Name: Lipidomika tkanek gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Poznaj metodę lipidomiki tkanek gryzoni umożliwiającą ilościową analizę ponad 400 lipidów w 14 klasach. Ta technika masowej spektrometrii pozwala identyfikować wczesne biomarkery toksyczności w modelach zwierzęcych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować zespołowi badawczemu, a szczególnie podziękować za pomoc techniczną i wsparcie zespołów biobadań i aerozoli w PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapur, oraz PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Szwajcaria. Autorzy dziękują Samowi Ansariemu za zarządzanie biobankiem i dziękują za wsparcie Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy za redakcję szkicu manuskryptu.

Wszyscy autorzy są pracownikami firmy Philip Morris International. Philip Morris International jest jedynym źródłem finansowania i sponsorem tego projektu.

Dym papierosowy (CS) jest uznawany za główny czynnik ryzyka związany z rozwojem przewlekłych chorób zapalnych płuc, w tym raka płuc, zapalenia oskrzeli i przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP)1. Poza wpływem na płuca, narażenie na CS odgrywa znaczącą rolę w rozwoju innych chorób, takich jak miażdżycowa choroba wieńcowa i choroba naczyń obwodowych1. Choroby układu krążenia, wraz z POChP, są odpowiednio pierwszą i trzecią najczęstszą przyczyną zgonów na świecie. Podejścia do oceny ryzyka toksykologicznego w przeszłości opierały się na wykorzystaniu modeli zwierzęcych, takich jak gryzonie. Modele szczurów i myszy in vivo z samym nosem lub całym ciałem są powszechnie stosowane do badania długoterminowych skutków narażenia na CS.
Na przykład, ogólnie rzecz biorąc, 6-miesięczna ekspozycja na dym tytoniowy wywołuje histologiczne i funkcjonalne nieprawidłowości w płucach myszy, które naśladują te związane z ludzkimi chorobami, w tym rozedmę płuc, przebudowę dróg oddechowych i nadciśnienie płucne, chociaż zmiany są stosunkowo łagodne w porównaniu z tymi obserwowanymi u długotrwałych palaczy2. Zarówno w tkankach zwierzęcych, jak i ludzkich w badaniach zaobserwowano szeroki zakres zmian molekularnych w odpowiedzi na ekspozycję na CS, w tym reakcje na stres oksydacyjny, stan zapalny i zmiany strukturalne w tkance3,4. Nic dziwnego, że doniesiono również, że narażenie na CS ma daleko idący wpływ na lipidom płuc, w tym wpływ na lipidy środków powierzchniowo czynnych, mediatory sygnalizacji lipidowej i lipidy strukturalne4,5,6.
Aby scharakteryzować duże zmiany lipidowe wywołane długotrwałą ekspozycją płuc myszy na CS, przeprowadziliśmy szybką i ilościową analizę spektrometrii mas metodą bezpośredniej infuzji shotgun. Po wprowadzeniu metody lipidomicznej shotgun w 2005 roku7, metoda ta została skutecznie wykorzystana do poszerzenia naszej wiedzy na temat metabolizmu komórek lipidowych8,9,10 w systemach modelowych, takich jak yeast11, Caenorhabditis elegans12 i Drosophila melanogaster13, a także w szerokim zakresie typów próbek ssaków, takich jak linie komórkowe14,15,16 różne human17,18 i tkanki gryzoni19,20 i płyny ustrojowe21,22.
W ciągu ostatnich dziesięcioleci badania wykazały złożoność odpowiedzi komórkowych na zmiany środowiskowe, obejmujące tysiące połączonych ze sobą białek, lipidów i metabolitów. To jasno pokazało, że stosowanie najnowocześniejszych technik analitycznych jest niezbędne do uzyskania dogłębnego wglądu w maszynerię molekularną i odkrycia pełnej skali egzogenicznych skutków fizjologicznych. W tym kontekście, kompleksowe, ilościowe lipidowe odciski palców uzyskane za pomocą podejść lipidomicznych typu shotgun mogą skutecznie wzbogacić naszą wiedzę na temat metabolizmu lipidów komórkowych8,9,10.
Jeśli chodzi o narażenie na CS jako czynnik ryzyka dla wielu chorób, podejścia do oceny ryzyka toksykologicznego historycznie opierały się na wykorzystaniu modeli zwierzęcych, takich jak gryzonie. Shotgun Lipidomics MS zapewnia szybkie, czułe i ilościowe narzędzie analityczne do oceny zaburzeń lipidomu w wielu typach próbek. Unikalną cechą lipidomiki typu shotgun jest zautomatyzowana analiza bezpośredniego wstrzykiwania całkowitego ekstraktu lipidowego - wzbogaconego znakowanymi wzorcami wewnętrznymi - bez separacji chromatograficznej do instrumentu MS o wysokiej rozdzielczości przy użyciu przewodzącego nanochipa generującego jonizację elektrorozpylania (ESI) nanospray23.
Informacje o stosunku masy do ładunku, które są jednocześnie pobierane w trybie MS1, dostarczają całkowitego śladu lipidowego wszystkich nienaruszonych endogennych lipidów. Opcjonalnie tryb MS2/MS3, w którym macierzyste cząsteczki lipidów są fragmentowane i analizowane, dostarcza dodatkowych informacji strukturalnych. Analiza danych wymaga specjalistycznego oprogramowania i obejmuje dekonwolucję widm i przypisań pików w widmach zbiorczych, co prowadzi do identyfikacji lipidów i wyjaśnienia przypuszczalnej struktury chemicznej. Dodatkowo, bezwzględną kwantyfikację można przeprowadzić, dodając znakowaną mieszaninę wzorców wewnętrznych zawierającą co najmniej jeden wzorzec lipidów na klasę lipidów będących przedmiotem zainteresowania. Ogólnie rzecz biorąc, przy obecnej technice, analiza stwardnienia rozsianego trwająca kilka minut na próbkę może obejmować identyfikację i kwantyfikację do 800 lipidów z 14 klas lipidów24 w tkankach gryzoni.

