Name: Ustalanie ludzkich organoidów płuc i różnicowanie proksymalne w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę hodowli ludzkich organoidów płuc z pierwotnych tkanek i ich proksymalnego różnicowania w dojrzałe organoidy dróg oddechowych. Technika umożliwia badanie biologii nabłonka oddechowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Centrum Nauk Panoromicznych i Jednostce Mikroskopu Elektronowego, Wydziałowi Medycyny Li Ka Shing, University of Hong Kong, za pomoc w obrazowaniu konfokalnym i cytometrii przepływowej. Prace te były częściowo wspierane przez fundusze z Funduszu Zdrowia i Badań Medycznych (HMRF, 17161272 i 19180392) Biura ds. Żywności i Zdrowia; Ogólny Fundusz Badawczy (GRF, 17105420) Rady ds. Grantów Badawczych; oraz Health@InnoHK, Komisja ds. Innowacji i Technologii, rząd Specjalnego Regionu Administracyjnego Hongkong.

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty z użyciem tkanek ludzkich zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board of the University of Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 i UW21-695). Przed pobraniem tkanek uzyskano świadomą zgodę pacjentów.
1. Wyprowadzenie organoidu płuc człowieka
<ol>
	<li>Przygotowanie materiałów doświadczalnych
	<ol>
		<li>Przygotuj podłoże podstawowe, uzupełniając zaawansowaną pożywkę DMEM/F12 o 2 mM glutaminy, 10 mM HEPES, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
		<li>Przygotować pożywkę do ekspandowania organoidów płuc ludzkich, uzupełniając podłoże podstawowe 10% pożywką kondycjonowaną R-spondyną 1, 10% pożywką kondycjonowaną Noggin, 1x suplementem B27, 1,25 mM N-acetylocysteiny, 10 mM nikotynamidu, 5 μM Y-27632, 500 nM A-83-01, 1 μM SB202190, 5 ng / ml fibroblistowego czynnika wzrostu (FGF)-7, 20 ng / ml FGF-10, i 100 μg/ml prymocyny (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Pożywkę kondycjonowaną R-spondyną 1 i Noggin można zastąpić komercyjną rekombinowaną R-spondyną 1 (500 ng / ml) i Noggin (100 ng / ml).</li>
		<li>Rozgrzej 24-dołkową płytkę do hodowli zawiesinowej w inkubatorze do hodowli komórkowych. Użyć standardowego inkubatora do hodowli komórkowych z 5% CO2 i nawilżoną atmosferą o temperaturze 37 °C. Rozmrozić matrycę piwniczną w lodówce o temperaturze 4 °C. Utrzymuj matrycę podstawową i pożywkę hodowlaną na lodzie podczas eksperymentowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja komórek z ludzkich tkanek płucnych do hodowli organoidów 3D
	<ol>
		<li>Pobieraj świeżo wycięte ludzkie tkanki płucne o wielkości około 0,5 cm od pacjentów, którzy przechodzą resekcję chirurgiczną z powodu różnych chorób. Tkanki płuc należy przetransportować w 30 ml podłoża podstawowego o temperaturze pokojowej i przetworzyć tak szybko, jak to możliwe, w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Tkanki płuc rozdrobnić na małe kawałki (0,5-1 mm) za pomocą sterylnego skalpela w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 10 cm. Przemyć kawałki tkanek 10 ml zimnego podłoża podstawowego w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, a następnie odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 8 ml podłoża podstawowego uzupełnionego kolagenazą w końcowym stężeniu 2 mg/ml. Trawić kawałki tkanki, potrząsając probówką z prędkością 120 obr./min przez 30-40 min w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Pipetować w górę i w dół przez 20x, aby ścinać strawione kawałki tkanki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Ułóż sitko o wielkości 100 μm na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i przefiltruj zawiesinę.</li>
		<li>Odzyskaj kawałki tkanek na sitku z podłożem podstawowym i przenieś je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, a następnie wykonaj drugą rundę ścinania i filtrowania. Dodatkowe ścinanie i filtrowanie można wykonać 1x-2x, aby wyizolować więcej komórek, zwłaszcza gdy pobierany jest mały kawałek tkanki (np. <0,5 cm).</li>
		<li>Dodać FBS do przepływu o końcowym stężeniu 2%, aby zakończyć trawienie, a następnie odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 10 ml podłoża podstawowego, a następnie odwirować w sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>(Opcjonalnie) Jeśli w osadzie widocznych jest wiele erytrocytów (oszacowanych na podstawie koloru osadu), ponownie zawieś osad komórkowy w 2 ml buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie dodać 10 ml podłoża podstawowego do probówki, a następnie odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w zimnej matrycy piwnicznej i trzymać na lodzie. Dodać 80-160 μl macierzy podstawnej dla komórek odzyskanych z tkanki płucnej o wielkości około 0,5 cm; Ilość wystarcza do wysiania 2-4 kropel.</li>
		<li>Dozować 40 μl zawiesiny do każdego dołka wstępnie podgrzanej 24-dołkowej płytki do hodowli zawiesiny. Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut. Pozwól, aby matryca piwnicy zestaliła się, tworząc kroplę.</li>
