Ex vivo Uwalnianie peptydu związanego z genem kalcytoniny z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni

Metoda ta jest narzędziem do badania mechanizmów związanych z uwalnianiem CGRP z układu naczyniowego nerwu trójdzielnego. Główną zaletą tej metody jest możliwość podzielenia układu naczyniowego nerwu trójdzielnego na trzy różne miejsca i oceny uwalniania CGRP w każdym odrębnym miejscu. Procedurę zademonstruję ja i Inger Jansen-Olesen, starszy naukowiec z naszej grupy.

Na początek przygotuj tkankę szczura, usuwając skórę i mięśnie wokół głowy i szyi za pomocą nożyczek. Następnie użyj trymera do kości i nożyczek, aby oddzielić dolne szczęki od głowy. Teraz odsłoń rdzeń kręgowy i pień mózgu, wkładając doogonowo trymer do kości w grzbietową część kręgów i usuń go.

Następnie przetnij ogonową część czaszki przy granicach kości potylicznej i międzyciemieniowej, aby usunąć te struktury kostne, odsłaniając móżdżek. Aby odizolować TNC biegnący doogonowo około 13 do 16 milimetrów od bregmy z każdej strony, odetnij grzbietowo-boczną część pnia mózgu nożyczkami sprężynowymi. Następnie zanurza się lewą i prawą stronę TNC w SIF.

Następnie przetnij głowę w połowie obsady, aby podzielić czaszkę na dwie części za pomocą piły. Teraz ostrożnie usuń mózg, nie dotykając opony twardej przyczepionej do czaszki za pomocą szpatułki. Aby wyizolować TG, przetnij go, w tym jego gałęzie wokół granic wizualnych, przy czym gałąź żuchwy wchodzi w otwór owalny, a gałęzie oczne i szczękowe wchodzą do czaszki.

Następnie zanurz połówki czaszki i TG w SIF. Aby przygotować tkankę myszy, usuń skórę i mięśnie wokół głowy i szyi za pomocą nożyczek. Teraz odsłoń rdzeń kręgowy i pień mózgu, wkładając doogonowo nożyczki do grzbietowej części kręgów i usuń je.

Następnie przetnij ogonową część czaszki przy granicach kości potylicznej i międzyciemieniowej, aby usunąć te struktury kostne odsłaniające móżdżek. Przetnij kość ciemieniową w połowie obsadzenia i usuń kość, aby odsłonić mózg. Ostrożnie usuń móżdżek, aby odsłonić pień mózgu za pomocą szpatułki.

Odizoluj TNC zawierający część pnia mózgu za pomocą nożyczek sprężynowych, a następnie zanurz pień mózgu w SIF. Teraz ostrożnie usuń mózg za pomocą szpatułki i przetnij nerw trójdzielny w miejscu, w którym wchodzi do pnia mózgu. Aby wyizolować TG, przetnij go, w tym jego gałęzie wokół granic wizualnych z gałęzią żuchwy, w miejscu, w którym wchodzi w otwór owalny oraz gałęziami ocznymi i szczękowymi wchodzącymi do czaszki.

Następnie zanurz TG w SIF. Aby ułatwić wymianę SIF, dodaj pokrywę do plastikowych pojemników i rozpocznij mycie tkanek szczurów i myszy w SIF przez 30 minut, wymieniając SIF co pięć minut. Po 30 minutach mycia w temperaturze pokojowej przenieś połówki TNC szczura i TG szczura do oddzielnych nakrętek probówek do mikrowirówek z 350 mikrolitrami SIF.

Przenieś pień mózgu myszy z TNC do nasadki probówki mikrowirówki z 250 mikrolitrami SIF. Na koniec przenieś dwie mysie TG do nasadki probówki mikrowirówki z 250 mikrolitrami SIF. Umieść połówki czaszki szczura na sześciodołkowej płytce hodowlanej i wypełnij czaszkę 400 mikrolitrami SIF.

