Ustalanie ludzkich organoidów płuc i różnicowanie proksymalne w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych

Wprowadzamy metodę ustalania hodowli organoidowej nabłonka ludzkich dróg oddechowych na płytkach hodowlanych. Z wysoką wydajnością pozyskujemy ludzkie organoidy płucne bezpośrednio z pierwotnych tkanek płuc. Uzyskany organoid płuc człowieka jest stabilnie rozwijany przez ponad rok, a protokół różnicowania proksymalnego pozwala na generowanie dojrzałych organoidów dróg oddechowych, które mogą wiernie symulować nabłonek ludzkich dróg oddechowych do poziomu zbliżonego do fizjologicznego.

W związku z tym system hodowli pozwala naukowcom zrekonstruować i rozszerzyć nabłonek ludzkich dróg oddechowych na płytkach hodowlanych. Procedurę zademonstrują Man Chun Chiu i Yifei Yu, doktoranci w naszym laboratorium Aby rozpocząć izolację komórek z ludzkich tkanek płuc do hodowli organoidów 3D, zmiel tkanki płuc na jednomilimetrowe małe kawałki za pomocą sterylnego skalpela i umyj fragmenty tkanek 10 mililitrami zimnego podłoża podstawowego. Odwirować tkanki w temperaturze 400 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w ośmiu mililitrach podłoża podstawowego uzupełnionego kolagenazą w końcowym stężeniu dwóch miligramów na mililitr.

Następnie trawić kawałki tkanki, potrząsając probówką z prędkością 120 obr./min przez 30 do 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po strawieniu pipetuj w górę i w dół 20 razy za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby ścinać strawione kawałki tkanki. Następnie przefiltruj zawiesinę za pomocą sitka o średnicy 100 mikronów do 50-mililitrowej tubki.

Odzyskaj i przenieś kawałki tkanki z sitka do 15-mililitrowej probówki wirówkowej z podłożem podstawowym. Aby zakończyć trawienie, dodać płodową surowicę bydlęcą do przepływu do końcowego stężenia 2%, Następnie odwirować probówkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach podłoża podstawowego, jak opisano wcześniej. Po odwirowaniu ponownie zawiesić granulki w 80 do 160 mikrolitrach zimnego podłoża macierzystego i umieścić probówki na lodzie.

Następnie dozować 40 mikrolitrów zawiesiny do każdej studzienki wstępnie podgrzanej 24-dołkowej płytki do hodowli zawiesiny. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut. Pozwól, aby matryca piwniczna zestaliła się i utworzyła kroplę.

Po inkubacji dodać 500 mikrolitrów pożywki ekspansywnej ludzkich organoidów płucnych uzupełnionej pięcioma nanomolami hereguliny-beta 1 do każdego dołka i inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po trzech dniach usuń starą pożywkę, zachowując nienaruszoną kroplę i ostrożnie dodaj świeżą pożywkę. Po 10 do 14 dniach pasażowania obserwuj organoidy pod mikroskopem i upewnij się, że organoidy nie są osadzone o bardzo dużej gęstości komórek.

Aby przejść przez organoidy płuc za pomocą ścinania, rozbij kropelki, pipetując w górę iw dół za pomocą jednomililitrowej końcówki. Następnie przenieś organoidy wraz z pożywką do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i dostosuj objętość do 10 mililitrów za pomocą zimnego podłoża podstawowego. Odwirować probówkę o sile 300 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wyrzucić supernatant i przemyć organoidy 10 mililitrami zimnego podłoża podstawowego.

Następnie ponownie zawieś organoidy w dwóch mililitrach zimnego podłoża podstawowego i ścinaj na małe kawałki za pomocą pipety Pasteura. Następnie dodaj podłoże podstawowe do całkowitej objętości 10 mililitrów i odwiruj przed ponownym zawieszeniem fragmentów organoidów zimną matrycą podstawową wystarczającą do umożliwienia ekspansji 1:3 do 1:5 i umieść probówki na lodzie. Dozować 40 mikrolitrów zawiesiny organoidowej do każdej studzienki wstępnie podgrzanej 24-dołkowej płytki do inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić zestalenie się matrycy podstawowej przez 10 do 15 minut.

Później dodaj 500 mikrolitrów pożywki do ekspandowania organoidów płucnych do każdej studzienki i inkubuj w inkubatorze do hodowli komórkowych. Odświeżaj pożywkę co trzy dni i przechodź przez organoidy co dwa tygodnie. Aby przejść organoidy płuc z trypsynizacją, ponownie zawieś zebrane organoidy płucne w jednym mililitrze enzymu dysocjacyjnego.

Inkubuj organoid w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut. Następnie dodaj jeden mililitr podłoża podstawowego do probówki i ścinaj organoidy mechanicznie, pipetując w górę iw dół. Sprawdź wielkość kawałków organoidów pod mikroskopem w 100-krotnym powiększeniu przed zakończeniem trawienia za pomocą 40 mikrolitrów płodowej surowicy bydlęcej.

