Name: Ex vivo Uwalnianie peptydu związanego z genem kalcytoniny z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę ex vivo do badania uwalniania CGRP z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni. Technika umożliwia analizę trzech odrębnych lokalizacji i ocenę wpływu substancji farmakologicznych na mechanizmy bólu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Fundację Candys.

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z przewodnikiem Wspólnoty Europejskiej dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt (2010/63/UE). Do zademonstrowania tego protokołu wykorzystano samce myszy C57BL / 6JBomTac w wieku 10 tygodni i samce szczurów Sprague Dawley w wieku 10 tygodni.
1. Przygotowanie syntetycznego płynu śródmiąższowego
<ol>
	<li>Przygotować syntetyczny płyn śródmiąższowy (SIF) według następującej receptury: 108 mM NaCl, 3,48 mM KCl, 3,50 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 11,70 mM NaH2PO4, 1,50 mM CaCl2, 9,60 mM Na-glukonianu, 5,50 mM glukozy i 7,60 mM sacharozy (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: SIF może być zróżnicowany w zależności od celu stymulacji, np. podczas badania kanałów wapniowych można zastosować roztwór bezwapniowy.</li>
	<li>Dostosuj pH do 7,4 i ustabilizuj pH przez gazowanie karbogenem (5% CO2 i 95% O2)46.</li>
</ol>
2. Eutanazja
<ol>
	<li>Znieczulenie dorosłych myszy i szczurów mieszaniną 70% CO2 i 30% O2 . Ścinaj głowy myszom za pomocą nożyczek, a szczurom za pomocą gilotyny (patrz Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Użyj odmiany i wieku, które pasują do celu badania. W tym modelu można używać zarówno mężczyzn, jak i kobiet.</li>
	<li>Oddziel głowę od ciała na poziomie C3-C4 rdzenia kręgowego. 
	UWAGA: Eutanazja może być również wykonana z dootrzewnowym wstrzyknięciem pentobarbitalu (100-150 mg/kg).</li>
</ol>
3. Sekcja
<ol>
	<li>Przygotuj tkankę szczura, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Usuń skórę i mięśnie wokół głowy i szyi za pomocą nożyczek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Użyj trymera do kości i nożyczek, aby oddzielić dolne szczęki od głowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B-C).</li>
		<li>Otwórz rdzeń kręgowy, wkładając doogonowo trymer do kości w grzbietową część kręgów i usuń grzbietową część kręgów, aby odsłonić rdzeń kręgowy i pień mózgu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D).</li>
		<li>Przeciąć część ogonową czaszki przy granicach kości potylicznej i międzyciemieniowej, aby usunąć te struktury kostne odsłaniające móżdżek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E). 
		UWAGA: Ważne jest, aby nie uszkodzić pnia mózgu i rdzenia kręgowego podczas przecinania i usuwania kręgów.</li>
		<li>Odizoluj TNC (Sp5C) biegnący doogonowo około 13-16 mm od bregmy z każdej strony, przecinając grzbietowo-boczną część pnia mózgu nożyczkami sprężynowymi. Zanurz lewą i prawą stronę TNC w SIF (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E-I). 
		UWAGA: Opis dotyczy dorosłych szczurów.</li>
		<li>Przytnij głowę do połowy odległości strzałkowej, aby podzielić czaszkę na dwie części za pomocą piły (<silna klasa="xfig">Rysunek 1J-L).</li>
		<li>Ostrożnie usuń mózg, nie dotykając opony twardej przyczepionej do czaszki za pomocą szpatułki i przecinając nerw trójdzielny w miejscu, w którym wchodzi on do pnia mózgu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1M-P).</li>
		<li>Aby odizolować TG, odetnij go, łącznie z jego gałęziami wokół granic wizualnych. Przetnij gałąź żuchwy w miejscu, w którym wchodzi ona w otwór owalny. Przetnij gałęzie okulistyczne i szczękowe wchodzące do czaszki, ponieważ nie są one podzielone makroskopowo. Podczas preparowania TG usuń oponę twardą pokrywającą TG (ryc. 1Q-T).</li>
		<li>Zanurz połówki czaszki i TG w SIF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj tkankę myszy, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Usuń skórę i mięśnie wokół głowy i szyi za pomocą małych nożyczek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A-B).</li>
		<li>Otwórz rdzeń kręgowy, wkładając doogonowo parę małych nożyczek do grzbietowej części kręgów i usuń grzbietową część kręgów, aby odsłonić rdzeń kręgowy i pień mózgu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C). 
		UWAGA: Ważne jest, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego podczas przecinania i usuwania kręgów.</li>
		<li>Przeciąć czaszkę wzdłuż granic kości potylicznej i międzyciemieniowej, aby usunąć te struktury kostne odsłaniające móżdżek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D-F).</li>
		<li>Następnie przetnij kość ciemieniową w połowie strzałki i usuń kość, aby odsłonić mózg (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2G-I).</li>
		<li>Ostrożnie usuń móżdżek szpatułką, aby odsłonić pień mózgu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2J).</li>
		<li>Odizoluj część pnia mózgu zawierającą TNC za pomocą nożyczek sprężynowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2K-N). Zanurz pień mózgu za pomocą TNC w SIF (<silna klasa="xfig">Rysunek 2O).</li>
		<li>Usuń mózg i przetnij nerw trójdzielny w miejscu, w którym wchodzi on do pnia mózgu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2P-Q).</li>
		<li>Aby odizolować TG, odetnij go, łącznie z jego gałęziami wokół granic wizualnych. Przetnij gałąź żuchwy w miejscu, w którym wchodzi ona w otwór owalny. Przetnij gałęzie okulistyczne i szczękowe wchodzące do czaszki, ponieważ nie są one podzielone makroskopowo. Podczas preparowania TG usuń oponę twardą pokrywającą TG (<silna klasa="xfig">Rysunek 2R-S).</li>
		<li>Zanurz TG w SIF (<silna klasa="xfig">Rysunek 2T).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Mycie
<ol>
	<li>Myj połówki czaszki, TNC i TG w SIF przez 30 minut, wymieniając SIF co 5 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Etapy prania można wykonać, trzymając chusteczkę w plastikowych pojemnikach z tiulową pokrywką, aby umożliwić łatwą wymianę SIF (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A-B).</li>
	<li>Przygotuj tkankę szczura, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Przenieś połówki TNC do oddzielnych nasadek probówek do mikrowirówek z 350 μl SIF (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C).</li>
		<li>Przenieś TG do nasadek probówek do mikrowirówek - jedna TG na nasadkę probówki do mikrowirówki z 350 μL SIF (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
		<li>Umieść połówki czaszki na platformach wykonanych z gliny lub 6-dołkowej płytce hodowlanej i wypełnij czaszkę 400 μl SIF (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj tkankę myszy, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Przenieś pień mózgu za pomocą TNC do nasadki probówki mikrowirówkowej z 250 μl SIF (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D).</li>
		<li>Przenieś dwie TG do nasadki probówki do mikrowirówki z 250 μl SIF (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3D). 
		UWAGA: Umieść dwie TG na nasadkę probówki mikrowirówkowej podczas używania tkanek od myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić czaszki szczurów i nakrętki probówek do mikrowirówek z tkankami szczurów i myszy w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C. Wymieniać SIF za pomocą pipety co 5 minut przez 20 minut. 
	UWAGA: Ważne jest, aby nie dotykać tkanki podczas dodawania i usuwania SIF.</li>
</ol>
5. Testy na obecność narkotyków
<ol>
	<li>Określ podstawowe poziomy uwalniania CGRP.
	<ol>
		<li>Po ostatnim praniu dodaj 250 μl SIF do mysich TG i TNC. Dodać 350 μl do TG i TNC szczura i 400 μl do każdej czaszki szczura.</li>
		<li>Po 10 minutach inkubacji zebrać 200 μl próbki do probówki mikrowirówkowej i dodać 50 μl 10-krotnego buforu EIA (dostarczonego z zestawem do testu immunoenzymatycznego CGRP, patrz tabela materiałów), aby umożliwić pomiar podstawowego uwalniania CGRP (krok 6). Wylej pozostały płyn. 
		UWAGA: Czas inkubacji musi być taki sam dla wszystkich próbek.</li>
		<li>Próbki należy natychmiast przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Po pobraniu próbek podstawowych poziomów uwalniania CGRP postępuj zgodnie z jedną z trzech metod: (A) Pojedyncza stymulacja (krok 5.2); (B) stymulacja koncentracji-odpowiedzi (krok 5.3); oraz (C) Hamowanie stymulacji (krok 5.4) (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). 
		UWAGA: Badany związek i zastosowane stężenia zależą od celu badania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj pojedynczą stymulację, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Dodać badany związek lub nośnik do tkanki i pozostawić na 10 minut (objętość: 250 μl dla TG i TNC myszy, 350 μl dla TG i TNC szczura i 400 μl dla każdej czaszki szczura).</li>
		<li>Po 10 minutach inkubacji zebrać 200 μl próbki do probówki mikrowirówkowej z 50 μl 10-krotnego buforu EIA. Pozostałą ciecz należy odrzucić i natychmiast przechowywać próbki w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Czas inkubacji musi być taki sam dla wszystkich próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj stymulację koncentracji-odpowiedzi, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć badany związek lub nośnik do pożądanych stężeń. Dodać badany związek w rosnących stężeniach, zaczynając od najniższego stężenia. 
		UWAGA: Badany związek i zastosowane stężenia zależą od celu badania. Na przykład w niniejszym badaniu użyto aldehydu supercynamonowego 1 μM, 10 μM i 100 μM.</li>
