Name: Wrażliwość wewnętrznej błony mitochondrialnej na Na+ ujawnia częściowo segmentowane funkcjonalne pule CoQ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Odkryj rolę sodu jako drugiego posłańca w różnicowaniu puli ubichinolu w mitochondriach. Ta metoda pozwala badać transfer elektronów i częściowo segmentowane pule CoQ w prostym modelu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr C. Jimenez i E. R. Martínez-Jimenez za pomoc techniczną. Badanie to było wspierane przez MICIN: RTI2018-099357-B-I00 i HFSP (RGP0016/2018). CNIC jest wspierany przez Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) oraz Fundację Pro CNIC i jest Centrum Doskonałości Severo Ochoa (SEV-2015-0505). Rysunek 2 utworzony za pomocą BioRender.com.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Hiszpania, zgodnie z Dyrektywą Unii Europejskiej z 22 września 2010 roku (2010/63/UE) oraz z hiszpańskim dekretem królewskim z 1 lutego 2013 roku (53/2013). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować liczbę wykorzystywanych zwierząt i ich cierpienie.
UWAGA: Ten test porównawczy do badania segmentacji mitochondrialnych pul CoQ jest opisany w następujący sposób:
1. Kwantyfikacja białka
<ol>
	<li>Zamroź i rozmroź wyizolowane mitochondria26 z wątroby myszy typu dzikiego trzy razy (tj. błony mitochondrialne) przed eksperymentami, aby organelle były przepuszczalne dla substratów reakcyjnych.</li>
	<li>Określić ilościowo ilość białka w izolowanej próbce mitochondriów metodami Bradforda lub kwasu bicunchoninowego (BCA). W przypadku odczynnika Bradford dodać 2 μl próbki do 1 ml 1x odczynnika Bradford.</li>
	<li>Podzielić próbkę na cztery podpróbki o masie 20 μg każda (mianowicie: A, B, C, D; <silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
</ol>
2. Pomiar aktywności CI+CIII
UWAGA: Ta część protokołu wykorzystuje próbki A i B do pomiaru aktywności CI+CIII (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).
<ol>
	<li>Próbki A i B należy podzielić na dwie podpróbki o masie 10 μg każda (tj. A1, A2, B1 i B2). Wymieszać każdą z podpróbek w kuwecie o pojemności 1 ml z 30 μl cyt c (10 mg/ml), 10 μl 100 mM malonianu i dodać podgrzany bufor C1/C2 (tabela 1) w temperaturze 37 °C do 980 μl (979 μl dla kuwet A2 i B2). 
	UWAGA: Ten etap wiąże się z użyciem toksycznych odczynników malonianu i cyjanku potasu. 
	UWAGA: cyt c (10 mg/ml) musi być przygotowany na świeżo, mieszając 10 mg cyt c w 1 ml 10 mM K2HPO4 roztworu, pH dostosowanym do 7,2 i musi być utrzymywany w lodzie przez cały czas trwania doświadczenia.</li>
