Wizualizacja ruchliwości bakterii na podstawie reakcji kolorystycznej
15 lutego 2022
Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ruchliwości bakterii na podstawie reakcji kolorystycznej. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest łatwa do oceny i dokładniejsza oraz nie wymaga specjalistycznego sprzętu.
Wykrywanie ruchliwości bakterii jest ważne, ponieważ ruchliwość ma kluczowe znaczenie dla patogenności. Opisany tutaj protokół jest niezawodną metodą wykrywania ruchliwości bakterii, ponieważ opiera się na reakcji barwnej TTC z wewnątrzkomórkowymi dehydrogenazami żywych bakterii. Metoda agaru półstałego TTC do wykrywania ruchliwości bakterii jest prosta, łatwa w obsłudze i nie wymaga dużych i drogich instrumentów.
Metoda może być stosowana przez mikrobiologów klinicznych lub badaczy do badania bakterii chorobotwórczych. Procedurę zademonstruje Xiyi Zhuang, starszy eksperymentator z mojego laboratorium. Na początek przygotuj tradycyjną półstałą pożywkę, dodając 10 gramów tryptozy, 15 gramów chlorku sodu i cztery gramy agaru w odpowiedniej objętości wody destylowanej.
Dostosuj pH do 7,2 i uzupełnij końcową objętość do 1 000 mililitrów. Autoklawuj pożywkę w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 20 minut i dozuj pożywkę do 10-mililitrowych probówek na wysokość trzech centymetrów. Aby przygotować pożywkę TTC, schłodź autoklawowane tradycyjne podłoże do 50 stopni Celsjusza, a następnie dodaj pięć mililitrów sterylnego 1% roztworu TTC do 100 mililitrów pożywki.
Wymieszaj i dozuj pożywkę do 10-mililitrowych probówek na wysokość trzech centymetrów. Pobrać pojedyncze kolonie bakterii z płytek agarowych i zaszczepić je w obu półstałych pożywkach przez nakłucie za pomocą igieł do zaszczepiania. Należy pamiętać, aby włączyć szczepy niemodalne jako kontrole ujemne, a szczepy modalne jako kontrole pozytywne.
Aby zaobserwować wpływ stężenia agaru na ruchliwość bakterii, należy przygotować półstałe podłoża zawierające różne stężenia agaru i zaszczepić je przez nakłucie. Inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i obserwować wyniki po 24 do 48 godzinach inkubacji. Jeśli tylko linia nakłucia jest czerwona, scharakteryzuj bakterie jako niemodalne.
Jeśli czerwony kolor rozprzestrzenia się na zewnątrz wzdłuż linii nakłucia, scharakteryzuj bakterie jako modalne. Ruchliwość bakterii porównano dla różnych szczepów na podłożach tradycyjnych i półstałych TTC i podsumowano w tej tabeli. Po 24-godzinnym hodowaniu na półstałym podłożu TTC, Staphylococcus aureus wykazał wzrost wzdłuż zaszczepionej linii.
Natomiast Escherichia coli wykazywała wzrost we wszystkich kierunkach wokół zaszczepionej linii. Największą ruchliwość dla Escherichia coli zaobserwowano w pożywce półstałej TTC przygotowanej z 0,3% agarem, w której pożywka zmieniła kolor na prawie całkowicie czerwony. Natomiast obszar czerwonej dyfuzji zmniejszył się w 0,5% agarze i dyfuzja została przedłużona wraz ze wzrostem stężenia agaru do 0,8%Ważne jest, aby dostosować pH do 7,2 i schłodzić autoklawowane podłoże do 50 stopni Celsjusza przed inokulacją za pomocą igieł.
Bakterie należy zaszczepić przez nakłucie w półstałej pożywce zawierającej TTC. Jest to bezpośrednia metoda wykrywania ruchliwości bakterii. Możliwe jest również pośrednie wykrycie ruchliwości za pomocą mikroskopu elektronicznego i
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia niezawodny protokół wykrywania ruchliwości bakterii, co jest kluczowe dla zrozumienia patogenności. Metoda opiera się na reakcji barwnej TTC z wewnątrzkomórkowymi dehydrogenazami żywych bakterii, oferując prosty i dokładny sposób analizy wymagający minimalnego wyposażenia.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Ruchliwość bakterii i jej znaczenie dla patogenności
- Mikrobiologia kliniczna i metodologie badawcze
- Testy kolorymetryczne w detekcji drobnoustrojów
Wstęp
- Znaczenie ruchliwości bakterii w przebiegu chorób
- Istniejące metody wykrywania ruchliwości i ich ograniczenia
- Potrzeba opracowania niezawodnej i dostępnej metody
Zastosowane metody
- Metoda agaru półpłynnego z TTC
- Różne szczepy bakteryjne, w tym Staphylococcus aureus i Escherichia coli
- Kolorymetryczna ocena ruchliwości
Główne wyniki
- Staphylococcus aureus wykazuje wzrost wzdłuż linii nakłucia, co wskazuje na ograniczoną ruchliwość
- Escherichia coli wykazała rozległy wzrost, co świadczy o większej ruchliwości w podłożu z TTC
- Metoda ta skutecznie różnicuje bakterie ruchliwe i nieruchliwe
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia prostą metodę oceny motywności bakterii, która ma kluczowe znaczenie w badaniach nad patogenami.