<table><tbody><tr><td>Probówki samoblokujące 1, 5 i 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30120086, 30120094</td><td></td></tr><tr><td>3 mm nierdzewne koraliki niegazowane</td><td>Qiagen</td><td>69997</td><td></td></tr><tr><td>4.1 &micro; m chip dyszy</td><td>Advion</td><td>HD-D-384</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>45754-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Honeywell</td><td>14267-25G</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma</td><td>Aldrich 09830-500G</td><td></td></tr><tr><td>Wzorcowa albumina surowicy bydlęcej, 2 mg/ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>&nbsp; 23209</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Honeywell</td><td>33065-2,5L</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650498-1L</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Honeywell</td><td>34856-1L</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Honeywell</td><td>33211</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96-dołkowe płytki</td><td>Sigma</td><td>M9686</td><td></td></tr><tr><td>Heptan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34873-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A461</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>Mysz z pulą osocza</td><td>Mysz BioIvt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPLASH standard</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>330710X</td><td>Wzorzec wewnętrzny</td></tr><tr><td>Nunc 96-płaskie dno przezroczyste płytki</td><td>VWR</td><td>62409-068</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa szpatułka</td><td>Sigma</td><td>Z560049-300EA</td><td></td></tr><tr><td>Szybki start Bradford 1x Odczynnik barwnikowy</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik do surowicy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5197</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt/oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoPrep CP02 instrument udarowy</td><td>Covaris</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Młotek magnetyczny</td></tr><tr><td>Wirówka 5427R</td><td>Eppendorf</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>wirówka</td></tr><tr><td>ChipSoft 8.3</td><td>Advion Biosciences</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Oprogramowanie do konfiguracji metody i akwizycji na robocie Triversa nanomate</td></tr><tr><td>LipidXplorer 1.2.8.1</td><td>Nie dotyczy</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Oprogramowanie do identyfikacji lipidów</td></tr><tr><td>Spektrum pik po</td><td>pikuSwiss.</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Program do konwersji .raw danych z formatu MS do .mzml</td></tr><tr><td>ProteoWizard</td><td>ProteoWizard</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Alternatywne (open source) oprogramowanie do konwersji danych .raw z formatu MS na .mzml</td></tr><tr><td>Q-Exactive MS</td><td>Thermo Fisher</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Spektrometr masowy orbitrap o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Qiagen Tissue Lyser II</td><td>Qiagen</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Lizer tkankowy</td></tr><tr><td>SpeedVac SPD140DDA</td><td>Thermo Fisher</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Koncentrator próżni</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M nano plus</td><td>Tecan</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Czytnik płytek</td></tr><tr><td>Mieszalnik ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Mieszalnik termiczny</td></tr><tr><td>TriVersa Nanomate</td><td>Advion Biosciences</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Nanoźródło naparu bezpośredniego</td></tr><tr><td>Xcalibur 4.3</td><td>Thermo Scientific</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Oprogramowanie do ustawiania metody i akwizycji w Q-Exactive MS</td></tr></tbody></table>

