Badania termochemiczne trójskładnikowych kompleksów Ni(II) i Zn(II) z wykorzystaniem spektrometrii ruchliwości jonów i mas

Ta nowa technika łączy spektrometrię ruchliwości jonów i mas z modelowaniem molekularnym i teorią dynamiki reakcji w celu określenia względnej termochemii dwóch konkurujących ze sobą reakcji dysocjacji kompleksu trójskładnikowego. Połączenie tych technik charakteryzuje szlaki reakcji reagentów i produktów, struktury konformacyjne i powinowactwo liganda do tworzenia trójskładnikowego kompleksu z jonem metalu. Badania te modelują reaktywność dwóch potencjalnych znaczników peptydowych do oczyszczania białek rekombinowanych, w których znacznik reaguje z metalem schelatowanym przez kwas nitrylotrioctowy w unieruchomionej kolumnie powinowactwa do metalu.

Zacznij od załadowania 2 mililitrowej próbki do 2,5-mililitrowej strzykawki z noskiem i wstrzyknięcia próbki do elektrorozpylania instrumentu za pomocą pompy strzykawkowej instrumentu z natężeniem przepływu 10 mikrolitrów na minutę. Umieść przyrząd w trybie spektrometrii mas ruchliwości jonów ujemnych lub IM-MS. Zidentyfikuj wzór izotopów od masy do ładunku ujemnie naładowanego alternatywnego kompleksu trójskładnikowego wiążącego metal lub kompleksu amb-metal-NTA, otwierając program spektrometrii mas i wybierając Widmo.

Następnie wybierz Narzędzia, a następnie Model izotopowy. W wyskakującym okienku podaj wzór cząsteczkowy kompleksu, zaznacz pole Pokaż naładowany jon, wprowadź 1 dla ładunku ujemnego i kliknij OK.In wyświetlany wzór izotopowy kompleksu, zwróć uwagę na najniższy pik masy. W oprogramowaniu instrumentu wybierz Konfiguracja, a następnie Quad Profile.

Następnie wybierz opcję Ręcznie Naprawiono i wprowadź masę najniższego piku wzoru izotopowego. Kliknij Aktualizuj i zamknij okno. Ponownie wybierz Konfiguracja, a następnie kliknij Rozwiązywanie problemów z czwórką.

Zbierz widma IM-MS jonów ujemnych, zaczynając od energii pierwszego zderzenia transferowego, używając 5-minutowego czasu trwania i 2-sekundowego czasu skanowania. Powtórz tę czynność, aby zebrać widma IM-MS dla każdej z pozostałych energii zderzeń. Wykorzystaj zintegrowane rozkłady czasu przybycia lub obszary ATD dla trójskładnikowego kompleksu amb-metal-NTA i dwóch produktów, kompleksu NTA-metal i kompleksu amb-metal, aby znormalizować do względnej skali procentowej.

Na podstawie pomiarów dysocjacji wywołanej zderzeniem (TCID) progu powtórzenia znajdź średnią i odchylenia standardowe każdego punktu danych. Następnie przekształć energię zderzenia przeniesienia ramy lab-frame na energię zderzenia środka masy. Aby zmierzyć przekroje czynne zderzeń, należy zebrać widma jonów ujemnych IM-MS próbki poli-DL-alaniny lub PA o stężeniu 10 ppm przez 10 minut, korzystając z warunków pracy instrumentu.

Następnie zbierz widma IM-MS każdego kompleksu trójskładnikowego przez 5 minut. Wyodrębnij ATD każdego z PA i kompleksów trójskładnikowych i wyeksportuj ich pliki do oprogramowania do spektrometrii mas za pomocą opcji Zachowaj czas dryftu. Znajdź średni czas przybycia na podstawie maksimów odpowiednich krzywych ATD.

Użyj metody kalibracji przekroju poprzecznego, aby przeliczyć średnie czasy przybycia na przekroje kolizyjne kompleksu trójskładnikowego. Z menu głównego CRUNCH otwórz plik tekstowy GB5 zawierający energię środka masy lub względne intensywności produktów zależne od ECM. Odpowiedz Nie, aby odczytać parametry.

Następnie wybierz Modelowanie, a następnie Ustaw wszystkie parametry. Z opcji modelu reakcji wybierz domyślną opcję Threshold CID, a następnie RRKM z całkowaniem nad rozkładem transferu energii kompleksu trójskładnikowego. Wprowadź wartość 2 dla modelowanych niezależnych kanałów produktów i wybierz opcję Oblicz przekroje poprzeczne.

