Name: Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Poznaj metodę edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA w badaniach nad rakiem. Technika umożliwia szybkie generowanie linii komórkowych z delecjami mikroRNA, wspierając zrozumienie wzrostu guzów i oporności na leki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Linie komórkowe PC3-ML zostały uprzejmie dostarczone przez Marka Stearna (Drexel University College of Medicine). Justin Toxey pomagał w genotypowaniu PCR. Praca ta była wspierana przez Breedan Adams Foundation Grant, Ryan Translational Research Fund oraz Commonwealth Health Research Board Grant (CHRB-274-11-20) dla AE-K.

<ol><li>Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHasegawa%2C+T+%22Translating+MicroRNAs+to+the+Clinic%22">Translating MicroRNAs to the Clinic</a>. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).</li>
<li>Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLewis%2C+H+%22Systems+Biology+of+Cancer%22">Systems Biology of Cancer</a>. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).</li>
<li>Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncomirs+-+microRNAs+with+a+role+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Oncomirs - microRNAs with a role in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).</li>
<li>Breving, K., Esquela-Kerscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexities+of+microRNA+regulation%3A+mirandering+around+the+rules%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+tools+for+microRNA+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36, Database issue 154-158 (2008).</li>
<li>Kabekkodu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+miRNAs+and+their+role+in+biological+functions+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases.</a> Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).</li>
<li>Xiang, J., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feud+or+friend%3F+The+role+of+the+miR-17-92+cluster+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis.</a> Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).</li>
<li>Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-15a+and+miR-16-1+in+cancer%3A+discovery%2C+function+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives.</a> Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).</li>
<li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+evidence+of+the+miR-888+cluster+as+a+novel+cancer+network+in+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate.</a> Molecular Cancer Research. , (2018).</li>
<li>Lewis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-888+is+an+expressed+prostatic+secretions-derived+microRNA+that+promotes+prostate+cell+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration.</a> Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+prostate+cancer+susceptibility+locus+on+the+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome.</a> Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).</li>
<li>Schleutker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+epidemiological+study+of+hereditary+prostate+cancer+%28HPC%29+in+Finland%3A+frequent+HPCX+linkage+in+families+with+late-onset+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease.</a> Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).</li>
<li>Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+the+HPCX+prostate+cancer+predisposition+locus+in+large+Utah+prostate+cancer+pedigrees%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees.</a> Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).</li>
<li>Brown, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+prostate+cancer+in+African+American+families%3A+linkage+analysis+using+markers+that+map+to+five+candidate+susceptibility+loci%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+Of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci.</a> British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).</li>
<li>Bochum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+the+prostate+cancer+susceptibility+locus+HPCX+in+a+set+of+104+German+prostate+cancer+families%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families.</a> Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA+guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.snapgene.com">https://www.snapgene.com</a> (2022).</li>
<li>Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ensembl.org">https://www.ensembl.org</a> (2022).</li>
<li>Howe, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensembl+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ensembl 2021.</a> Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).</li>
<li>miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mirbase.org">https://www.mirbase.org</a> (2022).</li>
<li>Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer">https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</a> (2022).</li>
<li>Tools for Guide Design and Off-Target Prediction (MIT CRISPR Design Tool from the Zhang Lab). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://crispr.mit.edu">http://crispr.mit.edu</a> (2022).</li>
<li>Sangsu Bae, J. P., Kim, J. -S. Cas-OFFinder (from Sangsu Bae, Jeongbin Park, Jin-Soo Kim). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.rgenome.net/cas-offinder/">http://www.rgenome.net/cas-offinder/</a> (2022).</li>
<li>Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/">https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/</a> (2022).</li>
<li>Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+experimental+and+computational+analyses+of+off-target+editing+by+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases.</a> Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).</li>
<li>Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf">https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf</a> (2022).</li>
<li>Baffoe-Bonnie, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+locus+for+hereditary+prostate+cancer+in+Finland%3A+localization+by+linkage+disequilibrium+of+a+haplotype+in+the+HPCX+region%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region.</a> Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).</li>
<li>Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+an+X-linked+microRNA+cluster+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates.</a> Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).</li>
<li>Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+analysis+of+human+prostatic+adenocarcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines.</a> Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).</li>
<li>Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+high+frequency+of+chromosomal+rearrangements+in+the+centromeric+regions+of+prostate+cancer+cell+lines+by+sequential+giemsa+banding+and+spectral+karyotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping.</a> Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Ta procedura edycji genów CRISPR pozwala badaczowi szybko wygenerować cały panel linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji klastrów miRNA. Transfekcja syntetycznych przewodnikowych RNA składających się z 5' i 3' genomowych crRNA specyficznych dla miejsca wyżarzanych syntetycznym tracrRNA (stosunek molowy 1:1) w tym protokole pozwala uniknąć czasochłonnego subklonowania wektorów plazmidowych i pozwala na bardziej elastyczny i wysokoprzepustowy projekt eksperymentalny przy użyciu formatu 24-dołkowego. Gen...