	<li>Dodać 10 μl 1 M KCl do kuwet A1 i A2 i dodać 10 μl 1 M NaCl do kuwet B1 i B2.</li>
	<li>Dodać 1 μl 1 mM rotenonu do kuwety zawierającej podpróbki A2 i B2. 
	UWAGA: Ten krok wiąże się z użyciem toksycznego odczynnika rotenonu.</li>
	<li>Tuż przed pomiarem dodaj 10 μl NADH (10 mM) do wszystkich kuwet. 
	UWAGA: 10 μl najlepiej dodać na etapie kuwety, aby reakcja rozpoczęła się po wymieszaniu.</li>
	<li>Wymieszaj kuwetę, ostrożnie obracając ją trzy razy. Umieścić go w czytniku kuwet absorbancji (spektrofotometr UV/VISJASCO).</li>
	<li>Kliknij Pomiar parametrów > > Ogólne i ustaw parametry pomiaru na Długość fali: 550 nm i Czas: 4 minuty odczytu; naciśnij przyciski Akceptuj i Start, aby rozpocząć eksperyment.</li>
	<li>Na końcu pomiaru zapisz nachylenie obejmujące liniowy wzrost absorbancji, klikając Plik i Zapisz jako. Nachylenie można również zbierać ręcznie.</li>
</ol>
3. Pomiar aktywności CII+CIII
UWAGA: Ta część protokołu wykorzystuje próbki C i D do pomiaru aktywności CII+CIII (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).
<ol>
	<li>Podzielić próbki C i D na dwie podpróbki o masie 10 μg każda (mianowicie C1, C2, D1 i D2). Wymieszać każdą z podpróbek w kuwecie o pojemności 1 ml z 30 μl cyt c (10 mg/ml), 1 μl 1 mM rotenonu i dodać podgrzany bufor C1/C2 w temperaturze 37 °C do 980 μl (970 μl dla kuwet C2 i D2). 
	UWAGA: Ten etap obejmuje użycie toksycznych odczynników cyjanku potasu i rotenonu. 
	UWAGA: cyt c (10 mg/ml) musi być przygotowany na świeżo, mieszając 10 mg cyt c w 1 ml 10 mM K2HPO4 roztworu, pH dostosowanym do 7,2 i musi być utrzymywany w lodzie przez cały czas trwania doświadczenia.</li>
	<li>Dodać 10 μl 1 M KCl do kuwet C1 i C2 i dodać 10 μl 1 M NaCl do kuwet D1 i D2.</li>
	<li>Dodać 1 μl 1 mM antymycyny A do kuwety zawierającej podpróbki C2 i D2. 
	UWAGA: Ten krok wiąże się z użyciem toksycznego odczynnika antymycyny A.</li>
	<li>Bezpośrednio przed pomiarem dodaj 10 μl bursztynianu (1 M) do wszystkich kuwet. 
	UWAGA: 10 μl najlepiej dodać na etapie kuwety, aby reakcja rozpoczęła się po wymieszaniu.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj kuwetę, obracając ją trzy razy. Umieścić go w czytniku kuwety absorbancji (spektrofotometr UV/VIS).</li>
	<li>Kliknij Pomiar parametrów > > Ogólne i ustaw parametry pomiaru na Długość fali: 550 nm i Czas: 4 minuty odczytu; naciśnij przyciski Akceptuj i Start, aby rozpocząć eksperyment.</li>
	<li>Na końcu pomiaru zapisz nachylenie obejmujące liniowy wzrost absorbancji, klikając Plik i Zapisz jako. Nachylenie można również zbierać ręcznie.</li>
</ol>

