Name: Wykrywanie i oznaczanie ilościowe komórek zatrzymujących znaczniki w siekaczach myszy przy użyciu podejścia do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji i ilościowego oznaczania komórek zatrzymujących znaczniki w niszy komórek macierzystych siekacza myszy przy użyciu rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu tkanek PEGASOS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Meghann K. Holt za redakcję rękopisu. Badanie to było wspierane przez granty NIH/NIDCR DE026461 i DE028345 oraz finansowanie start-upu z Texas A&M School of Dentistry dla dr Xiaofang Wang.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dla Texas A&M University College of Dentistry.
1. Przygotowanie koktajlu etykietującego EdU
<ol>
	<li>Przygotować roztwory bulionu koktajlowego zgodnie z opisem w Tabeli 1.</li>
	<li>Przygotuj koktajl z etykietą EdU zgodnie z opisem w Tabeli 1.</li>
</ol>
2. Przygotowanie myszy i roztworu EdU
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór EdU. Rozpuścić EdU w DMSO w stężeniu 20 mg/ml i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: EdU jest mutagenem. Użytkownicy powinni nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) podczas obchodzenia się z tą substancją.</li>
	<li>Wstrzyknąć 5-dniowym myszom C57BL/6J przygotowany roztwór EdU dootrzewnowo w stężeniu 3 μl/g masy ciała. Myszy muszą otrzymywać roztwór raz dziennie przez 7 kolejnych dni. Następnie przechodzą okres pościgu przez 6 tygodni, zanim zostaną zebrane do analizy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Należy uważać, aby uniknąć ukłucia igły podczas wstrzykiwania EdU myszom. Po wstrzyknięciu EdU przez 7 kolejnych dni umieść myszy w nowej klatce. Po tym, jak myszy znajdą się w nowym domu, wyrzuć ściółkę do starej klatki, stosując odpowiednie zasady dotyczące zagrożenia biologicznego.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki przez perfuzję przezsercową (53-dniowe myszy po urodzeniu po 6-tygodniowym okresie pościgu)
UWAGA: Wątroba myszy powinna zblednąć po udanej perfuzji przezsercowej.
<ol>
	<li>Znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym. Należy im podać kombinację ksylazyny i środków znieczulających ketaminą (ksylazyna 10-12,5 mg/kg; Ketamina, 80-100 mg/kg masy ciała).</li>
	<li>Odczekaj ~10 minut, aż mysz przestanie reagować na bolesne bodźce (takie jak odruch szczypania łapy).</li>
	<li>Umieść myszy w pozycji leżącej stabilizowanej na styropianowym podłożu za pomocą igieł w każdej łapie.</li>
	<li>Odsłoń klatkę piersiową, otwierając leżącą nad nią skórę za pomocą pęsety i nożyczek preparujących.</li>
	<li>Rozetnij membranę ostrymi nożyczkami. Uważaj, aby nie przebić serca.</li>
	<li>Przeciąć klatkę piersiową, chwytając podstawę mostka nożyczkami zaciskowymi, aby odsłonić serce.</li>
	<li>Przenieś mysz do etapu perfuzji w pobliżu pompy cyrkulacyjnej w okapie wyciągowym.</li>
	<li>Wprowadzić igłę 25 G (z rurki wypełnionej roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)/4% roztworem paraformaldehydu (PFA)) do wierzchołka lewej komory. Uważaj, aby końcówka igły znajdowała się w świetle komory. 
	UWAGA: PFA jest umiarkowanie toksyczny i prawdopodobnie rakotwórczy. Używaj środków ochrony osobistej do obchodzenia się z PFA i przygotuj roztwór pod wyciągiem chemicznym. Odpady PFA wymagają odpowiedniej utylizacji zgodnie z wytycznymi instytucji.</li>
	<li>Przeciąć prawą komorę ostrymi nożyczkami natychmiast po wprowadzeniu igły do lewej komory. Ten krok pozwala na wypłynięcie krwi z myszy i spływanie do naczynia zbiorczego.</li>
	<li>Próbki należy przeprowadzić perfuzję w 50 ml roztworu PBS przy natężeniu przepływu 7 ml/min.</li>
	<li>Po perfuzji PBS przełączyć zawór odcinający, aby umożliwić przepływ 20 ml 4% roztworu PFA przy tym samym natężeniu przepływu 5 ml/min.</li>
	<li>Gdy pompa cyrkulacyjna jest nadal włączona, wyjmij igłę z lewej komory. 
	UWAGA: Mysz jest teraz ustawiona na pozycję do pobierania tkanek. Aby zachować fluorescencję, należy unikać ekspozycji na światło, gdy tylko jest to możliwe przez cały czas trwania protokołu. Podczas przetwarzania tkanki stożkowa probówka o pojemności 50 ml z próbkami tkanek może być pokryta folią aluminiową.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie tkanki żuchwy za pomocą techniki PEGASOS
UWAGA: Stożkowa probówka o pojemności 15 ml lub 50 ml w zależności od objętości tkanek może być użyta do utrzymania próbek w gotowości do leczenia na każdym etapie. Próbki są przetwarzane w wytrząsarkach o temperaturze 37 °C (~100 obr./min) od stopni 4.2 do 4.7. Używaj plastikowych pojemników na bazie polipropylenu, które są odporne na rozpuszczalniki organiczne, aby uniknąć stopienia plastiku. Alternatywnie można użyć szkła.
UWAGA: Technika oczyszczania tkanek PEGASOS wykorzystuje toksyczne roztwory, takie jak Quadrol, glikol polietylenowy (PEG), benzoesan benzylu (BB), MMA500, itp. Wymagane są odpowiednie środki ochrony osobistej, aby uniknąć potencjalnego narażenia.
<ol>
	<li>Wypreparuj żuchwy i następnie utrwal próbki w 4% PFA. Przechowuj je w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