		<li>Dodać najniższe stężenie (1 μM dla niniejszego badania) badanego związku i odpowiadającego mu nośnika do dwóch identycznych preparatów tkankowych i inkubować przez 10 minut (objętość: 250 μl dla tkanki myszy, 350 μl dla TG i TNC szczura i 400 μl dla każdej czaszki szczura).</li>
		<li>Po 10 minutach inkubacji zebrać 200 μl próbki do probówki mikrowirówkowej z 50 μl 10-krotnego buforu EIA.</li>
		<li>Odrzucić pozostałą ciecz i dodać drugie najniższe stężenie (10 μM dla niniejszego badania) do tkanki.</li>
		<li>Próbki należy natychmiast przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Powtórzyć tę procedurę dla pozostałych stężeń (100 μM dla niniejszego badania).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj hamowanie stymulacji, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Dodać bloker lub nośnik do tkanki i inkubować przez 10 minut (objętość: 250 μl dla tkanki myszy, 350 μl dla TG i TNC szczura i 400 μl dla każdej czaszki szczura). 
		UWAGA: Zastosowany bloker i stężenie zależą od celu badania. Na przykład glibenklamid 3 μM został użyty do uzyskania reprezentatywnego wyniku w <silna klasa="xfig">Rysunek 5.</li>
		<li>Po 10 minutach inkubacji zebrać 200 μl próbki w probówce mikrowirówkowej z 50 μl 10-krotnego buforu EIA. Odrzucić pozostałą ciecz i natychmiast przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Dodać agonistę lub agonistę + bloker (patrz Tabela Materiałów) do tkanki i inkubować przez 10 min. 
		UWAGA: Zastosowany agonista, bloker i stężenia zależą od celu badania. W niniejszym badaniu użyto 3 μM glibenklamidu i 1 μM kapsaicyny, <silna klasa="xfig">Ryc. 5.</li>
		<li>Po 10 minutach inkubacji zebrać 200 μl próbki w probówce mikrowirówkowej z 50 μl 10-krotnego buforu EIA. Odrzucić pozostałą ciecz i natychmiast przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić kontrolę pozytywną dla eksperymentu.
	<ol>
		<li>W stosownych przypadkach dodać kontrolę dodatnią (np. 1–10 μM kapsaicyny, zob. tabela materiałów) do tkanki na końcu protokołu i zebrać próbkę o objętości 200 μl do probówki mikrowirówkowej z 50 μl buforu 10x EIA po okresie inkubacji wynoszącym 10 min. 
		UWAGA: Korzystne jest włączenie kontroli dodatniej, aby upewnić się, że konfiguracja i tkanki funkcjonują. Kapsaicyna48,49,50 lub depolaryzujący bodziec potasu (40-60 mM KCl)46,47,49 są rutynowo stosowane w celu spowodowania uwolnienia CGRP z układu trójdzielno-naczyniowego. 40-60 mM KCl SIF przygotowuje się jako SIF, z wyjątkiem NaCl jest wymieniany na KCl na zasadzie równomolowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza stężeń CGRP
<ol>
	<li>Zmierz ilość uwalnianego CGRP za pomocą zestawu do testu immunoenzymatycznego (EIA) zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Zmierzyć gęstość optyczną przy 410 nm za pomocą fotometru płytkowego. Jeśli używany jest inny zestaw CGRP EIA, zmierz gęstość optyczną przy długości fali podanej w protokole producenta. 
	UWAGA: Próbki należy rozcieńczyć, aby pasowały do krzywej wzorcowej.</li>
	<li>Przeprowadzanie analizy danych.
	<ol>
		<li>Przedstaw dane jako stężenia bezwzględne lub znormalizuj do podstawowego uwalniania CGRP z określonej tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana metoda została opracowana na podstawie badań wykazujących znaczenie CGRP w patofizjologii migreny. Doskonale nadaje się do badania mechanizmów związanych z uwalnianiem CGRP z układu trójdzielno-naczyniowego, co ma kluczowe znaczenie dla sygnalizacji bólu w okolicy głowy. Ilość CGRP uzyskana w tym modelu bezpośrednio mierzy uwalnianie CGRP z nerwów trójdzielnych unerwiających oponę twardą, TG i TNC. Ilość uwalniania CGRP jest ilościowo większa45,54 niż ilość uwalniania mierzonego w osoczu po termokoagulacji u ludzi, stymulacji trójdzielnej u kota 39,55,56 i podczas ataków migreny 23. Jednym z wyjaśnień może być to, że CGRP jest rozcieńczony i zdegradowany we krwi54. Należy jednak zauważyć, że bezpośrednia stymulacja substancjami chemicznymi może być lepsza niż aktywacja patofizjologiczna. Kolejną zaletą jest to, że możliwe jest zlokalizowanie uwolnienia z trzech różnych miejsc w układzie trójdzielno-naczyniowym i że może być ono stosowane razem z manipulacją farmakologiczną oraz w tkankach genetycznie zmodyfikowanych gryzoni.
Ostatnio wiele przedklinicznych modeli gryzoni koncentruje się na ogólnoustrojowym podawaniu substancji i późniejszych odczytach związanych z bólem lub migreną za pomocą testów von Freya57,58, grymasów 59,60,61 lub awersji do światła 62,63,64. Metody te są przydatne w zrozumieniu właściwości przeciwbólowych i przeciwbólowych różnych substancji. Podejścia te nie dostarczają jednak żadnych informacji na temat konkretnych tkanek docelowych zaangażowanych w badanie. W niniejszej metodzie układ trójdzielno-naczyniowy dzieli się na trzy struktury: oponę twardą, TG i TNC. Umożliwia to miejscową ekspozycję każdej struktury i ocenę miejsca działania konkretnej substancji. Zostało to wykorzystane w badaniu z 2011 roku, w którym zbadano rolę kanałów wapniowych bramkowanych napięciem u szczurów i stwierdzono, że hamowanie tych kanałów jest różne w trzech strukturach szlaku trójdzielno-naczyniowego47. Podczas preparowania struktur układu nerwowego aksotomia jest nieunikniona. Wykazano, że aksotomia zmienia transkrypcję różnych genów65. Te zmiany transkrypcyjne są zbyt wolne, aby wpłynąć na wyniki tej metody, ale nie można wykluczyć zmian w fosforylacji w porównaniu z sytuacjami in vivo 46. Chociaż neuropeptydy, takie jak CGRP, powstają w somie komórkowej, uwalnianie i działanie neuropeptydów odbywa się zwykle w centralnych lub obwodowych zakończeniach nerwowych. Tak więc badania nienaruszonych neuronów, w tym końcówek, są interesujące przy badaniu uwalniania neuropeptydów. W związku z tym ustalono metody badania kultur neuronów z izolowanych zwojów, które służą jako model zakończeń. Jednak hodowle komórek neuronalnych są narażone na kilka problemów, ponieważ mechaniczna dysocjacja może zniszczyć neurony w kulturze46. Dłuższe ramy czasowe związane z hodowlą komórek sprawiają, że metoda ta jest wrażliwa na zmiany transkryptomiczne spowodowane aksotomią i warunkami hodowli65. Co więcej, dodanie czynników wzrostu i hodowla na powłokach powierzchniowych zmieniły właściwości neuronów jako ekspresję przekaźnika i receptora 66,67,68,69. Problemów tych unika się, badając świeżo izolowane nienaruszone zwoje nerwowe zamiast kultur komórek neuronalnych.
Jednym z wyzwań związanych z metodą uwalniania CGRP ex vivo jest precyzyjna sekcja tkanki wymagana do uzyskania powtarzalnych wyników. Szczególnie dokładna sekcja TNC jest trudna, ponieważ jest to struktura w pniu mózgu bez widocznych granic. Co więcej, opona twarda jest delikatna, a usunięcie mózgu musi być przeprowadzone ostrożnie, aby zapewnić nienaruszoną strukturę. Przeszkody te mogą skutkować różną wielkością tkanki, a tym samym różnymi poziomami CGRP u podstawy i indukowanymi stymulacją. Jednak tę zmienność można wytłumaczyć normalizacją do podstawowego uwalniania CGRP. Należy również zauważyć, że podczas izolowania TNC od myszy izolowana jest cała dolna część pnia mózgu, a nie bardziej specyficzna część zawierająca TNC, jak to ma miejsce u szczurów. Ogólnie rzecz biorąc, stosowanie tkanki szczura może być korzystne, ponieważ umożliwia to pomiar uwalniania CGRP z opony twardej i bardziej precyzyjne rozwarstwienie TNC. Co więcej, rozmiar tkanki umożliwia również wykorzystanie szczura jako kontroli nośnika, ponieważ jeden szczur daje dwie połówki czaszki, dwie TG i dwa TNC, w których jeden fragment tkanki jest używany do stymulacji substancji, a drugi do nośnika. W przypadku korzystania z myszy, do jednego eksperymentu potrzebne są dwa zwierzęta, ponieważ oba TG są łączone w jednej próbce, a TNC są preparowane jako jeden pień mózgu. W związku z tym dwa TG i jeden pień mózgu są używane do stymulacji substancji, a dwa TG i jeden pień mózgu innej myszy są używane do kontroli pojazdu. Powoduje to użycie dwa razy więcej myszy w porównaniu ze szczurami, aby uzyskać tę samą liczbę powtórzeń. Aby zmniejszyć liczbę wykorzystywanych myszy, zaproponowano metodę pomiaru uwalniania CGRP z wycinków pnia mózgu49. Zaletą jest to, że metoda została zmodyfikowana, aby umożliwić wykorzystanie myszy. Pozwala to na wykorzystanie wielu już dostępnych transgenicznych szczepów myszy, co jest przydatnym narzędziem do badania np. szlaków sygnałowych. Kontrola pozytywna na koniec doświadczenia powinna być uwzględniona w celu zapewnienia, że tkanka użyta w doświadczeniu może uwolnić CGRP. Kontrolą pozytywną może być agonistyczna kapsaicyna TRPV1 lub depolaryzujący bodziec potasowy (KCl), które, jak stwierdzono, uwalniają CGRP z układu trójdzielno-naczyniowego zarówno u myszy, jak i szczurów 46,47,48,49,50. Co więcej, metoda została również dostosowana do pomiaru uwalniania innych istotnych peptydów, takich jak peptyd aktywujący cyklazę adenylanową przysadki (PACAP) - kolejny peptyd o dużym zainteresowaniu w badaniach nad migreną70.
Metoda ta stanowi użyteczne narzędzie do badania uwalniania CGRP z określonych tkanek docelowych u szczurów i myszy. Jest to stosunkowo szybka metoda, która pozwala uniknąć problemów związanych z hodowlą neuronów. Protokół metody można łatwo zmodyfikować w celu zbadania zależności stężenie-odpowiedź lub hamowania odpowiedzi przez różne związki farmakologiczne. Metoda uwalniania CGRP ex vivo jest jedną z kilku metod przedklinicznych przydatnych do badania roli CGRP i innych mechanizmów związanych z uwalnianiem CGRP w patofizjologii migreny.