<ol><li>Calvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mice%3A+SCAF1+relevance+and+segmentation+of+the+Qpool%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool.</a> Science Advances. 6 (26), (2020).</li>
<li>Garcia-Poyatos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaf1+promotes+respiratory+supercomplexes+and+metabolic+efficiency+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish.</a> EMBO Reports. 21 (7), 50287(2020).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+respiratory+Supercomplex+I%2BIII2+reveal+functional+and+conformational+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).</li>
<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+substrate+pool+revealed+by+cryo-EM+of+a+lipid-preserved+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex.</a> Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+the+mammalian+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of the mammalian respirasome.</a> Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of respiratory supercomplexes.</a> Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).</li>
<li>Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+asymmetry+and+electron+flow+in+the+bovine+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome.</a> Elife. 5, 21290(2016).</li>
<li>Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+orchestrate+proteostatic+and+metabolic+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses.</a> EMBO Reports. 20 (10), 47865(2019).</li>
<li>Berndtsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+supercomplexes+enhance+electron+transport+by+decreasing+cytochrome+c+diffusion+distance%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51015(2020).</li>
<li>Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+partially+organized+in+a+supercomplex+assembly%3A+kinetic+evidence+using+flux+control+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).</li>
<li>Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+respiratory+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of respiratory complexes.</a> Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+the+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria.</a> Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).</li>
<li>Letts, J. A., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+the+supercomplex%3A+the+higher-order+organization+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).</li>
<li>Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigma+of+the+respiratory+chain+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The enigma of the respiratory chain supercomplex.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).</li>
<li>Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+and+kinetics+reveal+electron+transfer+by+2D+diffusion+of+cytochrome+c+in+the+yeast+III-IV+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118(2021).</li>
<li>Szibor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+consequences+from+xenotopic+expression+of+a+tunicate+AOX+in+mouse+mitochondria%3A+Switch+from+RET+and+ROS+to+FET%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137(2020).</li>
<li>Guaras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CoQH2%2FCoQ+ratio+serves+as+a+sensor+of+respiratory+chain+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency.</a> Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).</li>
<li>Hernansanz-Agustin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29+controls+hypoxic+signalling+by+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Enriquez, J. A., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+q+and+the+respiratory+chain%3A+coenzyme+q+pool+and+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Syndromology%22%5BJournal%5D)">Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).</li>
<li>Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+segmentation+of+CoQ+and+cyt+c+pools+by+respiratory+complex+superassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly.</a> Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>den Brave, F., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+formation+boosts+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Supercomplex formation boosts respiration.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51830(2020).</li>
<li>Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c%3A+Surfing+off+of+the+mitochondrial+membrane+on+the+tops+of+Complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).</li>
<li>Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+monovalent+cations+on+the+kinetics+of+hypoxic+conformational+change+of+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).</li>
<li>Acin-Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+measure+mitochondrial+respiration+in+frozen+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples.</a> The EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).</li>
<li>Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sodium+chloride+on+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of sodium chloride on a lipid bilayer.</a> Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).</li>
<li>Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ions+on+a+dipalmitoyl+phosphatidylcholine+bilayer.+a+molecular+dynamics+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Chociaż protokół ten stanowi bardzo prostą procedurę identyfikacji istnienia częściowo podzielonych pul CoQ, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków. Substraty (tj. NADH lub bursztynian) najlepiej dodawać na końcu, ponieważ może dojść do autooksydacji tych związków. Odwracanie kuwety musi być ostrożne, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, które mogą zakłócać odczyt.
Ponadto obecna technika ma kilka ograniczeń, o których warto wspomnieć. Pomiary nie są wykonywane w nienaruszonych mito...

