Name: Charakterystyka septycznego zapalenia otrzewnej wywołanego przez Salmonellę Typhimurium u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Poznaj metodę indukcji sepsy wywołanej Salmonella Typhimurium u myszy. Model ten umożliwia badanie zapalnych odpowiedzi gospodarza i mechanizmów uszkodzenia narządów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Centralnemu Ośrodku dla Zwierząt, IISc za dostarczenie nam myszy do badań. Badanie to zostało sfinansowane z grantów dla DpN z Departamentu Biotechnologii oraz Rady Badawczej ds. Nauki i Inżynierii rządu Indii. Dużym uznaniem jest wsparcie infrastrukturalne ze strony programu DBT-IISc oraz grantów DST-FIST. Dziękujemy wszystkim byłym i obecnym członkom laboratorium DpN za ich wsparcie.

Wszystkie eksperymenty z użyciem Salmonella Typhimurium były prowadzone w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Należy zadbać o stosowanie odpowiednich środków ochrony indywidualnej (PPE), zapewnienie bezpieczeństwa oraz przestrzeganie standardowych metod utylizacji odpadów biologicznych poziomu BSL-2. Wszystkie eksperymenty na myszach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi określonymi przez Instytucjonalny Komitet Etyki ds. Zwierząt (Institutional Animal Ethics Committee) IISc. Myszy hodowano i utrzymywano w Centralnym Obiekcie dla Zwierząt IISc (numer rejestracyjny: 48/1999/CPCSEA z dnia 1/3/1999), za zgodą Ministerstwa Środowiska i Lasów Rządu Indii. Protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Celu, Kontroli i Nadzoru nad Eksperymentami na Zwierzętach (Committee for Purpose and Control and Supervision of Experiments on Animals) pod numerem zezwolenia CAF/Ethics/797/2020.
Definicja BSL2: Poziom BSL2 oznacza, że czynniki biologicznie niebezpieczne stanowią umiarkowane zagrożenie dla środowiska oraz personelu laboratoryjnego5.
1. Przygotowanie hodowli Salmonella Typhimurium         
<ol>
	<li>Do 3 mL bulionu Luria Bertani (LB) dodać 100 µL zamrożonego w glicerolu szczepu Salmonella Typhimurium NCTC 12023. Hodowlę inkubować przy 160 rpm w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>50 µL hodowli nocnej w bulionie LB wysiać metodą smugową na płytkę z agarem Salmonella Shigella (SS) i inkubować w temperaturze 37 °C przez ok. 12 h. Płytkę z agarem SS z koloniami bakterii przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni przed eksperymentem z infekcją in vivo.</li>
	<li>Z wyseianej płytki z agarem SS pobrać pojedynczą kolonię za pomocą mikrokońcówki. Wyrzucić mikrokońcówkę do 3 mL bulionu LB i hodować przy 160 rpm w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Do 50 mL bulionu LB dodać 0,1 mL hodowli bakteryjnej i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką przy 160 rpm przez 3-4 h, aż do osiągnięcia fazy logarytmicznej wzrostu. Hodowlę rozcieńczyć dwukrotnie bulionem LB. 
	UWAGA: W fazie logarytmicznej komórki bakteryjne są w optymalnej kondycji i aktywnie się dzielą.</li>
	<li>Zmierzyć gęstość optyczną (OD) hodowli przy długości fali 600 nm za pomocą spektrofotometru lub czytnika mikropłytek. Po osiągnięciu OD 1,0 przygotować dwie alikwoty po 1 mL hodowli w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Probówki wirować przy 7 750 × g przez 15 min. Odrzucić nadsącz i przemyć osad 1 mL 1x PBS (powtórzyć 2 razy). Probówki wirować przy 7 750 × g przez 15 min.</li>
	<li>Osad resuspender w 0,5 mL 1x PBS w dwóch oddzielnych probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Połączyć zawiesiny z obu probówek w jednej probówce 1,5 mL, która zawiera obecnie ok. 2 × 108 jednostek tworzących kolonie (CFU)/mL.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek bakteryjnych o stężeniu 1 × 106 CFU/mL poprzez rozcieńczenie tego roztworu zapasowego. 
	OSTREŻENIE: Przed rozpoczęciem eksperymentów należy zoptymalizować wartość CFU odpowiadającą OD w konkretnych warunkach laboratoryjnych, aby określić liczbę CFU dla OD 1,0.</li>
</ol>
2. Myszy i infekcje
<ol>
	<li>Mysz samce szczepu C57BL/6 w wieku 8–10 tygodni o masie ciała ok. 20 g utrzymuj przez kilka dni w pomieszczeniu z czystym powietrzem w zwierzęciu w celu aklimatyzacji.</li>
	<li>W dniu infekcji należy utrzymać mysz jedną ręką, przemyć skórę brzucha 70% etanolem i rozsunąć tylne kończyny, aby zapewnić lepszy dostęp do powłoki brzusznej.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,5 mL 1 × 106 zawiesinę bakteryjną o stężeniu CFU/ml drogą dosytroniczną za pomocą strzykawki 1 ml. W związku z tym każda mysz otrzymuje 5 × 105 CFU. Myszy kontrolne, niezinfekowane, otrzymują 0,5 ml samego PBS. Po infekcji należy wysiać kulturę na podłoże, aby sprawdzić faktyczną liczbę wstrzykniętych CFU, która może wynosić od 0,2 do 0,8 mln CFU/0,5 ml.</li>
	<li>Umieść myszy z powrotem w klatkach zgodnie z przypisaniem.</li>
	<li>Uśmierć myszy przy użyciu CO2 uduszenie w ok. 12–18 h po zakażeniu dla uzyskania najlepszej odpowiedzi. Zazwyczaj wszystkie zakażone myszy giną w ciągu 96 h. W przypadku niektórych interwencji eksperymentalnych część myszy może przeżyć. Takie myszy należy poddać eutanazji po 96 h. Należy również poddać eutanazji każdą mysz z temperaturą ciała poniżej 33.2 °C or ostry stres w 96. godzinie jako humanitarny punkt końcowy. 
	UWAGA: W tym modelu niektóre myszy mogą zacząć ginąć po 12 h od Salmonella wstrzyknięcie. Należy zatem odpowiednio zaplanować eksperymenty obejmujące wiele punktów czasowych.</li>
</ol>
3. Ocena CFU w organach
<ol>