Migrena to zaburzenie neurologiczne, które według WHO według szacunków dotyka ponad 1 miliarda ludzi i jest jedną z głównych przyczyn niepełnosprawności na całym świecie1. W związku z tym migrena ma znaczący wpływ zarówno na pacjentów, jak i na społeczeństwo. Pomimo niedawnego sukcesu klinicznego leków antagonizujących CGRP, duża część pacjentów potrzebuje lepszych opcji leczenia2,3,4,5. Konieczne jest wyjaśnienie patofizjologii migreny prowadzące do nowych, skutecznych metod leczenia. Sygnalizacja w układzie trójdzielno-naczyniowym składającym się z opon mózgowych, zwojów nerwu trójdzielnego (TG) i jądra nerwu trójdzielnego (TNC) ma kluczowe znaczenie dla patofizjologii migreny6,7.
37-aminokwasowy peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP) został po raz pierwszy odkryty na początku lat 80., kiedy Amara i współpracownicy wykazali, że pierwotny transkrypt RNA genu kalcytoniny może być przetworzony w celu uzyskania mRNA kodującego CGRP oprócz kalcytoniny8,9. Późniejsze badania sugerowały związek z patofizjologią migreny10. CGRP jest neuroprzekaźnikiem o silnych właściwościach rozszerzających naczynia krwionośne11,12,13,14,15,16,17, i jest szeroko rozpowszechniony w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym13,14,18,19,20,21,22. Udział CGRP w migrenie został podkreślony odkryciem podwyższonego poziomu CGRP w krążeniu pozamózgowym podczas ataków migreny u ludzi23, oraz że wlew CGRP powoduje ból podobny do migreny u pacjentów24. Dwa lata później opublikowano pierwsze badanie potwierdzające skuteczność antagonisty CGRP olcegepantu w leczeniu migreny25.
CGRP występuje obficie w układzie trigeminovascular (układ trójdzielno-naczyniowy), jak pokazano w TG21,26, czuciowe włókna nerwowe unerwiające oponę twardą27,28,29 oraz TNC30. W układzie trójdzielno-naczyniowym CGRP znajduje się w małych i średnich neuronach TG, w niezmielinizowanych włóknach C i ulega ekspresji w prawie 50% populacji neuronów TG. Receptor CGRP ulega ekspresji głównie w większych neuronach i znajduje się w mielinowanych włóknach Aδ31,32. CGRP jest uwalniany z neuronów po stymulacji chemicznej lub elektrycznej33,34. Badania szlaków prowadzących do uwalniania CGRP i lokalizacji tej aktywacji mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia patofizjologii migreny. W ciągu ostatnich 5 dekad badania przedkliniczne przyczyniły się do zdobycia obszernej wiedzy na temat sygnalizacji związanej z migreną i przyczyniły się do opracowania nowych metod leczenia35. Wiele metod uwzględniających zajęcie naczyń krwionośnych i neurogennych zostało zmodyfikowanych i zastosowanych w badaniach nad migreną. Modele in vivo i in vitro odpowiedzi tętnic na związki biologiczne lub leczenie farmakologiczne17,36,37, oraz elektryczna stymulacja nerwów38,39 można wymienić. Co więcej, aktywowane neurony w TNC mogą być wykrywane przez wyrażenie c-Fos40,41,42 i zapisy elektrofizjologiczne w tym obszarze43,44. Obie metody mierzą sygnały nocyceptywne przekazywane do mózgu z głowy, np. opony twardej. Zastosowanie tylko jednego modelu przedklinicznego nie daje pełnego obrazu patofizjologii migreny. Dlatego ważne jest, aby łączyć różne modele obejmujące jak najwięcej aspektów patofizjologii migreny. Ciągły rozwój nowych modeli obejmie różne aspekty mechanizmów migreny, a z czasem tajemnica patofizjologii migreny zostanie odkryta.
Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół metody uwalniania CGRP, wykonywanej ex vivo w wyizolowanych TG i TNC od myszy po stymulacji chemicznej. Uwalnianie CGRP można również badać w oponie twardej u szczurów. Tak więc w protokole eksperymentalnym dla szczurów opona twarda jest opisana razem z TG i TNC. Podstawy metody uwalniania CGRP zostały po raz pierwszy opisane w 1999 roku, gdzie Ebersberger i współpracownicy przeprowadzili pionierskie badania i odkryli, że CGRP został uwolniony z opony twardej po chemicznej i elektrycznej stymulacji opony twardej aferentów u szczurów45. Później to podejście zostało rozszerzone na wydanie CGRP z TG46 i TNC47. Następnie metoda została zmodyfikowana, aby można ją było zastosować do TG i TNC u myszy. Do tej pory uwalnianie CGRP z opony twardej było wyzwaniem u myszy.

