Name: Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna szerokokątnego mikrokrążenia płucnego w eksperymentalnym ostrym uszkodzeniu płuc z wykorzystaniem systemu obrazowania stabilizowanego próżniowo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj mikroskopię fluorescencyjną przyżyciową do badania mikrokrążenia płucnego z wykorzystaniem systemu stabilizowanego próżniowo. Ta metoda umożliwia obserwację interakcji leukocytów z endotelem w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Pinie Colarusso, która dostarczyła znaczące doświadczenie w edycji i poprawie tego manuskryptu.

Wszystkie opisane tutaj procedury zostały wykonane za uprzednią zgodą Komitetu ds. Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Dalhousie (UCLA).
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>System obrazowania płuc: Aby przygotować okno, należy podać cienką warstwę smaru próżniowego na górną część pierścienia zewnętrznego, unikając zanieczyszczenia kanału podciśnieniowego. Umieść czyste szkiełko nakrywkowe o grubości 8 mm na oknie i delikatnie dociśnij, aby uzyskać uszczelkę.</li>
	<li>Mikroskop fluorescencyjny szerokokątnego: Wykonuj obrazowanie za pomocą konwencjonalnego szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw o dużej odległości roboczej 20x/0,40 i czarno-białą kamerę ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) o szybkości 25 kl./s. Zastosuj filtr pasmowoprzepustowy 530-550 nm do wzbudzenia rodaminy-6G i filtr pasmowoprzepustowy 460-490 nm do wzbudzenia izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC).</li>
	<li>System próżniowy: Podłączyć okienko obrazowania do pompy próżniowej wyposażonej w cyfrowy manometr zdolny do zapewnienia stałego ssania 50-60 mmHg, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1. Krótko mówiąc, podłącz okienko obrazowania do pompy za pomocą rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej 1,0 mm, rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej 1,0 cm, kolby próżniowej i wbudowanego filtra 0,2 μm.</li>
	<li>Wentylator: Ustaw mały wentylator dla gryzoni, aby zapewnić wentylację sterowaną ciśnieniem z szybkością i objętością obliczoną na podstawie wagi myszy. Zapewnić dodatnie ciśnienie końcowo-wydechowe (PEEP) na poziomie 5 cmH2O na czas trwania eksperymentu i ustawić ciśnienie docelowe na 20 cmH2O.</li>
	<li>Środek znieczulający: Używając systemu do podawania znieczulenia o niskim przepływie, napełnij strzykawkę o pojemności 5,0 ml 99,9% izofluranem. Użyj systemu oczyszczania gazów odlotowych, aby zminimalizować ryzyko wdychania przez chirurga.</li>
</ol>
2. Znieczulenie
<ol>
	<li>Umieść 20-25 g 12-tygodniowego samca myszy C57Bl/6 w komorze indukcyjnej znieczulenia. Przy szczelnie zamkniętej komorze rozpocząć indukcję izofluranem o stężeniu 3% i natężeniu przepływu 500 ml/min.</li>
	<li>Gdy mysz zostanie znieczulona (uwidoczniona przez spowolnienie oddechu), przenieś ją do stanowiska intubacyjnego i przymocuj górne siekacze do wiszącego szwu.</li>
	<li>Zaciśnij szew, aby zabezpieczyć pysk wewnątrz stożka nosowego. Rozpocząć przepływ gazu przez stożek nosowy o stężeniu 2,5%.</li>
	<li>Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia poprzez uszczypnięcie palca u nogi przed przejściem do następnego kroku.</li>
</ol>
3. Intubacja
<ol>
	<li>Obróć stojak tak, aby tył stojaka i grzbietowa strona myszy były skierowane w stronę chirurga.</li>
	<li>Przełóż końcówkę światłowodowego o długości 20 cm przez kaniulę dotchawiczą 20 G i zanurz końcówkę w HCl lidokainy (1%), aby ułatwić przejście przez krtań.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy podnieś dolną szczękę i przesuń język, aby zapewnić swobodne przejście do dróg oddechowych.</li>
	<li>Włóż zmodyfikowany otoskop (~60° usunięto obwód wziernika) tak, aby górne siekacze zmieściły się w szczelinie w wzierniku. Dostosuj zakres i pozycję języka, aż nagłośnia i struny głosowe będą wyraźnie widoczne.</li>
	<li>Przełóż światłowodowy obciążony kaniulą dotchawiczą przez szczelinę w wzierniku i do krtani. Małymi okrężnymi ruchami przeprowadź przez struny głosowe i do tchawicy.</li>
	<li>Przepchnij kaniulę wzdłuż światłowodowego, przechodząc między strunami głosowymi i do tchawicy.</li>
</ol>
4. Wentylacja
<ol>
	<li>Wyjmij mysz ze stanowiska do intubacji i umieść ją na poduszce grzewczej w prawej bocznej pozycji odleżynowa.</li>
	<li>Podłącz kaniulę do rurki respiratora i uruchom respirator. Zmniejsz stężenie środka znieczulającego do 1,5% i monitoruj głębokość, testując odruch pedałowania. Jeśli odruch utrzymuje się, stopniowo zwiększaj stężenie nawet do 2%.</li>
	<li>Umieść żel łzowy w oczach myszy, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Za pomocą taśmy medycznej przymocuj kaniulę do pyska. Za pomocą taśmy opisowej przymocuj prawą przednią łapę do poduszki grzewczej w przybliżeniu na godzinie 9. Wyprostuj lewą tylną łapę doogonowo i zabezpiecz w przybliżeniu w pozycji godziny 6.</li>
	<li>Za pomocą taśmy materiałowej lekko rozciągnij lewą przednią łapę do pozycji godziny 12 i przymocuj drugi koniec taśmy do górnej części platformy IVM, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2A (utrzymanie lekkiego napięcia w tym miejscu ułatwia późniejszą torakotomię).</li>
	<li>Włóż sondę temperatury doodbytniczej i zabezpiecz sondę, przyklejając ją taśmą do poduszki grzewczej. Umieść pulsoksymetr na prawej tylnej łapie i przymocuj do poduszki grzewczej, uważając, aby nie zakłócać krążenia.</li>
	<li>Gdy temperatura ustabilizuje się na poziomie 37,0 °C ± 0,1 °C, przystąp do wykonania torakotomii.</li>
</ol>
5. Torakotomia
<ol>