Uzupełnić objętość do 10 mililitrów podłożem podstawowym i odwirować przed ponownym zawieszeniem kawałków organoidu w zimnej matrycy podstawowej o objętości wystarczającej do przejścia w stosunku 1:5 do 1:10. Później dozować 40 mikrolitrów zawiesiny organoidów do każdego dołka 24-dołkowej płytki i hodować płytkę, jak pokazano wcześniej. Aby wygenerować organoidy dróg oddechowych 3D, należy inkubować organoidy płuc w pożywce ekspansyjnej przez siedem do 10 dni po pasażowaniu za pomocą mechanicznego ścinania.

Następnie zastąp pożywkę ekspansywną pożywką do różnicowania proksymalnego i inkubuj organoidy w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 14 dniach wyrzuć pożywkę z każdej studzienki i dodaj bufor lizatu komórkowego w celu zebrania zróżnicowanego organoidu dróg oddechowych w celu ekstrakcji RNA i wykrycia ekspresji genów komórkowych za pomocą testu RT-qPCR. Wstępnie inkubować wkładki w inkubatorze do hodowli komórkowych z 250 i 500 mikrolitrami podłoża podstawowego odpowiednio w górnej i dolnej komorze 24-dołkowej płytki.

Następnie dodaj jeden mililitr podłoża podstawowego do probówki i pipetuj w górę iw dół, aby ścinać organoidy na pojedyncze komórki. Obserwuj komórki pod mikroskopem przed zakończeniem trawienia za pomocą 40 mikrolitrów płodowej surowicy bydlęcej. Przefiltruj komórki przez 40-mikronowe sitko do 50-mililitrowej probówki i przenieś przefiltrowaną zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki.

Uzupełnij zawiesinę podłożem podstawowym do całkowitej objętości 10 mililitrów. Po odwirowaniu ponownie zawieś osad zebrany z 24 kropelek w 1 do 2,5 mililitra pożywki do ekspandowania organoidów płucnych, w zależności od gęstości komórek. Policz liczbę komórek z licznikiem komórek pod mikroskopem, a następnie dostosuj stężenie komórek do 1,3 razy 10 do sześciu na mililitr dla wkładek 24-dołkowych.

Usuń podłoże podstawowe z górnej i dolnej komory przed dodaniem 500 mikrolitrów pożywki rozprężnej do dolnej komory. Wysiewa 100 mikrolitrów przygotowanej wcześniej zawiesiny komórkowej do komory wierzchołkowej wkładki 24-dołkowej i inkubuje. Po dwóch dniach zastąp pożywkę ekspandacyjną proksymalnym podłożem różnicującym zarówno w wierzchołkowej, jak i dolnej komorze płytki.

Inkubować organoidy przez 14 dni i odświeżać podłoże co trzy dni. Codziennie mierz przeznabłonkową rezystancję elektryczną za pomocą systemu pomiaru oporu elektrycznego. Na reprezentatywnej mikrofotografii można zobaczyć świeżo wyizolowane komórki płuc osadzone w macierzy błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu typu drugiego.

Organoidy torbielowate pojawiały się i rosły z czasem. Pokazano tutaj organoidy płuc po czwartym pasażu. W ciągu dwóch godzin od mechanicznego ścinania fragmenty organoidów osadzone w ekstrakcie z błony podstawnej utworzyły domeny torbielowate.

Mikrofotografia tego samego pola w piątym dniu potwierdziła wzrost organoidów w czasie. Rozszerzające się organoidy zawierały wszystkie cztery główne typy komórek nabłonka dróg oddechowych, w tym komórkę rzęskową ACCTUB-dodatnią lub FOXJ1, komórkę podstawną P63-dodatnią, komórkę klubową CC10-dodatnią i komórkę kubkową MUC5AC-dodatnią w stanie przedwczesnym. Organoidy inkubowane w pożywce do ekspansji i różnicowania proksymalnego rozwinęły z czasem odrębną morfologię.

Po dwóch tygodniach różnicowania w proksymalnej ośrodku różnicującym, ruchliwe rzęski były widoczne w każdym organoidzie . Zaobserwowano, że synchronicznie bijąca celia wpychała szczątki komórek do wnętrza światła organoidu i obracała je jednokierunkowo, aby usunąć wdychane cząstki. Ponadto analiza cytometrii przepływowej wykazała, że zróżnicowane organoidy mieściły cztery typy komórek nabłonka dróg oddechowych w ośrodku różnicowania i ekspansji proksymalnej.

Po dwóch tygodniach różnicowania organoidy dróg oddechowych 2D rozwinęły nienaruszoną barierę nabłonkową. Przeprowadzono test blokady dekstranu w celu oceny integralności bariery nabłonkowej utworzonej w organoidach dróg oddechowych 2D. Organoidy 2D zawierały liczne komórki rzęskowe.

Długotrwale rozszerzalny organoid płucny i zróżnicowany organoid dróg oddechowych zapewniają fizjologicznie aktywny i uniwersalny system modelowy do badania biologii i patologii układu oddechowego, w tym COVID-19.