<table><tbody><tr><td>6-dołkowa płytka hodowlana</td><td>NUNC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Merck</td><td>1.02382.1000</td><td>Do bufora SIF</td></tr><tr><td>Nakrętki do pojemników plastikowych</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>536617</td><td></td></tr><tr><td>Kapsaicyna</td><td>Merck</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy CGRP</td><td>AH Diagnostics</td><td>A05482.96</td><td></td></tr><tr><td>CO2</ pod></td><td>Strandm&oslash; llen</td><td>4.6</td><td>Do gazowania karbonowego SIF</td></tr><tr><td>Delikatny trymer do kości</td><td>Fine Science Tools</td><td>16109-14</td><td></td></tr><tr><td>Glibenklamid</td><td>Tocris</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td>Do bufora SIF</td></tr><tr><td>Gilotyna dla szczurów</td><td>Scandidact</td><td>NS-802</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Merck</td><td>M5921</td><td>Do bufora SIF</td></tr><tr><td>Rurki do mikrocenrifuge + pokrywki/nasadki</td><td>VWR</td><td>700-5239</td><td></td></tr><tr><td>Mini piła do metalu</td><td>BAHCO</td><td>208</td><td></td></tr><tr><td>O2</td><td>Strandm&oslash; llen</td><td>4.5</td><td>Do gazowania karbogenem SIF</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Glostrup apteka</td><td>NA</td><td>Formuła magistralna</td></tr><tr><td>Pojemniki plastikowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>536455</td><td></td></tr><tr><td>Fotometr płytkowy - Infinite M200</td><td>Tecan</td><td>NA</td><td>Infinite M200 zostaje wycofany z produkcji. Infinite 200 PRO jest dostępny pod adresem Tecan. Oprogramowanie: SW Magellan v.6.3</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Merck</td><td>P9333</td><td>Do bufora SIF</td></tr><tr><td>Nożyce</td><td>Allgaier Instruments</td><td>307-156-170</td><td></td></tr><tr><td>Małe nożyczki</td><td>Allgaier Instruments</td><td>04-520-115</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Merck</td><td>S6014</td><td>Do bufora SIF</td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>soduMerck</td><td>S9888</td><td>Dla buforu SIF</td></tr><tr><td>Monohydrat diwodorofosforanu sodu</td><td>Merck</td><td>1.06346.1000</td><td>Dla buforu SIF</td></tr><tr><td>Glukonian sodu</td><td>Merck</td><td>S2054</td><td>Dla bufora SIF</td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>Bochem Lab Supply</td><td>3018</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Merck</td><td>84097</td><td>Dla Bufor SIF</td></tr><tr><td>Aldehyd supercynamonowy</td><td>Merck</td><td>S3322</td><td></td></tr><tr><td>Tiul (tkaniny)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Kupiony w lokalnym sklepie z tkaninami</td></tr></tbody></table>

