Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Protokół ten wykorzystuje wysokoprzepustowy przepływ pracy edycji genów CRISPR do molekularnej analizy genów mikro RNA zorganizowanych i zgrupowanych jednostek. I określenie, w jaki sposób te niekodujące sieci RNA koordynują szlaki progresji raka. Ta procedura edycji genów CRISPR pozwala badaczowi szybko wygenerować cały panel linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji klastrów mikro RNA, unikając jednocześnie czasochłonnego subklonowania wektorów DNA.

Metoda ta zapewni lepsze zrozumienie, w jaki sposób zgrupowane mikro RNA działają wspólnie w celu regulacji wzrostu guza, agresywności i oporności na leki przed przeniesieniem mikro RNA do praktyki klinicznej jako narzędzi terapeutycznych i diagnostycznych. Procedurę zademonstruje Grace Yi, asystentka naukowa w moim laboratorium. Aby rozpocząć, utwórz plik DNA zawierający pełną sekwencję genomową interesującego regionu klastra mikro RNA w co najmniej jednym kilobajtach otaczających regionów genomu za pomocą oprogramowania do adnotacji sekwencji DNA.

Następnie zaprojektuj cztery unikalne RNA CRISPR dla każdego docelowego locus mikro RNA. Dwa zaprojektowane RNA CRISPR do natychmiastowego celowania w komplementarne sekwencje DNA, pięć pierwszych klastra spinki do włosów z mikro RNA i dwa zaprojektowane RNA CRISPR do natychmiastowego celowania w komplementarne sekwencje DNA, trzy pierwsze z klastra spinki do włosów mikro RNA. Użyj narzędzia do edycji cech w utworzonym pliku DNA, aby oznaczyć docelową sekwencję DNA dla każdego zaprojektowanego RNA CRISPR, które ma zostać zsyntetyzowane.

Zaprojektowano i zsyntetyzowano startery PCR flankujące docelowe regiony klastrów mikro RNA do genotypowania linii komórkowych CRISPR. Wykonaj krzywą stężenia doksycykliny na nowo wygenerowanych liniach komórkowych Cas9 indukowanych soczewicą, aby określić optymalne warunki indukcji białka Cas9. Płytka pięć razy 10 czwartych komórek na dołek z każdej sześciodołkowej płytki i rosnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, w preferowanym podłożu przez 24 godziny.

Rozcieńczyć dox w preferowanym podłożu z końcową krzywą stężenia dox w zakresie od 0 5100, 150, 250 do 500 nanogramów na mililitr. Oznacz studzienki każdej osadzonej płytki sześciodołkowej od jednego do sześciu. Usunąć pożywkę i zastąpić ją odpowiednimi stężeniami doks.

Hoduj płytki od jednego do czterech do 24 godzin, 48 godzin i 72 godzin indukcji dox i 120 godzin po odstawieniu dox. Zbierz dołki na talerzu w każdym punkcie czasowym. Przetwórz granulki komórkowe i bufor ripa w celu izolacji lizatu.

Wykonaj analizę western blot z 40 mikrogramami białka, aby zmierzyć indukcję białka Cas9 i określić optymalne stężenie Cas9. Na papierze zmapuj pięć pierwszych i trzy pierwsze kombinacje par RNA CRISPR, które zostaną przetransektowane do każdej studzienki 24-dołkowej płytki ukierunkowanej na cały klaster mikro RNA, różne zgrupowane kombinacje genów mikro RNA, a także poszczególnych członków klastra mikro RNA. Płytkę indukowaną lenti odlewać dziewięciokomórkową linię komórkową pięć razy 10 do czwartej komórki na dołek 24-dołkowej płytki w preferowanym podłożu zawierającym zoptymalizowane stężenie dox.

Hoduj komórki przez 24 do 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, aby indukować ekspresję białka Cas9. Transfekować komórki Cas9 indukowane lenti za pomocą przygotowanych pięciu podstawowych i trzech głównych przewodnikowych RNA. Oznacz cztery 1,5-mililitrowe mikroprobówki wirówkowe na docelowe locus mikro RNA.

W każdej probówce wymieszaj ze sobą stosunek molowy znacznikowego RNA i unikalnych RNA CRISPR, aby utworzyć dwa mikromolowe prowadzące kompleksy RNA. Dodaj 2,5 mikrolitra znacznikowego RNA, 1,25 mikrolitra pięciu głównych CRISPR RNA, 1,25 mikrolitra trzech głównych CRISPR RNA i pięć mikrolitrów 10-milimolowego buforu tris hcl pH 7,5 do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Mikrowirować przez 30 sekund w temperaturze 16 000 razy G, aby wymieszać.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Do każdej probówki po 40 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy do 10 mikrolitrów reakcji kompleksu przewodnika RNA. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół.

W czystej 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej wymieszaj delikatnie dwa mikrolitry odczynnika do transfekcji i 48 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy, pipetując w górę iw dół. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Do każdej probówki zawierającej 50 mikrolitrów mieszaniny prowadzącego RNA dodać 50 mikrolitrów rozcieńczonego odczynnika do transfekcji.