Jako typ modelu niezawiłego należy wybrać przekrój czynny 0 kelwinów, który obejmuje statystyczną poprawkę RRKM na przesunięcia kinetyczne spowodowane 50-mikrosekundowym oknem czasowym od komórki zderzeniowej do detektora czasu przelotu. Jako opcje konwolucji wybierz podwójną całkę Tiernana, która obejmuje konwolucję nad rozkładami energii translacyjnej między trójskładnikowym jonem złożonym a gazem zderzeniowym argonu. Jako metodę całkowania numerycznego wybierz kwadraturę Gaussa z wstępnie zapisanymi przekrojami poprzecznymi.

Z opcji wprowadzania parametrów molekularnych wprowadź G, aby odczytać plik modelowania strukturalnego z częstotliwościami drgań i rotacji PM6 kompleksu trójskładnikowego. Odpowiedz Tak na pytanie:Czy jeden z reagentów jest atomowy? Wpisz położenie i nazwę pliku modelowania.

Wprowadź 1 dla ładunku jonowego i 1,664 dla polaryzowalności argonu. Masa jonu i masa celu dotyczą odpowiednio kompleksu trójskładnikowego i argonu i są automatycznie odczytywane z pliku tekstowego GB5. Wprowadź wartość 0 dla drgań harmonicznych.

Naciśnij Enter, aby odczytać stałe obrotowe 1-D i 2-D z pliku modelowania konstrukcyjnego. Należy wybrać wartości domyślne 0 dla obróbki wirnika z utrudnieniem i 1 dla symetrii cząsteczek. Wybierz domyślną 300 kelwinów dla temperatury reagenta.

Wybierz Całkowanie dla metody zmniejszania gęstości tablicy stanów. Wybierz opcję Tak, aby obciąć dystrybucję energii. Wprowadź numer grupy czynności 40000 dla maksymalnej energii dla dystrybucji, numer grupy fali 2 dla rozmiaru pojemnika i 32 dla liczby punktów w dystrybucji energii.

W polu Parametry modelu TCID/RRKM wybierz opcję Tak dla opcji Zmień, wprowadź wartość 0 w polu Stały czas i 0,000050 sekundy w polu górny limit okna wykrywania. W przypadku kanału produktu 1 wybierz 1 dla pojedynczego stanu przejścia z opcji kanału dysocjacji i 0 dla braku sekwencyjnej dysocjacji. Jako typ stanu przejścia wybierz 1 dla orbitowania.

Wybierz G, aby odczytać pliki programu do modelowania, które zawierają parametry rotacji i drgań PM6 dla kompleksu amb-metal oraz produktów NTA. Wprowadź nr dla:Czy jeden ze stanów przejścia granicy przestrzeni fazowej lub PSL TS jest gatunkiem atomowym? Wprowadź lokalizację i nazwę pliku złożonego amb-metal.

Użyj 1.062 dla częstotliwości skali, naciśnij Enter dla liczby atomów i wprowadź Nie dla:Czy cząsteczka jest liniowa? Powtórz to samo dla pliku modelowania, który zawiera częstotliwości drgań i obrotów produktu NTA. Wprowadź opis orbitującego TS. Wprowadź 1.0 dla ładunku jonu amb-metalu, a następnie wprowadź polaryzowalność i moment dipolowy NTA.

Wybierz 0 kelwinów dla temperatury rotacji i zablokowany dipol dla traktowania orbitalnego stanu przejściowego. Wprowadź średnie masy jonu amb-metalu i NTA. Naciśnij Enter, aby odczytać stałe obrotowe 1-D i 2-D z plików modelowania.

Wybierz 0 dla wirników z przeszkodą, 1 dla symetrii cząsteczek i 1 dla degeneracji reakcji. Wprowadź opcję Bez zmian. W przypadku kanału produktu 2 wybierz 1 dla pojedynczego stanu przejścia, 0 dla braku dla sekwencyjnej dysocjacji i 1 dla orbitowania dla typu stanu przejścia.

Wybierz G, aby wczytać pliki modelowania, które zawierają parametry obrotowe i drgania PM6 dla kompleksu NTA-metal i produktów amb. Następnie wprowadź opis orbitującego TS. Wprowadź 1.0 dla ładunku NTA-kompleksu metalowego i wprowadź polaryzowalność i moment dipolowy amb. Wybierz 0 kelwinów dla temperatury rotacji i zablokowany dipol dla traktowania stanu przejściowego orbity.

Wprowadź średnie masy kompleksu metalowego NTA i produktów amb. Naciśnij Enter, aby odczytać stałe obrotowe 1-D i 2-D z plików modelowania. Wybierz 0 dla wirników z przeszkodą, 1 dla symetrii cząsteczek i 1 dla degeneracji reakcji.