		<li>Dodać 500 μl pożywki do ekspandowania ludzkich organoidów płucnych uzupełnionej 5 nM hereguliny beta-1 do każdego dołka i inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Odświeżaj podłoże co 3 dni. Usuń stare podłoże, zachowując nienaruszoną kroplę i ostrożnie dodaj świeże podłoże. Pasaż organoidów po inkubacji przez 10-14 dni. Heregulinę beta-1 należy stosować tylko w początkowej hodowli przed pierwszym pasażem.</li>
		<li>Obserwuj organoidy pod mikroskopem, aby upewnić się, że organoidy nie są osadzone o bardzo dużej gęstości komórek. Jeśli kropelka rozpadnie się z powodu zbyt dużej gęstości komórek, odzyskaj i ponownie osadź organoidy i komórki o większej objętości macierzy podstawowej, aby wytworzyć więcej kropelek o niższej i pożądanej gęstości komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekspansja organoidów płuc ludzkich
<ol>
	<li>Przygotuj pipetę Pasteura, spalając końcówkę pipety Pasteura na płomieniu, takim jak palnik Bunsena, aby zwęzić otwór o średnicy od 1,5 mm do około 1,0 mm. Ostudzić pipety, a następnie przeprowadzić sterylizację w autoklawie w celu sterylizacji. Zwilż pipety podłożem podstawowym, aby uniknąć przyczepiania się i utraty komórek podczas mechanicznego ścinania.</li>
	<li>Pasaż organoidów płucnych z mechanicznym ścinaniem
	<ol>
		<li>Użyj końcówki o pojemności 1 ml i pipetuj w górę iw dół, aby rozbić otrzymane powyżej kropelki. Następnie przenieś organoidy wraz z pożywką do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dostosuj objętość do 10 ml zimnym podłożem podstawowym. Odrzucić sklarowany osad po odwirowaniu w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C</li>
		<li>Ponownie przemyć organoidy 10 ml zimnego podłoża podstawowego. Zawiesić organoidy w 2 ml zimnego podłoża podstawowego. Pipetować w górę i w dół, aby ścinać organoidy na małe kawałki za pomocą pipety Pasteura.</li>
		<li>Uzupełnić podłożem podstawowym do całkowitej objętości 10 ml, a następnie odwirować w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić fragmenty organoidów zimną matrycą podstawową wystarczającą do umożliwienia ekspansji 1:3 do 1:5. Trzymaj na lodzie.</li>
		<li>Umieścić 40 μl zawiesiny organoidów w każdym dołku wstępnie podgrzanej płytki 24-dołkowej. Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut. Niech matryca piwnicy zestali się.</li>
		<li>Dodać 500 μl pożywki do ekspanderowania organoidów płucnych do każdej studzienki i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych. Odświeżaj podłoże co 3 dni. Organoidy należy przechodzić co 2 tygodnie w stosunku 1:3 do 1:5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pasaż organoidów płucnych z trypsynizacją 
	UWAGA: Trypsyna jest preferowana, gdy trudno jest ścinać organoid płuc na małe kawałki za pomocą pipety Pasteura lub rozmiar organoidów jest bardzo zmienny, lub późniejsze eksperymenty wymagają organoidów o bardziej jednolitym rozmiarze.
	<ol>
		<li>Zebrać organoidy płuc, jak pokazano w kroku 2.2.1. Zawiesić organoid w 1 ml enzymu dysocjującego i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.</li>
		<li>Dodać 1 ml podłoża podstawowego do probówki. Ścinać organoidy mechanicznie, pipetując organoidy w górę i w dół na małe kawałki za pomocą pipety Pasteura. Sprawdź rozmiar fragmentów organoidów pod mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu. Następnie dodaj 40 μl FBS, aby zakończyć trawienie. 
		UWAGA: Określić wielkość fragmentów organoidów pod mikroskopem zgodnie z układem doświadczalnym. Jeśli eksperyment wymaga więcej organoidów lub organoidów o bardziej jednolitym rozmiarze, należy je rozciąć na mniejsze kawałki lub nawet pojedyncze komórki. Następnie mija więcej czasu, prawdopodobnie 3 tygodnie, zanim organoidy będą gotowe do eksperymentów.</li>
		<li>Uzupełnić podłożem podstawowym do końcowej objętości 10 ml, a następnie odwirować w sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić kawałki organoidów w zimnej matrycy podstawowej o objętości wystarczającej do przejścia w stosunku 1:5-1:10. Trzymaj na lodzie.</li>
		<li>Umieścić 40 μl zawiesiny organoidów w każdym dołku wstępnie podgrzanej płytki 24-dołkowej. Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut. Niech matryca piwnicy zestali się.</li>
		<li>Uzupełnić 500 μl pożywki do ekspandowania organoidów płucnych na dołek i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych. Odświeżaj podłoże rozszerzające co 3 dni. Pasaż organoidów po 2-3 tygodniach. 
		UWAGA: Około 100 organoidów jest zamontowanych w kropli 40 μl matrycy podstawowej. Organoidy płuc zwykle rosną lepiej przy stosunkowo dużej gęstości komórek. Ponownie osadź organoidy o mniejszej gęstości komórek, jeśli kropelki rozpadną się lub rosnące organoidy przyczepią się do siebie z powodu zbyt dużej gęstości komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Różnicowanie proksymalne w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych
<ol>
	<li>Przygotować proksymalną pożywkę różnicującą (pożywkę PD), uzupełniając podstawową ośrodek granicy faz powietrze-ciecz 1x suplementem granicy faz powietrze-ciecz, 1x suplementem do konserwacji granicy faz powietrze-ciecz, 4 μg/ml heparyny, 1 μM hydrokortyzonu, 10 μM Y-27632 i 10 μM DAPT (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Organoidy 3D dróg oddechowych
	<ol>
