Wykrywanie i oznaczanie ilościowe komórek zatrzymujących znaczniki w siekaczach myszy przy użyciu podejścia do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu tkanek
June 10th, 2022
Siekacz myszy zawiera cenne komórki zachowujące etykietę w swojej niszy komórek macierzystych. Dysponujemy nowatorskim sposobem na bezstronne wykrywanie i ilościowe określanie komórek zachowujących etykiety; W naszym badaniu wykorzystano znakowanie EdU i podejście do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu żuchwy z materiału PEGASOS.
Protokół ten opisuje metodę wizualizacji in vivo i trójwymiarowej oraz kwantyfikacji komórek zachowujących znaczniki w niszy komórek macierzystych siekaczy myszy. Ta technika oszczędza czas i jest przyjazna dla nowych uczniów. Obrazy 3D są pozyskiwane bez uszkadzania tkanki.
Kwantyfikacja 3D sprawia, że dane są bardziej wiarygodne i dokładne. Aby rozpocząć, przeanalizuj żuchwy. Utrwal próbki w 4% paraformaldehydzie i przechowuj je w temperaturze pokojowej przez noc.
Po inkubacji usuń mięśnie z żuchwy. Zanurz je w 0,5-molowym roztworze kwasu etylenodiaminotetraoctowego, aby odwapnić przez cztery dni z codzienną wymianą podłoża na shakerze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odbarwić żuchwy w 15 mililitrach 25% roztworu Quadrol na wytrząsarce o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden dzień, aby usunąć pozostały hem krwi.
W przypadku barwienia całej góry 5-etynylo-2-prime-deoksyurydyną należy przygotować świeży koktajl do znakowania 5-etynylo-2-prime-deoksyurydyny, jak wspomniano w tekście. Opłucz żuchwy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami za pomocą Tween 20 lub PBST przez 30 minut na wytrząsarce o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Powtórzyć płukanie żuchwy roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami trzykrotnie przez trzy minuty każde, a następnie inkubację w świeżo przygotowanym koktajlu znakującym 5-etynylo-2-prime-deoksyurydynę na shakerze przez noc.
Powtórz trzykrotne płukanie roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami i wykonaj seryjne odlipidowanie, umieszczając żuchwy w roztworach wymienionych w tekście na sześć godzin każda w wytrząsarce o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odwodnić żuchwy w roztworze glikolu tert-butanolowo-polietylenowego lub tB-PEG przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z dzienną zmianą podłoża. Po dwóch dniach oczyść żuchwę w pożywce oczyszczającej z benzoesanu benzylu i glikolu polietylenowego zawierającej 75% benzoesanu benzylu, 22% metakrylanu glikolu polietylenowego i eteru metylowego średnio 500 lub PEG-MMA500 i 3% Quadrol w celu uzyskania dopasowania współczynnika załamania światła i do uzyskania przezroczystości.
Zamontuj oczyszczoną tkankowo całą żuchwę na markowych szkiełkach wnękowych w podłożu oczyszczającym z glikolu benzoesanu benzylu i polietylenu i przykryj ją szkiełkami przykrywającymi. W oprogramowaniu do obrazowania konfokalnego ustaw żądane parametry akwizycji obrazu. W panelu do wzbudzenia fluorescencyjnego aktywuj laser wymagany do optymalnego wzbudzenia fluoroforów.
W panelu wykrywania fluorescencyjnego przesuń suwak, aby wybrać długości fal, które mają być mierzone. Dodaj kroplę olejku immersyjnego o współczynniku załamania światła 1,52 na wierzch szkiełka nakrywkowego, aby dopasować współczynnik załamania szklanego szkiełka nakrywkowego i obiektywu, a następnie umieść zamontowaną żuchwę na stoliku mikroskopu. Włącz lampy fluorescencyjne i wybierz odpowiedni obiektyw powiększający, aby sfotografować obszary zainteresowania.
W trybie skanowania na żywo zidentyfikuj pole widzenia, aby zobrazować cały obszar żuchwy w wymiarach X i Y. Ustaw parametry akwizycji górnego i dolnego stopnia Z, które dokładnie pokrywają objętość niszy komórek macierzystych w siekaczu myszy. Użyj kroku Z o rozmiarze dwóch mikrometrów lub zgodnie z wymaganiami.
Pobieraj i zapisuj pliki obrazów Z-stack w formacie lif. Użyj konwertera plików oprogramowania do obrazowania, aby przekonwertować plik obrazu Z-stack na typ pliku w formacie natywnym. W oprogramowaniu do obrazowania kliknij przycisk Arena, a następnie wybierz opcję Obraz.