Potrzebne są lepsze narzędzia badawcze, aby zbadać wpływ niekodujących RNA na choroby ludzkie. Rozregulowanie MiRNA jest często obserwowane w zaburzeniach u ludzi, takich jak rak, porównując profile ekspresji tych małych niekodujących RNA w tkankach i płynach ustrojowych (np. krwi, moczu) pacjentów z rakiem w porównaniu z osobami zdrowymi, nienowotworowymi, z zastosowaniem mikromacierzy, ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) i technologii głębokiego sekwencjonowania nowej generacji1,2. Ostatnie prace scharakteryzowały duży podzbiór tych miRNA jako czynniki supresorowe, onkogenne i przerzutowe, które kontrolują tworzenie się guza, postęp choroby i oporność na leki. Eksperymentalna nadekspresja i/lub regulacja w dół/utrata miRNA powoduje funkcjonalne i plejotropowe konsekwencje w komórce, odzwierciedlając szeroki zakres działań związanych z rakiem, które te niekodujące RNA koordynują - wzrost, apoptoza, różnicowanie, przebudowa chromatyny, angiogeneza, przejścia nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) i MET, metabolizm i odpowiedź immunologiczna3.
MiRNA są kodowane jako pojedyncze geny lub znajdują się w klastrach genomowych, które są transkrybowane w jądrze i intensywnie przetwarzane przed wygenerowaniem biologicznie dojrzałych, jednoniciowych ~22 nukleotydów (nt) gatunków miRNA zlokalizowanych w cytoplazmie4. Te małe RNA wywierają swoje działanie po transkrypcji i działają jako ujemne regulatory genów, które wiążą się z celami informacyjnego RNA (mRNA) w sposób specyficzny dla sekwencji, aby doprowadzić katalityczny kompleks wyciszający indukowany RNA (RISC) do miejsca mRNA, co powoduje degradację mRNA i / lub blok translacji białek. MiRNA są niezwykle liczną klasą niekodujących RNA w układach zwierzęcych, a 2,654 dojrzałe miRNA istnieją w ludzkim genomie (miRBase release 22.1)5. MiRNA zazwyczaj wiążą się z niepełną komplementarnością do swoich celów mRNA4. Dlatego pojedyncze miRNA może regulować dziesiątki do setek różnych celów mRNA i funkcjonalnie wpływać na szeroki zakres szlaków biologicznych. Aby zwiększyć złożoność mechanizmów opartych na miRNA, pojedyncze mRNA może być regulowane przez wiele odrębnych miRNA. W związku z tym trudno jest zbadać, w jaki sposób dysregulacja miRNA zaburza równowagę homeostatyczną organizmu i prowadzi do nowotworu złośliwego u ludzi.
Większość opublikowanych badań skupiała się na pojedynczym miRNA podczas charakteryzowania ich roli w zdarzeniach chorobotwórczych. Jednak ~30% ludzkich genów miRNA jest zorganizowanych w zgrupowane jednostki (zwykle ~10 kilozasad [kb]), które często są transkrybowane w tej samej orientacji i współwyrażane, co wskazuje na skoordynowany i złożony system regulacji niekodującego RNA6. Największym policistronicznym klastrem ludzkich miRNA jest klaster 14q32 składający się z 54 prekursorów miRNA. Jedną z najlepiej przebadanych zgrupowanych jednostek miRNA związanych z nowotworami u ludzi jest policistroniczny klaster miR-17-92 składający się z miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 i miR-92-1 znajdujących się w intronie 3 niekodującego RNA, c13orf25. Klaster miR-17-92 jest często amplifikowany w nowotworach układu krwiotwórczego i nadeksprymowany w guzach litych i ma ustaloną rolę onkogenną w promowaniu progresji cyklu komórkowego, apoptozy i angiogenezy7. Ponadto supresyjny klaster miR-15a i miR-16-1 zlokalizowany w intronie niekodującego genu Leu2 jest często deleczowany w białaczkach i regulowany w dół w dużym zakresie nowotworów, działając w celu blokowania wzrostu guza poprzez celowanie w gen antyapoptotyczny BCL2 i dodatkowe geny progresji cyklu komórkowego8. Klaster miR-888 jest podwyższony u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego o wysokim stopniu złośliwości i składa się z siedmiu genów miRNA (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b i -891a) zlokalizowanych na ludzkim chromosomie Xq27.39,10.
Klaster miR-888 mapuje się w locus HPCX1 (Dziedziczny rak prostaty, X-linked 1) obejmujący Xq27-2, który został zidentyfikowany przez analizę powiązań dziedzicznych rodowodów rodziny raka prostaty11,12,13,14,15,29. Charakterystyka funkcjonalna poszczególnych zgrupowanych członków miR-888 przy użyciu konwencjonalnych narzędzi do błędnej ekspresji miRNA - mimimiki miRNA i inhibitory antysensu - wykazała, że te miRNA odgrywają nakładające się role w regulacji wzrostu i inwazji guza prostaty9,10. Jednak te eksperymentalne metody nie nadają się łatwo do badania, w jaki sposób wiele zgrupowanych członków miR-888 działa synergistycznie lub antagonistycznie w niekodującej sieci RNA w celu kontrolowania homeostazy tkanek i progresji raka. Ten opisany, uproszczony protokół wykorzystujący wysokoprzepustową technologię edycji genów CRISPR jest modyfikowany w celu molekularnej analizy klastrów miRNA związanych z ludzkimi nowotworami (np. klaster miR-888), aby wypełnić tę lukę w wiedzy.