		<li>Inkubować organoidy płuc w pożywce ekspansyjnej przez 7-10 dni po pasażowaniu za pomocą mechanicznego ścinania. Wymień nośnik rozprężny na nośnik PD. Inkubować organoidy w pożywce PD przez 14 dni w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Wyrzuć pożywkę PD z każdej studzienki. Dodać bufor lizatu komórkowego, aby zebrać zróżnicowany organoid dróg oddechowych w celu ekstrakcji RNA i wykrycia ekspresji genów komórkowych za pomocą testu RT-qPCR.</li>
		<li>Alternatywnie, inkubować organoidy w temperaturze 37 °C przez 60 minut po dodaniu 10 mM EDTA w celu rozdzielenia organoidów na pojedyncze komórki, a następnie przeprowadzić analizę metodą cytometrii przepływowej w celu zbadania populacji komórek. Organoidy są gotowe do różnych manipulacji eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Organoid dróg oddechowych 2D
	<ol>
		<li>Przygotuj wystarczającą ilość organoidów płuc 3D do hodowli różnicowania 2D. Łącznie 1,3 x 105 i 4,5 x 105 komórek są wymagane odpowiednio dla 24-dołkowej przepuszczalnej wkładki nośnej i 12-dołkowej przepuszczalnej wkładki nośnej.</li>
		<li>Po tym, jak organoidy płuc 3D rosną w pożywce ekspansywnej przez 2 tygodnie, trawią organoidy na pojedyncze komórki i wysiewają się do wkładek 24-dołkowych i 12-dołkowych, aby wytworzyć organoidy dróg oddechowych 2D.</li>
		<li>Wstępnie inkubować inserty z podłożem podstawowym przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych. Dodać 250 μl i 500 μl podłoża podstawowego odpowiednio do górnej i dolnej komory płytki 24-dołkowej. W przypadku płytki 12-dołkowej dodać 500 μl i 1 000 μl podłoża podstawowego odpowiednio do górnej i dolnej komory.</li>
		<li>Zbierz organoidy płuc 3D zgodnie z opisem w kroku 2.2.1. Zawiesić organoidy w 1 ml enzymu dysocjującego i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.</li>
		<li>Dodać 1 ml podłoża podstawowego do probówki. Pigazuj w górę iw dół, aby ścinać organoidy na pojedyncze komórki za pomocą pipety Pasteura i sprawdzaj komórki pod mikroskopem. Następnie dodaj 40 μl FBS, aby zakończyć trawienie.</li>
		<li>Przefiltrować komórki przez sitko o średnicy 40 μm do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przefiltrowaną zawiesinę komórkową przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Uzupełnić podłożem podstawowym do całkowitej objętości 10 ml, a następnie odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić osad zebrany z 24 kropelek (40 μl) w 1-2,5 ml pożywki do ekspandowania organoidów płucnych w zależności od gęstości komórek w kropelkach. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek pod mikroskopem. Dostosuj stężenie komórek do 1,3 x 106/ml (dla wkładek 24-dołkowych) lub 9 x 105/ml (dla wkładek 12-dołkowych).</li>
		<li>Usuń podłoże podstawowe z górnej i dolnej komory. Dodać 500 μl i 1 000 μl podłoża rozprężnego do dolnej komory odpowiednio wkładki 24-dołkowej i wkładki 12-dołkowej. Zasiewy 100 μl i 500 μl zawiesiny komórkowej przygotowanej w kroku 3.3.7 umieścić w komorze wierzchołkowej odpowiednio wkładki 24-dołkowej i wkładki 12-dołkowej.</li>
		<li>Inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 2 dni. Wymień pożywkę rozprężną na pożywkę wyładowań niezupełnych zarówno w komorze wierzchołkowej, jak i dolnej płytek. Inkubować organoidy w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 14 dni i odświeżać pożywkę PD co 3 dni. 
		UWAGA: Ruchome rzęski są dostrzegalne w organoidach 3D i 2D pod mikroskopem od 7 dnia po inkubacji w pożywce PD. Po 14 dniach hodowli różnicującej w pożywce PD organoidy dróg oddechowych są dojrzałe do różnych manipulacji eksperymentalnych.</li>
		<li>Mierz przeznabłonkową rezystancję elektryczną (TEER) co drugi dzień za pomocą systemu pomiaru oporu elektrycznego zgodnie ze standardowym protokołem opisanym w17.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li>
<li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li>
<li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modelling+in+human+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li>
<li>Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</a> (2021).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098(2015).</li>
<li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+grow+a+lung%3A+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pathobiology+Reports%22%5BJournal%5D)">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li>
<li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt%2Fbeta-catenin+and+Wnt%2FPCP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li>
<li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li>
<li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li>
<li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li>
<li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+immunological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li>
<li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li>
<li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508(2021).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li>
<li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li>
<li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li>
</ol>