Wybierz oryginalny plik lif, a następnie wybierz scalony plik. Obrazy zostaną zaimportowane do oprogramowania do obrazowania. Kliknij dwukrotnie zaimportowany plik, aby otworzyć zestaw danych obrazu.
W oprogramowaniu do przetwarzania obrazu przejdź do panelu Regulacja wyświetlania. W panelu Dopasowanie wyświetlania kliknij nazwę kanału. Zwykle jest oznaczony jako czerwony w trybie domyślnym.
W oknie Właściwości obrazu kliknij kartę Odwzorowany kolor. W opcji Plik karty kolorów wybierz Fire Flow, a następnie kliknij OK. Wybierz kolor wyświetlacza, aby odróżnić fluorescencję tła od fluorescencji dodatniej od próbki. W lewym górnym rogu ekranu, w okienku Właściwości sceny, kliknij niebieską ikonę z etykietą Dodaj nową powierzchnię.
Usuń zaznaczenie ikony głośności, aby usunąć większość fluorescencji tła, co spowoduje, że dodatnia fluorescencja będzie wyraźnie widoczna podczas ręcznej segmentacji. Następnie rozpocznij ręczną segmentację obszaru zainteresowania, czyli ROI, klikając kartę Utwórz i wybierając zakładkę Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie. W kreatorze ręcznego tworzenia powierzchni kliknij kartę Kontur, aby wybrać orientację na podstawie próbek, aby łatwo obrysować ROI.
Następnie upewnij się, że menu wskaźnika w prawym rogu jest w trybie wyboru. Dostosuj pozycję plastra, aby zlokalizować ROI w tkance. Jak wspomniano wcześniej, większość fluorescencji tła została już usunięta.
Kliknij przycisk Rysuj i narysuj wstępny obszar zainteresowania. Wybierz opcję Widoczność na Brak, aby uniknąć zakłóceń z obszarów innych niż ROI, a następnie podziel obszar zainteresowania na segmenty. Po zakończeniu rysowania ROI kliknij Utwórz powierzchnię, aby uzyskać geometrię 3D ROI.
Kliknij przycisk Edytuj w kreatorze ręcznego tworzenia powierzchni i wybierz opcję Maskuj wszystko. W wyskakującym oknie Mask Channel (Kanał maski) wybierz Channel 1 (Kanał 1) w opcjach Channel Selection (Wybór kanału). Następnie wybierz Duplikuj kanał przed zastosowaniem maski.
W ustawieniach maski wybierz Stała wewnątrz/na zewnątrz i ustaw woksel na powierzchnię zewnętrzną na zero. W okienku Właściwości sceny usuń zaznaczenie obiektu Powierzchnia, a następnie wybierz obiekt Objętość. W dopasowaniu wyświetlania usuń zaznaczenie oryginalnego kanału czerwonego i wybierz kanał zamaskowany czerwony.
Dostosuj intensywność kolorów, aby uzyskać pożądany, renderowany w 3D i pozytywnie oznaczony zwrot z inwestycji w fluorescencję. Utwórz nowy obiekt punktowy, klikając ikonę Spoty, aby określić ilościowo komórki zachowujące etykiety renderowane w 3D, tworząc punkty 3D, które w porównywalny sposób pokrywają się z komórkami zachowującymi etykiety renderowanymi w 3D. Użyj dolnych strzałek, aby przechodzić między krokami w kreatorze tworzenia miejsca.
Kliknij przycisk Zakończ i wybierz przycisk Statystyka. Następnie wybierz kartę Ogólne, aby znaleźć wartość całkowitej liczby plam na obrazie. Po znakowaniu 5-etynylo-2-prime-deoksyurydyny i procesie oczyszczania tkanek z systemu rozpuszczalnikowego związanego z glikolem polietylenowym uzyskano przezroczystą żuchwę.
Zmodyfikowaną próbkę porównano z normalną żuchwą bez procesu oczyszczania tkanek, a przezroczystą żuchwę znakowaną 5-etynylo-2-deoksyurydyną poddano obrazowaniu konfokalnemu. Przekrój optyczny siekacza wykazał komórki zatrzymujące etykietę w niszy komórek macierzystych wierzchołka siekacza w płaszczyźnie XY. Konstrukcja obrazu 3D wierzchołka siekacza wykazała 5-etynylo-2-prime-deoksyurydynę, dodatnie, zatrzymujące znacznik spoczynkowy komórek macierzystych zarówno w niszy nabłonkowych, jak i mezenchymalnych komórek macierzystych.