lipidomika tkanek gryzoni

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Lipidy odgrywają istotną rolę jako niezbędne składniki wszystkich komórek prokariotycznych i eukariotycznych. Ciągły postęp technologiczny w spektrometrii mas sprawił, że lipidomika stała się potężnym narzędziem analitycznym do monitorowania składu lipidomu tkankowego w stanach homeostatycznych, a także chorobowych. W artykule przedstawiono krok po kroku protokół dla metody analizy lipidów typu shotgun, która wspiera jednoczesne wykrywanie i kwantyfikację kilkuset gatunków lipidów molekularnych w różnych próbkach tkanek i płynów biologicznych przy dużej przepustowości. Metoda ta wykorzystuje zautomatyzowane bezpośrednie wstrzykiwanie nano-przepływu całkowitego ekstraktu lipidowego wzbogaconego znakowanymi wzorcami wewnętrznymi bez separacji chromatograficznej do instrumentu spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości. Zaczynając od submikrogramowych ilości tkanki gryzonia, analiza MS trwa 10 minut na próbkę i obejmuje do 400 lipidów z 14 klas lipidów w tkance płucnej myszy. Przedstawiona tutaj metoda doskonale nadaje się do badania mechanizmów chorobowych oraz identyfikacji i ilościowego określania biomarkerów, które wskazują na wczesną toksyczność lub korzystne efekty w tkankach gryzoni.

