Multipleksowe obrazowanie chemiczne oparte na szerokopasmowej mikroskopii rozpraszania Ramana stymulowanego

Nasz protokół opisuje, jak zbudować wymuszoną mikroskopię rozpraszania Ramana, która umożliwia pomiar widma drgań cząsteczek w ciągu mikrosekund. A po zastosowaniu do obrazowania może zapewnić mikroskopię hiperspektralną w celu zlokalizowania i ilościowego określenia składników chemicznych materii w sposób bezznacznikowy i nieinwazyjny. Istnieje kilka zastosowań tego protokołu, głównie w naukach biologicznych i biomedycznych.

Na przykład do obrazowania komórek lub tkanek. Nasze podejście wiąże się z dwoma ważnymi wyzwaniami: szerokopasmowym źródłem optycznym i łańcuchem detekcji. Aby rozwiązać ten pierwszy problem, można zakupić OPR lub zbudować go samodzielnie.

Alternatywnie można wykorzystać superkontinuum światła białego generowane w kryształach masowych lub w światłowodach nieliniowych. Temu ostatniemu wyzwaniu można sprostać, skanując sekwencyjnie każdy składnik widmowy za pomocą komercyjnej fotodiody i skanera galvo Na początek wyekstrahuj dwa mikrolitry z wodnej zawiesiny polimetakrylanu metylu lub mikrogranulek PMMA i wlej zawiesinę na szkiełko nakrywkowe mikroskopu. Następnie wyekstrahuj dwa mikrolitry z wodnej zawiesiny mikrogranulek polistyrenu i połącz je z zawiesiną PMMA na szkiełku nakrywkowym.

Delikatnie wymieszać zawiesinę z końcówką pipety i pozostawić do wyschnięcia na 24 godziny. Biała warstwa koralików pojawi się na wierzchu szkiełka nakrywkowego, gdy woda wyschnie. Dodaj 20 mikrolitrów dimetylosulfotlenku i 20 mikrolitrów czystej oliwy z oliwek na wierzch szkiełka nakrywkowego.

I nałóż lakier do paznokci na krawędzie drugiego szkiełka nakrywkowego mikroskopu. Umieść szkiełko nakrywkowe na mieszance, lakierem do paznokci skierowanym w dół i zastosuj wystarczający nacisk, aby go uszczelnić. Pozostaw do wyschnięcia.

Optymalizacja wydajności modulacji wąskopasmowej wiązki Stokesa. Zmień odległość między soczewkami F1 i F2 i zmierz modulowaną wiązkę za pomocą fotodiody. Następnie zapisz jego profil za pomocą oscyloskopu.

Dostosuj długość wnęki optycznego oscylatora parametrycznego w taki sposób, aby wynikowe widmo pompy szerokopasmowej, wraz z wąskopasmowym pasmem Stokesa przy 1040 nanometrach, mogło wytworzyć rozstrojenie częstotliwości w zakresie od 2 800 do 3 100 centymetrów odwrotnych. Ten zakres widmowy obejmuje drgania obszaru rozciągania CH. Wyślij pompę szerokopasmową do kompresora pryzmatu, aby skompensować efekty dyspersji zawarte w obiektywie mikroskopu wzbudzenia.

Wprowadź pompę do pryzmatu A, przez jej wierzchołek i poprowadź rozproszoną pompę w kierunku wierzchołka pryzmatu B. Określ niezbędną ilość ujemnej dyspersji i odpowiednio ustaw odległość między wierzchołkami pryzmatów. Użyj pryzmatów Brewstera i upewnij się, że polaryzacja belki pompy leży w trójkątnych płaszczyznach pryzmatów. Aby zoptymalizować wbudowany zrównoważony schemat wykrywania, ustaw szybką oś tego dwójłomnego kryształu w pionie i skieruj spolaryzowaną pompę do płytki YV04 o długości 13,3 milimetra.

Następnie za pomocą płytki półfalowej ustaw polaryzację belki pompy na 45 stopni. Połącz pompę i belki Stokesa z lustrem dichroicznym i ostrożnie wyrównaj je z parą fluorescencyjnych otworów. Upewnij się, że obie belki rozchodzą się współliniowo.

Osłabij wiązki i skieruj je na szybką fotodiodę, aby tymczasowo na nie nałożyć. Następnie usuń fotodiodę. Następnie zmierz profile wiązki za pomocą skalibrowanej kamery i użyj karty na podczerwień, aby oszacować średnice na oko.

