Charakterystyka septycznego zapalenia otrzewnej wywołanego przez Salmonellę Typhimurium u myszy

Sepsa to rozregulowana odpowiedź immunologiczna gospodarza na inwazję drobnoustrojów lub uszkodzenie tkanek, prowadząca do uszkodzenia narządów w miejscu odległym od miejsca infekcji lub uszkodzenia. Opinia publiczna stała się bardziej świadoma tego zaburzenia podczas pandemii COVID-19. W 2017 r. na całym świecie odnotowano 48,9 miliona przypadków sepsy i 11 milionów zgonów, co stanowi prawie 20% wszystkich zgonów na świecie.

Jak można się spodziewać, większość przypadków ma miejsce w szpitalach. W rzeczywistości badanie wykazało, że prawie 62% pozytywnych izolatów od pacjentów na oddziałach intensywnej terapii z sepsą było organizmami Gram-ujemnymi. Istnieje kilka modeli, a niektóre z powszechnie stosowanych mysich modeli sepsy obejmują endotoksemię wywołaną przez LPS, model podwiązania i nakłucia jelita ślepego oraz systemy modelowe infekcji monobakteryjnych.

W naszym laboratorium ustandaryzowaliśmy system modelu mysiego, aby wywołać sepsę otrzewnową za pomocą Salmonella Typhimurium. Ten model jest korzystny w stosunku do innych, ponieważ Salmonella Typhimurium jest patogenem wewnątrzkomórkowym, który naśladuje klinicznie istotny stan posocznicy Gram-ujemnej. Wynik sepsy zapalenia otrzewnej w tym modelu jest ogólnoustrojowy ze 100% śmiertelnością, w ciągu 96 godzin po zakażeniu.

Dlatego model ten odgrywa zasadniczą rolę w badaniu odpowiedzi zapalnych gospodarza. W tym modelu sepsa jest wywoływana przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,5 miliona CFU Salmonella Typhimurium u 8-10 tygodniowej myszy C57BL/6. Zakażenie ogólnoustrojowe można potwierdzić, oceniając obciążenie bakteryjne narządów, około 16 godzin po zakażeniu.

Eksperymenty z użyciem Salmonella Typhimurium wymagają placówki BSL-2 i przestrzegania wytycznych BSL-2. Należy zachować ostrożność, aby używać odpowiednich środków ochrony osobistej i zapewnić bezpieczeństwo oraz postępować zgodnie ze standardowymi metodami usuwania zagrożeń biologicznych BSL-2. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną ds. zwierząt.

Przygotowanie kultury Salmonella Typhimurium. Dodaj sto mikrolitrów bulionu glicerolowego Salmonella Typhimurium NCTC 12023 do 3 ml bulionu LB. Inkubuj kulturę z prędkością 160 obrotów na minutę, w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Rozłóż 50 mikrolitrów wyhodowanej przez noc kultury w bulionie LB na płytkę agarową Salmonella Shigella i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Wybierz pojedynczą kolonię z płytki agarowej SS z prążkami za pomocą mikrokońcówki. Wyrzuć mikrokońcówkę do 3 ml bulionu LB i hoduj przez noc przy 160 obr./min w 37 stopniach Celsjusza.

Dodaj 0,1 ml kultury bakteryjnej do 50 ml bulionu LB i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsarką z prędkością 160 obr./min przez trzy do czterech godzin, aby osiągnąć logarytmiczną fazę wzrostu. Rozcieńczyć kulturę dwukrotnie za pomocą bulionu LB. Zmierz gęstość optyczną kultury przy długości fali światła 600 nanometrów w spektrofotometrze.

Gdy OD osiągnie jeden, wykonaj dwie porcje po 1 ml kultury w probówkach do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Odwirować probówki o stężeniu 7,750 G przez 15 minut. Odrzucić ten supernatant i przemyć osad dwukrotnie 1 ml 1XPBS.

Odwirować probówki o stężeniu 7,750 G przez 15 minut. Ponownie zawiesić granulkę w 0,5 ml 1XPBS, w dwóch różnych probówkach do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Połączyć zawiesiny z obu probówek w jedną probówkę o pojemności 1,5 ml, zawierającą teraz około dwóch pomnożonych przez 10, podniesionych do potęgi ośmiu jednostek tworzących kolonie na ml.

