Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna szerokokątnego mikrokrążenia płucnego w eksperymentalnym ostrym uszkodzeniu płuc z wykorzystaniem systemu obrazowania stabilizowanego próżniowo

Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie chirurgiczne i zastosowanie stabilizowanego próżniowo systemu do obrazowania adhezji leukocytów płucnych i perfuzji naczyń włosowatych in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia stabilne obrazowanie przyżyciowe w wysokiej rozdzielczości nienaruszonego lustrzanego płuca przy minimalnym urazie fizycznym. Na początek należy przygotować okienko obrazowania, podając cienką warstwę smaru próżniowego na górną część pierścienia zewnętrznego, unikając zanieczyszczenia kanału podciśnieniowego.

Umieść czyste 8-milimetrowe szklane szkiełko nakrywkowe na oknie i delikatnie dociśnij, aby utworzyć uszczelkę. Podłącz okienko obrazowania do pompy próżniowej wyposażonej w cyfrowy manometr i zdolnej do zapewnienia od 50 do 60 milimetrów stałego ssania rtęci. Przeprowadź światłowodowy przez kaniulę dotchawiczą o średnicy 20 i zanurz końcówkę w lidokainie HCL.

Po znieczuleniu należy wprowadzić zmodyfikowany otoskop tak, aby górne siekacze mieściły się w szczelinie w wzierniku. Dostosuj zakres i pozycję języka, aż nagłośnia i struny głosowe będą wyraźnie widoczne. Przełóż światłowodowy przez szczelinę w wzierniku i małymi okrężnymi ruchami przeprowadź między strunami głosowymi, a następnie używając światłowodowego jako prowadnicy, delikatnie wsuń kaniulę do tchawicy, aby zaintubować mysz.

Po uruchomieniu wentylacji za pomocą 1,5% izofluranu potwierdź głębokość znieczulenia, testując odruch pedałowania. Przymocuj kaniulę do pyska za pomocą taśmy medycznej. Użyj taśmy do etykietowania, aby przymocować prawą przednią łapę do poduszki grzewczej w pozycji godziny dziewiątej, a następnie wysuń lewą tylną łapę doogonowo i zabezpiecz ją w pozycji godziny szóstej.

Za pomocą taśmy tkaninowej delikatnie rozciągnij lewą przednią łapę do pozycji godziny 12 i przymocuj drugi koniec taśmy do górnej części platformy mikroskopii przyżyciowej, a następnie zastosuj sondę temperatury doodbytniczej i pulsoksymetr łapy, aby monitorować parametry życiowe przez cały czas trwania eksperymentu. Aby przygotować mysz do zabiegu, wysterylizuj klatkę piersiową i brzuch chusteczką nasączoną 70% alkoholem i nałóż cienką warstwę oleju mineralnego, aby zwilżyć włosy po lewej stronie myszy. Wykonaj małe nacięcie w pobliżu dolnej części klatki piersiowej, aby odsłonić leżącą pod spodem warstwę mięśni, a następnie przedłuż początkowe nacięcie i użyj cięcia, aby odsłonić klatkę piersiową.

Za pomocą kleszczy hemostatycznych chwyć wypreparowany nabłonek i tkankę tłuszczową i umieść z dala od pola operacyjnego. Aby fluorescencyjnie znakować leukocyty i przepływ krwi, podaj 2,5 mililitra na kilogram bolusa rodaminy 6G i albuminy FITC przez żyłę ogonową. Za pomocą kleszczy zębatych chwyć żebro bezpośrednio poniżej pozycji podstawy płuca na końcu wdechu.

Lekko cofnij kleszcze, aby odciągnąć żebro od płuca, a następnie przetnij żebro, aby wywołać odmę opłucnową. Przedłuż nacięcie na boki w obu kierunkach, uważając, aby nie dotknąć płuca. Chwyć następne najwyższe żebro kleszczami i lekko się cofnij, aby płuco mogło odpaść od ściany klatki piersiowej.

Jeśli płuco nie odrywa się, lekko dociśnij ścianę klatki piersiowej do płuca, aby płuco przylegało do leżącej poniżej opłucnej, a tym samym łatwiej odpadło. Kontynuuj pierwotne nacięcie ostatecznie aż do mostka i czaszki, aż wierzchołek płuca zostanie odsłonięty. Używaj bawełnianych aplikatorów i gazy, aby złagodzić pojawiające się krwawienie.