ex vivo uwalnianie peptydu związanego z genem kalcytoniny z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni

Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents

Peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP) został po raz pierwszy odkryty w latach 80. jako wariant splicingu genu kalcytoniny. Od czasu jego odkrycia, jego rola w patofizjologii migreny została dobrze ustalona, najpierw ze względu na jego silne właściwości rozszerzające naczynia krwionośne, a następnie przez jego obecność i funkcję jako neuroprzekaźnika w czuciowym układzie trójdzielno-naczyniowym. Zdolność CGRP do wywoływania migreny pomogła przemysłowi farmaceutycznemu w opracowaniu przeciwciał monoklonalnych i antagonistów hamujących działanie CGRP. Nowy paradygmat leczenia okazał się skuteczny w profilaktyce migreny. Jednym z użytecznych narzędzi do lepszego zrozumienia mechanizmów migreny jest model ex vivo uwalniania CGRP z układu trójdzielno-naczyniowego. Jest to stosunkowo prosta metoda, która może być stosowana z różnymi narzędziami farmakologicznymi w celu uzyskania know-how w celu dalszego rozwoju nowych skutecznych metod leczenia migreny. Niniejszy protokół opisuje model uwalniania CGRP oraz technikę ilościowego określania wpływu środków farmakologicznych na ilość CGRP uwalnianego z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni. Przedstawiono procedurę opisującą eksperymentalne podejście od eutanazji do pomiaru poziomu białka. Szczegółowo opisano niezbędną izolację zwoju nerwu trójdzielnego i jądra dolnego nerwu trójdzielnego zarówno od myszy, jak i szczurów oraz przygotowanie opony twardej szczura. Ponadto przedstawiono reprezentatywne wyniki dla obu gatunków (szczurów i myszy). Technika ta jest kluczowym narzędziem do badania mechanizmów molekularnych związanych z patofizjologią migreny przy użyciu różnych związków farmakologicznych i genetycznie modyfikowanych zwierząt.