Bakteryjne geny CRISPR i związane z CRISPR (cas) pośredniczą w odporności adaptacyjnej przeciwko bakteriofagom16. Odkrycie tego starożytnego systemu nadzoru prokariotycznego zostało szybko zaadaptowane jako skuteczne narzędzie naukowe do łatwego namierzania dowolnego pożądanego locus genomowego i dokonywania zmian w sekwencji DNA w szerokim zakresie układów zwierzęcych i typów komórek, zarówno in vitro, jak i in vivo16,17. Technika ta jest bardzo obiecująca jako skuteczna metoda badania sieci miRNA w kontekście chorób u ludzi. W tym celu ten wysokoprzepustowy protokół edycji genów CRISPR do badania klastra miR-888 o długości ~ 35 kb na ludzkim chromosomie X w unieśmiertelnionych ludzkich liniach komórkowych raka prostaty (LNCaP, PC3-ML) został skonstruowany w celu zbadania, w jaki sposób członkowie klastra koordynują szlaki progresji raka. Podejście to można zastosować do scharakteryzowania dowolnego klastra miRNA i pozwala badaczom szybko wygenerować ludzkie linie komórkowe przenoszące całą delecję klastra miRNA oraz indywidualne i kombinowane delecje klastrów genów miRNA w ramach jednego eksperymentu.
W tej procedurze tworzone są stabilne linie komórkowe z indukowanym doksycykliną (DOX) systemem ekspresji lentiwirusowej, który umożliwia badaczowi kontrolowanie ekspresji genu Cas9 (csn1) związanego z CRISPR Streptococcus pyogenes za pomocą konstytutywnego promotora indukowanego przez DOX TRE3G. Dwudzielny system Tet-On 3G obejmuje konstytutywny promotor ludzkiego czynnika wydłużenia 1 alfa (hEF1alpha), który napędza transkrypcję zarówno genu Tet-On 3G, jak i genu oporności na blastycydynę (BlastR) jako transkryptu bicystronicznego. Białko transaktywatora Tet-On 3G wiąże się z promotorem TRE3G tylko w obecności DOX, co skutkuje solidną transkrypcją Cas9. W przypadku braku DOX nie ma podstawowej ekspresji Cas9 lub jest ona bardzo minimalna. W związku z tym badacz może indukować wysoką produkcję białka Cas9 w komórkach hodowanych w pożywkach uzupełnionych DOX podczas etapów edycji genu CRISPR i kontroli szybkiego usuwania białka CAS9 po wycofaniu DOX.
Ten protokół opisuje również projekt syntetycznych oligonukleotydów CRISPR RNA (crRNA) ukierunkowanych na regiony flankujące całe skupisko miRNA, poszczególne regiony spinki do włosów miRNA (premiRNA) i/lub podzbiory genów miRNA w klastrze. Każdy zaprojektowany crRNA zawiera unikalną 5'-końcową sekwencję prowadzącą 20 nt (komplementarną do sekwencji genomowej, która ma być celem ataku), po której następuje niezmienna sekwencja powtórzeniowa 22 nt S. pyogenes (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3'), która umożliwia parowanie zasad z uniwersalnymi oligonukleotydami CRISPR RNA (tracrRNA) aktywującymi trans (tracrRNA)18. Razem, wyżarzone crRNA i tracrRNA (mieszany stosunek 1:1) działają jako przewodnik RNA dla tego protokołu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A). W każdym eksperymencie dwa syntetyczne przewodnikowe RNA są transfekowane do komórek indukowanych przez DOX w celu powiązania i eskortowania bakteryjnego białka Cas9 do miejsc genomowego DNA (5' i 3') flankujących region klastra miRNA przeznaczony do usunięcia (<silna klasa = "xfig">Figura 1B).
Sekwencja motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) (5'-NGG-3' dla dzikiego typu S. pyogenes Cas9) musi być obecna w genomie komórki i znajdować się bezpośrednio obok sekwencji DNA 20 nt, na którą wskazuje przewodnik RNA17. Sekwencja PAM służy jako sygnał wiążący i pozycjonuje region katalityczny enzymu endonukleazy Cas9 w docelowym miejscu genomowego DNA, prowadząc następnie do skierowanego, dwuniciowego (ds) rozszczepienia DNA zlokalizowanego ~ 3 nt przed PAM. Maszyneria naprawy DNA komórki naprawia rozszczepione końce DNA, co może skutkować doskonałą ligacją, ale często dochodzi do niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), powodując małe insercje lub delecje (indele) w miejscu naprawy. Ponieważ miRNA są niekodującymi genami, często zlokalizowanymi w regionach międzygenowych i intronowych, indele te niosą ze sobą niskie ryzyko powstania niepożądanych mutacji nonsensownych/missense.
Poprzez zastosowanie syntetycznych oligonukleotydów RNA (wyżarzonych crRNA i tracrRNA, stosunek molowy 1:1) kodujących dla prowadzącego kompleksu RNA w tych eksperymentach, ta strategia nokautu genów pozwala uniknąć czasochłonnego subklonowania wektorów DNA i pozwala na ogromną elastyczność w transfekowaniu unikalnych kombinacji przewodnika RNA do komórek w formacie 24-dołkowym. Przygotowanie surowych lizatów komórkowych do badań przesiewowych genotypu PCR pozwala również uniknąć kosztownych i czasochłonnych metod oczyszczania DNA, umożliwiając jednocześnie usprawnienie generowania linii komórkowych pojedynczej kolonii i analizy fenotypowej. Rzeczywiście, ten wysokoprzepustowy protokół edycji genów CRISPR został z powodzeniem wykorzystany do transfekcji hodowanych linii komórkowych raka prostaty (LNCaP, PC3-ML) z 32 unikalnymi kombinacjami przewodnika RNA w jednym eksperymencie i generowania linii nokautujących niosących delecje dla całego regionu klastra miR-888 o wielkości ~35 kb; mniejsze kombinacje delecji dla członków klastra miR-888 należących do rodzin miR-743 i miR-891a; a także delecje dla poszczególnych członków miRNA w klastrze miR-888. Badania takie jak te dostarczą jaśniejszego zrozumienia, w jaki sposób zgrupowane miRNA działają wspólnie w celu regulacji wzrostu guza, agresywności i oporności na leki, zanim przetłumaczą miRNA na praktykę kliniczną jako narzędzia terapeutyczne i diagnostyczne.