Mitochondrialny system fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) jest głównym szlakiem napędzającym syntezę trifosforanu adenozyny (ATP), produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) i konsumpcję redukujących równoważników, takich jak dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH) lub bursztynian, przez mitochondria. System OXPHOS składa się z pięciu kompleksów białkowych: Kompleks I (CI) utlenia NADH i redukuje CoQ do ubichinolu (CoQH2). Kompleks II (CII) utlenia bursztynian do fumaranu i redukuje CoQ do CoQH2. Kompleks III (CIII) utlenia CoQH2 z powrotem do CoQ, redukując cytochrom c (cyt c). Wreszcie kompleks IV (CIV) utlenia cyt c i redukuje tlen do wody. Ten łańcuch oksydoredukcyjny, tak zwany łańcuch transportu elektronów (mETC), jest sprzężony z pompowaniem H+ przez IMM, co tworzy gradient elektrochemiczny wykorzystywany przez kompleks V (CV) do fosforylacji difosforanu adenozyny (ADP) do ATP.
mETC kompleksy mogą być albo same w IMM, albo łączyć się w czwartorzędowe struktury zwane superkompleksami. CIV może łączyć się z CIII, tworząc III2+IV lub Q-respirasom (ponieważ jest w stanie oddychać w obecności CoQH2)1,2,3 lub tworząc homodimery lub homooligomery4. CIII może wchodzić w interakcje z CI, tworząc superkompleks I+III25. Wreszcie, CI jest również w stanie wchodzić w interakcje z Q-respirasomem, budując I+III2+IV lub N-respirasom (ponieważ może oddychać, zużywając NADH)1,6,7,8,9,10.
CoQ i cyt c są mobilnymi nośnikami elektronów odpowiedzialnymi za przenoszenie elektronów z CI/CII do CIII i z CIII do CIV, odpowiednio. To, czy superkompleksy nakładają funkcjonalne lokalne ograniczenie dla tych nośników, było przedmiotem intensywnej debaty w ciągu ostatnich dwóch dekad2,7,11,12,13,14,15,16,17. Jednak kilka niezależnych grup wykazało, że CoQ i cyt c mogą być funkcjonalnie podzielone na pule w IMM. Jeśli chodzi o CoQ, można go funkcjonalnie podzielić na określoną pulę CoQ dla CI (CoQNAD) i inną pulę dedykowaną enzymom zależnym odFAD (CoQ FAD)1,7,12,18,19. Jednakże, aby zróżnicować istnienie częściowo segmentowanych funkcjonalnych pul CoQ, wymagana była nadekspresja alternatywnej oksydazy (AOX) i generowanie specyficznych mutantów mtDNA, które mogą składać CI przy braku CIII1,19,20.
Mechanizm produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) podczas niedotlenienia był do niedawna nieznany. Po ostrym niedotlenieniu CI ulega przemianie aktywny/dezaktywny (A/D), która polega na zmniejszeniu aktywności oksydoreduktazy NADH-CoQ pompującej H+. Taki spadek pompowania H+ zakwasza macierz mitochondrialną i częściowo rozpuszcza osady wapniowo-fosforanowe w macierzy mitochondrialnej, uwalniając rozpuszczalny Ca2+. Ten wzrost rozpuszczalnego Ca2+ aktywuje wymiennik Na+/Ca2+ (NCLX), który wytłacza Ca2+ w zamian za Na+. Wzrost mitochondrialnego Na+ oddziałuje z fosfolipidami po wewnętrznej stronie IMM, zmniejszając jego płynność i transfer CoQ między CII i CIII, ostatecznie wytwarzając anion ponadtlenkowy, sygnał redoks21. Co ciekawe, transfer CoQ był zmniejszony tylko między CII i CIII, ale nie między CI i CIII, podkreślając, że 1) Na+ był w stanie modulować tylko jedną z istniejących pul CoQ w mitochondriach; 2) w IMM istnieją funkcjonalnie zróżnicowane pule CoQ. W związku z tym szeroko stosowany protokół do badania aktywności enzymów mitochondrialnych może być wykorzystany do oceny istnienia wspomnianych pul CoQ.
Obecny protokół opiera się na pomiarze redukcji utlenionego cyt c, substratu CIII, przez absorbancję w obecności bursztynianu (tj. substratu CII) lub NADH (tj. substratu CI). Ta sama próbka jest dzielona na dwie, z których jedna zostanie potraktowana KCl, a druga o tym samym stężeniu NaCl. W ten sposób, biorąc pod uwagę, że Na+ zmniejsza płynność IMM, gdyby CoQ istniało w unikalnej puli w IMM, zarówno CI+CIII, jak i CII+CIII zmniejszyłyby się w obecności Na+. Gdyby jednak CoQ istniał w częściowo segmentowanych funkcjonalnych pulach CoQ, wpływ Na+ byłby w większości (lub tylko) widoczny na aktywność CII+CIII, ale nie na CI+CIII. Jak ostatnio opublikowano21, Na+ wpływa tylko na transfer CoQ między CII i CIII (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C,D), ale nie między CI a CIII (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B).
Ten protokół, wraz z całym wachlarzem technik, został wykorzystany do potwierdzenia istnienia częściowo segmentowanych funkcjonalnych pul CoQ w IMM, jednej dedykowanej CI (tj. CoQNAD), a drugiej dedykowanej enzymom powiązanym zFAD (np. CoQ FAD)1,3,7; obserwacja, która, choć nadal jest dyskutowana22, zostało potwierdzone niezależnie przez kilka grup7,19. Tak więc superorganizacja CI w superkompleksy wpływa na lokalną mobilność CoQ, ułatwiając jego wykorzystanie przez CIII w ramach superkompleksu1,7,13,14,23,24,25.