Podnieś klatkę piersiową, aby odsłonić międzyżebrowe naczynia krwionośne na grzbietowej stronie klatki piersiowej, uważając, aby nie uszkodzić płuca, kauteryzuj najniższe naczynie międzyżebrowe w pobliżu kręgosłupa, a następnie przetnij sąsiednie żebro. Poruszając się czaszką, a ostatecznie użyj powtarzającego się wzoru kauteryzacji i cięcia, aby wyciąć około jednej na dwie centymetrowe części klatki piersiowej. Aby przygotować się do obrazowania, przenieś platformę mikroskopii przyżyciowej na stolik mikroskopu i umieść okienko obrazowania bezpośrednio nad odsłoniętym płucem.

Użyj mikromanipulatora, aby ostrożnie opuścić okienko obrazowania, aż przylgnie do powierzchni płuc i ustabilizuje ją. Aby zobrazować mikrokrążenie płucne, należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia, wyposażonego w obiektyw 20x oraz standardowe zestawy filtrów FITC i rodaminy. Użyj czarno-białej kamery CCD, aby nagrywać filmy z optymalnym kontrastem.

Korzystając z zestawu filtrów FITC, zidentyfikuj miejsce w płucach na podstawie zbieżnego wzorca przepływu krwi i nagraj 30-sekundowy film z miejscem w ostrości, a następnie powtórz nagranie w tym samym polu view, używając zestawu filtrów rodaminy do wizualizacji leukocytów. Aby zlokalizować tętnicę płucną, użyj zestawu filtrów FITC, aby zidentyfikować naczynie o rozbieżnym wzorcu przepływu krwi i nagrać 30-sekundowy film. Powtórz zapis w tym samym polu widzenia, używając zestawu filtrów rodaminy do wizualizacji leukocytów.

Aby zlokalizować interesujące obszary naczyń włosowatych, użyj zestawu filtrów FITC, aby zidentyfikować obszar pęcherzyków płucnych i naczyń włosowatych, które nie są przecięte przez większe naczynia i nagrać 30-sekundowy film. Powtórz zapis w tym samym polu widzenia, używając zestawu filtrów rodaminy do wizualizacji leukocytów. Ten film przedstawia obrazowanie przepływu krwi w płucach za pomocą FITC, jak wskazuje zielona strzałka.

Obrazowanie rodaminy umożliwia wizualizację leukocytów w tym samym miejscu z dwoma przylegającymi leukocytami oznaczonymi czerwonymi strzałkami. Metody te zastosowano również do wizualizacji tych samych zjawisk oraz tętnic płucnych i obszarów naczyń włosowatych będących przedmiotem zainteresowania. Aby zademonstrować ilościowe określenie parametrów mikrokrążenia, myszy leczono donosowym LPS w celu wywołania zapalenia płuc.

Pokazano tutaj transport leukocytów w miejscach płucnych z zarysowanymi obszarami reprezentującymi analizowane regiony śródbłonka u myszy naiwnych i leczonych LPS. Adhezja i zwijanie leukocytów były zwiększone u myszy leczonych LPS. Pokazano tutaj transport leukocytów w tętnicach płucnych z zarysowanymi obszarami reprezentującymi analizowane regiony śródbłonka u myszy nieleczonych i leczonych LPS.

Adhezja leukocytów była wyższa u myszy leczonych LPS. Ten rysunek pokazuje adhezję leukocytów w naczyniach włosowatych płuc u myszy wcześniej nieleczonych i leczonych LPS. Wykazano, że adhezja leukocytów była wyższa u myszy leczonych LPS w porównaniu z myszami nieleczonymi.

Ten rysunek przedstawia perfuzję naczyń włosowatych płuc u myszy nieleczonych wcześniej i leczonych LPS. Wykazano, że funkcjonalna gęstość naczyń włosowatych była niższa u myszy leczonych LPS w porównaniu z myszami nieleczonymi. Istnieje wiele trudnych aspektów tego protokołu.

Optymalizacja pozycjonowania myszy na platformie to prosty krok, który może sprawić, że etapy chirurgiczne i obrazowania będą znacznie bardziej powtarzalne. Procedurę tę można dostosować do szerokiego zakresu parametrów badania i podejść mikroskopowych. W związku z tym powinno to ułatwić dalsze badania mikrokrążenia płucnego zarówno w stanach zdrowych, jak i chorych.