	<li>Usuń mięśnie z żuchwy i zanurz je w 0,5 M roztworze EDTA (pH 8,0) w celu odwapnienia na 4 dni. W tym czasie należy codziennie wymieniać pożywkę w wytrząsarce o temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Pożądane jest usunięcie mięśni z próbki w jak największym stopniu. Ten środek ostrożności uprości proces obrazowania i zmniejszy autofluorescencję mięśni</li>.
	<li>Odbarwić żuchwy 25% roztworem Quadrol (v/v w H2O) na wytrząsarce o temperaturze 37 °C przez jeden dzień w celu usunięcia pozostałego hemu krwi.</li>
	<li>Kompletne barwienie EdU całego mocowania.
	<ol>
		<li>Przygotuj świeży koktajl z etykietą EdU zgodnie z tabelą 1. 
		UWAGA: Koktajl do etykietowania EdU musi być za każdym razem świeży z dodatkiem świeżo przygotowanego roztworu askorbinianu w celu uzyskania optymalnych wyników etykietowania EdU.</li>
		<li>Płukać żuchwy PBST przez 30 minut na wytrząsarce o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Opłucz żuchwy PBS trzy razy przez 3 minuty za każdym razem.</li>
		<li>Inkubuj żuchwy w świeżo przygotowanym koktajlu z etykietą EdU na shakerze o temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Opłucz żuchwy PBS trzy razy przez 3 minuty za każdym razem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić seryjne odlipidanie w każdym z poniższych roztworów przez 6 godzin w temperaturze 37 °C: 
	30% roztwór tert-butanolu (tB): 75% v/vH2O, 22% v/v tB i 3% v/v Quadrol. 
	Roztwór 50% tB: 50% v/v H2O, 47% v/v tB i 3% v/v Quadrol. 
	70% tB roztwór: 30% v/v H2O, 67% v/v tB i 3% v/v Quadrol 
	UWAGA: Etap delipidacji ma kluczowe znaczenie. Delipidację można przeprowadzić przez 4-6 godzin w roztworze o stężeniu 30% i 50% tB oraz przez 1 dzień w roztworze o stężeniu 70% tB.</li>
	<li>Odwodnić żuchwy w roztworze tB-PEG przez 2 dni z następującą dzienną zmianą podłoża: 75% tB, 22% v/v metakrylanu eteru metylowego glikolu polietylenowego średnia MMA500 i 3% v/v Quadrol w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Oczyść żuchwę w podłożu oczyszczającym benzoesan benzylu (BB)-PEG, aby uzyskać dopasowanie współczynnika załamania: 75% v/v BB, 22% v/v PEG-MMA500 i 3% Quadrol aż do uzyskania przezroczystości. 
	UWAGA: Mamy informacje na temat dopasowania współczynnika załamania światła. Składniki nieorganiczne i organiczne w tkankach, takie jak woda, lipidy, białka, minerały, organelle itp., Mają różny współczynnik załamania światła (RI) w zakresie od 1,33 do 1,55. To niedopasowanie RI między składnikami tkanki utrudnia proces obrazowania. Przezroczystość można osiągnąć poprzez wyeliminowanie niedopasowania RI w tkance. Zaleca się zanurzenie próbek oczyszczonych tkankowo w podłożu czyszczącym BB-PEG. Ten krok zapewni jednolite wewnętrzne RI wynoszące ~1,54 (zwane dopasowaniem RI) dla całej próbki, ułatwiając proces obrazowania.</li>
	<li>Zachowaj żuchwy w pożywce do oczyszczania tkanek BB-PEG w temperaturze pokojowej do przechowywania i obrazowania. 
	UWAGA: Dobrze jest zakończyć obrazowanie tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć stopniowej utraty reporterów fluorescencyjnych. Jednak metoda PEGASOS pozwoli utrzymać reportery fluorescencji w dobrym stanie nawet po kilku tygodniach przechowywania20,21. W przypadku długotrwałego przechowywania próbki można również przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
5. Konfokalne obrazowanie żuchwy oczyszczonej z tkanek
<ol>
	<li>Zamontuj oczyszczoną tkankę całą żuchwę na markowych szkiełkach w podłożu czyszczącym BB-PEG i przykryj szkiełkami szklanymi. Unikaj pęcherzyków.</li>
	<li>Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą odpowiedniego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Wybierz opcję Acquire (Akwizycja) i ustaw parametry akwizycji obrazu na rozdzielczość 512 x 512 pikseli i szybkość akwizycji 400 Hz. Ustawienia te znajdują się w menu trybu akwizycji oprogramowania sterującego mikroskopem.</li>
	<li>W panelu do wzbudzenia fluorescencyjnego aktywuj wymagany laser (TRITC) do optymalnego wzbudzenia fluoroforów (sonda, której użyliśmy do wizualizacji LRC, ma właściwości fluorescencyjne, takie jak Cy3 ze wzbudzeniem przy 548 nm i emisją przy 563 nm długości fali lasera).</li>
	<li>W panelu wykrywania fluorescencyjnego przesuń suwak, aby wybrać długości fal, które będą mierzone (na przykład od 555 do 625 nm dla fluoroforu podobnego do Cy3).</li>
	<li>Umieść zamontowaną żuchwę na stoliku mikroskopu, aby zwizualizować i znaleźć próbkę za pomocą białego światła i obiektywu o mniejszym powiększeniu (2-10x).</li>
	<li>Dodaj kroplę olejku immersyjnego o współczynniku załamania światła 1,52 na wierzch szkiełka nakrywkowego, aby dopasować współczynnik załamania światła szklanego szkiełka nakrywkowego i obiektywu. 
	UWAGA: Dopasuj współczynnik załamania światła obiektywów, mediów obrazowych i tkanek tak dokładnie, jak to możliwe, aby zminimalizować wprowadzanie zniekształceń optycznych podczas akwizycji obrazu.</li>
	<li>Włącz lampy fluorescencyjne i wybierz odpowiedni obiektyw powiększający, aby obrazować obszary zainteresowania. Użyliśmy obiektywu o powiększeniu 20x i aperturze numerycznej 0,9 przy odległości roboczej 1,95 mm. Soczewka o większej odległości roboczej może być wymagana podczas obrazowania większych próbek tkanek w mikroskopie konfokalnym. Alternatywnie, obrazowanie można łatwo wykonać za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi w przypadku większych próbek tkanek.</li>
