Multipleksowe obrazowanie chemiczne oparte na szerokopasmowej mikroskopii rozpraszania Ramana stymulowanego
25 lipca 2022
Przedstawiamy protokół do pozyskiwania obrazów chemicznych za pomocą mikroskopii SRS (ang. broadband stimulated Raman scattering). Opierając się na mikroskopie SRS, który działa z różnicową detekcją wielokanałową typu lock-in, protokół opisuje przygotowanie próbki, regulację aparatury SRS i chemometrię w celu rozplątania różnych składników chemicznie niejednorodnych próbek.
Nasz protokół opisuje, jak zbudować wymuszoną mikroskopię rozpraszania Ramana, która umożliwia pomiar widma drgań cząsteczek w ciągu mikrosekund. A po zastosowaniu do obrazowania może zapewnić mikroskopię hiperspektralną w celu zlokalizowania i ilościowego określenia składników chemicznych materii w sposób bezznacznikowy i nieinwazyjny. Istnieje kilka zastosowań tego protokołu, głównie w naukach biologicznych i biomedycznych.
Na przykład do obrazowania komórek lub tkanek. Nasze podejście wiąże się z dwoma ważnymi wyzwaniami: szerokopasmowym źródłem optycznym i łańcuchem detekcji. Aby rozwiązać ten pierwszy problem, można zakupić OPR lub zbudować go samodzielnie.
Alternatywnie można wykorzystać superkontinuum światła białego generowane w kryształach masowych lub w światłowodach nieliniowych. Temu ostatniemu wyzwaniu można sprostać, skanując sekwencyjnie każdy składnik widmowy za pomocą komercyjnej fotodiody i skanera galvo Na początek wyekstrahuj dwa mikrolitry z wodnej zawiesiny polimetakrylanu metylu lub mikrogranulek PMMA i wlej zawiesinę na szkiełko nakrywkowe mikroskopu. Następnie wyekstrahuj dwa mikrolitry z wodnej zawiesiny mikrogranulek polistyrenu i połącz je z zawiesiną PMMA na szkiełku nakrywkowym.
Delikatnie wymieszać zawiesinę z końcówką pipety i pozostawić do wyschnięcia na 24 godziny. Biała warstwa koralików pojawi się na wierzchu szkiełka nakrywkowego, gdy woda wyschnie. Dodaj 20 mikrolitrów dimetylosulfotlenku i 20 mikrolitrów czystej oliwy z oliwek na wierzch szkiełka nakrywkowego.
I nałóż lakier do paznokci na krawędzie drugiego szkiełka nakrywkowego mikroskopu. Umieść szkiełko nakrywkowe na mieszance, lakierem do paznokci skierowanym w dół i zastosuj wystarczający nacisk, aby go uszczelnić. Pozostaw do wyschnięcia.
Optymalizacja wydajności modulacji wąskopasmowej wiązki Stokesa. Zmień odległość między soczewkami F1 i F2 i zmierz modulowaną wiązkę za pomocą fotodiody. Następnie zapisz jego profil za pomocą oscyloskopu.
Dostosuj długość wnęki optycznego oscylatora parametrycznego w taki sposób, aby wynikowe widmo pompy szerokopasmowej, wraz z wąskopasmowym pasmem Stokesa przy 1040 nanometrach, mogło wytworzyć rozstrojenie częstotliwości w zakresie od 2 800 do 3 100 centymetrów odwrotnych. Ten zakres widmowy obejmuje drgania obszaru rozciągania CH. Wyślij pompę szerokopasmową do kompresora pryzmatu, aby skompensować efekty dyspersji zawarte w obiektywie mikroskopu wzbudzenia.
Wprowadź pompę do pryzmatu A, przez jej wierzchołek i poprowadź rozproszoną pompę w kierunku wierzchołka pryzmatu B. Określ niezbędną ilość ujemnej dyspersji i odpowiednio ustaw odległość między wierzchołkami pryzmatów. Użyj pryzmatów Brewstera i upewnij się, że polaryzacja belki pompy leży w trójkątnych płaszczyznach pryzmatów. Aby zoptymalizować wbudowany zrównoważony schemat wykrywania, ustaw szybką oś tego dwójłomnego kryształu w pionie i skieruj spolaryzowaną pompę do płytki YV04 o długości 13,3 milimetra.
Następnie za pomocą płytki półfalowej ustaw polaryzację belki pompy na 45 stopni. Połącz pompę i belki Stokesa z lustrem dichroicznym i ostrożnie wyrównaj je z parą fluorescencyjnych otworów. Upewnij się, że obie belki rozchodzą się współliniowo.
Osłabij wiązki i skieruj je na szybką fotodiodę, aby tymczasowo na nie nałożyć. Następnie usuń fotodiodę. Następnie zmierz profile wiązki za pomocą skalibrowanej kamery i użyj karty na podczerwień, aby oszacować średnice na oko.