J. Z., C. L. i M. C. C. są wymienieni jako wynalazcy w patencie na organoidy dróg oddechowych (publikacja nr: US-2021-0207081-A1). Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Ludzkie drogi oddechowe są wyściełane nabłonkiem dróg oddechowych, znanym również jako pseudostratyfikowany nabłonek rzęskowy. Główne typy komórek nabłonka górnych dróg oddechowych to komórki rzęskowe, które umożliwiają skoordynowany ruch ich rzęsek wierzchołkowych w celu wydalenia śluzu i wdychanych cząstek z dróg oddechowych, komórki kubkowe, które produkują i wydzielają śluz oraz komórki podstawne, które wyściełają błonę podstawną i biorą udział w regeneracji. W małych drogach oddechowych, takich jak oskrzeliki, prost...

Organoidy stały się solidnym i uniwersalnym narzędziem do modelowania in vitro rozwoju narządów oraz badania biologii i chorób. W przypadku hodowli w pożywce hodowlanej zdefiniowanej przez czynnik wzrostu, dorosłe komórki macierzyste (ASC) z różnych narządów mogą być namnażane w 3-wymiarowym (3D) i samoorganizujące się w przypominające narządy klastry komórkowe złożone z wielu typów komórek, zwanych organoidami. Laboratorium Cleversa poinformowało o wyprowadzeniu pierwszego organoidu pochodzącego z ASC, organoidu jelitowego ludzkiego, w 2009 roku1,2. Następnie organoidy pochodzące z ASC zostały stworzone dla różnych ludzkich narządów i tkanek, w tym prostaty3,4, wątroba5,6, żołądek7,8,9, trzcreas10, gruczoł sutkowy11, oraz płuco 12,13. Te organoidy pochodzące z ASC zachowały krytyczne właściwości komórkowe, strukturalne i funkcjonalne narządu rodzimego oraz zachowały stabilność genetyczną i fenotypową w hodowli długoterminowej ekspansji14,15.
Organoidy mogą być również pozyskiwane z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), w tym embrionalnych komórek macierzystych (ES) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS)16. Podczas gdy organoidy pochodzące z PSC wykorzystują mechanizmy rozwoju narządów do ich powstawania, ASC mogą być zmuszane do tworzenia organoidów poprzez odbudowę warunków, które naśladują niszę komórek macierzystych podczas fizjologicznej samoodnowy tkanek lub naprawy tkanek. Organoidy pochodzące z PSC są korzystnymi modelami do badania rozwoju i organogenezy, choć nie są w stanie osiągnąć porównywalnego poziomu dojrzewania organoidów pochodzących z ASC. Status dojrzewania podobny do płodu organoidów pochodzących z PSC i złożoność tworzenia tych organoidów znacznie uniemożliwiają ich szerokie zastosowanie w badaniu biologii i patologii w dojrzałych tkankach.
Drogi oddechowe człowieka, od nosa do końcowego oskrzelika, są wyściełane nabłonkiem dróg oddechowych, zwanym również pseudowarstwowym nabłonkiem rzęskowym, który składa się z czterech głównych typów komórek, tj. komórki rzęskowej, komórki kubkowej, komórki podstawnej i komórki maczugi. Stworzyliśmy organoid płuc ludzkich pochodzący z ASC z ludzkich tkanek płucnych we współpracy z lab12,13. Te organoidy płuc są kolejno namnażane w pożywce ekspansywnej przez ponad rok; Dokładny czas trwania różni się w zależności od różnych linii organoidów uzyskanych od różnych dawców. Jednak w porównaniu z natywnym nabłonkiem dróg oddechowych, te długotrwałe, rozszerzalne organoidy płuc nie są wystarczająco dojrzałe, ponieważ komórki rzęskowe, główna populacja komórek w ludzkich drogach oddechowych, są niedostatecznie reprezentowane w tych organoidach płuc. W związku z tym opracowaliśmy protokół różnicowania proksymalnego i wygenerowaliśmy organoidy dróg oddechowych 3D i 2D, które morfologicznie i funkcjonalnie fenokopiują nabłonek dróg oddechowych do poziomu zbliżonego do fizjologicznego.
Tutaj udostępniamy protokół wideo, który pozwala na uzyskanie organoidów ludzkich płuc z pierwotnych tkanek płuc, rozszerzenie organoidów płuc i wywołanie różnicowania proksymalnego w celu wygenerowania organoidów dróg oddechowych 3D i 2D.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki do hodowli organoidów płuc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>12634010-A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500nM</td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>Cultrex Matryca błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu, typ 2 (BME 2)</td><td>Trevigen</td><td>3533-010-0</td><td>70-80%</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMAX (glutamina)</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Heregulina &beta;-1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>N-Acetylocysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin (pożywka warunkowa)</td> <td>domowej roboty</td><td></td> <td>- 10x</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U / ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>1x</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Rspondin1 (pożywka warunkowa)</td> <td>domowej roboty</td> <td>-</td> <td>10x</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td>1 &mikro; M</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 & mikro; M</td></tr><tr><td><silny>proksymalny środek różnicujący</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Tocris</td><td>2634</td><td>10 &mikro; </td></tr><tr><td>M Roztwór heparyny</td><td>StemCell Technology</td><td>7980</td><td>4 & mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy hydrokortyzonu</td><td>Technologia komórek macierzystych</td><td>7925</td><td>1 i mikro; M</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 10X Suplement</td><td></td><td></td><td>uzupełniający interfejs powietrzno-cieczowy</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td><td>StemCell Technology</td><td>05001</td><td>interfejs powietrza i cieczy podłoże podstawowe</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI Suplement</td><td></td><td></td> konserwacyjny Suplement do konserwacji <td>interfejsu cieczy powietrznej</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Baker</td><td>1-800-992-2537</td><td></td></tr><tr><td>Carl Zeiss LSM 780 lub 800</td><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>42093483</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31SF</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5418BG040397</td><td></td></tr><tr><td>Pipetor serologiczny</td><td>Eppendorf</td> Micropipette Eppendorf <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN black lub ZEN blue oprogramowanie</td><td>Oprogramowanie analityczne Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12mm Trans-well</td><td>StemCell Technology</td><td>#38023</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Cellstar</td><td>665970</td><td></td></tr><tr><td>15- i 50 ml stożkowe probówki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L6BF5Z8118</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>6.5mm Trans-well</td><td>StemCell Technology</td><td>#38024</td><td></td></tr><tr><td>Medyczna jednostka filtrująca strzykawkę, 0,22 i mikro; m</td><td>Rurki do mikropipet Sigma-Aldrich</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet</td><td></td> Eppendorf <td></td> Thermo Fisher Scientific TFLR140-200-Q21190531 <td></td></tr><tr><td>Szkło do pipet Pasteura</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-378893</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne (5 ml, 10 ml, 25 ml)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BA08003, 08004, 08005</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Koza Anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Koza Anty-Królik Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Kozia Anty-Szczur Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anty-Cytokeratyna 5</td><td>Abcam</td><td>ab128190</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anti-FOX J1</td><td>Invitrogen</td><td>14-9965-82</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anti-Mucin 5AC</td><td>Abcam</td><td>ab3649</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anti-&beta;-tubulina 4</td><td>Sigma</td><td>T7941</td><td></td></tr><tr><td>Królik Anti-p63</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>Szczura Anty-Uteroglobina/CC-10</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB4218-SP</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Inny odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1217701</td><td>enzym dysocjacyjny</td></tr></tbody></table>