Powoli pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Dodać 400 mikrolitrów pożywki wolnej od antybiotyków uzupełnionej doksycykliną do każdej probówki zawierającej 100 mikrolitrów mieszaniny transfekcji przewodnika RNA.

Delikatnie odpipetować, aby wymieszać. Usunąć pożywkę z indukowanych doksycykliną komórek Cas9 indukowanych soczewicą. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki z przewodnikową mieszanką transformacji RNA doksycykliny w oparciu o eksperymentalną mapę 24-dołkową.

Inkubuj transfekowane komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Zastąp pożywkę świeżo przygotowaną pożywką bez doksycykliny. Pozwól komórkom zregenerować się przez kolejne 24 do 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Zbierz transfekowane komórki i przygotuj się do genotypowania i urojeń jednokomórkowych. Podziel 150 mikrolitrów zawieszonych komórek na trzy części. Zamrozić jedną trzecią transfekowanych komórek w pożywce plus 10% DMSO w fiolkach kriogenicznych w celu długotrwałego przechowywania.

Przenieś jedną trzecią transfekowanych komórek do czystej probówki PCR o pojemności 0,2 mililitra w celu genotypowania. Przygotuj ostatnią jedną trzecią transfekowanych komórek do zliczenia i rozcieńczenia w formacie płytki 96-dołkowej w celu wygenerowania kolonii pojedynczych komórek. Używając 12-kanałowego pipetera wielokanałowego i sterylnego zbiornika na odczynniki, dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonych komórek na studzienkę do dwóch rzędów płytki na każde rozcieńczenie.

Odczekaj od czterech do sześciu tygodni, aż komórki osiągną zbieżność w celu ekspansji kolonii pojedynczej komórki. Zbierz około 10 do 15 kolonii pojedynczych komórek do genotypowania. Zidentyfikuj co najmniej trzy niezależne linie kolonii pojedynczych komórek z nokautem dla każdego docelowego locus mikroRNA.

Zachowaj pojedyncze linie komórek typu dzikiego jako kontrolki. Zawiesić osad komórkowy w czterech mikrolitrach pięciu polimerazy X DNA, jednym mikrolitrze proteinazy K, jednym mikrolitrze RNazy A i wodzie wolnej od nukleaz do całkowitej objętości 20 mikrolitrów. w termocyklerze należy utrzymywać w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut i w temperaturze 96 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Przechowuj lizaty komórkowe w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do genotypowania PCR. Przeprowadź reakcję genotypowania PCR przy użyciu zaprojektowanych starterów PCR, które otaczają miejsce docelowe dla prowadzącego RNA, pięciu głównych i trzech głównych miejsc docelowych przewodnika RNA. Uruchom reakcję PCR w termocyklerze za pomocą programu wymienionego w rękopisie tekstowym.

Załaduj produkty PCR na 1% żel agarozowy w celu analizy elektroforetycznej. Wyodrębnij DNA z izolowanych fragmentów PCR o przewidywanej wielkości cząsteczki dla genotypów nokautujących. Przygotuj próbki do sekwencjonowania DNA.

Sprawdź, czy reakcja CRISPR zakończyła się sukcesem i wykonaj sekwencjonowanie DNA izolowanych fragmentów PCR, aby zidentyfikować miejsce cięcia Cas9 i potwierdzić delecję locus mikroRNA. Zaprojektowano unikalne RNA CRISPR, które celowały w cały 35-kilogramowy region klastra miR-888 o masie 35 kilozasad. Mniejsze kombinacje klastrów w rodzinie miR-743 lub rodzinie miR-891, a także delecje mikro RNA.

Analiza reakcji PCR za pomocą elektroforezy żelowej wykazała, że przewidywana wielkość fragmentu DNA reprezentującego genotyp nokautu była amplifikowana dla każdej transfekcji CRISPR. Kolonie pojedynczych komórek genotypowano metodą PCR w zweryfikowanej sekwencji. Sekwencjonowanie DNA tych izolowanych fragmentów PCR z nokautem potwierdziło, że transfekowane pięć głównych i trzech głównych przewodnikowych RNA kierowało ligacją rozszczepienia Cas9 około trzech nukleotydów przed miejscami PAM i potwierdziło utratę genomu docelowego locus mikro RNA.

Testy proliferacji WST-1 porównujące komórki nokautujące i dzikie miR-891a potwierdzają, że nadekspresja wektora lentiwirusowego naśladującego mikro RNA indukuje wzrost komórek prostaty i dlatego przewidywano, że utrata miR-891 a wykaże odwrotne skutki. Oprócz starannego projektowania prowadzącego RNA, ważne jest, aby szybko generować pojedyncze kolonie komórek przez każdą linię nokautującą mikro RNA. Jest to szczególnie istotne, jeśli komórki nokautujące mikro RNA mają zmniejszony wzrost żywotności i byłyby łatwo konkurencyjne w populacjach mieszanych z komórkami typu dzikiego.

Należy wykonać dodatkowe metody, takie jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, northern blot i sekwencjonowanie RNA, aby potwierdzić, że linie komórkowe nokautujące CRISPR nie wyrażają dojrzałego mikro RNA dla usuniętego locus.