Użyj dwóch teleskopów. Jeden dla pompy, a drugi dla wiązki Stokesa i spróbuj dopasować średnice wiązki do tylnego otworu obiektywu wzbudzenia. Po uzyskaniu wymuszonego rozpraszania Ramana lub sygnału SRS, użyj teleskopu na wiązce pompy, aby dostosować jego średnicę, zmieniając zakres Rayleigha, a co za tym idzie, objętość oddziaływania w ognisku mikroskopu.
Zatrzymaj się, gdy zostanie osiągnięty maksymalny SRS. Użyj fotodiody, aby zmierzyć intensywność wiązki pompy, a przy czułości fotodiody oblicz średnią moc uderzającą w obszar aktywny detektora. Aby zmierzyć względne natężenie szumu lasera, odłącz filtr dolnoprzepustowy i podłącz wyjście fotodiody o wysokim paśmie do wejścia wzmacniacza lock-in.
Przechowuj wyjście blokady w woltach nad pierwiastkiem kwadratowym z herca przy różnych częstotliwościach demodulacji i wykorzystaj reakcję fotodiod do konwersji woltów na waty. Skieruj pompę i belki Stokesa do mikroskopu. Umieść próbkę i znajdź obszar bez koralików, aby pomóc wyrównać belkę pompy.
Następnie spraw, aby cele wzbudzenia i zbierania były konfokalne. Umieść filtr krótkoprzepustowy, aby usunąć modulowane Stokesy i poprowadź belkę pompy do sortowania. Umieść soczewkę po gradacji, aby skupić rozproszoną wiązkę na detektorach.
W celu zapewnienia zrównoważonej detekcji należy zmierzyć widmo odniesienia i replik sygnałów rozchodzących się wzdłuż wiązki pompy. Umieść małą szczelinę lub tęczówkę między stopniowaniem a rozdzielaczem wiązki polaryzacyjnej, aby zagwarantować dopasowanie widmowe między dwoma układami fotodiod i przefiltrować przestrzennie rozproszoną pompę. Przyciąć wszystkie oprócz jednej składowej widmowej replik pomp, aby wyśrodkować przesyłane promienie na N-tym detektorze matryc fotodiod odniesienia i sygnału.
Za pomocą lusterek kierowniczych można dostosować korelację między różnymi kanałami wykrywania. Aby rozpocząć mikroskopię SRS: moduluj Stokesa, zeskanuj raster próbki i uzyskaj transfer modulacji na widmie pompy z odpowiadającym mu widmem prądu stałego, aby uzyskać znormalizowane widmo SRS z każdego piksela. Utworzyć trójwymiarowe matryce, których wiersze i kolumny zawierają zeskanowane pozycje próbki.
Na każdym wektorze prostopadłym do płaszczyzny XY przechowuj widmo SRS. Wykreślić stężenie i profile widmowe w celu uzyskania obrazów chemicznych i widm charakterystycznych składników chemicznych próbki. Reprezentatywny obraz przedstawia widma szumów o względnym natężeniu źródeł optycznych używanych w tym protokole.
Pokazany tutaj jest najlepszy obszar spektralny dla eksperymentów SRS. Modulacja wiązki Stokesa na dowolnej częstotliwości w tym paśmie gwarantuje, że wpływ szumu laserowego na sygnał SRS będzie najmniejszy z możliwych. Przykładowe dane widm niezrównoważonych i zrównoważonych przedstawiono tutaj.
Efekty zrównoważonej detekcji wpływają na końcowe wyniki eksperymentów. Mianowicie mapy chemiczne. Obrazy złożone w warunkach niezrównoważonych i zrównoważonych są pokazane tutaj.
Reprezentatywne obrazy pokazują chemometryczną analizę hiperspektralnych danych SRS. Przedstawiono tutaj złożony zestaw map stężeń różnych składników chemicznych próbki i ich charakterystycznych widm SRS. Na podstawie tych danych można łatwo zidentyfikować różne składniki próbki, na przykład oliwę z oliwek, polistyren DMSO i populamid metylu.
Obecnie nasza technika może tylko sondować rozciąganie drgań CO. Jednak optymalizując źródło optyczne, ten sam łańcuch detekcji pozwoli nam zbadać bardziej pouczający obszar odcisków palców wykrywający kilka trybów jednocześnie. Nasz łańcuch detekcji toruje drogę do integracji szerokopasmowego SRS w klinikach, wprowadzając technologię, która uzupełni i usprawni tradycyjny przepływ pracy histopatologicznej w diagnostyce tkanek.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół obrazowania chemicznego z wykorzystaniem szerokopasmowej mikroskopii stymulowanego rozpraszania Ramanowskiego (SRS). Metoda ta umożliwia bezmarkerowe i nieinwazyjne obrazowanie składników chemicznych w próbkach biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Techniki mikroskopowe
Wstęp
- Mikroskopia z wykorzystaniem stymulowanego rozpraszania Ramanowskiego umożliwia szybki pomiar widm wibracyjnych.
- Znajduje ona zastosowanie w obrazowaniu komórek i tkanek.
- Protokół odnosi się do wyzwań związanych z szerokopasmowymi źródłami optycznymi oraz łańcuchami detekcji.