<table><tbody><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Test białka Sigma-Aldrich</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c z serca koni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Kwas malonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207810</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Spectra Manager</td><td>JASCO</td><td>wersja 2</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>UV/VISJASCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Succinate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398055</td><td></td></tr></tbody></table>

wrażliwość wewnętrznej błony mitochondrialnej na na+ ujawnia częściowo segmentowane funkcjonalne pule coq

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Pule ubichinonu (CoQ) w wewnętrznej błonie mitochondrialnej (IMM) są częściowo podzielone na enzymy zależne od kompleksu I lub FAD. Taki podział można łatwo ocenić za pomocą testu porównawczego z użyciem NADH lub bursztynianu jako donorów elektronów w mitochondriach mrożonych i rozmrożonych, w których mierzy się redukcję cytochromu c (cyt c). Test opiera się na wpływie Na+ na IMM, zmniejszając jego płynność. W tym miejscu przedstawiamy protokół pomiaru aktywności oksydoreduktazy NADH-cyt c i aktywności oksydoreduktazy bursztynianowo-cyt c w obecności NaCl lub KCl. Reakcje, które polegają na mieszaninie odczynników w kuwecie w sposób stopniowy, są mierzone spektrofotometrycznie przez 4 minuty w obecności Na+ lub K+. Tę samą mieszaninę przeprowadza się równolegle w obecności specyficznych inhibitorów enzymów w celu odjęcia niespecyficznej zmiany absorbancji. Aktywność oksydoreduktazy NADH-cyt c nie zmniejsza się w obecności żadnego z tych kationów. Jednak aktywność oksydoreduktazy bursztynianowo-cyt c zmniejsza się w obecności NaCl. Ten prosty eksperyment podkreśla: 1) wpływ Na+ na zmniejszenie płynności IMM i transferu CoQ; 2) że nadkompleks I+III2 chroni transfer ubichinonu (CoQ) przed wpływem obniżenia płynności IMM; 3) że transfer CoQ między CI i CIII różni się funkcjonalnie od transferu CoQ między CII i CIII. Fakty te potwierdzają istnienie funkcjonalnie zróżnicowanych pul CoQ w IMM i pokazują, że mogą być regulowane przez zmieniające się środowisko Na+ mitochondriów.

Typowe wyniki uzyskane zgodnie z tym protokołem przedstawiono poniżej (Rysunek 3). Ponieważ absorbancja zredukowanego cyt c znajduje się przy 550 nm, wszystkie niehamowane próby powinny wykazywać wzrost absorbancji przy 550 nm. Próby z hamowaniem idealnie wykazują płaską linię lub lekko rosnący nachylenie (Rysunek 3). Nachylenia z prób z hamowaniem należy odjąć od nachyleń z prób niehamowanych.
Próbki A i B, obie skorygowane o odpowia...

Ten protokół opisuje test porównawczy, wykorzystujący aktywność kompleksu mitochondrialnego CI+CIII i CII+CIII w obecności lub braku Na+, w celu zbadania istnienia częściowo segmentowanych funkcjonalnych pul CoQ.

Wrażliwość wewnętrznej błony mitochondrialnej na Na+ ujawnia częściowo segmentowane funkcjonalne pule CoQ

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

Protokół ten podkreśla rolę sodu jako drugiego przekaźnika, a także pokazuje istnienie częściowo zróżnicowanych pul ubichinolu. Technika ta demonstruje niezwykle proste podejście do badania puli ubichinolu, które w przeciwnym razie wymaga bardzo specyficznych modeli komórkowych. Podejście to może być wykorzystane do badania transferu elektronów w innych błonach, w szczególności enzymów w kroplach lipidów.Podzielić próbki na cztery podpróbki po 20 mikrogramów każda i oznaczyć je od A do D. Podziel próbki A i B na dwie podpróbki po 10 mikrogramów każda i oznacz je jako A1, A2, B1 i B2. Przygotuj bufor C1/C2 zgodnie z opisem w protokole tekstowym i podgrzej do 37 stopni Celsjusza. W kuwecie o pojemności jednego mililitra dodaj każdą z podpróbek do 30 mikrolitrów cytochromu c i 10 mikrolitrów malonianu. Dodaj bufor C1/C2, aby zwiększyć objętość do 980 mikrolitrów w kuwetach A1 i B1 oraz 979 mikrolitrów w A2 i B2. Dodać 10 mikrolitrów jednomolowego chlorku potasu w kuwetach A1 i A2 oraz 10 mikrolitrów jednomolowego chlorku sodu w B1 i B2. Dodaj jeden mikrolitr jednomilimolowego rotenonu do kuwet A2 i B2. Tuż przed pomiarem dodaj 10 mikrolitrów 10-milimolowego NADH do wszystkich kuwet.Od