	<li>Uśmierć zakażoną mysz poprzez uduszenie CO2, a następnie przemyj brzuch kawałkiem waty nasączonej 70% etanolem. Rozetnij skórę brzucha. W celu zapoznania się z protokołem wideo dotyczącym pobierania płynu z płukania otrzewnej, należy odwołać się do artykułu Raya i Dittela6. Rozetnij jamę otrzewną i pobierz interesujące organy do probówek typu microfuge. Dodatkowo, ponieważ krew u myszy z sepsą szybko krzepnie, a jej ilość jest niewielka, należy ją pobrać niezwłocznie po uśmierceniu zwierzęcia. 
	UWAGA: Niniejsze wideo prezentuje oznaczanie liczby CFU w organach na przykładzie wątroby, ponieważ w tym modelu sepsy wątroba ulega rozległym uszkodzeniom histopatologicznym.</li>
	<li>Wytnij mały fragment wątroby i umieść go w probówce typu microfuge. 
	UWAGA: Fragment ten można przechowywać w lodzie przez maksymalnie 2-3 h przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>Zważ i przenieś fragmenty do probówek do mikrocentryfugi. W celu zapewnienia prawidłowej homogenizacji zaleca się wycinanie fragmentów o masie ~10-15 mg. W przypadku mniejszych organów, takich jak węzły chłonne krezkowe (MLNs) lub grasica, należy użyć całych organów.</li>
	<li>Do probówki dodaj 0,5 mL 1x PBS i zhomogenizuj organy za pomocą homogenizatora ręcznego. Upewnij się, że organy zostały całkowicie zhomogenizowane. Uzupełnij objętość do 1 mL, dodając 0,5 mL 1x PBS.</li>
	<li>Wiruj probówki z prędkością 200 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zbierz nadsącz do nowych probówek typu microfuge i przygotuj rozcieńczenia 1 × 10−1 oraz 10−2 na płytce 96-dołkowej.</li>
	<li>Wyjałowuj 50 µL rozcieńczalnika na świeże płytki z agarem SS i inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 12 h.</li>
	<li>Policz liczbę kolonii, które pojawiły się w każdym wariancie, i znormalizuj dane względem masy organu, korzystając z równania (1): 
	CFU/mg = <img alt="Równanie ilościowego oznaczania kolonii bakteryjnych, Liczba kolonii × 20 × Współczynnik rozcieńczenia/Masa organu w mg." src="/files/ftp_upload/63695/63695eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1"> (1) 
	UWAGA: Liczba 20 w formule służy do przeliczenia liczby kolonii na płytce na CFU/mL. Wartość ta wynika z podzielenia 1 mL przez objętość wysianej kultury – w tym przypadku 50 µL. 
	Na przykład, jeśli na płytce z agarem SS stwierdzono 100 kolonii, przy wysianiu 50 µL rozcieńczenia 1 × 10-1 zhomogenizowanego organu o masie 10 mg, to 
	CFU/mg = <img alt="Wzór mnożenia i dzielenia: \(100 \times 20 \times 10 / 10 = 2,000\)." src="/files/ftp_upload/63695/63695eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 2"></li>
</ol>
4. Analiza cytometryczna przepływowa różnych populacji komórek odpornościowych w wysięku otrzewnowym
<ol>
	<li>Należy zebrać komórki otrzewnej zgodnie z opisem przedstawionym wcześniej przez Raya i Dittela6.</li>
	<li>Osad komórkowy z płynu z płukania otrzewnej należy resuspender w 1 mL pożywki RPMI uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Całkowitą liczbę komórek w płynie z płukania otrzewnej należy określić za pomocą hemocytometru. Liczbę komórek należy dostosować tak, aby do każdej probówki trafiło 0,2-0,5 miliona komórek. 
	UWAGA: Płyn z płukania otrzewnej u myszy z sepsą może zawierać erytrocyty (RBC), które prawdopodobnie pojawiają się wskutek krwawienia. Należy uważać, aby wykluczyć erytrocyty podczas liczenia komórek otrzewnej. W mikroskopie w świetle przechodzącym erytrocyty wydają się znacznie mniejsze niż komórki układu odpornościowego. Mają one postać płaskich dysków lub pączków, są okrągłe, z wgłębieniem w centrum, ale nie są puste w środku. Można dodać etap lizy erytrocytów7.</li>
	<li>Komórki należy odwirować przy 200 × g w temperaturze 4 °C przez 10 min, odlać nadsącz i wyprać komórki 1x zimnym 1x PBS. Następnie komórki należy odwirować przy 200 × g w temperaturze 4 °C przez 10 min.</li>
	<li>Receptory Fc na PECs należy zablokować za pomocą blokera FcR (rozcieńczenie 1:400), przygotowanego w buforze blokującym składającym się z 5% FBS i 0,02% azotku sodu w PBS. Inkubować na lodzie przez 15 min.</li>
	<li>Komórki należy odwirować przy 200 × g w temperaturze 4 °C przez 10 min. Nadsącz należy odlać. Przeciwciała koniugowane z fluorochromem należy rozcieńczyć w buforze blokującym. Do barwienia neutrofili należy użyć rozcieńczenia 1:500 przeciwciał anti-mouse LY6G. 
	UWAGA: Inne populacje komórek odpornościowych można również wykryć, stosując na przykład anti-mouse B220 dla limfocytów B, anti-mouse CD3 dla limfocytów T oraz anti-mouse F4/80 dla makrofagów.</li>
	<li>Około 0,2 miliona komórek w 200 µL rozcieńczonych roztworów przeciwciał należy inkubować w osobnych probówkach. Jako kontrolę negatywną, dla każdego typu fluorochromu, należy odstawić jedną probówkę jako kontrolę niebarwioną, inkubując komórki w 200 µL buforu blokującego bez przeciwciał.</li>
	<li>Próbki należy inkubować na lodzie przez 45 min, delikatnie mieszając poprzez stukanie co 15 min.</li>
	<li>Komórki należy odwirować przy 200 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Nadsącz należy odlać. Jeśli komórki mają być przechowywane przez kilka dni, należy je utrwalić 4% paraformaldehydem przez około 15 min w temperaturze pokojowej. Zaleca się jednak pozyskanie danych z cytometru przepływowego z nowo zbarwionych próbek.</li>
	<li>Komórki należy resuspender w 200 µL buforu do barwienia FACS (2% FBS w PBS). Następnie należy pozyskać dane za pomocą cytometru przepływowego.</li>
</ol>