	<li>W oprogramowaniu do obrazowania konfokalnego naciśnij przycisk Na żywo, aby uruchomić tryb skanowania na żywo. Aby zmaksymalizować zakres dynamiczny obrazów i uniknąć nasycenia pikseli, dostosuj wzmocnienie i intensywność lasera dla wybranego kanału.</li>
	<li>Zidentyfikuj pole widzenia, aby zwizualizować cały obszar żuchwy w wymiarach X i Y. Ustaw górne i dolne parametry akwizycji stopnia Z, które dokładnie pokrywają objętość niszy komórek macierzystych w siekaczu myszy. Użyj kroku Z o rozmiarze 2 μm lub zgodnie z własnymi wymaganiami. Nowsze wersje mikroskopów konfokalnych powinny być w stanie automatycznie rejestrować stosy z różnych nakładających się na siebie obszarów.</li>
	<li>Pobieraj i zapisuj pliki obrazów stosu Z w formacie .lif. 
	UWAGA: Muchy .lif można przekonwertować na pliki .tiff i wykorzystać w innym oprogramowaniu do analizy 3D.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie obrazu, rekonstrukcja obrazu 3D i kwantyfikacja komórek zachowujących etykiety poprzez tworzenie powierzchni, segmentację obszaru zainteresowania (ROI), maskowanie ROI i tworzenie plam
UWAGA: Użyliśmy Imaris (Bitplane 9.0.1) do przetwarzania obrazów i rekonstrukcji 3D, ale podobne kroki przetwarzania obrazu można przeprowadzić za pomocą innych pakietów oprogramowania (np. ImageJ/Fiji, 3D slicer, Avizo, Arivis, Amira, itp.).
<ol>
	<li>W oprogramowaniu do obrazowania kliknij przycisk Arena, a następnie wybierz opcję Obraz. Wybierz oryginalny plik .lif i wybierz scalony plik, obrazy zostaną zaimportowane do oprogramowania do obrazowania. 
	UWAGA: Alternatywnie użyj konwertera plików oprogramowania do obrazowania, aby przekonwertować plik obrazu stosu Z na natywny typ pliku dla oprogramowania. Na przykład: przekonwertuj pliki .lif na pliki .ims za pomocą konwertera plików Imaris i otwórz pliki .ims w oprogramowaniu do obrazowania. Konwersja danych do natywnego formatu pliku oprogramowania pozwoli na szybką konwersję plików i zminimalizuje błędy.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie zaimportowany plik, aby otworzyć zestaw danych obrazu.</li>
	<li>Odwiedź panel Regulacja wyświetlania, kliknij nazwę kanału. Zwykle jest oznaczony jako czerwony w trybie domyślnym.
	<ol>
		<li>W oknie Właściwości obrazu kliknij kartę Odwzorowany kolor. W opcji Plik tabeli kolorów wybierz Fire Flow, a następnie kliknij OK. Kolor wyświetlacza jest zwykle wybierany w celu odróżnienia fluorescencji tła i fluorescencji dodatniej od próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W lewym górnym rogu ekranu w okienku Scena — Właściwości kliknij niebieską ikonę z etykietą Dodaj nową powierzchnię. Usuń zaznaczenie ikony głośności, która usunie większość fluorescencji tła, a fluorescencja dodatnia będzie wyraźnie widoczna (patrz krok 6.4.2).
	<ol>
		<li>Rozpocznij proces ręcznej segmentacji regionu zainteresowania (ROI) klikając w zakładkę Create (Tworzenie) i wybierając zakładkę Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie. W kreatorze ręcznego tworzenia powierzchni kliknij kartę Kontur, aby wybrać orientację (XY, YZ lub XZ) na podstawie próbek, aby łatwo obrysować ROI. Tutaj wybieramy orientację XY.</li>
		<li>Następnie upewnij się, że menu wskaźnika w prawym rogu jest w trybie wyboru. Dostosuj pozycję plastru, aby zlokalizować ROI w tkance. Zauważysz, że większość fluorescencji tła została usunięta z wyraźną fluorescencją dodatnią, jak wspomniano w kroku 6.4. Kliknij przycisk Rysuj i narysuj wstępny obszar zainteresowania. Wybierz opcję Widoczność na brak, aby uniknąć zakłóceń z obszarów innych niż ROI.</li>
		<li>Powtórz krok 6.4.2. plasterek po plasterku, aby narysować cały obszar zainteresowania.</li>
		<li>Po zakończeniu rysowania ROI kliknij Utwórz powierzchnię, aby uzyskać geometrię 3D ROI.</li>
		<li>Kliknij przycisk Edytuj w kreatorze ręcznego tworzenia powierzchni i wybierz opcję Maskuj wszystko.</li>
		<li>W wyskakującym oknie Mask Channel (Kanał maski) wybierz Channel 1 (Kanał 1) w opcjach wyboru kanałów. Następnie wybierz Duplikuj kanał przed zastosowaniem maski. W ustawieniach maski wybierz Stała wewnątrz/na zewnątrz i ustaw zewnętrzną powierzchnię woksela na 0.</li>
		<li>W okienku Właściwości sceny usuń zaznaczenie obiektu powierzchni i wybierz obiekt objętościowy. W Display Adjustment (Dopasowanie wyświetlania) usuń zaznaczenie oryginalnego kanału "Czerwony" i wybierz kanał Zamaskowany czerwony oraz dostosuj intensywność kolorów, aby uzyskać żądany zwrot z inwestycji w fluorescencję renderowany w 3D i pozytywnie oznaczony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utwórz nowy obiekt dodatkowy. Zacznij od kliknięcia ikony Dodaj punkty, aby określić ilościowo LRC renderowane w 3D, tworząc punkty 3D, które w porównywalny sposób pokrywają się z LRC renderowanymi w 3D. Użyj dolnych strzałek, aby przechodzić między krokami w kreatorze tworzenia spotów.
	<ol>
		<li>W kreatorze tworzenia spotów będą dostępne cztery sekwencyjne kroki instrukcji, aby automatycznie tworzyć spoty za pomocą oprogramowania. Upewnij się, że w pierwszym kroku jest zaznaczona opcja Segmentuj tylko obszar zainteresowania. Kliknij ikonę Dalej.</li>