Umieść czaszki szczurów w nakrętkach probówek do mikrowirówek z tkanką szczura i myszy w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wymieniaj SIF za pomocą pipety co pięć minut przez 20 minut bez dotykania tkanki. Przygotować probówki do mikrowirówek do pobrania próbki, odpowiednio etykietując.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu EIA o sile 10 do każdej probówki mikrowirówkowej. Następnie należy przygotować roztwór badanego związku i roztwór nośnika, rozcieńczając go w SIF dla wszystkich stężeń. Po ostatnim praniu dodaj 250 mikrolitrów SIF do myszy TG i TNC, 350 mikrolitrów SIF do szczurzych TG i TNC oraz 400 mikrolitrów SIF do każdej czaszki szczura.

Po 10 minutach inkubacji zebrać 200 mikrolitrów próbki do wstępnie znakowanej probówki wirówkowej z 50 mikrolitrami buforu EIA o sile 10, aby umożliwić pomiar podstawowego uwalniania CGRP. Wyrzuć pozostałą ciecz i natychmiast przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Dodać badany związek do odpowiedniego nośnika w rosnących stężeniach, zaczynając od najniższego stężenia, i inkubować przez 10 minut.

Po 10 minutach inkubacji zebrać 200 mikrolitrów próbki we wstępnie oznakowanej probówce wirówkowej z 50 mikrolitrami buforu EIA o sile 10. Wyrzuć pozostały płyn i dodaj drugie najniższe stężenie do tkanki. Próbki należy natychmiast przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i powtórzyć tę procedurę z pozostałym stężeniem.

Aby przeprowadzić kontrolę pozytywną w eksperymencie, dodaj kontrolę pozytywną do tkanki na końcu protokołu. Po okresie inkubacji trwającym 10 minut zebrać próbkę o objętości 200 mikrolitrów w probówce wirówkowej z 50 mikrolitrami buforu EIA o sile 10. Stężenia CGRP uwalnianego w pobranych próbkach mierzy się za pomocą zestawu EIA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta dostarczonymi z zestawem EIA.

U szczurów ekspozycja na kapsaicynę indukowała znaczne uwalnianie CGRP z opony twardej i TG w porównaniu z podłożem. W oponie twardej maksymalne uwalnianie CGRP stwierdzono przy jednym mikromolu kapsaicyny. A w TG maksymalne uwalnianie CGRP stwierdzono przy 10 mikromolach kapsaicyny.

Podczas analizy za pomocą jednoczynnikowego ANOVA, glibenklamid nie wykazuje wpływu na podstawowe uwalnianie CGRP z opony twardej i TG. Glibenklamid istotnie zmniejszał indukowane kapsaicyną uwalnianie CGRP w oponie twardej o 40% i TG o 39% w porównaniu z kapsaicyną z podłożem, gdy analizowano je za pomocą jednoczynnikowej ANOVA. Stwierdzono, że przejściowy potencjał receptora agonista ankyryny-1 super aldehyd cynamonowy uwalnia CGRP w sposób zależny od stężenia z TG z 1, 10 i 100 mikromolami super aldehydu cynamonowego, co powoduje 9% 52% i 69% zwiększone uwalnianie CGRP w porównaniu z nośnikiem odpowiednio podczas analizy za pomocą dwukierunkowej ANOVA. Zwiększone uwalnianie CGRP było nieobecne w TG z myszy z nokautem ankyryny-1 o potencjale przejściowego receptora, u których ekspozycja na 1, 10 i 100 mikromolów super aldehydu cynamonowego powodowała 11% minus 13% i 9% zmianę w uwalnianiu CGRP odpowiednio w porównaniu z nośnikiem podczas analizy za pomocą dwukierunkowej ANOVA.

Ważne jest, aby zachować ostrożność, aby nie dotykać tkanki podczas pobierania próbki i zachować precyzję w określaniu czasu inkubacji dla wszystkich próbek. Jeśli dostępne są odpowiednie zestawy ELISA, możliwe jest zastosowanie tej procedury do pomiaru uwalniania innych peptydów obecnych w układzie naczyniowym nerwu trójdzielnego.