ustalanie ludzkich organoidów płuc i różnicowanie proksymalne w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych

Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

Brak solidnego modelu in vitro ludzkiego nabłonka oddechowego utrudnia zrozumienie biologii i patologii układu oddechowego. Opisujemy zdefiniowany protokół pozyskiwania ludzkich organoidów płucnych z dorosłych komórek macierzystych w tkance płucnej i indukowania różnicowania proksymalnego w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych. Organoidy płuc są następnie kolejno namnażane przez ponad 1 rok z wysoką stabilnością, podczas gdy zróżnicowane organoidy dróg oddechowych są wykorzystywane do morfologicznej i funkcjonalnej symulacji ludzkiego nabłonka dróg oddechowych na poziomie zbliżonym do fizjologicznego. W ten sposób tworzymy solidny model organoidowy nabłonka ludzkich dróg oddechowych. Długoterminowa ekspansja organoidów płucnych i zróżnicowanych organoidów dróg oddechowych generuje stabilne i odnawialne źródło, umożliwiając naukowcom rekonstrukcję i ekspansję komórek nabłonka ludzkich dróg oddechowych w szalkach hodowlanych. Ludzki system organoidów płuc zapewnia unikalny i fizjologicznie aktywny model in vitro do różnych zastosowań, w tym do badania interakcji wirus-gospodarz, testowania leków i modelowania chorób.