- Dostępność tego protokołu sprawia, że jest on wartościowy zarówno w zastosowaniach klinicznych, jak i badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna detekcja ruchliwości bakterii jest niezbędna do zrozumienia mechanizmów patogenności, tworzenia biofilmu oraz oporności na leki we wczesnych etapach poszukiwania nowych środków przeciwinfekcyjnych. Kolorymetryczny test oparty na TTC umożliwia zestandaryzowaną, ilościową ocenę fenotypów ruchliwości, co zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych i minimalizacji ryzyka mechanistycznego. Metoda ta oferuje przystępne i powtarzalne wyniki, które pomagają w selekcji projektów w portfolio oraz w dostosowaniu do poziomu ryzyka dalszych etapów badań i rozwoju w dziedzinie chorób zakaźnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę ruchliwości jako czynnika wirulencji u bakterii patogennych.
- Wspiera biologiczną ocenę ryzyka poprzez rozróżnianie szczepów modalnych i niemodalnych w określonych warunkach.
- Dostarcza ilościowych, powtarzalnych danych fenotypowych do walidacji celów oraz badań mechanistycznych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych testów motylości dla procesów przesiewowych związków chemicznych.
- Zapewnia standaryzowane wyniki kolorymetryczne, które są łatwe do interpretacji i porównania między eksperymentami.
- Umożliwia skalowalne wdrażanie testów przy niskich wymaganiach infrastrukturalnych, zapewniając gotowość do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia fenotypowanie ruchliwości z zachowaniami bakteryjnymi istotnymi dla przebiegu choroby w celu zachowania ciągłości translacyjnej.
- Wspiera decyzje o dalszych etapach badań w oparciu o analizę ryzyka, wiążąc ruchliwość in vitro z potencjalną patogennością in vivo.
- Zapewnia platformę do oceny wpływu zmiennych środowiskowych na fenotypy ruchliwości.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten test motylości oparty na TTC wpisuje się w proces od wczesnego etapu odkrywania do identyfikacji wiodących związków, umożliwiając solidny screening fenotypowy oraz walidację celów dla portfeli leków przeciwinfekcyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących patogennych mechanizmów zależnych od ruchliwości oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych.
- Przesiew: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki kolorymetryczne służące do standaryzacji testów i oceny związków.
- Analityka: Umożliwia bezpośrednie porównanie fenotypów ruchliwości pomiędzy różnymi szczepami i warunkami przy użyciu mierzalnych wzorców dyfuzji.
- Badania translacyjne: Łączy dane o ruchliwości in vitro z zachowaniami bakterii istotnymi dla przebiegu choroby, przy wsparciu modeli pochodnych.
- Zastosowania instytucjonalne: Oferuje wielokrotnego użytku, niskokosztową platformę do oceny ruchliwości różnych gatunków bakterii i programów badawczych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w odkrywaniu leków przeciwinfekcyjnych.
- Wartość operacyjna: dostarcza standaryzowane, powtarzalne i skalowalne testy motylości bez konieczności stosowania specjalistycznej aparatury.
- Wartość strategiczna: usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego ograniczania ryzyka fenotypowego.
- Wpływ na portfolio: wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na leki przeciwinfekcyjne w oparciu o funkcjonalne dane dotyczące motylości.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowej wiedzy z zakresu mikrobiologii w celu przygotowania testu i interpretacji wyników.
- Minimalne wymagania sprzętowe, ograniczone do standardowych inkubatorów i podstawowych materiałów laboratoryjnych.
- Standaryzacja stężenia agaru, pH oraz warunków inkubacji jest kluczowa dla powtarzalności wyników.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych gatunków bakterii i warunków środowiskowych.
- Potencjalne ograniczenia obejmują wrażliwość na warunki wzrostu oraz wymóg zastosowania żywych, metabolicznie aktywnych bakterii.