Użyj dwóch teleskopów. Jeden dla pompy, a drugi dla wiązki Stokesa i spróbuj dopasować średnice wiązki do tylnego otworu obiektywu wzbudzenia. Po uzyskaniu wymuszonego rozpraszania Ramana lub sygnału SRS, użyj teleskopu na wiązce pompy, aby dostosować jego średnicę, zmieniając zakres Rayleigha, a co za tym idzie, objętość oddziaływania w ognisku mikroskopu.

Zatrzymaj się, gdy zostanie osiągnięty maksymalny SRS. Użyj fotodiody, aby zmierzyć intensywność wiązki pompy, a przy czułości fotodiody oblicz średnią moc uderzającą w obszar aktywny detektora. Aby zmierzyć względne natężenie szumu lasera, odłącz filtr dolnoprzepustowy i podłącz wyjście fotodiody o wysokim paśmie do wejścia wzmacniacza lock-in.

Przechowuj wyjście blokady w woltach nad pierwiastkiem kwadratowym z herca przy różnych częstotliwościach demodulacji i wykorzystaj reakcję fotodiod do konwersji woltów na waty. Skieruj pompę i belki Stokesa do mikroskopu. Umieść próbkę i znajdź obszar bez koralików, aby pomóc wyrównać belkę pompy.

Następnie spraw, aby cele wzbudzenia i zbierania były konfokalne. Umieść filtr krótkoprzepustowy, aby usunąć modulowane Stokesy i poprowadź belkę pompy do sortowania. Umieść soczewkę po gradacji, aby skupić rozproszoną wiązkę na detektorach.

W celu zapewnienia zrównoważonej detekcji należy zmierzyć widmo odniesienia i replik sygnałów rozchodzących się wzdłuż wiązki pompy. Umieść małą szczelinę lub tęczówkę między stopniowaniem a rozdzielaczem wiązki polaryzacyjnej, aby zagwarantować dopasowanie widmowe między dwoma układami fotodiod i przefiltrować przestrzennie rozproszoną pompę. Przyciąć wszystkie oprócz jednej składowej widmowej replik pomp, aby wyśrodkować przesyłane promienie na N-tym detektorze matryc fotodiod odniesienia i sygnału.

Za pomocą lusterek kierowniczych można dostosować korelację między różnymi kanałami wykrywania. Aby rozpocząć mikroskopię SRS: moduluj Stokesa, zeskanuj raster próbki i uzyskaj transfer modulacji na widmie pompy z odpowiadającym mu widmem prądu stałego, aby uzyskać znormalizowane widmo SRS z każdego piksela. Utworzyć trójwymiarowe matryce, których wiersze i kolumny zawierają zeskanowane pozycje próbki.

Na każdym wektorze prostopadłym do płaszczyzny XY przechowuj widmo SRS. Wykreślić stężenie i profile widmowe w celu uzyskania obrazów chemicznych i widm charakterystycznych składników chemicznych próbki. Reprezentatywny obraz przedstawia widma szumów o względnym natężeniu źródeł optycznych używanych w tym protokole.

Pokazany tutaj jest najlepszy obszar spektralny dla eksperymentów SRS. Modulacja wiązki Stokesa na dowolnej częstotliwości w tym paśmie gwarantuje, że wpływ szumu laserowego na sygnał SRS będzie najmniejszy z możliwych. Przykładowe dane widm niezrównoważonych i zrównoważonych przedstawiono tutaj.

Efekty zrównoważonej detekcji wpływają na końcowe wyniki eksperymentów. Mianowicie mapy chemiczne. Obrazy złożone w warunkach niezrównoważonych i zrównoważonych są pokazane tutaj.

Reprezentatywne obrazy pokazują chemometryczną analizę hiperspektralnych danych SRS. Przedstawiono tutaj złożony zestaw map stężeń różnych składników chemicznych próbki i ich charakterystycznych widm SRS. Na podstawie tych danych można łatwo zidentyfikować różne składniki próbki, na przykład oliwę z oliwek, polistyren DMSO i populamid metylu.

Obecnie nasza technika może tylko sondować rozciąganie drgań CO. Jednak optymalizując źródło optyczne, ten sam łańcuch detekcji pozwoli nam zbadać bardziej pouczający obszar odcisków palców wykrywający kilka trybów jednocześnie. Nasz łańcuch detekcji toruje drogę do integracji szerokopasmowego SRS w klinikach, wprowadzając technologię, która uzupełni i usprawni tradycyjny przepływ pracy histopatologicznej w diagnostyce tkanek.