Niniejszy protokół umożliwia otrzymywanie ludzkich organoidów płuc z wysokim wskaźnikiem sukcesu. Świeżą tkankę płuc człowieka sieka się na małe kawałki, a następnie trawi kolagenazą. Powstałe pojedyncze komórki osadza się w macierzy błony podstawnej i inkubuje w medium do ekspansji organoidów płuc uzupełnionym o koktajl czynników niszy w celu wzrostu nabłonkowych komórek macierzystych (krok 1.1.2). Rycina 1 przedstawia mikrofotografię świeżo wyizolowanych komórek płuc osadzonych w macierzy ...

Protokół przedstawia metodę pozyskiwania ludzkich organoidów płucnych z pierwotnych tkanek płuc, rozszerzania organoidów płuc i wywoływania różnicowania proksymalnego w celu wygenerowania organoidów dróg oddechowych 3D i 2D, które wiernie kopiują nabłonek ludzkich dróg oddechowych.

Ustalanie ludzkich organoidów płuc i różnicowanie proksymalne w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

Wprowadzamy metodę ustalania hodowli organoidowej nabłonka ludzkich dróg oddechowych na płytkach hodowlanych. Z wysoką wydajnością pozyskujemy ludzkie organoidy płucne bezpośrednio z pierwotnych tkanek płuc. Uzyskany organoid płuc człowieka jest stabilnie rozwijany przez ponad rok, a protokół różnicowania proksymalnego pozwala na generowanie dojrzałych organoidów dróg oddechowych, które mogą wiernie symulować nabłonek ludzkich dróg oddechowych do poziomu zbliżonego do fizjologicznego.W związku z tym system hodowli pozwala naukowcom zrekonstruować i rozszerzyć nabłonek ludzkich dróg oddechowych na płytkach hodowlanych. Procedurę zademonstrują Man Chun Chiu i Yifei Yu, doktoranci w naszym laboratorium Aby rozpocząć izolację komórek z ludzkich tkanek płuc do hodowli organoidów 3D, zmiel tkanki płuc na jednomilimetrowe małe kawałki za pomocą sterylnego skalpela i umyj fragmenty tkanek 10 mililitrami zimnego podłoża podstawowego. Odwirować tkanki w temperaturze 400 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w ośmiu mililitrach podłoża podstawowego uzupełnionego kolagenazą w końcowym stężeniu dwóch miligramów na mililitr.Następnie trawić kawałki tkanki, potrząsając probówką z prędkością 120 obr./min przez 30 do 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po strawieniu pipetuj w górę i w dół 20 razy za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby ścinać strawione kawałki tkanki. Następnie przefiltruj zawiesinę za pomocą sitka o średnicy 100 mikronów do 50-mililitrowej tubki.Odzyskaj i przenieś kawałki tkanki z sitka do 15-mililitrowej probówki wirówkowej z podłożem podstawowym. Aby zakończyć trawienie, dodać płodową surowicę bydlęcą do przepływu do końcowego stężenia 2%, Następnie odwirować probówkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach podłoża podstawowego, jak opisano wcześniej. Po odwirowaniu ponownie zawiesić granulki w 80 do 160 mikrolitrach zimnego podłoża macierzystego i umieścić probówki na lodzie.Następnie dozować 40 mikrolitrów zawiesiny do każdej studzienki wstępnie podgrzanej 24-dołkowej płytki do hodowli zawiesiny. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut. Pozwól, aby matryca piwniczna zestaliła się i utworzyła kroplę.Po inkubacji dodać 500 mikrolitrów pożywki ekspansywnej ludzkich organoidów płucnych uzupełnionej pięcioma nanomolami hereguliny-beta 1 do każdego dołka i inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po trzech dniach usuń starą pożywkę, zachowując nienaruszoną kroplę i ostrożnie dodaj świeżą pożywkę. Po 10 do 14 dniach pasażowania obserwuj organoidy pod mikroskopem i upewnij się, że organoidy nie są osadzone o bardzo dużej gęstości komórek.Aby przejść przez organoidy płuc za pomocą ścinania, rozbij kropelki, pipetując w górę iw dół za pomocą jednomililitrowej końcówki. Następnie przenieś organoidy wraz z pożywką do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i dostosuj objętość do 10 mililitrów za pomocą zimnego podłoża podstawowego. Odwirować probówkę o sile 300 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wyrzucić supernatant i przemyć organoidy 10 mililitrami zimnego podłoża podstawowego.Następnie ponownie zawieś organoidy w dwóch mililitrach zimnego podłoża podstawowego i ścinaj na małe kawałki za pomocą pipety Pasteura. Następnie dodaj podłoże podstawowe do całkowitej objętości 10 mililitrów i odwiruj przed ponownym zawieszeniem fragmentów organoidów zimną matrycą podstawową wystarczającą do umożliwienia ekspansji 1:3 do 1:5 i umieść probówki na lodzie. Dozować 40 mikrolitrów zawiesiny organoidowej do każdej studzienki wstępnie podgrzanej 24-dołkowej płytki do inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić zestalenie się matrycy podstawowej przez 10 do 15 minut.Później dodaj 500 mikrolitrów pożywki do ekspandowania organoidów płucnych do każdej studzienki i inkubuj w inkubatorze do hodowli komórkowych. Odświeżaj