<table><tbody><tr><td>Probówki do PCR 0,2 ml, płaska nakrętka</td><td>Fisher</td><td>14-230-225</td><td>Plastikowe</td></tr><tr><td>probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>Plastikowe naczynia</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkankowych</td><td>Corning Costar</td><td>&nbsp; 09761146</td><td>Plasticware</td></tr><tr><td>5x Phusion HF Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-518L</td><td>odczynnik PCR, genotypowanie</td></tr><tr><td>6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej</td><td>Fisher</td><td>FB012927</td><td>Plasticware</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Falcon</td><td>08-772-2C</td><td>Plasticware</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CRISPR-Cas9 [7A9-3A3], mysi monoklonalny</td><td>odczynnik AbCam</td><td>ab191468</td><td>Western blot; 160 kDa; rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Odczynnik kulturowy Tisuue</td></tr><tr><td>BLAST wyszukiwarka nukleotydów</td><td>National Center for Biotechnology</td><td>Information NA;</td><td>strona internetowa: blast.ncbi.nlm.nih.gov</td></tr><tr><td>Blasticidin S, Chlorowodorek, Streptomyces griseochromogenes</td><td>Calbiochem</td><td>Odczynnik CAS 589205</td><td>CRISPR; Chemiczny, Zapas roboczy = 1 mg/ml w wodzie</td></tr><tr><td>Countess 3 Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>A50298</td><td>Sprzęt; Licznik komórek</td></tr><tr><td>Probówki kriogeniczne</td><td>Thermo Scientific</td><td>50001012</td><td>Plasticware</td></tr><tr><td>Dharmacon CRISPR Design Tool</td><td>Horizon Discovery Ltd.</td><td></td><td>NA Freeware; strona internetowa: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</td></tr><tr><td>DharmaFECT odczynnik do transfekcji siRNA #2</td><td>Dharmacon, Inc.</td><td>T-2002-02</td><td>Odczynnik do transfekcji; Linie komórkowe LNCaP i PC3-ML</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Fisher</td><td>&nbsp; BP231100</td><td>Odczynnik do hodowli Tisuue</td></tr><tr><td>DMEM Medium z L-glutaminą, 4,5 g / L glukozy i pirogronianu sodu</td><td>Odczynnik</td> do hodowli Corning <td>MT10013CV</td><td>Tisuue; Pożywka dla komórek PC3-ML</td></tr><tr><td>Chlorowodorek doksycykliny, Gotowy roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3072-1ML</td><td>odczynnik CRISPR; Chemiczny, zapas roboczy = 1 mg / ml zapas w wodzie</td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Odczynnik do hodowli Gibco</td><td>14190144</td><td>Tisuue</td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 Syntetyczny tracrRNA, 20 nmol, zaprojektowany</td><td>Dharmacon, Inc.</td><td>U-002005-20</td><td>Odczynnik CRISPR; Uniwersalne oligonukleotydy tracrRNA</td></tr><tr><td>Edit-R Zmodyfikowany syntetyczny crRNA, odsolony/odchroniony, 2 nmol</td><td>Dharmacon, Inc.</td><td>odczynnik crRNA-460XXX</td><td>CRISPR; Zaprojektowane oligonukleotydy crRNA</td></tr><tr><td>EditR Indukowalne lentiwirusowe cząstki nukleazy hEF1aBlastCas9, 50 &mu; L, 107 TU/mL</td><td>Dharmacon, Inc.</td><td>VCAS11227</td><td>odczynnik CRISPR; Lenti-iCas9; Indukowany doksycykliną lentiwirusowy system wektorowy Streptococcus pyogenes Cas9</td></tr><tr><td>Ensembl przeglądarka genomiczna</td><td>Ensembl</td><td>NA</td><td>Freeware; strona internetowa: [ensembl.org] Zastosowanie: Przeglądarka genomu do identyfikacji seuqnces nukleotydowych zawierających klaster miRNA i otaczające sekwencje genowe/regulatorowe.</td></tr><tr><td>Przeciwciało GAPDH (FL-335), poliklonalne królika</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc25778</td><td>Odczynnik Western blot; 37 kDa; rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji fragmentów DNA w żelu/PCR</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47010</td><td>Odczynnik do elektroforezy w żelu kwasu nukleinowego</td></tr><tr><td>Gibco Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Odczynnik do hodowli Tisuue</td></tr><tr><td>Bromek heksadimetryny</td><td>MilliporeSigma</td><td>H9268</td><td>Odczynnik CRISPR; Chemiczny, Zapas roboczy = 0,8 mg/ml</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF Membrana</td><td>MilliporeSigma</td><td>IPFL10100</td><td>odczynnik Western blot; bufor blokujący nitrocelulozę</td></tr><tr><td>(TBS)</td><td>LI-COR</td><td>927-60001</td><td>Odczynnik Western blot</td></tr><tr><td>IRDye 680RD Goat anty-mysie przeciwciało wtórne IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-68070</td><td>Odczynnik Western blot</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Kozie przeciwciało anty-IgG IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32211</td><td>Odczynnik Western blot</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; 5425 R</td><td>Plasticware</td></tr><tr><td>miRBase microRNA viewer</td><td>miRBase</td><td>NA</td><td>Freeware; website: [mirbase.org] Zastosowanie: Borowser wymienia wszystkie adnotowane spinki do włosów miRNA, dojrzałe sekwencje miRNA i związane z nimi mapowanie klastrowanych miRNA w obrębie 10 kb.</td></tr><tr><td>NuPAGE 4 do 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini żel białkowy, 10-dołkowy</td><td>odczynnik Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>System obrazowania Odyssey CLx</td> Sprzęt <td>LI-COR</td><td>CLx</td><td>; Obrazowanie Western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM Zredukowana surowica Medium</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System</td><td>Owl</td><td>D2-BP</td><td>Sprzęt; System elektroforezy żelowej z kwasami nukleinowymi</td></tr><tr><td>Startery PCR, zaprojektowane (jednoniciowe oligonukleotydy DNA)</td> <td>Zintegrowany odczynnik do PCR w technologii DNA</td><td>NA</td><td>, genotypowanie</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności Phusion (2 U /&micro; L)</td><td>Odczynnik PCR Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td>, genotypowanie</td></tr><tr><td>RIPA Lysis Buffer 10x</td><td>MiliporeSigma</td><td>20-188</td><td>Western blot odczynnik</td></tr><tr><td>Proteinaza K Roztwór (20 mg / ml),</td> odczynnik <td>Invitrogen</td><td>25530049</td> PCR klasy RNA, <td>genotypowanie</td></tr><tr><td>RNazy, DNazy i wolne od proteazy (10 mg / ml)</td><td>Odczynnik Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td>PCR, genotypowanie</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>MT10041CV</td><td>odczynnik do hodowli Tisuue; Nośniki do komórek LNCaP</td></tr><tr><td>SnapGene Viewer</td><td>Snap Gene</td><td>NA</td><td>Freeware; strona internetowa: [snapgene.com]&nbsp; Zastosowanie: Program do adnotacji sekwencji DNA do tworzenia pliku DNA do projektowania gRNA, który&nbsp; zwraca uwagę na locus klastra miRNA (międzygenowy, introniczny), każdą pojedynczą sekwencję spinki do włosów miRNA należącą do klastra miRNA oraz inne pobliskie geny kodujące i niekodujące i/lub cechy regulatorowe</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1x), bez odczynnika</td> do hodowli barwników <td>Gibco</td><td>12563029</td><td>Tisuue czerwieni fenolowej; Rekombinowana trypsyna</td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>16500100</td><td>Odczynnik do elektroforezy żelu z kwasem nukleinowym</td></tr><tr><td>Veriti 96-well Fast Thermal Cycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4375305</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell Electro-Cell Electrophoresis System</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>Sprzęt; System elektroforezy w żelu białkowym</td></tr></tbody></table>