<ol><li>Hotchkiss, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+and+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Sepsis and septic shock.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).</li>
<li>Rudd, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regional%2C+and+national+sepsis+incidence+and+mortality%2C+1990-2017%3A+Analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).</li>
<li>Vincent, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+study+of+the+prevalence+and+outcomes+of+infection+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units.</a> JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).</li>
<li>Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+murine+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Infections%22%5BJournal%5D)">Current murine models of sepsis.</a> Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).</li>
<li>Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+and+biohazards%3A+Understanding+biosafety+levels+and+meeting+safety+requirements+of+a+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Biobanking%22%5BJournal%5D)">Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank.</a> Biobanking. 1897, 213-225 (2019).</li>
<li>Ray, A., Dittel, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mouse+Peritoneal+Cavity+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488(2010).</li>
<li>Liu, X., Quan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+isolation+from+mouse+femur+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Immune cell isolation from mouse femur bone marrow.</a> Bio-protocol. 5 (20), 1631(2015).</li>
<li>Yadav, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+2+enhances+the+survival+of+mice+during+Salmonella+Typhimurium+infection-induced+sepsis+by+increasing+reactive+oxygen+species%2C+inflammatory+cytokines+and+recruitment+of+neutrophils+to+the+peritoneal+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity.</a> Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).</li>
<li>Verma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+hemoglobin+is+a+marker+of+systemic+inflammation+in+mouse+models+of+sepsis%3A+A+Raman+spectroscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study.</a> Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).</li>
<li>Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+mouse+peritoneal+macrophages%3A+Heterogeneity%2C+development%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function.</a> Frontiers in Immunology. 6, 225(2015).</li>
<li>Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+pathophysiology+of+sepsis%2C+an+inflammatory+disorder%3A+Key+roles+of+oxidative+and+nitrosative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress.</a> Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W artykule opisano metodę wywoływania ciężkiej postaci sepsy bakteryjnej poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie Salmonella Typhimurium. Ten model jest korzystny w stosunku do innych, ponieważ Salmonella Typhimurium jest patogenem wewnątrzkomórkowym, a zatem wysoce patogennym, naśladującym klinicznie istotny stan sepsy Gram-ujemnej. Wynik sepsy zapalenia otrzewnej w tym modelu jest ogólnoustrojowy, ze 100% śmiertelnością w ciągu 96 godzin po zakażeniu. Dlatego model ten odgrywa zasadniczą rolę w badaniu zapa...