		<li>W drugim kroku pojawi się "XYZ 3D box". Dostosuj pole XYZ, aby pokryć zwrot z inwestycji. Kliknij ikonę Dalej.</li>
		<li>W trzecim kroku przejdź do opcji Kanał źródłowy. Wybierz zamaskowany czerwony kanał; wprowadzić szacowaną średnicę plamki XY porównywalną do dopasowania i nałożenia na siebie kropek fluorescencyjnych próbki. Kliknij ikonę Dalej.</li>
		<li>W czwartym kroku dodaj typ filtra "Jakość" i dostosuj dolny próg intensywności, przesuwając przesuwane okno po histogramie "Jakość", aż większość możliwych do zidentyfikowania LRC zostanie oznaczona jako 
		UWAGA: Segmentacja, a co za tym idzie odczyty statystyczne (przykład: liczba komórek) w dużym stopniu zależą od wartości progowych intensywności. Uważaj, aby precyzyjnie ustawić odpowiednie wartości progowe.</li>
		<li>Kliknij przycisk Zakończ i wybierz przycisk Statystyka. Wybierz kartę Ogólne, aby znaleźć wartość całkowitej liczby plam na obrazie.</li>
		<li>Eksportuj statystyki, klikając przycisk Zakładka Wyświetl do pliku i otrzymaj wyniki w .xls pliku.</li>
		<li>Użyj odpowiedniego diagramu, aby przedstawić wyniki kwantyfikacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+incisor+through+gene+co-expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis.</a> eLife. 6, 24712(2017).</li>
<li>Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+tooth+development%2C+growth%2C+repair%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).</li>
<li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quiescent+cell+population+replenishes+mesenchymal+stem+cells+to+drive+accelerated+growth+in+mouse+incisors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors.</a> Nature Communications. 9 (1), 378(2018).</li>
<li>Biehs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMI1+represses+Ink4a%2FArf+and+Hox+genes+to+regulate+stem+cells+in+the+rodent+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor.</a> Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).</li>
<li>Sharir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+pool+of+actively+cycling+progenitors+orchestrates+self-renewal+and+injury+repair+of+an+ectodermal+appendage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).</li>
<li>Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label+retaining+cells+and+cutaneous+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Label retaining cells and cutaneous stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).</li>
<li>de Miguel-Gomez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+and+the+endometrium%3A+From+the+discovery+of+adult+stem+cells+to+pre-clinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models.</a> Cells. 10 (3), 595(2021).</li>
<li>Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescent+adult+stem+cells+in+murine+teeth+are+regulated+by+Shh+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling.</a> Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).</li>
<li>Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EdU%2C+a+new+thymidine+analogue+for+labelling+proliferating+cells+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).</li>
<li>Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+nucleotide+analogue-based+techniques+for+tracking+dividing+stem+cells%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview.</a> The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345(2021).</li>
<li>Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+EdU+labeling+on+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).</li>
<li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+and+tracking+of+mesenchymal+stromal+cells+with+EdU%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU.</a> Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).</li>
<li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+expression+of+H2B-GFP+transgene+in+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 3 (6), 2357(2008).</li>
<li>Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstructions+from+optical+sections+of+thick+mouse+inner+ears+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).</li>
<li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+technique%3A+Recent+progress+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li>
<li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li>
<li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807(2021).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+application+to+bone+and+dental+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its application to bone and dental tissues.</a> Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li>
<li>Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+stem+cell+lineage+tracing+and+deep+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging.</a> BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wielokrotne dawki zastrzyków (BrdU, EdU) są zwykle stosowane u rosnących noworodków myszy w celu jak największego znakowania proliferujących komórek 1,6,13. Okres gonitwy jest uważany za krytyczny krok w odniesieniu do tempa odnawiania tkanek 6,13. Siekacz myszy odnawia się mniej więcej co miesiąc. Ta cecha pozwala badaczom ustawić okres pogoni na 4 tygodnie lub dłużej<s...