W tym miejscu, jako wyniki reprezentatywne, przedstawiamy dane ilustrujące, w jaki sposób lipidomika typu shotgun może zostać wykorzystana do badania wpływu CS na płuca myszy. Protokół analizy lipidów typu shotgun z sukcesem zastosowano w badaniu in vivo w celu analizy porównawczej dwóch grup próbek: tkanek płuc pobranych od dziewięciu samic myszy Apoe−/− narażonych na CS (grupa 3R4F; kontrola pozytywna) oraz od równiej liczby myszy utrzymywanych w warunkach świeżego powietrza (grupa pozorowana) jako kontrola negatywna, pobranych w punktach czasowych ekspozycji wynoszących odpowiednio 3 miesiące, 4 miesiące i 6 miesięcy. Zwierzęta przebywały w warunkach filtrowanego i kondycjonowanego świeżego powietrza w temperaturze 22 °C ± 2 °C i wilgotności 55% ± 15%, otrzymując dietę w formie granulatu poddanego napromieniowaniu gamma. Reżim oświetlenia utrzymywano na poziomie 12 h na dobę. W każdej klatce przebywało do ośmiu myszy. Papierosy referencyjne 3R4F do traktowania ekspozycyjnego zakupiono z University of Kentucky w celu wytworzenia aerozolu CS 3R4F (600 µg całkowitej materii cząsteczkowej TPM/L aerozolu) dla docelowego stężenia ekspozycji równoważnego 28 µg nikotyny/L. Dym CS z papierosów 3R4F wytwarzano przy użyciu 30-portowych rotacyjnych maszyn do palenia zgodnie z metodą Phillipsa i wsp.27. W oparciu o protokół intensywnego palenia Health Canada, w celu zapewnienia odpowiedniej ekspozycji, zastosowano objętość zaciągnięcia 55 mL, jedno zaciągnięcie co 30 s oraz 100% zablokowanie otworów wentylacyjnych papierosów 3R4F. Wszystkie dodatkowe szczegóły dotyczące projektu badania zostały opisane wcześniej27,28.
Ogólnie zidentyfikowano i określono ilość około 400 molekularnych gatunków lipidów z 14 najliczniejszych klas lipidowych (Rysunek 3). Całkowite znormalizowane stężenie lipidów w poszczególnych klasach było nieco podwyższone dla klas lipidów PE, PEO, PC, PCO, PI i PG, natomiast w przypadku lipidów SM, LPE i PA zaobserwowano pewną regulację w dół (Rysunek 3A), podczas gdy nie stwierdzono różnic dla TAG i PS. Co ciekawe, podwyższone poziomy lipidów plazmalogenowych PCO i PEO w grupie CS zgłaszano w komórkach zapalnych29. Jedną z wewnątrzkomórkowych funkcji lipidów plazmalogenowych jest aktywność przeciwutleniająca. W przypadku ekspozycji na reaktywne formy tlenu (ROS) i azotu (RNS) zgłoszono selektywne utlenianie plazmalogenów w porównaniu z fosfolipidami diacylowymi30. Wiązanie enyl-eterowe w strukturze chemicznej plazmalogenów jest wrażliwe na atak rodnikowy podczas stresu oksydacyjnego31. Głównymi produktami ataku rodnikowego są hydroksylowane kwasy eikosatetraenowe, fosfolipidy 2-monoacyloglicerolowe, pentadekanol, kwasy mrówkowe, α-hydroksyaldehydy o różnych długościach łańcucha, 1-formylo-2-arachidonilo-glicerofosfolipid oraz lizofosfolipidy.
Wyniki te pokazują, że spośród cech molekularnych opartych na całkowitym wzorze cząsteczkowym, ekspozycja na CS znacząco wpłynęła na 100-120 związków (Ryc. 3D). Szczegółowa dekonwolucja informacji o fragmentacji MS2 oraz normalizacja intensywności sygnałów fragmentów pozwoliły na przybliżone określenie całkowitej ilości każdego sprzężonego kwasu tłuszczowego (FA) reprezentowanego w każdej klasie lipidów (Ryc. 3E) oraz porównanie tych danych pomiędzy grupami eksponowanymi i kontrolnymi. Zaobserwowano wyraźny spadek zarówno w przypadku FA w pełni nasyconych, jak i tych z niewielką liczbą nienasyceń, głównie w kontekście lizo-lipidów. Z kolei wielonienasycone kwasy tłuszczowe (PUFA) w składzie klas fosfolipidów PC, PE i PG były podwyższone w grupie CS we wszystkich punktach czasowych. Ekstremalne przypadki PC i PG sprzężonych z kwasem eikozapentainenowym (EPA) i dokozaheksainenowym (DHA) wykryto wyłącznie w grupie narażonej na dym papierosów 3R4F CS (Ryc. 3E, kolor czerwony).