Sepsa jest definiowana jako rozregulowana ogólnoustrojowa reakcja zapalna i immunologiczna na inwazję drobnoustrojów lub uszkodzenie tkanek, prowadząca do uszkodzenia narządu odległego od miejsca infekcji lub uszkodzenia. Wstrząs septyczny jest podgrupą sepsy charakteryzującą się niedociśnieniem utrzymującym się podczas resuscytacji objętościowej, ze znacznie zwiększonym ryzykiem śmiertelności1. Opinia publiczna stała się bardziej świadoma tego zaburzenia podczas pandemii COVID-19. Pomimo wysokiej śmiertelności związanej z sepsą, ze względu na złożoność diagnozy brakuje kompleksowych danych epidemiologicznych na temat globalnego obciążenia sepsą. W 2017 roku na całym świecie odnotowano 48,9 miliona przypadków sepsy i 11 milionów zgonów, co stanowi 19,7% wszystkich zgonów na świecie2. Co więcej, badanie dotyczące przedłużonego występowania infekcji i związanej z nią sepsy u pacjentów oddziału intensywnej terapii wykazało, że 62% pozytywnych izolatów od pacjentów to organizmy Gram-ujemne3.
Początkowo badania nad sepsą koncentrowały się na określeniu patogenezy drobnoustrojów. Jednak zrozumienie "hipotezy niebezpieczeństwa", która dyktuje, w jaki sposób gospodarz odróżnia siebie od nie-siebie, doprowadziło do przechylenia szali badań nad sepsą w kierunku zrozumienia reakcji gospodarza na atakujący patogen. Szeroko stosowane modele sepsy na myszach obejmują model endotoksemii wywołanej lipopolisacharydem (LPS), modele sepsy wielodrobnoustrojowej, podwiązanie i nakłucie jelita ślepego (CLP) i stent ascendens zapalenia otrzewnej jelita grubego (CASP) oraz modele infekcji monobakteryjnych4.
Ustandaryzowaliśmy system modelu mysiego, wywołując sepsę otrzewnową za pomocą Salmonella Typhimurium. Ten model jest korzystny w stosunku do innych, ponieważ Salmonella Typhimurium jest patogenem wewnątrzkomórkowym, który naśladuje klinicznie istotny stan sepsy Gram-ujemnej. Wynik sepsy zapalenia otrzewnej w tym modelu jest ogólnoustrojowy, ze 100% śmiertelnością w ciągu 96 godzin po zakażeniu. Dlatego model ten odgrywa zasadniczą rolę w badaniu zapalnych i śmiertelnych reakcji gospodarza. W tym modelu sepsa jest wywoływana przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,5 miliona jednostek tworzących kolonie (CFU) Salmonella Typhimurium do 8-10-tygodniowej myszy C57BL/6. Zakażenie ogólnoustrojowe można potwierdzić poprzez ocenę obciążenia bakteryjnego narządów ~16 h po zakażeniu. W artykule przedstawiono posocznicę wywołaną przez Salmonella Typhimurium zapalenie otrzewnej u myszy, scharakteryzowano wynikające z tego zmiany w składzie komórek otrzewnej i określono ilościowo obciążenie bakteryjne w różnych narządach.

<table><tbody><tr><td>Materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL Sterylna strzykawka z igłą 26 G</td><td>Beckton Dickinson, Singapur</td><td>303060</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka do mikrowirówek</td><td>Tarsons, USA</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>10 ml sterylna strzykawka z igłą 21 G</td><td>Beckton Dickinson, Hiszpania</td><td>307758</td><td></td></tr><tr><td>50 ml kolba stożkowa</td><td>Tarsons, USA</td><td>441150</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Stopniowa probówka</td> wirówkowa <td>Tarsons, USA</td><td>546041</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Stopniowa probówka wirówkowa</td><td>Tarsons, USA</td><td>546021</td><td></td></tr><tr><td>Rozsiewacz komórek</td><td>VWR, USA</td><td>VWRU60828-680</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>HiMedia, Bombaj, Indie</td><td>TS1006</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>bloker FcR</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FITC Szczur anty-mysi Ly6G (klon 1A8)</td> <td>BD Pharmingen</td><td>551460</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny homogenizator</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>hemocytometr (komora licząca Neubauera)</td> <td>Rohem, Indie</td><td>I.S. 10269</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>HiMedia, Bombaj, Indie</td><td>M1245</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Petriplates</td><td>Tarsons, USA</td><td>460091</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>AT060-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella-Shigella Agar</td><td>HiMedia, Bombaj, Indie</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Kubota</td> Cytometr przepływowy <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD FACSverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>N-biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do ważenia</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka septycznego zapalenia otrzewnej wywołanego przez salmonellę typhimurium u myszy