pożywkę co trzy dni i przechodź przez organoidy co dwa tygodnie. Aby przejść organoidy płuc z trypsynizacją, ponownie zawieś zebrane organoidy płucne w jednym mililitrze enzymu dysocjacyjnego.Inkubuj organoid w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut. Następnie dodaj jeden mililitr podłoża podstawowego do probówki i ścinaj organoidy mechanicznie, pipetując w górę iw dół. Sprawdź wielkość kawałków organoidów pod mikroskopem w 100-krotnym powiększeniu przed zakończeniem trawienia za pomocą 40 mikrolitrów płodowej surowicy bydlęcej.Uzupełnić objętość do 10 mililitrów podłożem podstawowym i odwirować przed ponownym zawieszeniem kawałków organoidu w zimnej matrycy podstawowej o objętości wystarczającej do przejścia w stosunku 1:5 do 1:10. Później dozować 40 mikrolitrów zawiesiny organoidów do każdego dołka 24-dołkowej płytki i hodować płytkę, jak pokazano wcześniej. Aby wygenerować organoidy dróg oddechowych 3D, należy inkubować organoidy płuc w pożywce ekspansyjnej przez siedem do 10 dni po pasażowaniu za pomocą mechanicznego ścinania.Następnie zastąp pożywkę ekspansywną pożywką do różnicowania proksymalnego i inkubuj organoidy w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 14 dniach wyrzuć pożywkę z każdej studzienki i dodaj bufor lizatu komórkowego w celu zebrania zróżnicowanego organoidu dróg oddechowych w celu ekstrakcji RNA i wykrycia ekspresji genów komórkowych za pomocą testu RT-qPCR. Wstępnie inkubować wkładki w inkubatorze do hodowli komórkowych z 250 i 500 mikrolitrami podłoża podstawowego odpowiednio w górnej i dolnej komorze 24-dołkowej płytki.Następnie dodaj jeden mililitr podłoża podstawowego do probówki i pipetuj w górę iw dół, aby ścinać organoidy na pojedyncze komórki. Obserwuj komórki pod mikroskopem przed zakończeniem trawienia za pomocą 40 mikrolitrów płodowej surowicy bydlęcej. Przefiltruj komórki przez 40-mikronowe sitko do 50-mililitrowej probówki i przenieś przefiltrowaną zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki.Uzupełnij zawiesinę podłożem podstawowym do całkowitej objętości 10 mililitrów. Po odwirowaniu ponownie zawieś osad zebrany z 24 kropelek w 1 do 2,5 mililitra pożywki do ekspandowania organoidów płucnych, w zależności od gęstości komórek. Policz liczbę komórek z licznikiem komórek pod mikroskopem, a następnie dostosuj stężenie komórek do 1,3 razy 10 do sześciu na mililitr dla wkładek 24-dołkowych.Usuń podłoże podstawowe z górnej i dolnej komory przed dodaniem 500 mikrolitrów pożywki rozprężnej do dolnej komory. Wysiewa 100 mikrolitrów przygotowanej wcześniej zawiesiny komórkowej do komory wierzchołkowej wkładki 24-dołkowej i inkubuje. Po dwóch dniach zastąp pożywkę ekspandacyjną proksymalnym podłożem różnicującym zarówno w wierzchołkowej, jak i dolnej komorze płytki.Inkubować organoidy przez 14 dni i odświeżać podłoże co trzy dni. Codziennie mierz przeznabłonkową rezystancję elektryczną za pomocą systemu pomiaru oporu elektrycznego. Na reprezentatywnej mikrofotografii można zobaczyć świeżo wyizolowane komórki płuc osadzone w macierzy błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu typu drugiego.Organoidy torbielowate pojawiały się i rosły z czasem. Pokazano tutaj organoidy płuc po czwartym pasażu. W ciągu dwóch godzin od mechanicznego ścinania fragmenty organoidów osadzone w ekstrakcie z błony podstawnej utworzyły domeny torbielowate.Mikrofotografia tego samego pola w piątym dniu potwierdziła wzrost organoidów w czasie. Rozszerzające się organoidy zawierały wszystkie cztery główne typy komórek nabłonka dróg oddechowych, w tym komórkę rzęskową ACCTUB-dodatnią lub FOXJ1, komórkę podstawną P63-dodatnią, komórkę klubową CC10-dodatnią i komórkę kubkową MUC5AC-dodatnią w stanie przedwczesnym. Organoidy inkubowane w pożywce do ekspansji i różnicowania proksymalnego rozwinęły z czasem odrębną morfologię.Po dwóch tygodniach różnicowania w proksymalnej ośrodku różnicującym, ruchliwe rzęski były widoczne w każdym organoidzie . Zaobserwowano, że synchronicznie bijąca celia wpychała szczątki komórek do wnętrza światła organoidu i obracała je jednokierunkowo, aby usunąć wdychane cząstki. Ponadto analiza cytometrii przepływowej wykazała, że zróżnicowane organoidy mieściły cztery typy komórek nabłonka dróg oddechowych w ośrodku różnicowania i ekspansji proksymalnej.Po dwóch tygodniach różnicowania organoidy dróg oddechowych 2D rozwinęły nienaruszoną barierę nabłonkową. Przeprowadzono test blokady dekstranu w celu oceny integralności bariery nabłonkowej utworzonej w organoidach dróg oddechowych 2D. Organoidy 2D zawierały liczne komórki rzęskowe.Długotrwale rozszerzalny organoid płucny i zróżnicowany organoid dróg oddechowych zapewniają fizjologicznie aktywny i uniwersalny system modelowy do badania biologii i patologii układu oddechowego, w tym COVID-19.