<img alt="Układ mikropłytki dla analizy ze standardami, próbami ślepymi i próbkami badawczymi; kontekst oceny danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Układ płytki dla rozkładu próbek w metodzie Bradforda. Próbki ślepe i standardy są umieszczane w trzech powtórzeniach w kolumnach 1-3; próbki nieznane są umieszczane w dwóch powtórzeniach w kolumnach 4-11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ płytki mikrotitracyjnej przedstawiający pozycje próbek, kontrole QC oraz testy TB/ISB dla wyników analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Układ 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej do analizy metodą spektrometrii mas typu shotgun. Rozmieszczenie próbek pustych, wzorców, próbek nieznanych oraz próbek QC dla akwizycji w dodatnim trybie jonizacji jest zaznaczone po lewej stronie płytki (kolumny 1-6); wszystkie próbki dla ujemnego trybu jonizacji znajdują się po prawej stronie (kolumny 7-12). Skróty: pos = dodatni; QC = kontrola jakości; neg = ujemny; TB = całkowita próba pusta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki analizy lipidomicznej, wykresy słupkowe i wykresy rozrzutu zmian krotności, analiza korelacyjna mapą ciepła." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Analiza shotgun lipidomics płuc myszy eksponowanych na dym tytoniowy. Myszy Apoe−/− były eksponowane na dym tytoniowy (CS) z papierosów referencyjnych 3R4F lub na świeże powietrze (grupa kontrolna – sham). (A) Stężenia klas lipidów i liczba gatunków lipidów w każdej klasie. Dla każdej klasy liczba zidentyfikowanych gatunków lipidów podano w nawiasach. Przedstawiono średnie i 95% przedziały ufności dla każdej klasy lipidów, oddzielnie dla każdego typu ekspozycji (zagregowane dla trzech punktów czasowych). (B) Wykresy wulkaniczne (volcano plots) przedstawiające wielkość efektu (log2 fold change) i istotność (-log10 FDR-adjusted p value) zidentyfikowanych gatunków lipidów dla porównania 3R4F CS względem grupy kontrolnej w trzech punktach czasowych. Lipidy o istotnie podwyższonym poziomie zaznaczono na żółto; lipidy o istotnie obniżonym poziomie zaznaczono na cyjanowo (FDR-adjusted p value &lt; 0,05). (C) Różnice w zawartości 25 gatunków lipidów z największymi absolutnymi średnimi zmianami krotności. Zmiany log2 fold change dla porównania 3R4F CS względem grupy kontrolnej są zakodowane kolorami, a istotność statystyczna jest wskazana: *: FDR-adjusted p value &lt; 0,01; X: FDR-adjusted p value &lt; 0,05. (D) Wykresy porównawcze. Współczynniki korelacji dla porównań zmian krotności są zakodowane kolorami, a liczba wspólnych lipidów o zmienionej zawartości jest wskazana (całkowite liczby na marginesach). Wykresy kołowe przedstawiają procent wspólnych lipidów o zmienionej zawartości w tym samym kierunku zmian (znak FC). Gwiazdka wskazuje na istotne nakładanie się lipidów o różnej zawartości. (E) Różnice w zawartości sprzężonych FA w podziale na klasy lipidów. Mapa ciepła, analogicznie jak w panelu C, dla sprzężonych kwasów tłuszczowych z istotnymi różnicami w zawartości między ekspozycją 3R4F a grupą kontrolną we wszystkich trzech punktach czasowych (FDR-adjusted p value &lt; 0,05). Ilość każdego kwasu tłuszczowego w danej klasie lipidów oszacowano na podstawie intensywności MS2 fragmentów kwasów tłuszczowych. Skróty: CS = dym tytoniowy; FDR = wskaźnik fałszywych odkryć; FC = zmiana krotności; FA = kwasy tłuszczowe; PC = fosfatydylocholina; PS = fosfatydyloseryna; TAG = triacylglicerol; SM = sfingomielina; PEO = plazmalogen fosfatydyloetanoloamina; PE = fosfatydyloetanoloamina; PG = fosfatydyloglicerol; PI = fosfatydyloinozytol; DAG = diacylglicerol; SE = estry steroli/cholesterolu; PCO = plazmalogen fosfatydylocholina; LPC = lizofosfatydylocholina; LPE = lizofosfatydyloetanoloamina; PA = kwas fosfatydowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>końcowe stężenie BSA (mg/ml)</td>
			<td>roztwór BSA o stężeniu 2 mg/ml (µL)</td>
			<td>bufor wodorowęglanowy amonu (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.0625</td>
			<td>50 μL roztworu o stężeniu 0,125 mg/ml</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Schemat rozcieńczania wewnętrznego standardu BSA dla krzywej kalibracyjnej w analizie Bradforda. Skrót: BSA = albuminy surowicy bydlęcej.
Informacje uzupełniające: Pliki MFQL wykorzystywane do identyfikacji lipidów w programie LipidXplorer.Pakiet .zip zawiera poszczególne wymagane pliki MFQL, z których każdy został nazwany zgodnie z wzorem: &lt;skrót klasy lipidów&gt;_&lt;tryb jonizacji&gt;_MS2.mfql (np. PE_neg_MS2.mfql). Nazwy plików służące do identyfikacji znakowanych standardów wewnętrznych zawierają tag D7(D9) w obrębie &lt;skrótu lipidu&gt; (np. PED7_neg_MS2.mfql). Pliki MFQL te są wykorzystywane do weryfikacji ilości deuteru w standardzie wewnętrznym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>