inner-mitochondrial-membrane-sensitivity-to-na-reveals-partially

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Ten protokół opisuje separację funkcjonalnych mitochondrialnych kompleksów łańcucha transportu elektronów (Cx) I-V i ich superkompleksów za pomocą natywnej elektroforezy w celu ujawnienia informacji o ich budowie i strukturze. Natywny żel można poddać immunoblottingowi, testom w żelu i oczyszczaniu za pomocą elektroelucji w celu dalszego scharakteryzowania poszczególnych kompleksów.

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

Tutaj prezentujemy dwa protokoły pomiaru napływu mitochondrialnego Ca2+ w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. W przypadku izolowanych mitochondriów szczegółowo opisujemy test importu Ca2 + oparty na czytniku płytek przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + zieleni wapniowej-5N. W przypadku hodowanych komórek opisujemy metodę mikroskopii konfokalnej z użyciem barwnika Ca2+ Rhod-2/AM.

Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji, dystrybucji i identyfikacji superkompleksów mitochondrialnych, który minimalizuje narażenie na detergenty i Coomassie Blue. Protokół ten zapewnia optymalną równowagę między rozdzielczością a zachowaniem aktywności enzymów, jednocześnie minimalizując ryzyko utraty labilnych interakcji białko-białko.

Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Pomimo ostatnich osiągnięć, wiele białek mitochondrialnych drożdży nadal pozostaje ze swoimi funkcjami zupełnie nieznanymi. Protokół ten zapewnia prostą i niezawodną metodę określania submitochondrialnej lokalizacji białek, co ma fundamentalne znaczenie dla wyjaśnienia ich funkcji molekularnych.

Ocena lokalizacji białek submitochondrialnych u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae

Ta metoda wykorzystuje udział porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów do wycieku protonów o niskiej przewodności, aby określić próg napięcia dla otwarcia porów u noworodków z zespołem łamliwego chromosomu X o zwiększonej zawartości kardiomiocytów mitochondrialnego koenzymu Q w porównaniu do kontroli typu dzikiego.

Ocena otwartego prawdopodobieństwa porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów w warunkach nadmiaru koenzymu q

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Mitochondrialne miejsca kontaktu to kompleksy białkowe, które oddziałują z wewnętrznymi i zewnętrznymi białkami błony mitochondrialnej. Miejsca te są niezbędne do komunikacji między błonami mitochondrialnymi, a tym samym między cytozolem a macierzą mitochondrialną. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji kandydatów kwalifikujących się do tej konkretnej klasy białek.

Ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych

Ten protokół przedstawia proces propagacji, różnicowania i barwienia hodowanych komórek SH-SY5Y oraz pierwotnych neuronów hipokampa szczura do wizualizacji i analizy ultrastruktury mitochondriów za pomocą mikroskopii stymulowanego zubożenia emisji (STED).

Wykorzystanie obrazowania STED na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury wewnętrznej błony mitochondrialnej w modelach komórek neuronalnych

Oferujemy metodę jednoczesnego badania biblioteki fragmentów przeciwciał pod kątem powinowactwa wiązania i rozpuszczalności cytoplazmatycznej za pomocą szlaku translokacji podwójnej argininy Escherichia coli, który ma nieodłączny mechanizm kontroli jakości dla wewnątrzkomórkowego fałdowania białek, w celu wyświetlenia fragmentów przeciwciała na wewnętrznej błonie.

Bakteryjny wyświetlacz błony wewnętrznej do badania przesiewowego biblioteki fragmentów przeciwciał

Odkryj rolę sodu jako drugiego posłańca w różnicowaniu puli ubichinolu w mitochondriach. Ta metoda pozwala badać transfer elektronów i częściowo segmentowane pule CoQ w prostym modelu.

Wrażliwość wewnętrznej błony mitochondrialnej na Na⁺ ujawnia częściowo segmentowane funkcjonalne pule CoQ

Przeglądaj więcej filmów