Komórki 5-etynylo-2-prime-deoksyurydyny przeniesiono do miejsc w celu oceny ilościowej, które porównywalnie pokrywały się z komórkami zatrzymującymi mezenchymalną etykietę. Na obrazie widoczne są plamy utworzone tylko dla komórek zachowujących etykietę mezenchymalną i tylko dla komórek zachowujących etykietę nabłonkową. Przeprowadzono również ocenę ilościową komórek nabłonkowych i mezenchymalnych zachowujących znaczniki.
Właściwości przetwarzania i oczyszczania są najważniejszymi krokami i powinny być zoptymalizowane zgodnie z zastosowaniem tkanki, aby uzyskać zadowalające wyniki. Metodę tę można również zmodyfikować w celu wizualizacji LRC na poziomie S2VGFP oraz śledzenia linii komórkowych w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat lokalizacji potomstwa i jego ilościowości lub wkładu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nową metodę in vivo wizualizowania i ilościowego określania komórek zatrzymujących etykietę w niszy komórek macierzystych siekaczy mysich. Wykorzystując etykietowanie EdU i podejście do 3D rekonstrukcji po klarowaniu tkanki metodą PEGASOS, ta technika poprawia wiarygodność i dokładność zbierania danych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Badania nad komórkami macierzystymi
- 3D Techniki obrazowania
Tło
- Komórki zatrzymujące etykietę są kluczowe dla zrozumienia nisz komórek macierzystych.
- Siekacz mysi służy jako model do badania tych komórek.
- Tradcyjne metody mogą nie zapewniać dokładnego ilościowego określania.
- Klarowanie tkanki metodą PEGASOS pozwala na lepsze wizualizowanie struktur komórkowych.
Cel badania
- Opracowanie przyjaznej dla użytkownika metody ilościowego określania komórek zatrzymujących etykietę.
- Poprawa dokładności 3D obrazowania w próbkach biologicznych.
- Ułatwienie badań w dziedzinie biologii komórek macierzystych i regeneracji tkanek.
Stosowane metody
- Sekcja żuchwy mysi.
- Fiksowanie w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez noc.
- Etykietowanie EdU do identyfikacji komórek zatrzymujących etykietę.
- Rekonstrukcja 3D przy użyciu klarowania tkanki metodą PEGASOS.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja komórek zatrzymujących etykietę w 3D.
- Ilościowe określenie komórek wykazało poprawę dokładności.
- Metoda okazała się oszczędnością czasu i przyjazna dla użytkownika.
- Dane wspierają dalsze badania nad niszami komórek macierzystych.
Wnioski
- Nowa metoda poprawia badania nad komórkami zatrzymującymi etykietę.
- 3D obrazowanie zapewnia cenne wglądy w biologię komórek macierzystych.
- Ta technika może zostać przyjęta przez badaczy w tej dziedzinie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative 3D visualization of label-retaining cells (LRCs) in mouse incisors enables high-confidence interrogation of adult stem cell homeostasis and turnover. This approach enhances predictive confidence in stem cell niche dynamics, supporting early discovery and mechanistic de-risking for regenerative and tissue engineering portfolios. The method's non-biased quantitation and reproducibility position it as a strategic asset for translational research and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantitation of quiescent stem cell populations for hypothesis-driven target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing epithelial and mesenchymal stem cell contributions.
- Facilitates portfolio triage by providing robust, reproducible stem cell niche data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D biological systems for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, quantitative outputs for assay reproducibility and cross-study comparability.
- Enables reliable evaluation of compound effects on stem cell maintenance and differentiation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying tissue regeneration and stem cell dynamics.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling lineage tracing and progeny quantitation.
- Supports risk-adjusted advancement decisions in regenerative medicine and tissue engineering programs.
Pipeline & Workflow Integration
This 3D LRC quantitation method integrates from early discovery through preclinical research, bridging hypothesis testing, target validation, and translational model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in stem cell homeostasis.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible 3D imaging outputs for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements for robust statistical comparison.
- Translational Research: Enables biomarker alignment and continuity across discovery and preclinical stages.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for stem cell quantitation and lineage tracing across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in stem cell research.
- Operational Value: Standardizes 3D quantitation and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of regenerative and tissue engineering assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue clearing, confocal imaging, and 3D image analysis.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and compatible analytical software.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and quantitation protocols.
- Adaptable to various tissue types and lineage tracing applications with protocol optimization.
- Dependent on optimization of clearing and processing steps for specific tissue contexts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Tissue Clearing of Mandible Using PEGASOS Technique
3:03
Confocal Imaging of Tissue-Cleared Mandible
4:37
Image Processing, 3D Image Reconstruction, and Quantification of Label-Retaining Cells
8:25
Results: Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors
9:50
Conclusion