establishing-human-lung-organoids-proximal-differentiation-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół skutecznie kieruje endodermę pochodzącą z embrionalnych komórek macierzystych myszy do dojrzałych komórek nabłonka dróg oddechowych. Ta technika różnicowania wykorzystuje trójwymiarowe, zdecelularizowane rusztowania płuc do kierowania specyfikacją linii płuc w zdefiniowanych, wolnych od surowicy warunkach hodowli.

Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię metod dysocjacji tkanek i frakcjonowania komórkowego, umożliwiając wzbogacenie żywotnych komórek nabłonkowych z bliższych i dalszych obszarów ludzkiego płuca. W tym przypadku podejścia te są stosowane do analizy funkcjonalnej komórek progenitorowych nabłonka płuc poprzez wykorzystanie modeli hodowli organoidów 3D.

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

Opisujemy prosty protokół tworzenia organoidów nabłonkowych śluzowo-rzęskowych z głębokich komórek ektodermy wyizolowanych z zarodków Xenopus laevis. Multipotencjalne komórki progenitorowe regenerują prekursory nabłonkowych komórek kubkowych i umożliwiają śledzenie na żywo inicjacji i progresji przemian komórkowych na powierzchni organoidów.

Organoidy nabłonkowe śluzowo-rzęskowe z komórek embrionalnych Xendopus: generacja, hodowla i obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości

Artykuł opisuje stopniowe różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do trójwymiarowych organoidów całego płuca zawierających zarówno proksymalne, jak i dystalne komórki nabłonkowe płuc wraz z mezenchymą.

Generowanie 3D organoidów całych płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania biologii i chorób rozwojowych płuc

Protokół opisuje bioreaktor z obsługą obrazowania, który pozwala na selektywne usuwanie endogennego nabłonka z tchawicy szczura i jednorodne rozmieszczenie komórek egzogennych na powierzchni światła, a następnie długoterminową hodowlę in vitro konstruktu komórka-tkanka.

Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

Ostatnie postępy w protokołach różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pozwalają na stopniowe wyprowadzanie typów komórek specyficznych dla narządów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące utrzymania i ekspansji komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC oraz ich różnicowania w nabłonek śluzowo-rzęskowy w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz.

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje generowanie złożonego, wielokomórkowego modelu bariery dróg oddechowych, składającego się z nabłonka płuc pochodzącego z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), mezenchymów, komórek śródbłonka i makrofagów w hodowli na granicy powietrza i cieczy.

Hodowla komórek nabłonkowych, mezenchymalnych, śródbłonkowych i odpornościowych pochodzących z iPSC w celu modelowania integralności bariery dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie płuc

W tym protokole wideo krok po kroku wyjaśniamy transdukcję lentiwirusową w organoidach pierwotnego nabłonka jelitowego oraz przetwarzanie i dalszą analizę tych kultur za pomocą ilościowego RT-PCR, RNA-mikromacierzy i immunohistochemii.

Protokół transdukcji lentiwirusowej i dalszej analizy organoidów jelitowych

Hodowla agregatów dojrzałych adipocytów błonowych (MAAC) to nowa metoda hodowli dojrzałych ludzkich adipocytów. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wyizolować adipocyty z ludzkiej tkanki tłuszczowej i jak skonfigurować MAAC.

Izolacja i hodowla dojrzałych adipocytów ludzkich przy użyciu błonowych dojrzałych kultur zagregowanych adipocytów (MAAC)

Cała struktura 3D i zawartość komórkowa organoidów, jak również ich fenotypowe podobieństwo do oryginalnej tkanki, mogą być uchwycone za pomocą opisanego tutaj protokołu obrazowania 3D o rozdzielczości pojedynczej komórki. Protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy organoidów różniących się pochodzeniem, rozmiarem i kształtem.

Trójwymiarowe obrazowanie nienaruszonych organoidów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Poznaj metodę hodowli ludzkich organoidów płuc z pierwotnych tkanek i ich proksymalnego różnicowania w dojrzałe organoidy dróg oddechowych. Technika umożliwia badanie biologii nabłonka oddechowego.

Ustalanie ludzkich organoidów płuc i różnicowanie proksymalne w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych

Przeglądaj więcej filmów