Lipidomika oparta na spektrometrii mas typu shotgun dostarcza czuły ilościowy obraz szerokiego spektrum klas lipidów jednocześnie w jednym pomiarze z różnych tkanek gryzoni.

Lipidomika tkanek gryzoni

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

Przedstawiony protokół pozwala na ilościowe określenie szerokiego zakresu lipidów w tkance zwierzęcej. Jest to łatwe narzędzie do badania mechanizmów lipidowych, a także do identyfikacji biomarkerów wskazujących na wczesną toksyczność w modelach zwierzęcych. Metoda zapewnia ilościowy profil ponad 400 lipidów molekularnych w 14 różnych klasach lipidów w szerokiej gamie matryc próbek z 10-minutowym czasem trendu na próbkę.Na początek rozcieńczyć podwielokrotność 1 supernatantu odwirówki o dwukrotnym stężeniu buforem wodorowęglanowym amonu. Po przygotowaniu krzywej wzorcowej albuminy surowicy bydlęcej, należy zmieszać probówki wzorcowe i odwirować probówki przy 18 200 g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej. Z przygotowanych wcześniej standardowych probówek przenieś po 6 mikrolitrów każdej z ślepych prób, wzorców i próbek na 96-dołkową płytkę z płaskim dnem.Następnie dodaj 250 mikrolitrów odczynnika Bradford do każdej studzienki za pomocą wielokanałowej pipety i wymieszaj. Po inkubacji przez 5 minut zmierzyć absorbancję przy długości fali 595 nanometrów za pomocą czytnika płytek. Przygotować probówki o pojemności 2 mililitrów ze 100 mikrolitrami roztworu wodorowęglanu amonu do każdej probówki z całkowitej ślepej próby i wewnętrznej wzorcowej próby ślepej i utrzymywać wszystkie próbki na lodzie.Przygotuj próbki kontroli jakości, biorąc pod uwagę, że jedna próbka kontroli jakości jest umieszczana między każdym zestawem 10 próbek. Dodaj 10 mikrolitrów połączonego ludzkiego osocza do 2-mililitrowych probówek, a następnie dodaj 10 mikrolitrów wewnętrznego roztworu wzorcowego do wszystkich wewnętrznych wzorcowych próbek ślepych, kontroli jakości i badań. Dodać 300 mikrolitrów mieszaniny metanolu butanolu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do każdej próbki i wstrząsać w 450 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej na termomikserze.Następnie dodaj 300 mikrolitrów mieszaniny octanu etylu heptanu i wstrząsaj 450 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej na termomikserze, następnie dodaj 300 mikrolitrów mieszaniny 1% kwasu ascetycznego i wstrząsaj przez 5 minut w 450 g w temperaturze pokojowej na termomikserze. Wirować przy 2,800 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przenieść 360 mikrolitrów górnej fazy do nowej 2-mililitrowej probówki samoblokującej oznaczonej jako 2. Po dodaniu 320 mikrolitrów octanu etylu heptanu do rurki fazy wodnej oznaczonej jako 1, wstrząsnąć 450 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej na termomikserze, a następnie odwirować przy 2 800 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, jak wykazano wcześniej.Przenieś 320 mikrolitrów górnej fazy i połącz je z frakcją z poprzedniego kroku w probówce 2. Podobnie dodać 250 mikrolitrów octanu etylu heptanu do fazy wodnej w probówce 1 i wstrząsać 450 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej na termomikserze. Ponownie odwirować przy 2,800 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść 200 mikrolitrów górnej fazy i połączyć ją z frakcjami z poprzednich etapów w probówce 2.Odparować do sucha w temperaturze 35 stopni Celsjusza w koncentratorze próżniowym i ponownie rozpuścić w 300 mikrolitrach roztworu mieszającego MS. Wiruj każdą probówkę przez 5 sekund, aby upewnić się, że wszystko się rozpuściło i odwiruj w temperaturze 18, 200 g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przenieść podwielokrotność 50 mikrolitrów na płytkę mikrolitrową w celu analizy w trybie jonizacji dodatniej i rozcieńczyć 50 mikrolitrami roztworu mieszającego MS.Ponownie rozcieńczyć 80 mikrolitrami mieszanki MS i przenieść podwielokrotność 20 mikrolitrów na płytkę MTP w celu analizy w trybie jonizacji ujemnej. Owiń płytkę folią i trzymaj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przed analizą. Skalibrować MS zarówno w trybie dodatnim, jak i ujemnym, zgodnie z instrukcjami producenta na 5 dni lub mniej przed analizą.Zainstaluj nanoźródło infuzji bezpośredniej z przodu, upewniając się, że jest prawidłowo wyrównane z kapilarą transferową MS i chipem dyszy o średnicy 4,1 mikrometra w uchwycie chipa, a następnie sprawdź parametry infuzji dodatniej i ujemnej odpowiadającej ciśnieniu gazu 1,25 psi, napięciu źródła 1,1 kV, 5 mikrolitrów objętości