	<li>Wysterylizuj klatkę piersiową i brzuch chusteczką nasączoną 70% alkoholem. Nałóż cienką warstwę oleju mineralnego, aby zwilżyć włosy po lewej stronie myszy - od mostka do kręgosłupa i od ramienia do dołu klatki piersiowej.</li>
	<li>kleszczami i prostymi nożyczkami wykonaj małe podłużne nacięcie w pobliżu dolnej części klatki piersiowej, aby odsłonić leżącą pod spodem warstwę mięśni.</li>
	<li>Poruszając się brzusznie, użyj sekcji, aby oddzielić tkankę nabłonkową i tłuszczową od warstwy mięśniowej. Kauteryzuj odsłonięte naczynia krwionośne. Po zminimalizowaniu ryzyka utraty krwi należy przedłużyć pierwotne nacięcie brzusznie, aż do wyrostka mieczykowatego.</li>
	<li>Powtórz ten proces grzbietowo do ~5 mm w bok do kręgosłupa.</li>
	<li>Poruszając się czaszką, użyj sekcji, aby odsłonić klatkę piersiową. Kauteryzuj odsłonięte naczynia krwionośne, aby zachować stabilność hemodynamiczną.</li>
	<li>Gdy ryzyko utraty krwi zostanie zminimalizowane, rozszerz nacięcie od wyrostka mieczykowatego do pachy.</li>
	<li>Powtórz ten proces po grzbietowej stronie nacięcia, aż do ~1 cm poniżej lewego ucha.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy hemostatycznych chwyć wycięty nabłonek i tkankę tłuszczową i umieść je z dala od obszaru operacyjnego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwór rodaminy-6G (0,5 mg/ml; 1,5 ml/kg) w celu wizualizacji leukocytów i bydlęcej albuminy FITC (50 mg/ml; 1 ml/kg) w celu uwidocznienia perfuzji naczyń włosowatych przez żyłę ogonową.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy zębatych chwyć żebro bezpośrednio poniżej pozycji podstawy płuca przy wdechu końcowym i lekko cofnij, aby odciągnąć żebro od płuca. Przetnij żebro, aby wywołać odmę opłucnową.</li>
	<li>Przedłuż nacięcie bocznie wzdłuż mięśnia międzyżebrowego w obu kierunkach, uważając, aby nie dotknąć odsłoniętej powierzchni płuc.</li>
	<li>Używając kleszczy, chwyć następne najwyższe żebro i lekko się cofnij, aby płuco mogło odpaść od ściany klatki piersiowej. Jeśli płuco nie odrywa się, lekko dociśnij ścianę klatki piersiowej do płuca, aby płuco przylegało do leżącej poniżej opłucnej, a tym samym łatwiej odpadło.</li>
	<li>Kontynuuj pierwotne nacięcie brzusznie aż do mostka i czaszkowo, aż wierzchołek płuca zostanie odsłonięty. Używaj bawełnianych aplikatorów i gazy, aby złagodzić pojawiające się krwawienie.</li>
	<li>Podnieś klatkę piersiową, aby odsłonić międzyżebrowe naczynia krwionośne na grzbietowej stronie klatki piersiowej. Uważając, aby nie uszkodzić płuca, kauteryzuj najniższe naczynie międzyżebrowe w pobliżu kręgosłupa, a następnie przetnij żebro. Poruszając się czaszkowo i brzusznie, powtarzaj, aż część klatki piersiowej o wymiarach około 1 cm x 1,5 cm zostanie wycięta (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Usunąć nadmiar nagromadzonego płynu w jamie klatki piersiowej poprzez działanie kapilarne za pomocą małych pasków gazy.</li>
	<li>Przechodząc do mikroskopii, odczekaj ~5 minut, aż płyn opłucnowy rozproszy się, aby zapewnić bezpieczniejsze połączenie między płucem a okienkiem obrazowania.</li>
</ol>
6. Mikroskopia
<ol>
	<li>Włącz pompę próżniową i ustaw ciśnienie na ~50–60 mmHg.</li>
	<li>Przenieś platformę IVM na stolik mikroskopowy. Ustaw metalowy słupek i mikromanipulator w taki sposób, aby okienko obrazowania znajdowało się bezpośrednio nad odsłoniętym płucem, a ramię okienka zbliżało się do płuca w przybliżeniu z pozycji godziny 3.</li>
	<li>Za pomocą mikromanipulatora ostrożnie opuść okienko obrazowania, aż przylgnie do powierzchni płuc i ustabilizuje ją (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Korzystając z obiektywu 20x i filtra wzbudzenia pasmowoprzepustowego 460-490 nm, zidentyfikuj żyłę płucną na podstawie zbieżnego wzorca przepływu krwi. Wyśrodkuj naczynie w polu view i nagraj 30 s wideo.
	<ol>
		<li>Przełącz się na filtr wzbudzenia pasmowo-przepustowego 530-550 nm i nagrywaj 30 s wideo w tym samym polu view.</li>
		<li>Powtarzaj poprzedni krok, aż zobrazowanych zostanie pięć żyłek płucnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z filtra wzbudzenia pasmowoprzepustowego 460-490 nm, zidentyfikuj tętniczkę płucną na podstawie rozbieżnego wzorca przepływu krwi. Wyśrodkuj naczynie w polu view i nagraj 30 s wideo.
	<ol>
		<li>Przełącz się na filtr wzbudzenia pasmowo-przepustowego 530-550 nm i nagrywaj 30 s wideo w tym samym polu view.</li>
		<li>Powtarzaj poprzedni krok, aż zobrazowanych zostanie pięć tętniczek płucnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z filtra wzbudzenia pasmowo-przepustowego 460-490 nm, zlokalizuj obszar pęcherzyków płucnych i naczyń włosowatych, które nie są przecięte przez większe naczynia i nagraj 30 s wideo.
	<ol>
		<li>Przełącz się na filtr wzbudzenia pasmowo-przepustowego 530-550 nm i nagrywaj 30 s wideo w tym samym polu view.</li>
		<li>Powtarzaj poprzedni krok, aż zobrazowanych zostanie pięć obszarów naczyń włosowatych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Protokół eutanazji i czyszczenia
<ol>
	<li>Usuń platformę IVM ze stolika mikroskopu i dostosuj podawanie izofluranu do 5% przez 5 minut, aby poddać mysz eutanazji.</li>
	<li>Czekając, wyrzuć szkiełko nakrywkowe i odłącz okienko obrazowania od platformy. Wyczyść okienko obrazowania małą szczoteczką i za pomocą strzykawki 30 G włożonej do kanału, aby przepłukać je kilkakrotnie wodą destylowaną. Następnie przepłukać 95% etanolem za pomocą pompy próżniowej.</li>
	<li>Po upływie 5 minut należy odłączyć respirator i zapewnić całkowitą eutanazję poprzez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
</ol>