Niniejsza technika jest narzędziem do badania molekularnych mechanizmów związanych z CGRP, które biorą udział w patogenezie migreny. Pozwala ona na ocenę uwalniania CGRP z różnych poziomów układu trójdzielno-naczyniowego i może być stosowana zarówno u myszy i szczurów typu dzikiego, jak i u zwierząt transgenicznych, w połączeniu z różnymi związkami farmakologicznymi. W niniejszym opracowaniu przedstawiono eksperymenty z krzywą koncentracja-odpowiedź oraz próby blokowania przeprowadzone na szczurach, a także wyniki analizy koncentracja-odpowiedź u myszy typu dzikiego i transgenicznych.
Metodę uwalniania CGRP wykorzystano do zbadania wpływu glibenklamidu, inhibitora kanałów KATP, na uwalnianie CGRP z zwoju trójdzielnego (TG) i opony twardej u samic szczurów z spontaniczną allodynią trójdzielną (STA). W pierwszej kolejności, za pomocą badania zależności dawka-odpowiedź, wyznaczono optymalne stężenie kapsaicyny. Narażenie na kapsaicynę wywołało istotne uwalnianie CGRP z opony twardej i TG w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 5). W oponie twardej maksymalne uwalnianie CGRP odnotowano przy stężeniu kapsaicyny 1 µM, natomiast w TG maksymalne uwalnianie CGRP stwierdzono przy 10 µM kapsaicyny (Rysunek 5A-B). Na podstawie eksperymentów nad zależnością dawka-odpowiedź, do doświadczeń z blokowaniem wybrano 1 µM kapsaicyny oraz 3 µM glibenklamidu. Analiza jednoczynnikową ANOVA wykazała, że glibenklamid nie wpływa na podstawowe uwalnianie CGRP z opony twardej (P = 0,441) i TG (P = 0,881)51. Glibenklamid istotnie zredukował indukowane kapsaicyną uwalnianie CGRP w oponie twardej o 40% (P = 0,031) oraz w TG o 39% (P = 0,003) w porównaniu z grupą otrzymującą kapsaicynę z nośnikiem, co wykazano w analizie jednoczynnikową ANOVA (Rysunek 5C-D)51.
U myszy protokół ten wykorzystano do zbadania roli kanału jonowego TRPA1 (transient receptor potential ankyrin 1) w modelu migreny indukowanej GTN, w którym nadwrażliwość wywołana przez GTN była w pełni zależna od kanałów TRPA1. Stwierdzono, że agonista TRPA1, supercynamaldehyd (SCA), powoduje zależne od dawki uwalnianie CGRP z zwoju trójdzielnego (TG); zastosowanie 1 µM, 10 µM i 100 µM SCA doprowadziło odpowiednio do wzrostu uwalniania CGRP o 9% (P = 0,23), 51% (P = 0,011) i 69% (P = 0,0097) w porównaniu z grupą kontrolną (vehicle), wg analizy dwuczynnikową ANOVA. Uwalnianie to nie wystąpiło w TG myszy z nokautem genu Trpa1, gdzie ekspozycja na 1 µM, 10 µM i 100 µM SCA spowodowała odpowiednio zmianę poziomu uwalniania CGRP o 11% (P &gt; 0,99), -13% (P &gt; 0,99) i 9% (P = 0,97) w porównaniu z grupą kontrolną, wg analizy dwuczynnikowej ANOVA. Następna stymulacja 10 µM kapsaicyną (kontrola dodatnia) wykazała, że wszystkie próbki tkanek były zdolne do uwalniania CGRP (Rysunek 6)50.
<img alt="Proces dyssekcji tkanki przedstawiający kolejne kroki z użyciem instrumentów, podkreślający precyzyjną technikę laboratoryjną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Krok po kroku dyssekcja tkanki szczura. Szczegóły (A-T) znajdują się w sekcji protokołu (krok 3.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Procedura sekcji mózgu myszy; szczegółowe kroki; narzędzia chirurgiczne; ekstrakcja tkanki; przewodnik edukacyjny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Krok po kroku sekcja tkanki z myszy. Szczegóły (A-T) zostały podane w sekcji protokołu (krok 3.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces decelularyzacji tkanki; ustawienie eksperymentu z pojemnikami i próbkami tkanek do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Płukanie i inkubacja tkanek gryzoni. (A-B) Świeżo wyizolowana tkanka w plastikowych pojemnikach z SIF. Pojemniki są przykryte tiulem, aby umożliwić łatwą wymianę SIF. (C) Tkanka szczura - dwie połówki czaszki z oponą twardą pokrywającą wewnętrzne wyściółki czaszki umieszczone na płytce hodowlanej 6-dołkowej. Prawe i lewe jądro zstępujące nerwu trójdzielnego w osobnych zakrętkach probówek do mikrocentryfugi (górny rząd zakrętek). Dwa zwoje trójdzielne w oddzielnych zakrętkach probówek do mikrocentryfugi (dolny rząd zakrętek). (D) Tkanka myszy - część pnia mózgu zawierająca jądro zstępujące nerwu trójdzielnego w osobnej zakrętce probówki do mikrocentryfugi (góra). Dwa zwoje trójdzielne myszy znajdują się w jednej zakrętce probówki do mikrocentryfugi (dół). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat protokołów stymulacji; pojedyncza, zależna od stężenia, hamowanie; harmonogram dodawania roztworów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Schematy badań uwalniania CGRP. Trzy różne protokoły przeprowadzania eksperymentów uwalniania CGRP. Leki należy rozcieńczyć w syntetycznym płynie śródmiąższowym (SIF). (A) Pojedyncza stymulacja. (B) Stymulacja zależna od stężenia. (C) Hamowanie stymulacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres przedstawiający poziomy CGRP w odpowiedzi na kapsaicynę w różnych stężeniach; analiza statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Glibenklamid hamuje indukowane kapsaicyną uwalnianie CGRP z opony twardej i zwoju trójdzielnego szczura. Poziomy CGRP w zwoju trójdzielnym i oponie twardej wyizolowanych od samic szczurów z samoistną allodynią trójdzielną (STA) (215-318 g), pozyskanych pierwotnie z Thomas Jefferson University52, zmierzono za pomocą komercyjnych zestawów EIA do ludzkiego CGRP. (A-B) Uwalnianie CGRP z (A) opony twardej i (B) zwoju trójdzielnego po zastosowaniu zwiększających się stężeń kapsaicyny (10 nM, 100 nM, 1 µM i 10 µM) (n = 4). Dane przedstawiono jako punkty indywidualne i przeanalizowano za pomocą dwuczynnikowej analizy ANOVA. ****p &lt; 0.0001 (C-D) Poziomy CGRP uwalnianego z (C) opony twardej i (D) zwoju trójdzielnego po 10 min ekspozycji na nośnik, 3 µM glibenklamid (glib), 1 µM kapsaicynę oraz 1 µM kapsaicynę + 3 µM glib (n = 6-11). Dane przedstawiono jako punkty indywidualne oraz wartości średnie i przeanalizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA. *w porównaniu do nośnika. #kapsaicyna w porównaniu do kapsaicyny + glib. #P &lt; 0.05, ** i ##P &lt; 0.01, ****P &lt; 0.0001. Analizy uzupełniono testem wielokrotnych porównań Bonferroniego. Dla wszystkich testów przyjęto poziom istotności α = 0.05. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Christensen et al.51. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy stężenia CGRP w zależności od stężenia SCA dla grup WT i Trpa1 KO, analiza porównawcza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Ekspozycja na SCA skutkuje zależnym od TRPA1 uwalnianiem CGRP z zwoju trójdzielnego myszy. Poziomy CGRP uwalnianego ze zwojów trójdzielnych izolowanych od samców myszy WT oraz Trpa1 null (Trpa1tm1/Dpc)53 (8-10 tygodni) mierzono za pomocą zestawów EIA dla CGRP szczura po ekspozycji na supercynamaldehyd (SCA) w stężeniach 1 µM, 10 µM i 100 µM oraz kapsaicynę w stężeniu 10 µM jako kontrolę pozytywną (n = 6). Dane z każdej myszy przedstawiono jako pojedyncze punkty, a słupki wskazują wartości średnie. Statystyka: Porównanie między SCA a nośnikiem przy każdym stężeniu oraz między poziomem podstawowym a kontrolą pozytywną przeprowadzono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami. Poziom istotności α = 0,05. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Christensen et al.50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Obecny protokół opisuje model uwalniania peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) ex vivo oraz strategię ilościowego określania wpływu środków farmakologicznych na ilość CGRP uwalnianego z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni.