Ciągle rosnący siekacz myszy jest doskonałym modelem do badania dorosłych komórek macierzystych1. Nabłonkowe (pętla szyjna wargowa i językowa) i mezenchymalne komórki macierzyste (między pętlą szyjną wargową a językową), które znajdują się po bliższej stronie siekaczy, różnicują się w ameloblasty, odontoblasty i komórki miazgi zębowej. Ten unikalny proces stanowi źródło komórek do kompensacji utraty i obrotu tkanek2. Chociaż kilka markerów komórek macierzystych, takich jak Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1 itp., zostało zidentyfikowanych in vivo dla podzbiorów dorosłych komórek macierzystych w siekaczach myszy, są one nieodpowiednie do reprezentowania populacji komórek macierzystych, gdy są używane samodzielnie1,3,4,5. Wizualizacja długowiecznych komórek w stanie spoczynku poprzez znakowanie i przechowywanie analogowego DNA nukleotydów może zapewnić bezstronne wykrywanie większości podzbiorów dorosłych komórek macierzystych6. Co więcej, podejście to jest przydatne wśród wielu metod identyfikacji komórek macierzystych7 do zrozumienia zachowania komórek i homeostazy populacji komórek macierzystych zębów3,8. Podczas gdy dzielące się komórki macierzyste straciłyby swoje oznakowanie DNA po znacznym pościgu, domniemane komórki macierzyste w stanie spoczynku zachowują swoją etykietę DNA, uznając je za komórki zachowujące etykietę (LRC)6. Znakowanie i przechowywanie DNA przez niedzielące się komórki macierzyste oznaczy i zlokalizuje domniemane dorosłe komórki macierzyste w ich niszach.
W ciągu ostatnich lat, znakowanie analogiem 5-bromo-2′-deoksyurydyny (BrdU) analogu tymidyny zastąpiło kłopotliwą, czasochłonną i niekompatybilną metodę znakowania DNA 3H-tymidyny za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości do testów proliferacji komórek6,9. W ostatnich latach technika znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) jest coraz częściej stosowana w BrdU. Ten wzorzec pojawił się z kilku powodów. Po pierwsze, metoda BrdU jest powolna i pracochłonna. Warunki użytkowania są zmienne i nie jest w stanie zachować ultrastruktury w próbkach (ze względu na denaturację DNA). Podobnie, metoda BrdU traci antygenowość komórek, co czyni ją nieefektywną w dalszych analizach funkcjonalnych i testach, takich jak eksperymenty kolokalizacyjne i przeszczep komórek macierzystych in vivo3,7,9,10,11,12. BrdU jest również teratogenem, który nie nadaje się do oznaczania LRC w rozwoju embrionalnym6. Ponadto metoda BrdU jest nieefektywna, gdy jest stosowana w próbkach z pełnym mocowaniem. Wadą jest niska penetracja przeciwciał w głębokiej części próbek lub wymóg długiego okresu inkubacji przeciwciał do głębokiej penetracji13. Znakowanie EdU wymyka się etapom denaturacji próbek, zachowując w ten sposób ultrastrukturę. Ta funkcja jest korzystna w przypadku dalszych analiz funkcjonalnych, takich jak eksperymenty kolokalizacyjne i przeszczep komórek macierzystych11,12. Ponadto etykietowanie EdU jest bardzo czułe i szybkie; penetracja próbki jest wysoka dzięki zastosowaniu szybko wchłanianych i mniejszych azydków fluorescencyjnych do wykrywania etykiet EdU poprzez katalizowaną Cu(I) [3 + 2] reakcję cykloaddycji (chemia "klik")<klasa sup = "xref">14.
Inną coraz częściej stosowaną metodą znakowania DNA jest użycie zmodyfikowanych myszy transgenicznych. Myszy te wykazują ekspresję histonu 2B białka zielonej fluorescencji (H2B-GFP) kontrolowanego przez element regulatorowy reagujący na tetracyklinę5,14. Po karmieniu myszy karmą/wodą z tetracykliną przez okres od 4 tygodni do 4 miesięcy, fluorescencja GFP zmniejszy się w komórkach cyklicznych i tylko LRC zachowają fluorescencję6. Zaletą tej metody jest to, że znakowane LRC mogą być izolowane i pozostają żywotne dla hodowli komórkowych lub dalszych analiz funkcjonalnych6,7. Niektóre badania wykazały niedokładne oznaczanie komórek macierzystych w stanie spoczynku, gdy są one ścigane do długotrwałego stosowania. Wynik ten był spowodowany nieszczelnym wyrazem tła ze szczepu H2B-GFP, a nie odpowiednią odpowiedzią regulowaną przez tetracyklinę15.
Ponadto, większość literatury w przeszłości używała wykrywania LRC głównie na przekrojach slajdów, które są dwuwymiarowe i często błędnie pokazują dokładną lokalizację i liczbę LRC. Podejście wyświetlało nieprawidłowe kąty dla przekrojów złożonych struktur tkankowych16. Druga metoda polegała na pozyskaniu obrazów 3D z przekrojów seryjnych i wykonaniu rekonstrukcji po obrazie. Te kroki były niedokładne ze względu na zniekształcenia obrazu spowodowane zmianami w każdej sekcji szeregowej z powodu skompresowanych lub rozciągniętych sekcji, co skutkowało brakiem informacji16,17,18. Metoda była również pracochłonna i czasochłonna.
Aby ułatwić obrazowanie LRC w całości, próbki muszą być czyste, a fluorescencja dobrze utrzymana. Obecne techniki oczyszczania tkanek można podzielić na trzy główne kategorie: techniki oczyszczania tkanek na bazie rozpuszczalników organicznych, techniki oczyszczania tkanek na bazie odczynników wodnych oraz techniki oczyszczania tkanek na bazie hydrożelu17,19. Niedawno opracowano system rozpuszczalnikowy na bazie glikolu polietylenowego (PEG) (PEGASOS). Takie podejście sprawia, że prawie wszystkie rodzaje tkanek są przezroczyste i zachowują endogenną fluorescencję, w tym tkanki twarde, takie jak kości i zęby20. Metoda PEGASOS ma przewagę nad innymi metodami oczyszczania tkanek, zwłaszcza w przypadku oczyszczania materiałów zębowych i kostnych. Większość innych metod może tylko częściowo usunąć twarde tkanki, ma długi czas przetwarzania lub wymaga kosztownych odczynników21. Ponadto metoda PEGASOS może skutecznie zachować endogenną fluorescencję w porównaniu z innymi metodami.
Ta literatura doprowadziła nas do stworzenia nowej metody badania komórek. Połączyliśmy zalety wykrywania LRC wynikające z etykietowania EdU z najdoskonalszym obrazowaniem 3D w całości próbek oczyszczonych tkankowo; próbki zostały przetworzone za pomocą zaawansowanej techniki oczyszczania tkanek związanych z systemem rozpuszczalnikowym związanym z glikolem polietylenowym (PEG) (PEGASOS)15. Przezroczystość tkanek twardych umożliwiła nam zrekonstruowanie sygnału 3D fluorescencji LRC in vivo bez łamania zębów lub żuchwy, tworząc dokładniejszy sposób wizualizacji i ilościowego oznaczania LRC.
W tym badaniu dostarczamy innowacyjny przewodnik do wizualizacji LRC w siekaczu myszy. Przeprowadziliśmy wizualne podejście 3D, aby określić lokalizację i ilość LRC w niszy komórek macierzystych siekaczy myszy. W ramach tego projektu wykorzystano znakowanie EdU, techniki oczyszczania tkanek PEGASOS oraz mikroskopię konfokalną. Nasza metoda znakowania LRC metodą EdU na całej masowej tkance oraz wykorzystanie oczyszczonej i przezroczystej próbki pokonuje zarówno ograniczenia tradycyjnych szkiełek sekcyjnych, jak i inne niekorzystne metody znakowania DNA. Tym samym nasza technika będzie odpowiednia do badań nad homeostazą komórek macierzystych wymagających wykrycia LRC, zwłaszcza na tkankach twardych. Protokół może być równie korzystny dla tych, którzy koncentrują się na homeostazie komórek macierzystych w innych tkankach i narządach.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Sigma Aldrcih</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>20 i razy; Obiektyw/NA 0.9</td><td>Probówki</td> wirówkowe Falcon Leica <td>507702</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>BD Igła PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>REF 305111</td><td></td></tr><tr><td>Benzoesan bezylu (BB)</td><td>Sigma Aldrcih</td><td>409529</td><td></td></tr><tr><td>Bitplane 9.0.1</td> Szkiełka wnękowe <td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BRAND</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR475505</td><td></td></tr><tr><td>Myszy C57BL / 6J</td><td>Jackson</td><td>Laboratory Strain #: 000664</td><td></td></tr><tr><td>Pompa obiegowa</td><td>VWR</td><td>23609-170</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma Aldrcih</td><td>451657</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrcih</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>EdU</td><td>Carboynth</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Miiilipore Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania</td><td>Olympus</td><td>DP27</td><td></td></tr><tr><td>LAS X Oprogramowanie</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus Stereoskop</td><td>Olympus Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehye</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>PEGMMA500</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td></td></tr><tr><td>Quadrol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Sulfa-cyjanina 3 Azydowa</td><td>Lumiprobe</td><td>D1330</td><td></td></tr><tr><td>TBS-10X</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>12498</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP8 Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tert-butanol (tB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie i oznaczanie ilościowe komórek zatrzymujących znaczniki w siekaczach myszy przy użyciu podejścia do rekonstrukcji 3d po oczyszczeniu tkanek