narzędzie do edycji genów crispr do analizy sieci klastrów mikrorna

CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

MikroRNA (miRNA) okazały się ważnymi regulatorami komórkowymi (supresory nowotworów, czynniki proonkogenne) raka i przerzutów. Większość opublikowanych badań koncentruje się na pojedynczym miRNA podczas charakteryzowania roli małych RNA w raku. Jednak ~30% ludzkich genów miRNA jest zorganizowanych w zgrupowane jednostki, które często ulegają współekspresji, co wskazuje na złożony i skoordynowany system regulacji niekodującego RNA. Dokładniejsze wyjaśnienie, w jaki sposób zgrupowane sieci miRNA działają wspólnie w celu regulacji wzrostu guza, agresywności raka i oporności na leki, jest wymagane przed translacją niekodujących małych RNA do kliniki.
Użycie procedury edycji genów za pośrednictwem CRISPR (ang. high-throughput clustered regularly interspaced short palindromic repeats) zostało wykorzystane do zbadania onkogennej roli genomowego klastra siedmiu genów miRNA zlokalizowanych w locus o długości ~35 000 pz w kontekście raka prostaty. W tym celu ludzkie linie komórkowe raka zostały zakażone wektorem lentiwirusowym dla indukowanej doksycykliną (DOX) nukleazy Cas9 hodowanej w pożywce zawierającej DOKS przez 48 godzin. Komórki zostały następnie poddane jednoczesnej trans aktywującemu CRISPR RNA (tracrRNA) skompleksowanemu z genomowymi oligonukleotydami CRISPR RNA (crRNA), aby umożliwić szybkie generowanie linii komórek rakowych niosących całą delecję klastra miRNA oraz indywidualne lub kombinacje delecji klastrów genów miRNA w ramach jednego eksperymentu.
Zaletą tego wysokoprzepustowego systemu edycji genów jest możliwość uniknięcia czasochłonnego subklonowania wektorów DNA, elastyczność w transfekowaniu komórek unikalnymi kombinacjami przewodników RNA w formacie 24-dołkowym oraz niższe koszty genotypowania PCR przy użyciu surowych lizatów komórkowych. Badania wykorzystujące to uproszczone podejście obiecują odkrycie funkcjonalnych redundancji i synergicznych/antagonistycznych interakcji między członkami klastra miRNA, co pomoże w scharakteryzowaniu złożonych małych niekodujących sieci RNA zaangażowanych w choroby ludzkie i lepiej wpłynie na przyszły projekt terapeutyczny.

Ten wysokoprzepustowy protokół delecji CRISPR został z sukcesem zastosowany poprzez transfekcję indukowalnych Cas9 ludzkich linii komórkowych raka prostaty LNCaP i PC3-ML syntetycznymi oligonukleotydowymi gRNA celującymi w klaster miR-888, które badano w kontekście raka prostaty. Klaster miR-888 został początkowo zidentyfikowany w badaniu profilowania ekspresji jako podwyższony u pacjentów z rakiem prostaty w stadium zaawansowanym (high-grade) w porównaniu do pacjentów w stadium wczesnym (low-grade) oraz osób zdrowych<su...

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...