<ol><li>Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+pulmonary+immune+response+in+inflammation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471(2021).</li>
<li>Gaertner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+interpretation+of+intravital+microscopy+images+in+studies+of+lung+tissue+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009(2015).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Looney, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).</li>
<li>Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+intravital+two-photon+excitation+microscopy+reveals+absence+of+pulmonary+vasoocclusion+in+unchallenged+sickle+cell+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice.</a> IntraVital. 3 (2), 29748(2014).</li>
<li>Blueschke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+measurement+of+microcirculatory+blood+flow+velocity+in+pulmonary+metastases+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630(2014).</li>
<li>Tabuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precapillary+oxygenation+contributes+relevantly+to+gas+exchange+in+the+intact+lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).</li>
<li>Rodriguez-Tirado, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+intravital+microscopy+in+the+lung+with+a+vacuum+stabilized+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603(2016).</li>
<li>Fiole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+intravital+imaging+of+lungs+during+anthrax+infection+reveals+long-lasting+macrophage-dendritic+cell+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts.</a> Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).</li>
<li>Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iNKT+cell+emigration+out+of+the+lung+vasculature+requires+neutrophils+and+monocyte-derived+dendritic+cells+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation.</a> Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).</li>
<li>Neupane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patrolling+alveolar+macrophages+conceal+bacteria+from+the+immune+system+to+maintain+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis.</a> Cell. 183 (1), 110-125 (2020).</li>
<li>Tschernig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualisation+of+microparticles+in+the+living+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Direct visualisation of microparticles in the living lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).</li>
<li>Mertens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+dynamics+in+acute+lung+injury%3A+Heterogeneous+distension+rather+than+cyclic+opening+and+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse.</a> Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).</li>
<li>Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilation+and+perfusion+at+the+alveolar+level%3A+Insights+from+lung+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy.</a> Frontiers in Physiology. 11, 291(2020).</li>
<li>Margraf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%25+Hydroxyethyl+starch+%28HES+130%2F0.4%29+diminishes+glycocalyx+degradation+and+decreases+vascular+permeability+during+systemic+and+pulmonary+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice.</a> Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).</li>
<li>Roller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo+observations+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1-mediated+leukocyte-endothelial+cell+interactions+in+the+pulmonary+microvasculature+in+abdominal+sepsis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice.</a> Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).</li>
<li>Marques, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+increases+endothelial+CXCL16-leukocyte+CXCR6+adhesion+in+vitro+and+in+vivo.+Potential+consequences+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1766(2017).</li>
<li>Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+an+erythrocyte+population+with+decreased+deformability+and+hemoglobin+content+following+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).</li>
<li>Trzeciak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+microcirculatory+perfusion+derangements+in+patients+with+severe+sepsis+and+septic+shock%3A+Relationship+to+hemodynamics%2C+oxygen+transport%2C+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Emergency+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival.</a> Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).</li>
<li>Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+intravital+imaging+of+leukocyte+migration+during+inflammation+in+the+respiratory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acute+and+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system.</a> Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li>
<li>Orthgiess, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+exhibit+Lyz2+promoter+activity+in+vivo%3A+Implications+for+using+LysM-Cre+mice+in+myeloid+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research.</a> European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).</li>
<li>Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+lung+injury%3A+A+clinical+and+molecular+review%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute lung injury: A clinical and molecular review.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).</li>
<li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786(2019).</li>
<li>Kim, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+tracheal+epithelial+cells+in+mice+during+airway+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).</li>
<li>Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+optical+coherence+tomography+imaging+to+assess+mucus-mobilizing+interventions+for+muco-obstructive+lung+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).</li>
<li>Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+observations+of+15-%C2%B5m+microspheres+lodging+in+the+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li>
<li>Amato, M. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+protective-ventilation+strategy+on+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).</li>
<li>Looney, M. R., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the lung.</a> Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).</li>
</ol>

Dr Kamala D. Patel jest prezesem i współzałożycielką Luxidea, przedsiębiorstwa, od którego zakupiono okno obrazowania wykorzystane w tym eksperymencie.