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

Mysi siekacz to organ, który rośnie nieprzerwanie przez cały okres życia myszy. Nabłonkowe i mezenchymalne komórki macierzyste znajdujące się w tkankach proksymalnych siekaczy dają początek potomstwu, które różnicuje się w ameloblasty, odontoblasty i fibroblasty miazgi. Komórki te odgrywają kluczową rolę we wspieraniu trwałego obrotu tkanek siekaczy, co sprawia, że siekacz mysi jest doskonałym modelem do badania homeostazy dorosłych komórek macierzystych. Uważa się, że komórki macierzyste zawierają długowieczne komórki w stanie spoczynku, które mogą być znakowane analogami nukleotydów, takimi jak 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU). Komórki zachowują tę etykietę w czasie i są odpowiednio nazywane komórkami zachowującymi znacznik (LRC). Metody wizualizacji LRC in vivo stanowią solidne narzędzie do monitorowania homeostazy komórek macierzystych. W niniejszym opracowaniu opisaliśmy metodę wizualizacji i analizy LRC. Nasze innowacyjne podejście obejmuje LRC w siekaczach myszy po oczyszczeniu tkanek i barwieniu EdU w całości, a następnie mikroskopii konfokalnej i trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji za pomocą oprogramowania do obrazowania. Metoda ta umożliwia akwizycję obrazowania 3D i bezstronną ocenę ilościową w porównaniu z tradycyjną analizą LRC na przekrojonych szkiełkach.

Po znakowaniu EdU i przeprowadzeniu procesu klarowania tkanek PEGASOS (Rycina 2), uzyskano przezroczystą żuchwę, co przedstawiono na naszym obrazie (Rycina 3B). Porównano zmodyfikowaną próbkę z normalną żuchwą, która nie była poddawana procesowi klarowania tkanek (Rycina 3A). Przezroczystą żuchwę (Rycina 3B) ze znakowaniem EdU poddano obrazowaniu konfokalnemu. Skupiono się na wierzchołku siekacza wykazu...

Siekacz myszy zawiera cenne komórki zachowujące etykietę w swojej niszy komórek macierzystych. Dysponujemy nowatorskim sposobem na bezstronne wykrywanie i ilościowe określanie komórek zachowujących etykiety; W naszym badaniu wykorzystano znakowanie EdU i podejście do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu żuchwy z materiału PEGASOS.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe komórek zatrzymujących znaczniki w siekaczach myszy przy użyciu podejścia do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu tkanek

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...