Protokół ten wykorzystuje wysokoprzepustowy przepływ pracy edycji genów CRISPR do molekularnej analizy genów mikro RNA zorganizowanych i zgrupowanych jednostek. I określenie, w jaki sposób te niekodujące sieci RNA koordynują szlaki progresji raka. Ta procedura edycji genów CRISPR pozwala badaczowi szybko wygenerować cały panel linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji klastrów mikro RNA, unikając jednocześnie czasochłonnego subklonowania wektorów DNA.Metoda ta zapewni lepsze zrozumienie, w jaki sposób zgrupowane mikro RNA działają wspólnie w celu regulacji wzrostu guza, agresywności i oporności na leki przed przeniesieniem mikro RNA do praktyki klinicznej jako narzędzi terapeutycznych i diagnostycznych. Procedurę zademonstruje Grace Yi, asystentka naukowa w moim laboratorium. Aby rozpocząć, utwórz plik DNA zawierający pełną sekwencję genomową interesującego regionu klastra mikro RNA w co najmniej jednym kilobajtach otaczających regionów genomu za pomocą oprogramowania do adnotacji sekwencji DNA.Następnie zaprojektuj cztery unikalne RNA CRISPR dla każdego docelowego locus mikro RNA. Dwa zaprojektowane RNA CRISPR do natychmiastowego celowania w komplementarne sekwencje DNA, pięć pierwszych klastra spinki do włosów z mikro RNA i dwa zaprojektowane RNA CRISPR do natychmiastowego celowania w komplementarne sekwencje DNA, trzy pierwsze z klastra spinki do włosów mikro RNA. Użyj narzędzia do edycji cech w utworzonym pliku DNA, aby oznaczyć docelową sekwencję DNA dla każdego zaprojektowanego RNA CRISPR, które ma zostać zsyntetyzowane.Zaprojektowano i zsyntetyzowano startery PCR flankujące docelowe regiony klastrów mikro RNA do genotypowania linii komórkowych CRISPR. Wykonaj krzywą stężenia doksycykliny na nowo wygenerowanych liniach komórkowych Cas9 indukowanych soczewicą, aby określić optymalne warunki indukcji białka Cas9. Płytka pięć razy 10 czwartych komórek na dołek z każdej sześciodołkowej płytki i rosnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, w preferowanym podłożu przez 24 godziny.Rozcieńczyć dox w preferowanym podłożu z końcową krzywą stężenia dox w zakresie od 0 5100, 150, 250 do 500 nanogramów na mililitr. Oznacz studzienki każdej osadzonej płytki sześciodołkowej od jednego do sześciu. Usunąć pożywkę i zastąpić ją odpowiednimi stężeniami doks.Hoduj płytki od jednego do czterech do 24 godzin, 48 godzin i 72 godzin indukcji dox i 120 godzin po odstawieniu dox. Zbierz dołki na talerzu w każdym punkcie czasowym. Przetwórz granulki komórkowe i bufor ripa w celu izolacji lizatu.Wykonaj analizę western blot z 40 mikrogramami białka, aby zmierzyć indukcję białka Cas9 i określić optymalne stężenie Cas9. Na papierze zmapuj pięć pierwszych i trzy pierwsze kombinacje par RNA CRISPR, które zostaną przetransektowane do każdej studzienki 24-dołkowej płytki ukierunkowanej na cały klaster mikro RNA, różne zgrupowane kombinacje genów mikro RNA, a także poszczególnych członków klastra mikro RNA. Płytkę indukowaną lenti odlewać dziewięciokomórkową linię komórkową pięć razy 10 do czwartej komórki na dołek 24-dołkowej płytki w preferowanym podłożu zawierającym zoptymalizowane stężenie dox.Hoduj komórki przez 24 do 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, aby indukować ekspresję białka Cas9. Transfekować komórki Cas9 indukowane lenti za pomocą przygotowanych pięciu podstawowych i trzech głównych przewodnikowych RNA. Oznacz cztery 1,5-mililitrowe mikroprobówki wirówkowe na docelowe locus mikro RNA.W każdej probówce wymieszaj ze sobą stosunek molowy znacznikowego RNA i unikalnych RNA CRISPR, aby utworzyć dwa mikromolowe prowadzące kompleksy RNA. Dodaj 2,5 mikrolitra znacznikowego RNA, 1,25 mikrolitra pięciu głównych CRISPR RNA, 1,25 mikrolitra trzech głównych CRISPR RNA i pięć mikrolitrów 10-milimolowego buforu tris hcl pH 7,5 do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Mikrowirować przez 30 sekund w temperaturze 16 000 razy G, aby wymieszać.Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Do każdej probówki po 40 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy do 10 mikrolitrów reakcji kompleksu przewodnika RNA. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół.W czystej 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej wymieszaj delikatnie dwa mikrolitry odczynnika do transfekcji i 48 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy, pipetując w górę iw dół. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Do każdej probówki zawierającej 50 mikrolitrów mieszaniny prowadzącego RNA dodać 50 mikrolitrów rozcieńczonego odczynnika do transfekcji.Powoli pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Dodać 400 mikrolitrów pożywki wolnej od antybiotyków uzupełnionej doksycykliną do każdej probówki zawierającej 100 mikrolitrów mieszaniny transfekcji przewodnika RNA.Delikatnie odpipetować, aby wymieszać. Usunąć pożywkę z indukowanych doksycykliną komórek Cas9 indukowanych soczewicą. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki z przewodnikową mieszanką transformacji RNA doksycykliny w oparciu o eksperymentalną mapę 24-dołkową.Inkubuj transfekowane komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Zastąp pożywkę świeżo przygotowaną pożywką bez doksycykliny. Pozwól komórkom zregenerować się przez kolejne 24 do 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Zbierz transfekowane komórki i przygotuj się do genotypowania i urojeń jednokomórkowych. Podziel 150 mikrolitrów zawieszonych komórek na trzy części. Zamrozić jedną trzecią transfekowanych komórek w pożywce plus 10% DMSO w fiolkach kriogenicznych w celu długotrwałego przechowywania.Przenieś jedną trzecią transfekowanych komórek do czystej probówki PCR o pojemności 0,2 mililitra w celu genotypowania. Przygotuj ostatnią jedną trzecią transfekowanych komórek do zliczenia i rozcieńczenia w formacie płytki 96-dołkowej w celu wygenerowania kolonii pojedynczych komórek. Używając 12-kanałowego pipetera wielokanałowego i sterylnego zbiornika na odczynniki, dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonych komórek na studzienkę do dwóch rzędów płytki na każde rozcieńczenie.Odczekaj od czterech do sześciu tygodni, aż komórki osiągną zbieżność w celu ekspansji kolonii pojedynczej komórki. Zbierz około 10 do 15 kolonii pojedynczych komórek do genotypowania. Zidentyfikuj co najmniej trzy niezależne linie kolonii pojedynczych komórek z nokautem dla każdego docelowego locus mikroRNA.Zachowaj pojedyncze linie komórek typu dzikiego jako kontrolki. Zawiesić osad komórkowy w czterech mikrolitrach pięciu polimerazy X DNA, jednym mikrolitrze proteinazy K, jednym mikrolitrze RNazy A i wodzie wolnej od nukleaz do całkowitej objętości 20 mikrolitrów. w termocyklerze należy utrzymywać w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut i w temperaturze 96 stopni Celsjusza przez pięć minut.Przechowuj lizaty komórkowe w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do genotypowania PCR. Przeprowadź reakcję genotypowania PCR przy użyciu zaprojektowanych starterów PCR, które otaczają miejsce docelowe dla prowadzącego RNA, pięciu głównych i trzech głównych miejsc docelowych przewodnika RNA. Uruchom reakcję PCR w termocyklerze za pomocą programu wymienionego w rękopisie tekstowym.Załaduj produkty PCR na 1% żel agarozowy w celu analizy elektroforetycznej. Wyodrębnij DNA z izolowanych fragmentów PCR o przewidywanej wielkości cząsteczki dla genotypów nokautujących. Przygotuj próbki do sekwencjonowania DNA.Sprawdź, czy reakcja CRISPR zakończyła się sukcesem i wykonaj sekwencjonowanie DNA izolowanych fragmentów PCR, aby zidentyfikować miejsce cięcia Cas9 i potwierdzić delecję locus mikroRNA. Zaprojektowano unikalne RNA CRISPR, które celowały w cały 35-kilogramowy region klastra miR-888 o masie 35 kilozasad. Mniejsze kombinacje klastrów w rodzinie miR-743 lub rodzinie miR-891, a także delecje mikro RNA.Analiza reakcji PCR za pomocą elektroforezy żelowej wykazała, że przewidywana wielkość fragmentu DNA reprezentującego genotyp nokautu była amplifikowana dla każdej transfekcji CRISPR. Kolonie pojedynczych komórek genotypowano metodą PCR w zweryfikowanej sekwencji. Sekwencjonowanie DNA tych izolowanych fragmentów PCR z nokautem potwierdziło, że transfekowane pięć głównych i trzech głównych przewodnikowych RNA kierowało ligacją rozszczepienia Cas9 około trzech nukleotydów przed miejscami PAM i potwierdziło utratę genomu docelowego locus mikro RNA.Testy proliferacji WST-1 porównujące komórki nokautujące i dzikie miR-891a potwierdzają, że nadekspresja wektora lentiwirusowego naśladującego mikro RNA indukuje wzrost komórek prostaty i dlatego przewidywano, że utrata miR-891 a wykaże odwrotne skutki. Oprócz starannego projektowania prowadzącego RNA, ważne jest, aby szybko generować pojedyncze kolonie komórek przez każdą linię nokautującą mikro RNA. Jest to szczególnie istotne, jeśli komórki nokautujące mikro RNA mają zmniejszony wzrost żywotności i byłyby łatwo konkurencyjne w populacjach mieszanych z komórkami typu dzikiego.Należy wykonać dodatkowe metody, takie jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, northern blot i sekwencjonowanie RNA, aby potwierdzić, że linie komórkowe nokautujące CRISPR nie wyrażają dojrzałego mikro RNA dla usuniętego locus.