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

Sepsa to rozregulowana odpowiedź immunologiczna gospodarza na inwazję drobnoustrojów lub uszkodzenie tkanek, prowadząca do uszkodzenia narządów w miejscu odległym od miejsca infekcji lub uszkodzenia. Obecnie szeroko stosowane mysie modele sepsy obejmują endotoksemię wywołaną lipopolisacharydem (LPS), podwiązanie i nakłucie jelita ślepego (CLP) oraz systemy modelowe infekcji monobakteryjnych. Protokół ten opisuje metodę badania odpowiedzi gospodarza podczas septycznego zapalenia otrzewnej wywołanego przez Salmonellę Typhimurium u myszy. S. Typhimurium, Gram-ujemny patogen wewnątrzkomórkowy, powoduje chorobę brzuszną u myszy.
Ten protokół omawia przygotowanie hodowli, indukcję septycznego zapalenia otrzewnej u myszy poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe oraz metody badania ogólnoustrojowych reakcji gospodarza. Ponadto przedstawiono ocenę obciążenia bakteryjnego w różnych narządach oraz analizę metodą cytometrii przepływowej podwyższonej liczby granulocytów obojętnochłonnych w płukaniu otrzewnowym. Salmonella Sepsa wywołana typhimurium u myszy prowadzi do wzrostu cytokin prozapalnych i szybkiego naciekania neutrofili w jamie otrzewnej, co prowadzi do krótszego przeżycia.
Każdy krok w tym protokole został zoptymalizowany, co zaowocowało wysoką powtarzalnością patogenezy septycznego zapalenia otrzewnej. Model ten jest przydatny do badania odpowiedzi immunologicznych podczas sepsy bakteryjnej, roli różnych genów w postępie choroby oraz wpływu leków łagodzących sepsę.

Szczegółowa charakterystyka odpowiedzi immunologicznej gospodarza z wykorzystaniem tego konkretnego modelu została przedstawiona w poprzednich publikacjach8,9. W tej sekcji przedstawiono kilka reprezentatywnych wyników opisanego protokołu. Model ten ma na celu wywołanie systemowej infekcji S. Typhimurium poprzez wstrzyknięcie hodowli bakteryjnej do jamy otrzewnej w celu wywołania sepsy. Aby potwierdzić infekcję, lizaty wątroby i śledziony myszy z sepsą n...

Ten protokół opisuje indukcję monobakteryjnej sepsy Gram-ujemnej w systemie mysim. Model jest przydatny w badaniu zapalnych i śmiertelnych reakcji gospodarza podczas sepsy.

Charakterystyka septycznego zapalenia otrzewnej wywołanego przez Salmonellę Typhimurium u myszy

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection ...