- Przygotowanie próbek obejmuje wykorzystanie mikrokulek z PMMA i polistyrenu.
Cel badania
- W celu przedstawienia szczegółowego protokołu mikroskopii SRS.
- W celu umożliwienia lokalizacji i kwantyfikacji składników chemicznych.
- W celu udoskonalenia technik obrazowania w naukach biologicznych i biomedycznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek z wykorzystaniem mikrokulek PMMA i polistyrenu.
- Regulacja komponentów optycznych w celu optymalnej detekcji sygnału SRS.
- Użycie fotodiody i oscyloskopu do profilowania wiązki.
- Skanowanie rastrowe próbek w celu pozyskania widm SRS.
Główne wyniki
- Skuteczne pozyskanie obrazów chemicznych z próbek.
- Wykazanie efektywności protokołu mikroskopii SRS.
- Identyfikacja składników chemicznych na podstawie profili widmowych.
- Optymalizacja metod detekcji w celu poprawy jakości obrazowania.
Wnioski
- Protokół mikroskopii SRS jest skuteczny w obrazowaniu chemicznym.
- Zapewnia on nieinwazyjną metodę analizy próbek biologicznych.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć różne dziedziny badawcze.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szerokopasmowa mikroskopia stymulowanego rozproszenia Ramanowskiego (SRS) umożliwia szybie analityczne obrazowanie chemiczne bez użycia znaczników z rozdzielczością hiperspektralną, co bezpośrednio wspiera wczesne etapy odkrywania leków oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach i rozwoju (R&D) w sektorze biofarmaceutycznym. Dzięki pozyskiwaniu pełnych widm wibracyjnych dla każdego piksela, podejście to zwiększa specyficzność chemiczną oraz precyzję analizy ilościowej złożonych próbek biologicznych. Jego integracja z procesami badawczymi zwiększa pewność prognostyczną i pozwala na efektywną selekcję projektów w portfolio w kluczowych punktach decyzyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach biofarmaceutycznych&D
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę składu molekularnego w komórkach i tkankach na potrzeby badań opartych na hipotezach.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez mapowanie i kwantyfikację składników chemicznych bez użycia znaczników.
- Usprawnia minimalizację ryzyka mechanistycznego dzięki dostarczeniu multipleksowych informacji chemicznych o wysokiej rozdzielczości przestrzennej.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie oddziaływania na cele i analizy szlaków.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje walidowane, bezetykietowe systemy biologiczne do późniejszych etapów procesów screeningu.
- Dostarcza powtarzalne, ilościowe dane hiperspektralne do standaryzacji testów.
- Umożliwia wysokoprzepustową, multipleksową ocenę związków poprzez jednoczesne rejestrowanie wielu sygnatur chemicznych.
- Wspiera skalowalność platformy i możliwość jej ponownego wykorzystania w różnych typach próbek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie wyników obrazowania chemicznego do odkrywania biomarkerów istotnych dla choroby w przypadku zastosowania w próbkach tkanek.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki umożliwieniu ilościowej, nieinwazyjnej analizy.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez wsparcie rzetelnej charakterystyki chemicznej modeli przedklinicznych.
- Poprawia predykcyjne ograniczanie ryzyka w procesach decyzyjnych dotyczących rozwoju kandydatów na leki.
Integracja potoków i przepływów pracy
Szerokopasmowa mikroskopia SRS wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do identyfikacji wiodących związków, zapewniając wielokrotnego użytku możliwości analityczne w zakresie mapowania chemicznego i ilościowego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez multipleksowe obrazowanie chemiczne.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki w celu oceny gotowości testów i ewaluacji związków.
- Analityka: Zapewnia pomiary hiperspektralne i analizę chemometryczną dla wiarygodnego porównania warunków próbek.
- Badania translacyjne: Umożliwia dopasowanie do strategii biomarkerów i walidację modeli przedklinicznych w przypadku zastosowania w odpowiednich tkankach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako skalowalna platforma obrazowania bez znakowania, którą można dostosować do wielu programów B&R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w obrazowaniu chemicznym.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy dzięki powtarzalnej, wysokoprzepustowej analizie bez znakowania.
- Wartość strategiczna: Ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez dostarczanie rzetelnych danych chemicznych na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów badawczych i przedklinicznych.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu optyki nieliniowej, spektroskopii oraz chemometrycznej analizy danych.
- Wymagane jest specjalistyczne oprzyrządowanie, w tym szerokopasmowe źródła optyczne oraz wielokanałowe systemy detekcji.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie przygotowania próbek i interpretacji danych.
- Adaptacja do różnych modeli biologicznych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Obecny zakres widmowy może być ograniczony; rozszerzenie go o obszary „odcisków palców” (fingerprint regions) zależy od optymalizacji źródła optycznego.
FAQ dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:17
Sample Preparation
2:22
Optimizing Pump and Stokes Beams
5:54
Setting Up the Spectral Detection for SRS Imaging
7:07
Chemometrics of Hyperspectral SRS Data
7:54
Results: RIN Spectra and the Effect of Balanced Detection
9:15
Conclusion