wstrzyknięcia próbki, zamknięcie styku wyjściowego Rel1 na 2,5 sekundy, 5 minut czasu dostawy, chłodzenie płyty w temperaturze 4 stopni Celsjusza, następnie ustawienie regulatora temperatury i utworzenie nowej płytki. W trybie dodatnim sprawdź i dostrój oprogramowanie, które pokazuje, że metoda MS jest ustawiona na temperaturę kapilary 250 stopni Celsjusza i poziom RF soczewki S na 65.0. W oprogramowaniu Xcalibur otwórz metodę dodatnią i sprawdź, czy akwizycja MS w pełnym skanowaniu jest ustawiona od zera do 1 minuty w zakresie od 550 do 1 000 m/z z rozdzielczością 140 000 z automatyczną kontrolą wzmocnienia 1 milion i maksymalnym czasem wstrzykiwania 50 milisekund.Zastosować masę blokady 680.48022. Sprawdzić, czy metoda akwizycji MS/MS niezależna od danych jest ustawiona w zakresie czasu od 1 do 5 minut w rozdzielczości 17 500 z ustaloną pierwszą masą 250 m/z. Sprawdzić, czy automatyczna regulacja wzmocnienia dla MS2 jest ustawiona na 100 000, a maksymalny czas wtrysku na 64 milisekundy, energia zderzenia wynosi 20 NCE, okno izolacji jest ustawione na 1 m/z i czy zastosowano listę mas inkluzji od 398 do 1, 100 m/z z krokiem masy 1 daltonów.W przypadku akwizycji w trybie ujemnym sprawdź w oprogramowaniu, czy metoda MS jest skonfigurowana z temperaturą kapilary na poziomie 250 stopni Celsjusza na poziomie RF soczewki S na poziomie 65.0 w pliku MS tune. Następnie w oprogramowaniu Xcalibur sprawdź, czy tryb akwizycji pełnego skanowania jest ustawiony od zera do 1 minuty przy rozdzielczości 140 000 obejmującej zakres od 400 do 940 m/z, automatycznej kontroli wzmocnienia 1 miliona, maksymalnym czasie wtrysku 200 milisekund i masie blokady 526,46262. Sprawdź, czy akwizycja MS2 w trybie DIA jest ustawiona między 1 a 5 minutami przebiegu z rozdzielczością 17 500 ze stałą pierwszą masą 150 m/z, automatyczną kontrolą wzmocnienia 100 000, 64 milisekundy maksymalnego czasu wtrysku i 35 NCE energii zderzenia przy użyciu listy mas inkluzji od 400 do 940 z krokiem masy 1 daltona.Utwórz kolejkę sekwencji analizy w oprogramowaniu Xcalibur w trybie dodatnim i uruchom ją, a następnie utwórz sekwencję w oprogramowaniu ChipSoft i rozpocznij analizę, czekając na wyzwolenie akwizycji próbki przez sygnał zamknięcia styku pochodzący z robota do bezpośredniej infuzji dla każdej próbki. Po zakończeniu analizy w trybie dodatnim utwórz kolejkę sekwencji analizy w oprogramowaniu Xcalibur w trybie ujemnym i uruchom ją, a następnie utwórz sekwencję w oprogramowaniu ChipSoft i rozpocznij analizę, czekając na wyzwolenie akwizycji próbki przez sygnał zamknięcia styku pochodzący z robota do infuzji bezpośredniej dla każdej próbki. Całkowite znormalizowane stężenie lipidów zostało zidentyfikowane i określone ilościowo z 14 najliczniejszych klas lipidów, które było nieznacznie podwyższone dla klas lipidów PE, PEO, PC, PCO, PI i PG, a pewną regulację w dół zaobserwowano dla lipidów SM, LPE i PA.Chociaż nie było widać żadnej różnicy w przypadku TAG-ów i PS. Wyniki te pokazują również, że spośród cech molekularnych opartych na całkowitym wzorze cząsteczkowym, narażenie na dym papierosowy miało znaczący wpływ na 100 do 120 związków. Dekonwolucja fragmentacji MS2 i normalizacja intensywności sygnału fragmentu pozwoliła na przybliżone zdefiniowanie całkowitej ilości każdego sprzężonego kwasu tłuszczowego reprezentowanego w każdym szkle lipidowym i porównanie tych danych między grupą narażoną a kontrolną. Zaobserwowano spadek liczby w pełni nasyconych i nielicznych nienasyconych kwasów tłuszczowych, natomiast wielonienasycone kwasy tłuszczowe w składzie klas fosfolipidów PC, PE i PG były podwyższone we wszystkich punktach czasowych.Skrajne przypadki PC i PG sprzężonych z kwasem eikozapentaenowym i dokozaheksaenowym wykryto wyłącznie w grupie ekspozycji na 3R4F CS. Pipetowanie próbki i próbki kontroli jakości musi odbywać się za pomocą końcówek niskopasmowych i być dokładne, co oznacza, że końcówki muszą być sprawdzane między każdą próbką. Pipetowanie roztworu wzorca wewnętrznego ma kluczowe znaczenie i musi być dokładne.Z roztworem metanolu dichlorometanu w proporcji 1 do 1 należy obchodzić się ostrożnie i należy użyć końcówek zawierających nieplastyfikator, aby uniknąć obecności polimerów z tworzywa sztucznego w próbkach. Końcówki muszą być wymieniane między każdą próbką.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Celem tego artykułu jest przedstawienie krok po kroku procedury pobierania różnych białych tkanek tłuszczowych od myszy, przetwarzania próbek tłuszczu i ekstrakcji RNA.