Sepsa to rozregulowana odpowiedź immunologiczna gospodarza na inwazję drobnoustrojów lub uszkodzenie tkanek, prowadząca do uszkodzenia narządów w miejscu odległym od miejsca infekcji lub uszkodzenia. Opinia publiczna stała się bardziej świadoma tego zaburzenia podczas pandemii COVID-19. W 2017 r. na całym świecie odnotowano 48,9 miliona przypadków sepsy i 11 milionów zgonów, co stanowi prawie 20% wszystkich zgonów na świecie.Jak można się spodziewać, większość przypadków ma miejsce w szpitalach. W rzeczywistości badanie wykazało, że prawie 62% pozytywnych izolatów od pacjentów na oddziałach intensywnej terapii z sepsą było organizmami Gram-ujemnymi. Istnieje kilka modeli, a niektóre z powszechnie stosowanych mysich modeli sepsy obejmują endotoksemię wywołaną przez LPS, model podwiązania i nakłucia jelita ślepego oraz systemy modelowe infekcji monobakteryjnych.W naszym laboratorium ustandaryzowaliśmy system modelu mysiego, aby wywołać sepsę otrzewnową za pomocą Salmonella Typhimurium. Ten model jest korzystny w stosunku do innych, ponieważ Salmonella Typhimurium jest patogenem wewnątrzkomórkowym, który naśladuje klinicznie istotny stan posocznicy Gram-ujemnej. Wynik sepsy zapalenia otrzewnej w tym modelu jest ogólnoustrojowy ze 100% śmiertelnością, w ciągu 96 godzin po zakażeniu.Dlatego model ten odgrywa zasadniczą rolę w badaniu odpowiedzi zapalnych gospodarza. W tym modelu sepsa jest wywoływana przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,5 miliona CFU Salmonella Typhimurium u 8-10 tygodniowej myszy C57BL/6. Zakażenie ogólnoustrojowe można potwierdzić, oceniając obciążenie bakteryjne narządów, około 16 godzin po zakażeniu.Eksperymenty z użyciem Salmonella Typhimurium wymagają placówki BSL-2 i przestrzegania wytycznych BSL-2. Należy zachować ostrożność, aby używać odpowiednich środków ochrony osobistej i zapewnić bezpieczeństwo oraz postępować zgodnie ze standardowymi metodami usuwania zagrożeń biologicznych BSL-2. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną ds. zwierząt.Przygotowanie kultury Salmonella Typhimurium. Dodaj sto mikrolitrów bulionu glicerolowego Salmonella Typhimurium NCTC 12023 do 3 ml bulionu LB. Inkubuj kulturę z prędkością 160 obrotów na minutę, w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Rozłóż 50 mikrolitrów wyhodowanej przez noc kultury w bulionie LB na płytkę agarową Salmonella Shigella i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Wybierz pojedynczą kolonię z płytki agarowej SS z prążkami za pomocą mikrokońcówki. Wyrzuć mikrokońcówkę do 3 ml bulionu LB i hoduj przez noc przy 160 obr./min w 37 stopniach Celsjusza.Dodaj 0,1 ml kultury bakteryjnej do 50 ml bulionu LB i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsarką z prędkością 160 obr./min przez trzy do czterech godzin, aby osiągnąć logarytmiczną fazę wzrostu. Rozcieńczyć kulturę dwukrotnie za pomocą bulionu LB. Zmierz gęstość optyczną kultury przy długości fali światła 600 nanometrów w spektrofotometrze.Gdy OD osiągnie jeden, wykonaj dwie porcje po 1 ml kultury w probówkach do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Odwirować probówki o stężeniu 7,750 G przez 15 minut. Odrzucić ten supernatant i przemyć osad dwukrotnie 1 ml 1XPBS.Odwirować probówki o stężeniu 7,750 G przez 15 minut. Ponownie zawiesić granulkę w 0,5 ml 1XPBS, w dwóch różnych probówkach do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Połączyć zawiesiny z obu probówek w jedną probówkę o pojemności 1,5 ml, zawierającą teraz około dwóch pomnożonych przez 10, podniesionych do potęgi ośmiu jednostek tworzących kolonie na ml.Przygotować zawiesinę komórek bakteryjnych o stężeniu 10 potęgi sześć jtk/ml, rozcieńczając roztwór podstawowy. Ważna uwaga, zoptymalizuj CFU odpowiadający OD w swoim laboratorium, aby określić CFU dla OD jeden, przed rozpoczęciem eksperymentów. Myszy i infekcje.W dniu zakażenia przytrzymaj mysz jedną ręką, przetrzyj skórę brzucha 70% etanolem i rozłóż tylne nogi, aby uzyskać lepszy dostęp do ściany brzucha. Wstrzyknąć dootrzewnowo 0,5 ml 10 podniesionych do mocy sześć CFU/ml zawiesiny bakteryjnej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Po zakażeniu należy pobrać posiew, aby sprawdzić rzeczywistą wstrzykniętą jtkówkę, która może wahać się od 0,2 do 0,8 miliona CFU na 0,5 ml.Ocena narządów za pomocą CFU. Mysz została złożona w ofierze za pomocą uduszenia dwutlenkiem węgla. Po złożeniu w ofierze zarażonej myszy przetrzyj brzuch kawałkiem bawełny zamoczonym w 70% etanolu.Rozetnij skórę brzucha. Zapoznaj się z artykułem Raya i Dittle'a, aby zapoznać się z protokołem wideo, w którym dowiesz się, jak pobrać płyn z płukania otrzewnowego. Rozetnij jamę otrzewnej i zbierz interesujący Cię narząd.W tym filmie demonstrujemy wyliczanie narządu CFU z wątroby. Wątroba ulega rozległym uszkodzeniu histopatologicznym, w tym modelu sepsy. Wytnij mały kawałek wątroby i umieść go w probówce do mikrofuge.Można go przechowywać w lodzie przez dwie do trzech godzin, przed przejściem do następnego kroku. Zważ kawałek i przenieś go do probówki do mikrofuge. Najlepiej pokroić kawałki o wadze około 10 do 15 mg, aby zapewnić odpowiednią homogenizację.Dodaj 0,5 ml 1XPBS do probówki i homogenizuj narządy za pomocą homogenizatora ręcznego. Upewnij się, że narządy są