Ex vivo Uwalnianie peptydu związanego z genem kalcytoniny z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) was first discovered in the 1980s as a splice variant from the calcitonin gene. Since its discovery, its role in ...

Metoda ta jest narzędziem do badania mechanizmów związanych z uwalnianiem CGRP z układu naczyniowego nerwu trójdzielnego. Główną zaletą tej metody jest możliwość podzielenia układu naczyniowego nerwu trójdzielnego na trzy różne miejsca i oceny uwalniania CGRP w każdym odrębnym miejscu. Procedurę zademonstruję ja i Inger Jansen-Olesen, starszy naukowiec z naszej grupy.Na początek przygotuj tkankę szczura, usuwając skórę i mięśnie wokół głowy i szyi za pomocą nożyczek. Następnie użyj trymera do kości i nożyczek, aby oddzielić dolne szczęki od głowy. Teraz odsłoń rdzeń kręgowy i pień mózgu, wkładając doogonowo trymer do kości w grzbietową część kręgów i usuń go.Następnie przetnij ogonową część czaszki przy granicach kości potylicznej i międzyciemieniowej, aby usunąć te struktury kostne, odsłaniając móżdżek. Aby odizolować TNC biegnący doogonowo około 13 do 16 milimetrów od bregmy z każdej strony, odetnij grzbietowo-boczną część pnia mózgu nożyczkami sprężynowymi. Następnie zanurza się lewą i prawą stronę TNC w SIF.Następnie przetnij głowę w połowie obsady, aby podzielić czaszkę na dwie części za pomocą piły. Teraz ostrożnie usuń mózg, nie dotykając opony twardej przyczepionej do czaszki za pomocą szpatułki. Aby wyizolować TG, przetnij go, w tym jego gałęzie wokół granic wizualnych, przy czym gałąź żuchwy wchodzi w otwór owalny, a gałęzie oczne i szczękowe wchodzą do czaszki.Następnie zanurz połówki czaszki i TG w SIF. Aby przygotować tkankę myszy, usuń skórę i mięśnie wokół głowy i szyi za pomocą nożyczek. Teraz odsłoń rdzeń kręgowy i pień mózgu, wkładając doogonowo nożyczki do grzbietowej części kręgów i usuń je.Następnie przetnij ogonową część czaszki przy granicach kości potylicznej i międzyciemieniowej, aby usunąć te struktury kostne odsłaniające móżdżek. Przetnij kość ciemieniową w połowie obsadzenia i usuń kość, aby odsłonić mózg. Ostrożnie usuń móżdżek, aby odsłonić pień mózgu za pomocą szpatułki.Odizoluj TNC zawierający część pnia mózgu za pomocą nożyczek sprężynowych, a następnie zanurz pień mózgu w SIF. Teraz ostrożnie usuń mózg za pomocą szpatułki i przetnij nerw trójdzielny w miejscu, w którym wchodzi do pnia mózgu. Aby wyizolować TG, przetnij go, w tym jego gałęzie wokół granic wizualnych z gałęzią żuchwy, w miejscu, w którym wchodzi w otwór owalny oraz gałęziami ocznymi i szczękowymi wchodzącymi do czaszki.Następnie zanurz TG w SIF. Aby ułatwić wymianę SIF, dodaj pokrywę do plastikowych pojemników i rozpocznij mycie tkanek szczurów i myszy w SIF przez 30 minut, wymieniając SIF co pięć minut. Po 30 minutach mycia w temperaturze pokojowej przenieś połówki TNC szczura i TG szczura do oddzielnych nakrętek probówek do mikrowirówek z 350 mikrolitrami SIF.Przenieś pień mózgu myszy z TNC do nasadki probówki mikrowirówki z 250 mikrolitrami SIF. Na koniec przenieś dwie mysie TG do nasadki probówki mikrowirówki z 250 mikrolitrami SIF. Umieść połówki czaszki szczura na sześciodołkowej płytce hodowlanej i wypełnij czaszkę 400 mikrolitrami SIF.Umieść czaszki szczurów w nakrętkach probówek do mikrowirówek z tkanką szczura i myszy w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wymieniaj SIF za pomocą pipety co pięć minut przez 20 minut bez dotykania tkanki. Przygotować probówki do mikrowirówek do pobrania próbki, odpowiednio etykietując.Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu EIA o sile 10 do każdej probówki mikrowirówkowej. Następnie należy przygotować roztwór badanego związku i roztwór nośnika, rozcieńczając go w SIF dla wszystkich stężeń. Po ostatnim praniu dodaj 250 mikrolitrów SIF do myszy TG i TNC, 350 mikrolitrów SIF do szczurzych TG i TNC oraz 400 mikrolitrów SIF do każdej czaszki szczura.Po 10 minutach inkubacji zebrać 200 mikrolitrów próbki do wstępnie znakowanej probówki wirówkowej z 50 mikrolitrami buforu EIA o sile 10, aby umożliwić pomiar podstawowego uwalniania CGRP. Wyrzuć pozostałą ciecz i natychmiast przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Dodać badany związek do odpowiedniego nośnika w rosnących stężeniach, zaczynając od najniższego stężenia, i inkubować przez 10 minut.Po 10 minutach inkubacji zebrać 200 mikrolitrów próbki we wstępnie oznakowanej probówce wirówkowej z 50 mikrolitrami buforu EIA o sile 10. Wyrzuć pozostały płyn i dodaj drugie najniższe stężenie do tkanki. Próbki należy natychmiast przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i powtórzyć tę procedurę z pozostałym stężeniem.Aby przeprowadzić kontrolę pozytywną w eksperymencie, dodaj kontrolę pozytywną do tkanki na końcu protokołu. Po okresie inkubacji trwającym 10 minut zebrać próbkę o objętości 200 mikrolitrów w probówce wirówkowej z 50 mikrolitrami buforu EIA o sile 10. Stężenia CGRP uwalnianego w pobranych próbkach mierzy się za pomocą zestawu EIA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta dostarczonymi z zestawem EIA.U szczurów ekspozycja na kapsaicynę indukowała znaczne uwalnianie CGRP z opony twardej i TG w porównaniu z podłożem. W oponie twardej maksymalne uwalnianie CGRP stwierdzono przy jednym mikromolu kapsaicyny. A w TG maksymalne uwalnianie CGRP stwierdzono przy 10 mikromolach kapsaicyny.Podczas analizy za pomocą jednoczynnikowego ANOVA, glibenklamid nie wykazuje wpływu na podstawowe uwalnianie CGRP z opony twardej i TG. Glibenklamid istotnie zmniejszał indukowane kapsaicyną uwalnianie CGRP w oponie twardej o 40% i TG o 39% w porównaniu z kapsaicyną z podłożem, gdy analizowano je za pomocą jednoczynnikowej ANOVA. Stwierdzono, że przejściowy potencjał receptora agonista ankyryny-1 super aldehyd cynamonowy uwalnia CGRP w sposób zależny od stężenia z TG z 1, 10 i 100 mikromolami super aldehydu cynamonowego, co powoduje 9% 52% i 69% zwiększone uwalnianie CGRP w porównaniu z nośnikiem odpowiednio podczas analizy za pomocą dwukierunkowej ANOVA. Zwiększone uwalnianie CGRP było nieobecne w TG z myszy z nokautem ankyryny-1 o potencjale przejściowego receptora, u których ekspozycja na 1, 10 i 100 mikromolów super aldehydu cynamonowego powodowała 11% minus 13% i 9% zmianę w uwalnianiu CGRP odpowiednio w porównaniu z nośnikiem podczas analizy za pomocą dwukierunkowej ANOVA.Ważne jest, aby zachować ostrożność, aby nie dotykać tkanki podczas pobierania próbki i zachować precyzję w określaniu czasu inkubacji dla wszystkich próbek. Jeśli dostępne są odpowiednie zestawy ELISA, możliwe jest zastosowanie tej procedury do pomiaru uwalniania innych peptydów obecnych w układzie naczyniowym nerwu trójdzielnego.