Pobieranie i przetwarzanie tkanki tłuszczowej myszy do analizy RNA

Ten artykuł przedstawia modułowy protokół dla lipidomiki tkankowej i transkryptomiki oraz lipidomiki osocza w mysich modelach chorób neurologicznych ukierunkowanych na lipidy leżące u podstaw stanu zapalnego i aktywności neuronalnej, lipidy błonowe, dalsze przekaźniki oraz enzymy/receptory kodujące mRNA leżące u podstaw funkcji lipidów. Przedstawiono procedury pobierania próbek, przetwarzania próbek, ekstrakcji i kwantyfikacji.

Lipidomika i transkryptomika w chorobach neurologicznych

Celem tego protokołu jest synteza liposomów znakowanych fluorescencyjnie i wykorzystanie cytometrii przepływowej do identyfikacji lokalizacji liposomów in vivo na poziomie komórkowym.

Przygotowanie, podawanie i ocena specyficznego tkankowo wychwytu komórkowego in vivo liposomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Ten artykuł zawiera trzy łatwe i łatwo dostępne testy do oceny metabolizmu lipidów u myszy.

Ocena zdolności całego organizmu do obsługi lipidów u myszy

Szczegółowy protokół i trzy skrypty Pythona są dostępne do obsługi zrobotyzowanego systemu obsługi płynów o otwartym kodzie źródłowym do wykonywania półautomatycznego przygotowania próbek białek do eksperymentów spektrometrii mas, obejmujących etapy usuwania detergentów, trawienia białek i odsalania peptydów.

Zautomatyzowane przetwarzanie próbek proteomicznych typu shotgun przez robota laboratoryjnego typu open source

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących prawidłowego przygotowania próbki do analizy lipidów i metabolitów w małych tkankach, takich jak mózg Drosophila, przy użyciu wspomaganej matrycą laserowej desorpcji/jonizacji (MALDI) obrazowania spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do szybkiej analizy lipidów w mózgu Drosophila przy użyciu obrazowania metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Lipoliza triglicerydowa w adipocytach jest ważnym procesem metabolicznym, w wyniku którego uwalniane są wolne kwasy tłuszczowe i glicerol. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru podstawowej i stymulowanej lipolizy w adipocytach i tkance tłuszczowej ex vivo od myszy.

Pomiar częstości lipolizy w mysiej tkance tłuszczowej ex vivo i pierwotnych preadipocytach zróżnicowanych in vitro

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania w czterowymiarowym obrazowaniu ultrasonograficznym in vivo i obrazowaniu spektrometrii mas ex vivo do oceny biomechanicznych i biomolekularnych zmian w mysim układzie sercowo-naczyniowym. Technika ta jest stosowana do analizy przebudowy serca w chirurgicznie wywołanym zawale mięśnia sercowego i zmianach naczyniowych u starzejących się zwierząt.

Multimodalne badanie przebudowy układu sercowo-naczyniowego u myszy: czterowymiarowe obrazowanie ultrasonograficzne i spektrometria mas

Opisana jest zmodyfikowana metoda northern blot do pomiaru modyfikacji N 6-metylodenozyny (m6A) w RNA. Obecna metoda może wykrywać modyfikacje w różnych RNA i kontrolach w ramach różnych projektów eksperymentalnych.

Metoda pomiaru modyfikacji RNA N 6-metyloadenozyny w komórkach i tkankach

Poznaj metodę lipidomiki tkanek gryzoni umożliwiającą ilościową analizę ponad 400 lipidów w 14 klasach. Ta technika masowej spektrometrii pozwala identyfikować wczesne biomarkery toksyczności w modelach zwierzęcych.

Lipidomika tkanek gryzoni

Przeglądaj więcej filmów