Przygotować zawiesinę komórek bakteryjnych o stężeniu 10 potęgi sześć jtk/ml, rozcieńczając roztwór podstawowy. Ważna uwaga, zoptymalizuj CFU odpowiadający OD w swoim laboratorium, aby określić CFU dla OD jeden, przed rozpoczęciem eksperymentów. Myszy i infekcje.

W dniu zakażenia przytrzymaj mysz jedną ręką, przetrzyj skórę brzucha 70% etanolem i rozłóż tylne nogi, aby uzyskać lepszy dostęp do ściany brzucha. Wstrzyknąć dootrzewnowo 0,5 ml 10 podniesionych do mocy sześć CFU/ml zawiesiny bakteryjnej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Po zakażeniu należy pobrać posiew, aby sprawdzić rzeczywistą wstrzykniętą jtkówkę, która może wahać się od 0,2 do 0,8 miliona CFU na 0,5 ml.

Ocena narządów za pomocą CFU. Mysz została złożona w ofierze za pomocą uduszenia dwutlenkiem węgla. Po złożeniu w ofierze zarażonej myszy przetrzyj brzuch kawałkiem bawełny zamoczonym w 70% etanolu.

Rozetnij skórę brzucha. Zapoznaj się z artykułem Raya i Dittle'a, aby zapoznać się z protokołem wideo, w którym dowiesz się, jak pobrać płyn z płukania otrzewnowego. Rozetnij jamę otrzewnej i zbierz interesujący Cię narząd.

W tym filmie demonstrujemy wyliczanie narządu CFU z wątroby. Wątroba ulega rozległym uszkodzeniu histopatologicznym, w tym modelu sepsy. Wytnij mały kawałek wątroby i umieść go w probówce do mikrofuge.

Można go przechowywać w lodzie przez dwie do trzech godzin, przed przejściem do następnego kroku. Zważ kawałek i przenieś go do probówki do mikrofuge. Najlepiej pokroić kawałki o wadze około 10 do 15 mg, aby zapewnić odpowiednią homogenizację.

Dodaj 0,5 ml 1XPBS do probówki i homogenizuj narządy za pomocą homogenizatora ręcznego. Upewnij się, że narządy są całkowicie homogenizowane. Uzupełnić objętość do objętości 1 ml, dodając 0,5 ml 1XPBS.

Odwirować probówki o stężeniu 200 G przez pięć minut, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant do świeżych probówek do mikrofuge. Przygotować rozcieńczenia 10 do mocy minus jeden i 10 do mocy minus dwa, na płytce 96-dołkowej.

Rozprowadzić 50 mikrolitrów rozcieńczalnika na świeżych płytkach agarowych SS i inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Policz liczbę kolonii, które pojawiają się w każdym stanie, i znormalizuj dane za pomocą masy narządu, korzystając z następującego wzoru. CFU/mg jest równa liczbie kolonii pomnożonej przez 20, pomnożonej przez współczynnik rozcieńczenia, całość podzielonej przez masę narządu w mg.

Należy zauważyć, że liczba 20 jest używana we wzorze, aby przeliczyć kolonie na płytkę na CFU / ml. Liczbę tę otrzymuje się, dzieląc 1 ml ilości danej objętości platerowanej kultury. W tym przypadku 50 mikrolitrów.

Na przykład, jeśli znajdziesz sto kolonii na płytce agarowej SS, gdzie rozprzestrzenia się 50 mikrolitrów mocy 10 minus jedno rozcieńczenie homogenizowanego narządu o wadze 10 mg, to CFU/mg będzie równe 100 pomnożone przez 20, pomnożone przez 10, całość podzielona przez 10, co jest równe 2000 CFU/mg. Analiza cytometryczna przepływowa różnych populacji komórek odpornościowych w wysięku otrzewnowym. Zbierz komórki otrzewnej zgodnie z wcześniejszym opisem Raya i Dittle'a.

Zawiesić osad komórkowy z płynu z płukania otrzewnej w 1 ml RPMI uzupełnionego 10% FBS. Wylicz całkowitą liczbę komórek w płukaniu otrzewnej za pomocą hemocytometru. Dostosuj liczbę ogniw w taki sposób, aby każda lampa otrzymała od dwóch do pięciu pomnożonych przez 10 podniesionych do mocy pięciu ogniw.

