być trudny, ponieważ poczwarki są małe i delikatne, więc do przeprowadzenia sekcji potrzebna jest pewna ręka. A z doświadczeniem staje się to łatwiejsze, więc ćwicz na nieistotnych poczwarkach przed ważnymi.

Zacznij od ostrożnego usunięcia trzech do czterech poczwarek na etapie P5 za pomocą lunety preparacyjnej i zbierz je na szkiełku mikroskopowym obok taśmy. Następnie umieść poczwarki w odległości co najmniej jednej szerokości poczwarki od siebie, na taśmie, brzusznymi stronami do dołu. Teraz umieść kroplę kleju na folii parrafiny lub w pokrywie probówki wirówkowej.

Następnie zanurz koniec końcówki pipety o pojemności od 0,1 do 10 mikrolitrów w kropli kleju i dwukrotnie postukaj końcówką pipety w szkiełko nakrywkowe, w odległości jednego centymetra na jeden centymetr od rogu, tworząc linię kleju klejącego o długości około połowy długości poczwarki. Następnie ustaw pipetę P2 na dwa mikrolitry i pipetę P200 na objętość 200 mikrolitrów i dopasuj je do końcówek. Teraz włóż kleszcze w pobliżu boku głowy i delikatnie usuń jak najwięcej obudowy źrenicy, pracując od przodu do tyłu.

Następnie chwyć rozwijające się nogi poczwarki za pomocą kleszczy i ostrożnie wyciągnij poczwarkę z etui. Połóż poczwarkę w rogu szkiełka nakrywkowego. Chwyć poczwarkę w tylnej części brzucha lub rozwijającym się skrzydle kleszczami.

Podnieś i umieść brzuszną stronę poczwarki w dół, w linii kleju klejącego. Szybko napełnij pipetę P2 dwoma mikrolitrami PBS o pojedynczej mocy, zawierającej 0,1 milimola wapnia i trzymając ją w powietrzu, wydal tylko tyle, aby utworzyć mały pęcherzyk na końcówce. Dotknij małego pęcherzyka roztworu po jednej stronie poczwarki u podstawy klatki piersiowej, a następnie powtórz procedurę po drugiej stronie.

Następnie napełnij pipetę P200 200 mikrolitrami PBS o pojedynczej mocy z 0,1 milimolowym wapniem, a następnie umieść końcówkę pipety na klatce piersiowej i wyrzuć zawartość, aby całkowicie zanurzyć poczwarki, a pozostała część kleju natychmiast stwardnieje. Teraz usuń około 100 mikrolitrów roztworu PBS, aby poczwarka była ledwo zanurzona, zanim natychmiast przejdziesz do następnego kroku. Aby wypreparować notum, chwyć parę nożyczek do mikropreparacji, opierając jedną stronę rękojeści o palec wskazujący i środkowy dominującej ręki, tak aby kciuk dominującej ręki przykładał siłę cięcia.

Następnie ustabilizuj szyjkę nożyczek na środkowym palcu ręki niedominującej, jednocześnie usztywniając szkiełko nakrywkowe palcem serdecznym ręki niedominującej. Teraz odetnij środek grzbietowej części brzucha, aby utworzyć mały otwór o średnicy około 0,2 do 0,5 milimetra. Aby wyizolować tkankę grzbietową, wykonaj małe nacięcia o średnicy od 0,5 do 0,75 milimetra przez powłokę, od tyłu do przodu, a na końcu otoczą one tkankę grzbietową.

Ponadto powtórz nacięcia od tyłu do przodu po drugiej stronie poczwarek. Obróć stolik preparacyjny, aby w razie potrzeby umożliwić czyste cięcie przez głowę. Określ, czy notum zostało wyizolowane, sprawdzając, czy można je łatwo przenieść.

Dodać około 200 mikrolitrów PBS o pojedynczej mocy do środka szkiełka nakrywkowego i utworzyć kanał łączący go z oryginalną kroplą rozwarstwienia, delikatnie przeciągając końcówkę pipety po szkle nakrywkowym, od nowej kropli do oryginalnej. Za pomocą kleszczyków delikatnie popchnij lub przeciągnij izolowane nacięcie do środka szkiełka nakrywkowego i obróć tak, aby wewnętrzna strona była skierowana do góry. Przytrzymaj nacięcie kleszczami, wciskając się w część brzuszną lub głowę.