Protokół ten opisuje metodę wizualizacji in vivo i trójwymiarowej oraz kwantyfikacji komórek zachowujących znaczniki w niszy komórek macierzystych siekaczy myszy. Ta technika oszczędza czas i jest przyjazna dla nowych uczniów. Obrazy 3D są pozyskiwane bez uszkadzania tkanki.Kwantyfikacja 3D sprawia, że dane są bardziej wiarygodne i dokładne. Aby rozpocząć, przeanalizuj żuchwy. Utrwal próbki w 4% paraformaldehydzie i przechowuj je w temperaturze pokojowej przez noc.Po inkubacji usuń mięśnie z żuchwy. Zanurz je w 0,5-molowym roztworze kwasu etylenodiaminotetraoctowego, aby odwapnić przez cztery dni z codzienną wymianą podłoża na shakerze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odbarwić żuchwy w 15 mililitrach 25% roztworu Quadrol na wytrząsarce o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden dzień, aby usunąć pozostały hem krwi.W przypadku barwienia całej góry 5-etynylo-2-prime-deoksyurydyną należy przygotować świeży koktajl do znakowania 5-etynylo-2-prime-deoksyurydyny, jak wspomniano w tekście. Opłucz żuchwy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami za pomocą Tween 20 lub PBST przez 30 minut na wytrząsarce o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Powtórzyć płukanie żuchwy roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami trzykrotnie przez trzy minuty każde, a następnie inkubację w świeżo przygotowanym koktajlu znakującym 5-etynylo-2-prime-deoksyurydynę na shakerze przez noc.Powtórz trzykrotne płukanie roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami i wykonaj seryjne odlipidowanie, umieszczając żuchwy w roztworach wymienionych w tekście na sześć godzin każda w wytrząsarce o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odwodnić żuchwy w roztworze glikolu tert-butanolowo-polietylenowego lub tB-PEG przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z dzienną zmianą podłoża. Po dwóch dniach oczyść żuchwę w pożywce oczyszczającej z benzoesanu benzylu i glikolu polietylenowego zawierającej 75% benzoesanu benzylu, 22% metakrylanu glikolu polietylenowego i eteru metylowego średnio 500 lub PEG-MMA500 i 3% Quadrol w celu uzyskania dopasowania współczynnika załamania światła i do uzyskania przezroczystości.Zamontuj oczyszczoną tkankowo całą żuchwę na markowych szkiełkach wnękowych w podłożu oczyszczającym z glikolu benzoesanu benzylu i polietylenu i przykryj ją szkiełkami przykrywającymi. W oprogramowaniu do obrazowania konfokalnego ustaw żądane parametry akwizycji obrazu. W panelu do wzbudzenia fluorescencyjnego aktywuj laser wymagany do optymalnego wzbudzenia fluoroforów.W panelu wykrywania fluorescencyjnego przesuń suwak, aby wybrać długości fal, które mają być mierzone. Dodaj kroplę olejku immersyjnego o współczynniku załamania światła 1,52 na wierzch szkiełka nakrywkowego, aby dopasować współczynnik załamania szklanego szkiełka nakrywkowego i obiektywu, a następnie umieść zamontowaną żuchwę na stoliku mikroskopu. Włącz lampy fluorescencyjne i wybierz odpowiedni obiektyw powiększający, aby sfotografować obszary zainteresowania.W trybie skanowania na żywo zidentyfikuj pole widzenia, aby zobrazować cały obszar żuchwy w wymiarach X i Y. Ustaw parametry akwizycji górnego i dolnego stopnia Z, które dokładnie pokrywają objętość niszy komórek macierzystych w siekaczu myszy. Użyj kroku Z o rozmiarze dwóch mikrometrów lub zgodnie z wymaganiami.Pobieraj i zapisuj pliki obrazów Z-stack w formacie lif. Użyj konwertera plików oprogramowania do obrazowania, aby przekonwertować plik obrazu Z-stack na typ pliku w formacie natywnym. W oprogramowaniu do obrazowania kliknij przycisk Arena, a następnie wybierz opcję Obraz.Wybierz oryginalny plik lif, a następnie wybierz scalony plik. Obrazy zostaną zaimportowane do oprogramowania do obrazowania. Kliknij dwukrotnie zaimportowany plik, aby otworzyć zestaw danych obrazu.W oprogramowaniu do przetwarzania obrazu przejdź do panelu Regulacja wyświetlania. W panelu Dopasowanie wyświetlania kliknij nazwę kanału. Zwykle jest oznaczony jako czerwony w trybie domyślnym.W oknie Właściwości obrazu kliknij kartę Odwzorowany kolor. W opcji Plik karty kolorów wybierz Fire Flow, a następnie kliknij OK. Wybierz kolor wyświetlacza, aby odróżnić fluorescencję tła od fluorescencji dodatniej od próbki. W lewym górnym rogu ekranu, w okienku Właściwości sceny, kliknij niebieską ikonę z etykietą Dodaj nową powierzchnię.Usuń zaznaczenie ikony głośności, aby usunąć większość fluorescencji tła, co spowoduje, że dodatnia fluorescencja będzie wyraźnie widoczna podczas ręcznej segmentacji. Następnie rozpocznij ręczną segmentację obszaru zainteresowania, czyli ROI, klikając kartę Utwórz i wybierając zakładkę Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie. W kreatorze ręcznego tworzenia powierzchni kliknij kartę Kontur, aby wybrać orientację na podstawie próbek, aby łatwo obrysować ROI.Następnie upewnij się, że menu wskaźnika w prawym rogu jest w trybie wyboru. Dostosuj pozycję plastra, aby zlokalizować ROI w tkance. Jak wspomniano wcześniej, większość fluorescencji tła została już usunięta.Kliknij przycisk Rysuj i narysuj wstępny obszar zainteresowania. Wybierz opcję Widoczność na Brak, aby uniknąć zakłóceń z obszarów innych niż ROI, a następnie podziel obszar zainteresowania na segmenty. Po zakończeniu rysowania ROI kliknij Utwórz powierzchnię, aby uzyskać geometrię 3D ROI.Kliknij przycisk Edytuj w kreatorze ręcznego tworzenia powierzchni i wybierz opcję Maskuj wszystko. W wyskakującym oknie Mask Channel (Kanał maski) wybierz Channel 1 (Kanał 1) w opcjach Channel Selection (Wybór kanału). Następnie wybierz Duplikuj kanał przed zastosowaniem maski.W ustawieniach maski wybierz Stała wewnątrz/na zewnątrz i ustaw woksel na powierzchnię zewnętrzną na zero. W okienku Właściwości sceny usuń zaznaczenie obiektu Powierzchnia, a następnie wybierz obiekt Objętość. W dopasowaniu wyświetlania usuń zaznaczenie oryginalnego kanału czerwonego i wybierz kanał zamaskowany czerwony.Dostosuj intensywność kolorów, aby uzyskać pożądany, renderowany w 3D i pozytywnie oznaczony zwrot z inwestycji w fluorescencję. Utwórz nowy obiekt punktowy, klikając ikonę Spoty, aby określić ilościowo komórki zachowujące etykiety renderowane w 3D, tworząc punkty 3D, które w porównywalny sposób pokrywają się z komórkami zachowującymi etykiety renderowanymi w 3D. Użyj dolnych strzałek, aby przechodzić między krokami w kreatorze tworzenia miejsca.Kliknij przycisk Zakończ i wybierz przycisk Statystyka. Następnie wybierz kartę Ogólne, aby znaleźć wartość całkowitej liczby plam na obrazie. Po znakowaniu 5-etynylo-2-prime-deoksyurydyny i procesie oczyszczania tkanek z systemu rozpuszczalnikowego związanego z glikolem polietylenowym uzyskano przezroczystą żuchwę.Zmodyfikowaną próbkę porównano z normalną żuchwą bez procesu oczyszczania tkanek, a przezroczystą żuchwę znakowaną 5-etynylo-2-deoksyurydyną poddano obrazowaniu konfokalnemu. Przekrój optyczny siekacza wykazał komórki zatrzymujące etykietę w niszy komórek macierzystych wierzchołka siekacza w płaszczyźnie XY. Konstrukcja obrazu 3D wierzchołka siekacza wykazała 5-etynylo-2-prime-deoksyurydynę, dodatnie, zatrzymujące znacznik spoczynkowy komórek macierzystych zarówno w niszy nabłonkowych, jak i mezenchymalnych komórek macierzystych.Komórki 5-etynylo-2-prime-deoksyurydyny przeniesiono do miejsc w celu oceny ilościowej, które porównywalnie pokrywały się z komórkami zatrzymującymi mezenchymalną etykietę. Na obrazie widoczne są plamy utworzone tylko dla komórek zachowujących etykietę mezenchymalną i tylko dla komórek zachowujących etykietę nabłonkową. Przeprowadzono również ocenę ilościową komórek nabłonkowych i mezenchymalnych zachowujących znaczniki.Właściwości przetwarzania i oczyszczania są najważniejszymi krokami i powinny być zoptymalizowane zgodnie z zastosowaniem tkanki, aby uzyskać zadowalające wyniki. Metodę tę można również zmodyfikować w celu wizualizacji LRC na poziomie S2VGFP oraz śledzenia linii komórkowych w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat lokalizacji potomstwa i jego ilościowości lub wkładu.