Przedstawiony tutaj protokół wymaga praktyki i zwrócenia uwagi na kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, ważne jest, aby przygotować okno obrazowania przed rozpoczęciem intubacji i operacji. Użyj minimalnej ilości smaru próżniowego, aby pokryć zewnętrzny pierścień okienka obrazowania, nałóż szkło nakrywkowe i przetestuj odsysanie kroplą wody destylowanej. Przygotowanie tego z wyprzedzeniem zapobiegnie wysychaniu odsłoniętych płuc podczas konfiguracji. Chociaż możliwe jest spłukiwanie ciepłą solą fizjologiczną, może to gr...

Mikroskopia przyżyciowa (IVM) jest użytecznym narzędziem do obrazowania do wizualizacji i badania różnych procesów biofizycznych in vivo. Zobrazowanie płuc in vivo jest bardzo trudne ze względu na ich zamknięte położenie, delikatną naturę tkanki oraz artefakty ruchu wywołane oddychaniem i biciem serca1,2. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano różne zestawy mikroskopii przyżyciowej (IVM) do obrazowania w czasie rzeczywistym interakcji leukocytów-śródbłonka w mikrokrążeniu płucnym. Takie podejścia opierają się na chirurgicznym odsłonięciu i ustabilizowaniu płuc do obrazowania.
Zwierzęta są zazwyczaj przygotowywane do zapłodnienia in vitro metodą płuc za pomocą zabiegów chirurgicznych. Najpierw zwierzęta są intubowane i wentylowane, co pozwala na chirurgiczne wycięcie okna piersiowego, a następnie interwencje w celu ustabilizowania płuc do obrazowania. Jedna z technik polega na przyklejeniu miąższu do szklanego szkiełka nakrywkowego3, procedura, która grozi poważnym fizycznym urazem obrazowanej tkanki. Bardziej zaawansowane jest wykorzystanie systemu próżniowego do stabilizacji płuc pod szklanym oknem4. Taka konfiguracja ułatwia luźne przyleganie powierzchni płuc do szkiełka nakrywkowego za pomocą odwracalnego podciśnienia rozprowadzonego na dużym obszarze lokalnym i rozszerza płuco, jednocześnie ograniczając ruch w wymiarach x, y i z4. Podciśnienie jest stosowane równomiernie przez kanał otaczający obszar obrazowania zestawu i wciąga tkankę do płytkiego stożkowego obszaru skierowanego w stronę szkiełka nakrywkowego klasy obrazowej4. Przez to okno obserwacyjne można badać mikrokrążenie płuc za pomocą różnych modalności obrazowania optycznego.
Lung IVM umożliwia ilościowe obrazowanie wielu parametrów mikrokrążenia. Należą do nich takie pomiary, jak prędkość i długość ścieżki leukocytów5, prędkość przepływu czerwonych krwinek6 i natlenienie7, przerzuty nowotworowe8, rozróżnienie subpopulacji komórek odpornościowych9,10,11, wizualizacja mikrocząstek12, dynamika pęcherzyków płucnych13,14, przepuszczalność naczyń krwionośnych15, oraz funkcja kapilarna16. Nacisk kładziony jest tutaj na rekrutację leukocytów i funkcję naczyń włosowatych. Inicjacja rekrutacji leukocytów w mikrokrążeniu płucnym obejmuje przejściowe interakcje toczenia i silne interakcje adhezyjne między leukocytami a komórkami śródbłonka, które są zwiększone w stanach zapalnych16,17. Zazwyczaj walcowanie określa się ilościowo na podstawie liczby leukocytów, które przechodzą przez zdefiniowaną przez operatora linię odniesienia, podczas gdy adhezja jest określana ilościowo na liczbie leukocytów, które są nieruchome na śródbłonku16. Czynność naczyń włosowatych może być również zaburzona w stanach zapalnych, często powodując zmniejszenie perfuzji. Można to przypisać kilku czynnikom, w tym zmniejszeniu odkształcalności czerwonych krwinek18 i różnorodnej ekspresji indukowalnej syntazy NO przez komórki śródbłonka, co skutkuje patologiczną przetaczaniem19. Zazwyczaj zagregowana długość perfundowanych naczyń włosowatych na obszar jest mierzona i podawana jako funkcjonalna gęstość kapilarna (FCD).
Badanie rekrutacji leukocytów w płucach w czasie rzeczywistym wymaga oznaczania celów biologicznych barwnikami fluorescencyjnymi lub przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie20. Alternatywnie, różne transgeniczne szczepy myszy, takie jak myszy z zielonym białkiem fluorescencyjnym lizozymu M-(LysM-GFP), można wykorzystać do obrazowania określonych podzbiorów komórek odpornościowych, takich jak neutrofile 21,22. Leukocyty znakowane fluorescencyjnie można następnie uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej szerokokątnej, mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii wielofotonowej. Techniki te uzyskują kontrast poprzez wykorzystanie określonych długości fal wzbudzenia i wykrywanie emitowanej fluorescencji, jednocześnie blokując wykrywanie długości fali wzbudzenia, podświetlając w ten sposób oznaczony obiekt.
Istniejące badania dotyczące ilościowego oznaczania zwijania leukocytów, adhezji i funkcjonalnej gęstości naczyń włosowatych w płucach myszy opierały się głównie na ręcznej analizie wideo. Jest to możliwe dzięki oprogramowaniu typu open source, takiemu jak Fiji6,23, oprogramowaniu własnościowemu, takiemu jak CapImage12, lub niestandardowym systemom przetwarzania obrazu24. I odwrotnie, różne zastrzeżone platformy oprogramowania (np. NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) umożliwiają automatyczny pomiar szerokiej gamy innych parametrów fizjologicznych, w tym wielu z wcześniej wymienionych tutaj5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Dokonano ważnych obserwacji dotyczących patologii ostrego uszkodzenia płuc (ALI) i zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) przy użyciu IVM płuc. ARDS charakteryzuje się wieloma procesami patofizjologicznymi w płucach, w tym obrzękiem płuc i uszkodzeniem pęcherzyków płucnych spowodowanym dysfunkcją śródbłonka i bariery nabłonkowej25. Korzystając z mysiego modelu, stwierdzono, że ALI wywołane sepsą wiąże się ze znaczącymi szkodliwymi zmianami w transporcie komórek odpornościowych w środowisku płuc26. Stwierdzono, że neutrofile rekrutowane do naczyń włosowatych myszy z ALI wywołanym sepsą utrudniają mikrokrążenie, zwiększając w ten sposób niedotlenienie w ALI26. Ponadto IVM został wykorzystany do uzyskania wglądu w podstawowy mechanizm naprawy po wystąpieniu ARDS27. IVM płuc jest również cennym narzędziem w zrozumieniu zmian patofizjologicznych w różnych obturacyjnych chorobach płuc. Na przykład wizualizacja transportu śluzu w chorobach takich jak mukowiscydoza (CF) i przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) ułatwiła badanie nowych i istniejących metod leczenia usuwania śluzu 28. Przeanalizowano również handel leukocytami w tych warunkach17.