ex-vivo-release-calcitonin-gene-related-peptide-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Shannonhouse, J., et al. In vivo Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego. J. Vis. Exp. (2023). Film przedstawia technikę obrazowania wapnia in vivo w celu monitorowania aktywności neuronalnej w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) myszy transgenicznej. Neurony DRG wyrażają wskaźnik wapnia, który zwiększa intensywność fluorescencji po związaniu się z wapniem. Bodźce mechaniczne lub termiczne...

Obrazowanie in vivo wapnia zespołów neuronalnych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego myszy

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji przestrzennej korelacji peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) - immunoreaktywnych włókien nerwowych i naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki za pomocą immunofluorescencji i histochemii fluorescencyjnej odpowiednio z CGRP i falloidyną. Ponadto pochodzenie tych włókien nerwowych zostało prześledzone wstecznie za pomocą fluorescencyjnego znacznika neuronowego.

Wizualizacja immunoreaktywnego unerwienia peptydu związanego z genem kalcytoniny opony twardej czaszki szczura z immunofluorescencją i śledzeniem neuronalnym

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

To badanie przedstawia chirurgiczną manipulację polegającą na uwidocznieniu T-DRG u znieczulonych myszy do obrazowania wapnia in vivo, wraz z synchronicznymi zapisami EKG. Metoda ta stanowi najnowocześniejsze narzędzie do badania obwodowej stymulacji nerwów elektrycznych i danych wejściowych narządów trzewnych klatki piersiowej, a także ich interakcji na podstawowym poziomie sensorycznym.

Obrazowanie in vivo wapnia zwojów korzenia grzbietowego klatki piersiowej (DRG) i zapis EKG w celu badania stymulacji nerwów obwodowych

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Niniejsza metoda opisuje generowanie organotypowych kultur móżdżku oraz wpływ określonych bodźców apoptotycznych na żywotność różnych typów komórek móżdżku.

Organotypowe hodowle móżdżku: wyzwania apoptotyczne i ich detekcja

Opisujemy tutaj metodę pobierania biopsji błony śluzowej węchowej z jam nosowych szczura i człowieka. Biopsje te mogą być wykorzystane do identyfikacji anomalii molekularnych w chorobach mózgu lub do izolacji wielopotencjalnych dorosłych komórek macierzystych, które mogą zostać użyte do transplantacji komórkowej w zwierzęcych modelach urazów i chorób mózgu.

Izolowanie komórek macierzystych węchowych z nosa gryzoni lub ludzi

W niniejszym raporcie przedstawiamy w pełni zautomatyzowany i wysoce wszechstronny system umożliwiający jednoczesne badanie wielu zachowań poznawczych oraz rejestrację aktywności neuronów u gryzoni.

W pełni zautomatyzowany i wysoce wszechstronny system do badania wielorakich funkcji poznawczych i rejestracji aktywności neuronalnej u gryzoni

Opisano technikę szerokiego otwierania bariery krew-mózg u myszy z wykorzystaniem mikropęcherzyków i ultradźwięków. Dzięki zastosowaniu tej metody do mózgu myszy można wprowadzić mangan. Ponieważ mangan jest środkiem kontrastowym do MRI, który kumuluje się w zdepolaryzowanych neuronach, podejście to umożliwia obrazowanie aktywności neuronalnej.

Funkcjonalne obrazowanie neuronaukowe z wykorzystaniem ultrasonicznego otwierania bariery krew-mózg i MRI z wzmocnieniem manganem

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Poznaj metodę ex vivo do badania uwalniania CGRP z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni. Technika umożliwia analizę trzech odrębnych lokalizacji i ocenę wpływu substancji farmakologicznych na mechanizmy bólu.

Ex vivo Uwalnianie peptydu związanego z genem kalcytoniny z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni

Przeglądaj więcej filmów