Za pomocą pary ostrych kleszczy i delikatnych wydaleń PBS o pojedynczej mocy z pipety o pojemności 200 mikrolitrów, usuń wszelkie pozostałe ciała tłuszczowe, pasma mięśniowe lub hemo lifting, aby całkowicie odsłonić nabłonek jednowarstwowy. Gdy tkanka jest czysta, użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby usunąć jak najwięcej roztworu PBS, monitorując za pomocą zakresu preparacji, aby uniknąć zasysania notum. Po usunięciu maksymalnej ilości płynu użyj chusteczki chłonnej, aby ostrożnie zetrzeć resztę kleju klejącego, tuszę źrenicy i inne zanieczyszczenia z szkiełka nakrywkowego.

Teraz dodaj 150 do 200 mikrolitrów 4% PFA i utrwalaj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. W zależności od prędkości rozwarstwienia, można wypreparować od jednej do trzech dodatkowych poczwarek podczas utrwalania pierwszej poczwarki na oddzielnych szkiełkach nakrywkowych. Usuń PFA i zastąp go PBS o pojedynczej mocy, aby umyć notum raz przez 30 sekund.

Jeśli przystępujesz do barwienia przeciwciałami, wykonaj trzy pięciominutowe płukanie w PBS lub PBST o pojedynczej mocy, aby przeniknąć do tkanki, jeśli antygen jest wewnątrzkomórkowy. Próbka może być przechowywana w PBS o pojedynczej mocy, z 0,02% azydkiem sodu przez noc w wilgotnej komorze. Po zabarwieniu przygotuj nową szkiełko nakrywkowe, zwane topperem, z podporami.

Stwórz odstęp o długości około 200 mikrometrów, używając przekładek wykonanych z szkiełek nakrywkowych o wymiarach 22 na 22, oddalonych od siebie o około jeden centymetr, w środku nakładki. Aby przylegać, pomaluj szew przekładki najbardziej oddalony od środka cienką warstwą lakieru do paznokci, a następnie pozostaw do wyschnięcia. Usunąć jak najwięcej roztworu wodnego z próbki i natychmiast nałożyć na próbkę dwie krople środka mocującego zapobiegającego blaknięciu.

W razie potrzeby użyj czystych, ostrych kleszczy, aby umieścić notum w środku kropli medium do montażu zapobiegającego blaknięciu. Umieść szkiełko nakrywkowe z notum na piankowym wsporniku o wymiarach około 10 na 40 milimetrów, aby podnieść próbkę, aby nie przylegała do powierzchni roboczej. Pod lunetą sekcyjną powoli opuść nakładkę na próbkę.

Gdy środek montażowy zapobiegający blaknięciu zetknie się z nakładką, delikatnie zwolnij i pozwól, aby działanie kapilarne pociągnęło nakładkę w dół. Umieść kolejny kawałek pianki na nakładce i użyj standardowego szkiełka mikroskopowego jako ciężarka, aby delikatnie nakłonić środek mocujący zapobiegający blaknięciu między szkiełkiem nakrywkowym próbki, nakładką i przekładkami. Po 5-10 minutach użyj chłonnej chusteczki, aby usunąć nadmiar środka montażowego zapobiegającego blaknięciu, delikatnie dotykając krawędzi szkiełka nakrywkowego.

Delikatnie nałóż lakier do paznokci na każdy róg szkiełek nakrywkowych, aby je ze sobą skleić. Aby zapobiec przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego i uszkodzeniu tkanki grzbietowej, najpierw unikaj powlekania krawędzi, a po wyschnięciu lakieru do paznokci w rogach pomaluj wszystkie krawędzie szkiełek nakrywkowych, aby je uszczelnić. Protokół ten umożliwia obrazowanie utrwalonych próbek przy użyciu przeciwciał i barwników komórkowych.

Protokół ten może być stosowany na próbkach, które zostały wcześniej zranione i zobrazowane na żywo. Porównanie obrazów na żywo i utrwalonych pokazuje, że protokół zachowuje architekturę i morfologię tkanek. Protokół dopuszcza różne spojrzenia na wypreparowane notum.

Widok wierzchołkowy jest idealny do wizualizacji granic i jąder komórek nabłonka, poniżej naskórka. Widok podstawowy lepiej ujawnia struktury podstawne na brzegu rany. Pamiętaj, aby nie zginać ani nie wypaczać notum podczas sekcji.

Wytnij płaski kawałek, omijając boczne krawędzie. Nie tnij zbyt blisko boków brzusznych, w przeciwnym razie odkształci się podczas montażu. Po wypreparowaniu źrenicy można zastosować wiele innych technik, takich jak mikroskopia elektronowa i przekroje poprzeczne.

Techniki te mogą pozwolić na niezwykle szczegółowe zbadanie wcześniej zobrazowanych struktur.