Ten protokół rozszerza podejście początkowo opisane przez Lamm et al.29 do badania interakcji leukocytów-śródbłonka za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Opisane procedury wykorzystują system obrazowania płuc in vivo, który obejmuje metalową podstawę o wymiarach 16,5 cm x 12,7 cm, mikromanipulator i okienko do obrazowania próżniowego (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). System jest zamontowany na platformie wydrukowanej w 3D o wymiarach 20 cm x 23,5 cm (plik uzupełniający 1), aby zapewnić bezpieczne mocowanie rurki respiratora i poduszki grzewczej. Metoda ta zapewnia powtarzalne i wymierne obrazowanie mysiego mikrokrążenia płucnego in vivo. Szczegółowo wyjaśniono ważne aspekty przygotowania chirurgicznego, a także prawidłowego wykorzystania stabilizowanego próżniowo systemu obrazowania płuc. Wreszcie, eksperymentalny model ALI jest używany do zapewnienia reprezentatywnego obrazowania i analizy zmienionego toczenia leukocytów, adhezji leukocytów i perfuzji naczyń włosowatych związanych ze stanem zapalnym. Zastosowanie tego protokołu powinno ułatwić dalsze ważne badania nad patofizjologicznymi zmianami w mikrokrążeniu płucnym w ostrych stanach chorobowych.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml BD Luer Slip Tip sterylna, jednorazowego użytku</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td> 1 <td>ml strzykawka</td></tr><tr><td>ADSON Szczypce opatrunkowe, szerokość końcówki 0,6 mm, długość zębów 11,5 mm, 12 cm</td><td>RWD Life Science Co.</td><td>F12002-12</td><td>kleszcze</td></tr><tr><td>Albumina-Fluoresceina Izotiocyjanian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771-1G</td><td>FITC-albumina</td></tr><tr><td>Wacik alkoholowy Alkohol izopropylowy 70% v/v</td><td>Kanadyjska firma zajmująca się pakowaniem na zamówienie</td><td>80002455</td><td>Chusteczka nasączona alkoholem</td></tr><tr><td>AVDC110 Zaawansowany cyfrowy konwerter wideo</td><td>Canopus</td><td>00631069602029</td><td>Cyfrowy konwerter wideo</td></tr><tr><td>B/W - CCD -</td><td>Obrazowanie klaksonu kamery</td><td>BC-71</td><td>Aparat</td></tr><tr><td>fotograficzny Bovie Deluxe Zestaw do kauteryzacji wysokotemperaturowej</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td>Kauteryzator</td></tr><tr><td>C57BL/6 Myszy</td><td>Charles River Laboratories International</td><td>C57BL/6NCrl</td><td>C57BL/6</td></tr><tr><td>Myszy Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td>Aplikator bawełniany</td></tr><tr><td>CS-8R 8mm Okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0701</td><td>Szkiełko nakrywkowe szklane</td></tr><tr><td>Cyfrowy manometr</td><td>ITM Instruments Inc.</td><td>DG2551L0NAM02L0IM& V</td><td>Cyfrowy manometr</td></tr><tr><td>Dr Mom Slimline Otoskop ze stali nierdzewnej LED</td><td>Dr. Mom Otoskopy</td><td>1001</td><td>Otoskop</td></tr><tr><td>Etylo-alchohol 95% obj</td>. <td>Alkohole handlowe</td><td>P016EA95</td><td>95% etanolu</td></tr><tr><td>Drobne nożyczki - martenzytyczne Fine</td><td>Science Tools</td> ze stali nierdzewnej <td>14094-11</td><td>Nożyczki</td></tr><tr><td>Kolorowa taśma do etykietowania Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>1590110</td><td>Taśma opisowa</td></tr><tr><td>Gast DOA-P704-AA Pompa próżniowa o dużej wydajności</td><td>Cole-Parmer Canada Company</td><td>ZA-07061-40</td><td>Pompa próżniowa</td></tr><tr><td>Hartman Hemostats</td><td>Fine Science Tools</td><td>13003-10</td><td>Kleszczyki hemostatyczne</td></tr><tr><td>Smar wysokopróżniowy</td><td>Dow Corning</td><td>DC976VF</td><td>Smar próżniowy</td></tr><tr><td>Isoflurane USP</td><td>Fresenius Kabi</td><td>CP0406V2</td><td>Isoflurane</td></tr><tr><td>LIDOcaine HCl Wstrzyknięcie 1% 50 mg/5 ml</td><td>Teligent Canada</td><td>0121AD01</td><td>Lidokaina HCl 1%</td></tr> <tr><td>Płuca SurgiBoard</td><td>Luxidea, Inc.</td><td>IMCH-0001</td><td>Przeznaczony do mikroskopii przyżyciowej płuc</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Teva Canada</td><td>00485802</td><td>Olej mineralny</td></tr><tr><td>Zestaw do intubacji intubacji dotchawiczej myszy</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>ETI-MSE</td><td>Stanowisko do intubacji, maska anestezjologiczna, kaniula dotchawicza 20 G, światłowodowy</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny MST49</td><td>Leica Microsystems</td><td>10 450 022</td><td>Mikroskop fluorescencyjny</td></tr><tr><td>N Plan L 20x/0,40 Mikroskop dalekiej odległości roboczej Obiektyw</td><td>Leica Microsystems</td><td>566035</td><td>20x</td></tr><tr><td>obiektyw Gąbki włókninowe 2" x 2" x 2"</td> <td>AMD-Ritmed</td><td>A2101-CH</td><td>Gauze</td></tr><tr><td>Optixcare Eye Lube Plus</td><td>Aventix</td><td>5914322</td><td>Żel przeciwłzowy</td></tr><tr><td>Original Prusa i3 MK3S+ Drukarka 3D</td><td>Prusa Research</td><td>PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI</td><td></td></tr><tr><td>Tlen, Skompresowana</td><td>firma Linde Canada Inc.</td><td></td><td>Igła Oxygen</td></tr><tr><td>PrecisionGlide 30 G x 1/2 (0,3 mm x 13 mm)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305106</td><td>Igła 30 G</td></tr><tr><td>Kolby filtrujące Pyrex 5340-2L 5340, 2000 ml</td><td>Cole-Parmer Canada Company</td><td>5340-2L</td><td>Termos</td></tr><tr><td>Rhodamina 6 G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252433</td><td>Taśma medyczna z miękką</td>tkaniną Sigma-Aldrich 6G</tr><tr><td>- 3"</td> <td>Zagruntowana</td><td>PM5-630709</td><td>Taśma tkaninowa</td></tr><tr><td>Silastic Medical Grade Tubing .040 in. Identyfikator x .085 cala OD</td><td>Dow Corning</td><td>602-205</td><td>Rurka polietylenowa o średnicy wewnętrznej 1,0 mm System</td></tr><tr><td>anestezjologiczny o niskim przepływie Somnosuite</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SS-01, moduł SS-04</td><td>Mały wentylator dla gryzoni, System anestezjologiczny o niskim przepływie, Poduszka grzewcza, Sonda temperatury w odbycie, Pulsoksymetr</td></tr><tr><td>Kleszcze do tkanek, 12,5 cm długości, zakrzywione, 1 x 2 zęby</td><td>World Precision Instruments</td><td>501216</td><td>Kleszcze zębate</td></tr><tr><td>Taśma medyczna Transpore, 1527-1, 1 cal x 10 jardów (2,5 cm x 9,1 m)</td><td>Taśma medyczna</td> <td>3 m</td><td>7000002795</td></tr><tr><td>Rurka, przezroczysta, średnica wewnętrzna 3/8 cala.</td><td>Grainger Canada</td><td>USSZUSA-HT3314</td><td>Rurka polietylenowa o średnicy wewnętrznej 1,0 cm</td></tr><tr><td>Whatman 6720-5002 Filtry liniowe 50 mm, PTFE, 0,2 i mikro; m</td><td>Cole-Parmer Canada Company</td><td>6720-5002</td><td>Linia 0,2 i mikro; M Filtr</td></tr></tbody></table>

przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna szerokokątnego mikrokrążenia płucnego w eksperymentalnym ostrym uszkodzeniu płuc z wykorzystaniem systemu obrazowania stabilizowanego próżniowo

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Obrazowanie przyżyciowe interakcji leukocytów-śródbłonka dostarcza cennych informacji na temat chorób o podłożu immunologicznym u żywych zwierząt. Badanie ostrego uszkodzenia płuc (ALI)/zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) i innych patologii układu oddechowego in vivo jest trudne ze względu na ograniczoną dostępność i nieodłączne artefakty ruchowe płuc. Niemniej jednak opracowano różne podejścia w celu sprostania tym wyzwaniom. Protokół ten opisuje metodę przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej do badania interakcji leukocytów-śródbłonka w czasie rzeczywistym w mikrokrążeniu płucnym w eksperymentalnym modelu ALI. System obrazowania płuc in vivo i drukowana w 3D platforma mikroskopii przyżyciowej służą do zabezpieczenia znieczulonej myszy i ustabilizowania płuc przy jednoczesnym zminimalizowaniu mylącego uszkodzenia płuc. Po przygotowaniu stosuje się szerokopolową mikroskopię fluorescencyjną do badania adhezji leukocytów, zwijania leukocytów i funkcji naczyń włosowatych. Chociaż przedstawiony tutaj protokół koncentruje się na obrazowaniu w ostrym modelu zapalenia płuc, może być również przystosowany do badania innych patologicznych i fizjologicznych procesów zachodzących w płucach.

Aby zilustrować wyniki osiągalne za pomocą tego protokołu, ostry uszkodzenie płuc (ALI) wywołano na 6 h przed obrazowaniem, stosując model donosowego podania bakteryjnego lipopolisarydu (LPS). W skrócie, myszy (n = 3) zanieczulono izofluranem, a następnie do lewej dziurki nosowej wpipetowano małe krople LPS z Pseudomonas aeruginosa w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (10 mg/mL) w dawce 5 mg/kg. Wyniki zestawiono z myszami naiwnymi (n = 3; bez podawania donosowego).
W obrazowaniu...

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej może być wykorzystana do badania interakcji leukocytów-śródbłonka i perfuzji naczyń włosowatych w czasie rzeczywistym. Protokół ten opisuje metody obrazowania i ilościowego oznaczania tych parametrów w mikrokrążeniu płucnym za pomocą stabilizowanego próżniowo systemu obrazowania płuc.

Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna szerokokątnego mikrokrążenia płucnego w eksperymentalnym ostrym uszkodzeniu płuc z wykorzystaniem systemu obrazowania stabilizowanego próżniowo

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie chirurgiczne i zastosowanie stabilizowanego próżniowo systemu do obrazowania adhezji leukocytów płucnych i perfuzji naczyń włosowatych in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia stabilne obrazowanie przyżyciowe w wysokiej rozdzielczości nienaruszonego lustrzanego płuca przy minimalnym urazie fizycznym. Na początek należy przygotować okienko obrazowania, podając cienką warstwę smaru próżniowego na górną część pierścienia zewnętrznego, unikając zanieczyszczenia kanału podciśnieniowego.Umieść czyste 8-milimetrowe szklane szkiełko nakrywkowe na oknie i delikatnie dociśnij, aby utworzyć uszczelkę. Podłącz okienko obrazowania do pompy próżniowej wyposażonej w cyfrowy manometr i zdolnej do zapewnienia od 50 do 60 milimetrów stałego ssania rtęci. Przeprowadź światłowodowy przez kaniulę dotchawiczą o średnicy 20 i zanurz końcówkę w lidokainie HCL.Po znieczuleniu należy wprowadzić zmodyfikowany otoskop tak, aby górne siekacze mieściły się w szczelinie w wzierniku. Dostosuj zakres i pozycję języka, aż nagłośnia i struny głosowe będą wyraźnie widoczne. Przełóż światłowodowy przez szczelinę w wzierniku i małymi okrężnymi ruchami przeprowadź między strunami głosowymi, a następnie używając światłowodowego jako prowadnicy, delikatnie wsuń kaniulę do tchawicy, aby zaintubować mysz.Po uruchomieniu wentylacji za pomocą 1,5% izofluranu potwierdź głębokość znieczulenia, testując odruch pedałowania. Przymocuj kaniulę do pyska za pomocą taśmy medycznej. Użyj taśmy do etykietowania, aby przymocować prawą przednią łapę do poduszki grzewczej w pozycji godziny dziewiątej, a następnie wysuń lewą tylną łapę doogonowo i zabezpiecz ją w pozycji godziny szóstej.Za pomocą taśmy tkaninowej delikatnie rozciągnij lewą przednią łapę do pozycji godziny 12 i przymocuj drugi koniec taśmy do górnej części platformy mikroskopii przyżyciowej, a następnie zastosuj sondę temperatury doodbytniczej i pulsoksymetr łapy, aby monitorować parametry życiowe przez cały czas trwania eksperymentu. Aby przygotować mysz do zabiegu, wysterylizuj klatkę piersiową i brzuch chusteczką nasączoną 70% alkoholem i nałóż cienką warstwę oleju mineralnego, aby zwilżyć włosy po lewej stronie myszy. Wykonaj małe nacięcie w pobliżu dolnej części klatki piersiowej, aby odsłonić leżącą pod spodem warstwę mięśni, a następnie przedłuż początkowe nacięcie i użyj cięcia, aby odsłonić klatkę piersiową.Za pomocą kleszczy hemostatycznych chwyć wypreparowany nabłonek i tkankę tłuszczową i umieść z dala od pola operacyjnego. Aby fluorescencyjnie znakować leukocyty i przepływ krwi, podaj 2,5 mililitra na kilogram bolusa rodaminy 6G i albuminy FITC przez żyłę ogonową. Za pomocą kleszczy zębatych chwyć żebro bezpośrednio poniżej pozycji podstawy płuca na końcu wdechu.Lekko cofnij kleszcze, aby odciągnąć żebro od płuca, a następnie przetnij żebro, aby wywołać odmę opłucnową. Przedłuż nacięcie na boki w obu kierunkach, uważając, aby nie dotknąć płuca. Chwyć następne najwyższe żebro kleszczami i lekko się cofnij, aby płuco mogło odpaść od ściany klatki piersiowej.Jeśli płuco nie odrywa się, lekko dociśnij ścianę klatki piersiowej do płuca, aby płuco przylegało do leżącej poniżej opłucnej, a tym samym łatwiej odpadło. Kontynuuj pierwotne nacięcie ostatecznie aż do mostka i czaszki, aż wierzchołek płuca zostanie odsłonięty. Używaj bawełnianych aplikatorów i gazy, aby złagodzić pojawiające się krwawienie.Podnieś klatkę piersiową, aby odsłonić międzyżebrowe naczynia krwionośne na grzbietowej stronie klatki piersiowej, uważając, aby nie uszkodzić płuca, kauteryzuj najniższe naczynie międzyżebrowe w pobliżu kręgosłupa, a następnie przetnij sąsiednie żebro. Poruszając się czaszką, a ostatecznie użyj powtarzającego się wzoru kauteryzacji i cięcia, aby wyciąć około jednej na dwie centymetrowe części klatki piersiowej. Aby przygotować się do obrazowania, przenieś platformę mikroskopii przyżyciowej na stolik mikroskopu i umieść okienko obrazowania bezpośrednio nad odsłoniętym płucem.Użyj mikromanipulatora, aby ostrożnie opuścić okienko obrazowania, aż przylgnie do powierzchni płuc i ustabilizuje ją. Aby zobrazować mikrokrążenie płucne, należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia, wyposażonego w obiektyw 20x oraz standardowe zestawy filtrów FITC i rodaminy. Użyj czarno-białej kamery CCD, aby nagrywać filmy z optymalnym kontrastem.Korzystając z zestawu filtrów FITC, zidentyfikuj miejsce w płucach na podstawie zbieżnego wzorca przepływu krwi i nagraj 30-sekundowy film z miejscem w ostrości, a następnie powtórz nagranie w tym samym polu view, używając zestawu filtrów rodaminy do wizualizacji leukocytów. Aby zlokalizować tętnicę płucną, użyj zestawu filtrów FITC, aby zidentyfikować naczynie o rozbieżnym wzorcu przepływu krwi i nagrać 30-sekundowy film. Powtórz zapis w tym samym polu widzenia, używając zestawu filtrów rodaminy do wizualizacji leukocytów.Aby zlokalizować interesujące obszary naczyń włosowatych, użyj zestawu filtrów FITC, aby zidentyfikować obszar pęcherzyków płucnych i naczyń włosowatych, które nie są przecięte przez większe naczynia i nagrać 30-sekundowy film. Powtórz zapis w tym samym polu widzenia, używając zestawu filtrów rodaminy do wizualizacji leukocytów. Ten film przedstawia obrazowanie przepływu krwi w płucach za pomocą FITC, jak wskazuje zielona strzałka.Obrazowanie rodaminy umożliwia wizualizację leukocytów w tym samym miejscu z dwoma przylegającymi leukocytami oznaczonymi czerwonymi strzałkami. Metody te zastosowano również do wizualizacji tych samych zjawisk oraz tętnic płucnych i obszarów naczyń włosowatych będących przedmiotem zainteresowania. Aby zademonstrować ilościowe określenie parametrów mikrokrążenia, myszy leczono donosowym LPS w celu wywołania zapalenia płuc.Pokazano tutaj transport leukocytów w miejscach płucnych z zarysowanymi obszarami reprezentującymi analizowane regiony śródbłonka u myszy naiwnych i leczonych LPS. Adhezja i zwijanie leukocytów były zwiększone u myszy leczonych LPS. Pokazano tutaj transport leukocytów w tętnicach płucnych z zarysowanymi obszarami reprezentującymi analizowane regiony śródbłonka u myszy nieleczonych i leczonych LPS.Adhezja leukocytów była wyższa u myszy leczonych LPS. Ten rysunek pokazuje adhezję leukocytów w naczyniach włosowatych płuc u myszy wcześniej nieleczonych i leczonych LPS. Wykazano, że adhezja leukocytów była wyższa u myszy leczonych LPS w porównaniu z myszami nieleczonymi.Ten rysunek przedstawia perfuzję naczyń włosowatych płuc u myszy nieleczonych wcześniej i leczonych LPS. Wykazano, że funkcjonalna gęstość naczyń włosowatych była niższa u myszy leczonych LPS w porównaniu z myszami nieleczonymi. Istnieje wiele trudnych aspektów tego protokołu.Optymalizacja pozycjonowania myszy na platformie to prosty krok, który może sprawić, że etapy chirurgiczne i obrazowania będą znacznie bardziej powtarzalne. Procedurę tę można dostosować do szerokiego zakresu parametrów badania i podejść mikroskopowych. W związku z tym powinno to ułatwić dalsze badania mikrokrążenia płucnego zarówno w stanach zdrowych, jak i chorych.