całkowicie homogenizowane. Uzupełnić objętość do objętości 1 ml, dodając 0,5 ml 1XPBS.Odwirować probówki o stężeniu 200 G przez pięć minut, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant do świeżych probówek do mikrofuge. Przygotować rozcieńczenia 10 do mocy minus jeden i 10 do mocy minus dwa, na płytce 96-dołkowej.Rozprowadzić 50 mikrolitrów rozcieńczalnika na świeżych płytkach agarowych SS i inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Policz liczbę kolonii, które pojawiają się w każdym stanie, i znormalizuj dane za pomocą masy narządu, korzystając z następującego wzoru. CFU/mg jest równa liczbie kolonii pomnożonej przez 20, pomnożonej przez współczynnik rozcieńczenia, całość podzielonej przez masę narządu w mg.Należy zauważyć, że liczba 20 jest używana we wzorze, aby przeliczyć kolonie na płytkę na CFU / ml. Liczbę tę otrzymuje się, dzieląc 1 ml ilości danej objętości platerowanej kultury. W tym przypadku 50 mikrolitrów.Na przykład, jeśli znajdziesz sto kolonii na płytce agarowej SS, gdzie rozprzestrzenia się 50 mikrolitrów mocy 10 minus jedno rozcieńczenie homogenizowanego narządu o wadze 10 mg, to CFU/mg będzie równe 100 pomnożone przez 20, pomnożone przez 10, całość podzielona przez 10, co jest równe 2000 CFU/mg. Analiza cytometryczna przepływowa różnych populacji komórek odpornościowych w wysięku otrzewnowym. Zbierz komórki otrzewnej zgodnie z wcześniejszym opisem Raya i Dittle'a.Zawiesić osad komórkowy z płynu z płukania otrzewnej w 1 ml RPMI uzupełnionego 10% FBS. Wylicz całkowitą liczbę komórek w płukaniu otrzewnej za pomocą hemocytometru. Dostosuj liczbę ogniw w taki sposób, aby każda lampa otrzymała od dwóch do pięciu pomnożonych przez 10 podniesionych do mocy pięciu ogniw.Wiruj komórki w temperaturze 200 G w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Odrzucić supernatant. Umyj ogniwa raz za pomocą 1XPBS.Odwirować komórki przy sile 200 G przez 10 minut. Zablokuj receptory Fc za pomocą blokera FcR. Jednym z nich jest rozcieńczenie do 400, przygotowane w buforze blokującym, składającym się z 5% FBS i 0,02% azydku sodu w PBS.Inkubować na lodzie przez 15 minut. Odwirować komórki przy sile 200 G przez 10 minut. Odrzucić supernatant.Rozcieńczyć przeciwciała sprzężone z fluorochromem będące przedmiotem zainteresowania w buforze blokującym. Tutaj używamy jednego do 500 rozcieńczeń anty-mysiego Ly6G, aby zabarwić neutrofile. Należy zauważyć, że można również pokazać inne populacje komórek odpornościowych, używając anty-mysiej B220 dla komórek B, anty-mysiego CD3 dla limfocytów T, anty-mysiego F4 / 80 dla makrofagów i tak dalej.Inkubować około 0,2 miliona komórek w 200 mikrolitrach rozcieńczonych roztworów przeciwciał w oddzielnych probówkach. Jako kontrolę ujemną odłożyć po jednej probówce w każdym typie fluorochromu, w celu kontroli niebarwionej. W tej probówce inkubować komórki z 200 mikrolitrami buforu blokującego bez przeciwciała.Próbki należy inkubować na lodzie przez 45 minut, z przerywanym stukaniem co 15 minut. Odwirować komórki w temperaturze 200 G przez 10 minut, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant.Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej, w razie potrzeby do przechowywania przez kilka dni. Ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach buforu barwiącego FACS, 2% FBS w PBS. Uzyskaj dane w cytometrze przepływowym.Pokazane tutaj obrazy płytek agarowych SS wskazują na obciążenie narządów CFU w wątrobie i śledzionie myszy septycznych. Homogenizowany narząd Lys6 rozprowadzono w rozcieńczeniu 10 do potęgi minus jeden i inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kolonie S.Typhimurium o czarnym zabarwieniu pojawiły się po około 12 godzinach od inkubacji.Część płyty jest tutaj pokazana jako powiększona wstawka w celu podkreślenia kolonii. Wyniki te sugerują, że patogen z powodzeniem rozprzestrzenił się ogólnoustrojowo i skolonizował narządy wewnętrzne. Ten rysunek przedstawia surowice wyizolowane od zdrowych i septycznych myszy.Objętość krwi do pobrania od myszy septycznych jest mniejsza niż u zdrowych osób z grupy kontrolnej, więc uzyskana surowica jest mniejsza. Dzieje się tak z powodu zwiększonej krzepliwości w posocznicy. Również surowice od myszy septycznych wykazują wyraźne czerwone zabarwienie, co wskazuje na występowanie rozległej hemolizy.Rysunek przedstawia wykresy cytometryczne komórek otrzewnej od zdrowych i septycznych myszy, wybarwionych przeciwciałem anty-Ly6G. Obrazy te są reprezentatywne dla jednej zdrowej i dwóch zainfekowanych myszy. Myszy septyczne zauważyły zwiększoną infiltrację neutrofili do jamy otrzewnej.W tym filmie pokazaliśmy metodę wywoływania sepsy bakteryjnej u myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie Salmonella Typhimurium. Jest to model przydatny do badania wpływu interwencji terapeutycznych na łagodzenie sepsy. W tym systemie modelowym skład komórkowy jamy otrzewnej zmienia się dramatycznie w celu zwalczania patogenu.Dlatego jest to użyteczny model w badaniu zmian kinetycznych w składzie i funkcjach komórek odpornościowych podczas sepsy. Model jest również przydatny w zrozumieniu wzrostu międzykomórkowych reaktywnych form tlenu, poziomów cytokin prozapalnych, hemolizy i krzepnięcia krwi, z których wszystkie mają miejsce podczas sepsy.