Wiruj komórki w temperaturze 200 G w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Odrzucić supernatant. Umyj ogniwa raz za pomocą 1XPBS.

Odwirować komórki przy sile 200 G przez 10 minut. Zablokuj receptory Fc za pomocą blokera FcR. Jednym z nich jest rozcieńczenie do 400, przygotowane w buforze blokującym, składającym się z 5% FBS i 0,02% azydku sodu w PBS.

Inkubować na lodzie przez 15 minut. Odwirować komórki przy sile 200 G przez 10 minut. Odrzucić supernatant.

Rozcieńczyć przeciwciała sprzężone z fluorochromem będące przedmiotem zainteresowania w buforze blokującym. Tutaj używamy jednego do 500 rozcieńczeń anty-mysiego Ly6G, aby zabarwić neutrofile. Należy zauważyć, że można również pokazać inne populacje komórek odpornościowych, używając anty-mysiej B220 dla komórek B, anty-mysiego CD3 dla limfocytów T, anty-mysiego F4 / 80 dla makrofagów i tak dalej.

Inkubować około 0,2 miliona komórek w 200 mikrolitrach rozcieńczonych roztworów przeciwciał w oddzielnych probówkach. Jako kontrolę ujemną odłożyć po jednej probówce w każdym typie fluorochromu, w celu kontroli niebarwionej. W tej probówce inkubować komórki z 200 mikrolitrami buforu blokującego bez przeciwciała.

Próbki należy inkubować na lodzie przez 45 minut, z przerywanym stukaniem co 15 minut. Odwirować komórki w temperaturze 200 G przez 10 minut, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant.

Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej, w razie potrzeby do przechowywania przez kilka dni. Ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach buforu barwiącego FACS, 2% FBS w PBS. Uzyskaj dane w cytometrze przepływowym.

Pokazane tutaj obrazy płytek agarowych SS wskazują na obciążenie narządów CFU w wątrobie i śledzionie myszy septycznych. Homogenizowany narząd Lys6 rozprowadzono w rozcieńczeniu 10 do potęgi minus jeden i inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kolonie S.Typhimurium o czarnym zabarwieniu pojawiły się po około 12 godzinach od inkubacji.

Część płyty jest tutaj pokazana jako powiększona wstawka w celu podkreślenia kolonii. Wyniki te sugerują, że patogen z powodzeniem rozprzestrzenił się ogólnoustrojowo i skolonizował narządy wewnętrzne. Ten rysunek przedstawia surowice wyizolowane od zdrowych i septycznych myszy.

Objętość krwi do pobrania od myszy septycznych jest mniejsza niż u zdrowych osób z grupy kontrolnej, więc uzyskana surowica jest mniejsza. Dzieje się tak z powodu zwiększonej krzepliwości w posocznicy. Również surowice od myszy septycznych wykazują wyraźne czerwone zabarwienie, co wskazuje na występowanie rozległej hemolizy.

Rysunek przedstawia wykresy cytometryczne komórek otrzewnej od zdrowych i septycznych myszy, wybarwionych przeciwciałem anty-Ly6G. Obrazy te są reprezentatywne dla jednej zdrowej i dwóch zainfekowanych myszy. Myszy septyczne zauważyły zwiększoną infiltrację neutrofili do jamy otrzewnej.

W tym filmie pokazaliśmy metodę wywoływania sepsy bakteryjnej u myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie Salmonella Typhimurium. Jest to model przydatny do badania wpływu interwencji terapeutycznych na łagodzenie sepsy. W tym systemie modelowym skład komórkowy jamy otrzewnej zmienia się dramatycznie w celu zwalczania patogenu.

Dlatego jest to użyteczny model w badaniu zmian kinetycznych w składzie i funkcjach komórek odpornościowych podczas sepsy. Model jest również przydatny w zrozumieniu wzrostu międzykomórkowych reaktywnych form tlenu, poziomów cytokin prozapalnych, hemolizy i krzepnięcia krwi, z których wszystkie mają miejsce podczas sepsy.