crispr-gene-editing-tool-for-microrna-cluster-network-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Ten protokół opisuje kroki potrzebne do zaprojektowania i przeprowadzenia multipleksowanego celowania wzmacniaczy za pomocą dezaktywującego białka fuzyjnego SID4X-dCas9-KRAB, znanego również jako interferencja wzmacniacza (Enhancer-i). Protokół ten umożliwia identyfikację wzmacniaczy, które regulują ekspresję genów i ułatwia analizę relacji między wzmacniaczami regulującymi wspólny gen docelowy.

Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Tutaj opisujemy narzędzie do edycji genomu oparte na czasowej i warunkowej stabilizacji zgrupowanego, regularnie rozmieszczonego, krótkiego białka 9 (Cas9) związanego z powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) pod małą cząsteczką Shield-1. Metoda może być stosowana w przypadku hodowanych komórek i modeli zwierzęcych.

Nowy zestaw narzędzi do oceny funkcji genów za pomocą warunkowej stabilizacji Cas9

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Skrupulatne i ustrukturyzowane podejście jest stosowane do selekcji odpornych i wrażliwych genów promieniowania poprzez zastosowanie metody przesiewowej CRISPR/Cas9 obejmującej cały genom. Protokół ten ma również potencjał, aby służyć jako wszechstronne ramy dla innych przedsięwzięć badawczych badających mechanizmy oporności na klinicznie podawane leki chemiczne.

Badanie przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom do odkrywania genów radiowrażliwych i odpornych na promieniowanie

Protokół opisuje metody edycji epigenomu opartej na CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) w ludzkich liniach komórkowych przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i nukleofekcji mRNA.

Edycja epigenomu CRISPR w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i dostarczania nukleofekcji mRNA

Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.

Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA

Hodowlane komórki ssaków są szeroko wykorzystywane w badaniach z zakresu biologii komórki. Niniejszy film opisuje podstawowe umiejętności niezbędne do zamrażania i przechowywania komórek oraz sposób regeneracji zamrożonych zapasów.

Mrożenie, rozmrażanie i pakowanie komórek do transportu

Poznaj metodę edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA w badaniach nad rakiem. Technika umożliwia szybkie generowanie linii komórkowych z delecjami mikroRNA, wspierając zrozumienie wzrostu guzów i oporności na leki.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Przeglądaj więcej filmów