characterizing-salmonella-typhimurium-induced-septic-peritonitis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Utworzenie chronicznego modelu mysiego z infekcją bakteryjną z trwałą kolonizacją jelit przez Salmonella typhimurium przez 27 tygodni.

Model myszy z przewlekłą infekcją Salmonella

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Źródło: Lo, B. C. i in. Przewlekła infekcja salmonellą wywołana włóknieniem jelit. J. Vis. Exp. (2019)Film demonstruje ilościowe określenie obciążenia bakteryjnego w mysiim modelu przewlekłej infekcji streptomycynowooporną Salmonella typhimurium. Po eutanazji i sterylnej sekcji pobierane są tkanki cekalne i śledzionowe, ujednolicane stalowymi kulkami w celu uwalniania bakterii i seryjne rozcieńczane. Rozcieńczenia nakładane są na selektywnym agarze, a widoczne kolonie są liczone w celu...

Ilościowa ilościowa ilość obciążenia bakteryjnego tkanki w modelu myszy przewlekłej infekcji jelit

Zakażenie gryzoniami Citrobacter stanowi cenny model do badania infekcji bakteryjnych jelit, jak również odpowiedzi immunologicznych gospodarza i zapalenia jelita grubego u myszy. Protokół ten określa pomiar integralności bariery, obciążenia patogenem i uszkodzeń histologicznych, co pozwala na dokładne scharakteryzowanie udziału patogenu i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego u myszy.

Mysi model Citrobacter rodentium: badanie udziału patogenów i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego

Opracowano wysokoprzepustowy test in vitro fenotypu Salmonelli lub innych bakterii asocjacyjnych, inwazyjnych i replikacyjnych w komórkach fagocytarnych o wysokiej przepustowości. Metodę wykorzystano do oceny zmutowanych szczepów z nokautem genu Salmonelli pod kątem ich udziału w interakcjach gospodarz-patogen.

Wysokoprzepustowy test na fenotyp Salmonella enterica Typhimurium asocjacji, inwazji i replikacji w makrofagach

Ten protokół dostarcza niezbędnych kroków do ustalenia i oceny sepsy noworodków u 7-dniowych myszy.

Kontrolowany mysi model posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków

Ten protokół opisuje mysi model zwłóknienia jelit wywołanego przez Salmonellę, który przypomina kluczowe patologiczne cechy choroby Leśniowskiego-Crohna, w tym przezścienne zapalenie i zwłóknienie. Metoda ta może być stosowana do oceny czynników gospodarza, które zmieniają wyniki zwłóknienia przy użyciu zmutowanych myszy utrzymywanych na tle genetycznym C57Bl/6.

Przewlekłe zwłóknienie jelit wywołane zakażeniem Salmonellą

System rekombinacji za pośrednictwem λ-czerwieni został użyty do stworzenia mutanta delecji małego niekodującego RNA micC.

Niekodujący mały RNA MicC przyczynia się do zjadliwości białek błony zewnętrznej w Salmonella enteritidis

Salmonella atakuje i replikuje się wewnątrz komórek nabłonka jelitowego zarówno w wakuolach specyficznych dla Salmonelli, jak i w wolnych w cytozolu (hiperreplikacja). Opisano tutaj wysokoprzepustowy protokół oparty na mikroskopii fluorescencyjnej w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowych fenotypów Salmonelli za pomocą dwóch uzupełniających się analiz obrazu za pomocą ImageJ, osiągając rozdzielczość pojedynczej komórki i punktację.

Automatyczna analiza wewnątrzkomórkowych fenotypów salmonelli za pomocą ImageJ

Zapalenie otrzewnej wywołane stentem w okrężnicy wstępującej (Colon Ascendens Stent Peritonitis, CASP) jest wysoce ustandaryzowanym modelem polimikrobowej sepsy brzusznej u gryzoni. Niniejszy artykuł opisuje procedurę chirurgiczną CASP. Model CASP oraz jego warianty umożliwiają systematyczne badanie różnych zagadnień związanych z tematyką sepsy.

Zapalenie otrzewnej wywołane stentem w okrężnicy wstępującej (CASP) – standaryzowany model polimikrobowej sepsy brzusznej

Poznaj metodę indukcji sepsy wywołanej Salmonella Typhimurium u myszy. Model ten umożliwia badanie zapalnych odpowiedzi gospodarza i mechanizmów uszkodzenia narządów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Charakterystyka septycznego zapalenia otrzewnej wywołanego przez Salmonellę Typhimurium u myszy

Przeglądaj więcej filmów