intravital-widefield-fluorescence-microscopy-pulmonary

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę mikroskopii fluorescencyjnej w celu zbadania powstawania skrzepliny w modelu mysim. Myszowi wstrzykuje się polisacharyd znakowany fluoroforem w celu monitorowania krążenia krwi. Po oświetleniu światłem o dużym natężeniu, fototoksyczna indukcja urazu w mikrokrążeniu ucha prowadzi do powstania skrzepliny, co potwierdza się poprzez wizualizację przeszkody w przepływie krwi.

Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna do badania tworzenia się skrzeplin mikronaczyniowych

Izolowany preparat płucny z perfuzją krwi umożliwia wizualizację sieci mikronaczyń na powierzchni płuc. W tym miejscu opisujemy podejście do ilościowego określania przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi

Przedstawiono metodę pomiaru prędkości przepływu krwi mikrokrążącej w raku płuc z przerzutami do powierzchni opłucnej u szczurów w sposób zautomatyzowany, przy użyciu mikroskopii przyżyciowej płuc z zamkniętą klatką piersiową. Model ten ma potencjał do wykorzystania jako szeroko rozpowszechnione narzędzie do prowadzenia badań fizjologicznych nad przerzutami do płuc u gryzoni.

Zautomatyzowany pomiar prędkości przepływu krwi w mikrokrążeniu w przerzutach do płuc szczurów

Opisujemy stosunkowo prostą metodę obrazowania na żywo ex vivo interakcji komórka nowotworowa - zrąb w obrębie przerzutów do płuc, wykorzystując fluorescencyjne reportery u myszy. Wykorzystując mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, technika ta umożliwia wizualizację żywych komórek przez co najmniej 4 godziny i może być dostosowana do badania innych stanów zapalnych płuc.

Ex vivo Obrazowanie na żywo przerzutów do płuc i ich mikrośrodowiska

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania długoterminowego, wysokorozdzielczego, jednokomórkowego obrazowania nienaruszonego płuca w czasie rzeczywistym przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania.

Długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo

W tym badaniu prezentujemy protokół do przeprowadzenia dwufotonowego obrazowania intravital i analizy interakcji komórkowych w mysiej błonie śluzowej tchawicy po zakażeniu wirusem grypy. Protokół ten będzie istotny dla naukowców badających dynamikę komórek odpornościowych podczas infekcji dróg oddechowych.

Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Poznaj mikroskopię fluorescencyjną przyżyciową do badania mikrokrążenia płucnego z wykorzystaniem systemu stabilizowanego próżniowo. Ta metoda umożliwia obserwację interakcji leukocytów z endotelem w czasie rzeczywistym.

Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna szerokokątnego mikrokrążenia płucnego w eksperymentalnym ostrym uszkodzeniu płuc z wykorzystaniem systemu obrazowania stabilizowanego próżniowo (Wideo) | JoVE Journal

Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna szerokokątnego mikrokrążenia płucnego w eksperymentalnym ostrym uszkodzeniu płuc z wykorzystaniem systemu obrazowania stabilizowanego próżniowo

Przeglądaj więcej filmów