detection-quantitation-label-retaining-cells-mouse-incisors-using-3d

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Źródło: Pekarek, B. T., et. al., Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)W tym filmie pokazujemy przygotowanie, obrazowanie i analizę oczyszczonego mózgu myszy w celu zbadania dendrytycznych altan dendrytycznych, morfologii kręgosłupa i rozmieszczenia neuronów przy użyciu mikroskopii konfokalnej i technik rekonstrukcji 3D.

Obrazowanie mikroskopem konfokalnym nienaruszonych altan dendrytycznych i morfologii kręgosłupa w oczyszczonym mózgu myszy

Ciągle rosnący siekacz myszy dostarcza modelu do badania odnawiania tkanek zębowych z komórek macierzystych nabłonka zębów (DESCs). Przedstawiono solidny system do konsekwentnego i niezawodnego pozyskiwania tych komórek z siekacza i namnażania ich in vitro.

Izolacja i hodowla komórek macierzystych nabłonka zębów z siekacza dorosłej myszy

Nowatorskie, kompatybilne z barwieniem immunologicznym techniki oczyszczania tkanek, takie jak ostateczne obrazowanie 3D organów oczyszczonych rozpuszczalnikiem, pozwalają na wizualizację 3D infekcji mózgu wirusem wścieklizny i jego złożonego środowiska komórkowego. Grube, znakowane przeciwciałami wycinki tkanki mózgowej są optycznie przezroczyste, aby zwiększyć głębokość obrazowania i umożliwić analizę 3D za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem

Ta metoda opisuje użycie modelu myszy R26R-Confetti (Confetti) do badania zmineralizowanych tkanek, obejmując wszystkie etapy od strategii hodowlanej do pozyskiwania obrazów. Dołączony jest ogólny protokół, który można zastosować do wszystkich tkanek miękkich oraz zmodyfikowany protokół, który można zastosować do tkanek zmineralizowanych.

Klonalne śledzenie genetyczne przy użyciu myszy konfetti do badania zmineralizowanych tkanek

Przedstawiamy protokół generowania ruchów zębów ortodontycznych u myszy oraz metody wizualizacji 3D włókien kolagenowych i naczyń krwionośnych więzadła przyzębia bez sekcji.

Obrazowanie 3D włókien kolagenowych PDL podczas ortodontycznego ruchu zębów w mysim modelu żuchwy

Neuronalna morfologia dendrytyczna często leży u podstaw funkcji. Rzeczywiście, wiele procesów chorobowych, które wpływają na rozwój neuronów, objawia się fenotypem morfologicznym. Protokół ten opisuje prostą i potężną metodę analizy nienaruszonych altan dendrytycznych i związanych z nimi kolców.

Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek w ramach projektu CLARITY

Protokół dostarcza szczegółową metodę obrazowania neuronów w wycinku mózgu za pomocą metody oczyszczania tkanki, ScaleSF. Protokół obejmuje przygotowanie tkanki mózgowej, klarowanie tkanek, postępowanie z oczyszczonymi wycinkami oraz konfokalne obrazowanie struktur neuronalnych za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej od poziomu mezoskopowego do mikroskopowego.

Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Obrazowanie na żywo ex vivo to potężna technika badania dynamicznych procesów ruchów komórkowych i interakcji w żywych tkankach. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który implementuje mikroskopię dwufotonową do śledzenia na żywo komórek nabłonka zębów w hodowanych całych siekaczach dorosłych myszy.

Wykorzystanie obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek podczas odnawiania zębów myszy

Celem tego protokołu jest opisanie metody funkcji utraty i zysku, która ma zastosowanie do identyfikacji neogeniny jako specyficznego dla etapu receptora, który prowadzi do trofektodermy i różnicowania wewnętrznej masy komórkowej w preimplantacyjnych zarodkach myszy.

Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy

Poznaj metodę wizualizacji i ilościowego oznaczania komórek zatrzymujących znaczniki w niszy komórek macierzystych siekacza myszy przy użyciu rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu tkanek PEGASOS.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe komórek zatrzymujących znaczniki w siekaczach myszy przy użyciu podejścia do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu tkanek (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe komórek zatrzymujących znaczniki w siekaczach myszy przy użyciu podejścia do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu tkanek

Przeglądaj więcej filmów