Następnie wprowadź Brak zmian. Aby obsłużyć nieaktywne obroty 2-W, wybierz domyślne opcje statystycznego rozkładu momentu pędu i zintegruj rozkład P-E, G przez J. Użyj domyślnej wartości 32 w liczbie punktów w integracji.

W menu Model wybierz opcję Optymalizuj parametry w celu dopasowania danych, a następnie wprowadź minimalną i maksymalną energię, aby odpowiednio rozpocząć i zakończyć dopasowanie danych. Należy wybrać wartość 1 dla eksperymentalnych odchyleń standardowych modeli ważenia. Na podstawie danych wybierz minimalne dopuszczalne odchylenie standardowe, zwykle od 0,01 do 0,001.

Użyj wartości domyślnej dla granicy zbieżności E0 i wybierz Nie, aby utrzymać dowolny parametr na poziomie bieżącej wartości, 0,5 i 2,0 elektronowolta dla dolnej i górnej granicy oraz 2 dla metody oceny pochodnej. Z menu Optymalizacja wybierz opcję Rozpocznij optymalizację. Program CRUNCH zoptymalizuje wybrany model TCID do danych eksperymentalnych.

Na koniec w menu Model wybierz delta-H i S w T, aby uzyskać ocenę termochemiczną dwóch kanałów dysocjacji. Reprezentatywny obraz przedstawia podstawowe struktury alternatywnych peptydów wiążących metale A i H. Kolor podkreśla potencjalne miejsca wiązania metalu.

Zależność energetyczna od tworzenia jonów produktowych amb-metalu i NTA-metalu jest pokazana tutaj. Energia zderzenia środka masy, w której występuje 50% dysocjacja trójskładnikowego kompleksu amb-metal-NTA, jest uwzględniona na wykresach. Reprezentatywne obrazy pokazują model dynamiki dla metody TCID z rozdzielczością energetyczną.

Zderzenia kompleksu ambH--NTA z argonem powodują dysocjację na kompleks ambH-i wolny NTA lub kompleks NTA-i wolne produkty ambH. Energie progowe E1 i E2 są równe entalpiom dysocjacji 0 kelwinów dla reakcji kompleksu ambH--NTA do kompleksu ambH-i wolnego NTA lub kompleksu ambH--NTA do kompleksu NTA-i wolnego ambH, odpowiednio. Zoptymalizowane pod kątem geometrii PM6 trójskładnikowe kompleksy A i H amb-metal-NTA są pokazane tutaj.

Konformery te wykorzystano w modelowaniu TCID danych eksperymentalnych i wybrano spośród innych kandydujących struktur poprzez porównanie ich energii elektronicznej PM6 oraz tego, jak ich obliczone przekroje zderzeniowe w porównaniu z IM-MS mierzyły przekroje zderzeniowe. Na tych obrazach przedstawiono rozdzielczy energetycznie TCID czterech kompleksów amb-metal-NTA. Dla gatunków A i H jony iloczynowe amb-metalu i NTA-metalu z zawiłymi pasowaniami progowymi CRUNCH są pokazane tutaj.

Wartości energii są entalpiami dysocjacji w temperaturze 0 kelwinów dla reakcji amb-metal-NTA do amb-metalu i wolnego NTA lub amb-metaL-NTA do NTA-metalu i wolnego amb. Porównanie swobodnych energii asocjacji Gibbsa w kilodżulach na mol i stałych tworzenia wyprowadzonych z entalpii dysocjacji, zero kelwinów netto, z obliczeniami mechaniki statycznej przy użyciu parametrów PM6 przedstawiono tutaj. Reakcja NTA-niklu i wolnego ambA w celu wytworzenia kompleksu ambA-nikiel-NTA wykazuje najwyższą stałą tworzenia i reprezentuje reakcję, w której białko znakowane ambA jest unieruchamiane przez NTA-nikiel wewnątrz kolumny powinowactwa.

Dopasowanie CRUNCH wymaga starannego przesiewania reagentów i produktów w celu uzyskania dokładnych energii progowych. Wymagana jest specjalistyczna wiedza w zakresie modelowania molekularnego w celu uzyskania struktur i wiarygodnych parametrów molekularnych. Ogólne metody opisane w niniejszym dokumencie mogą zostać opracowane w celu badania przesiewowego skuteczności cząsteczek zaprojektowanych do wiązania kofaktorów metali i miejsc aktywnych białek w celu blokowania funkcji enzymatycznych.